CN105879020A

CN105879020A - 一种c群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法

Info

Publication number: CN105879020A
Application number: CN201610187232.1A
Authority: CN
Inventors: 张晓华; 孙述学; 周荔葆; 张景春; 马宏初; 刘晓磊; 王振业
Original assignee: Beijing Chengda Tianhe Biotechnology Co Ltd
Current assignee: Beijing Chengda Tianhe Biotechnology Co Ltd
Priority date: 2016-03-30
Filing date: 2016-03-30
Publication date: 2016-08-24

Abstract

本发明涉及一种新式的C群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法。将纯化的C群脑膜炎球菌荚膜多糖使用EDAC催化其与连接臂ADH共价结合，制备多糖衍生物，随后将多糖衍生物与载体蛋白白喉毒素无毒突变体CRM197在EDAC催化下共价结合，形成多糖‑蛋白结合物；经纯化、过滤后得到C群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗原液。这种疫苗可以预防婴幼儿中由C群脑膜炎球菌引起的流行性脑脊髓膜炎及其并发症。

Description

一种C群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法

技术领域

本发明属于生物制药技术领域，具体为一种C群脑膜炎球菌荚膜多糖结合疫苗的制备方法。

背景技术

脑膜炎球菌是世界范围内侵袭性脑膜炎的主要致病菌，也是唯一能引起大流行的细菌病原体。在撒哈拉以南的非洲地区，每5-10年会爆发一次大流行，在欧美发达国家每年也会有超过1万例病例报道。据估计，全球每年爆发超过1,200,000起感染病例，造成135,000例死亡。即使在得到适当治疗的条件下，脑膜炎球菌感染引起的死亡率也可超过10％，并在感染的幸存者中会有约10％～20％留有永久性的神经系统后遗症。

脑膜炎球菌已被发现有13种血清群，其中A、B、C、W135、Y群为主要的致病血清群。我国自1984年在全国各地进行儿童A群脑膜炎球菌多糖疫苗免疫以来，A群流脑得到了有效控制，全国的发病率低于1/10万。但近年来，C群流脑病例在我国开始增加，2003～2005年，国内十多个省市相继报道C群流脑的流行发病，2009～2010年全国检出的流脑病例中，C群病例比例约为70％，要高于A群病例，C群流脑菌株的比例呈上升趋势，流脑流行菌群正在发生从A群到C群的变化。疫苗是脑膜炎球菌感染的主要预防手段。目前已上市的脑膜炎球菌疫苗主要有两种，分别是多糖疫苗与结合疫苗。多糖疫苗以纯化的脑膜炎球菌荚膜多糖为主要成分，能在成人及年长儿童中诱导产生血清抗体反应，但是该种疫苗对婴幼儿的免疫原性极差，且不能诱导产生长期的免疫记忆；结合疫苗则是将纯化的脑膜炎球菌荚膜多糖与载体蛋白共价结合后制成的疫苗，可诱导产生高滴度的血清杀菌抗体，并产生长期的免疫记忆，对婴幼儿也有足够的免疫原性，是2岁以下幼儿接种脑膜炎球菌疫苗的首选。

在结合疫苗的制备过程中，往往要对荚膜多糖进行活化，并添加连接臂使多糖与载体蛋白共价结合。目前国内最常用的活化剂为溴化氰(CNBr)，在碱性条件下与多糖混合后可在多糖的结构添加一个活性的氰基基团，随后将活化多糖与己二酰肼(ADH)反应，从而在多糖结构中添加连接臂；活化后的多糖与载体蛋白混合，在催化剂碳二亚胺(EDAC)的作用下连接臂与载体蛋白的游离羧基共价结合，经超滤，纯化即得到多糖-蛋白结合物。上述传统方法有一定的缺陷，首先是活化剂溴化氰为剧毒物质，在制备过程中有对操作人员造成严重伤害的风险，并在制备完成后需严格检测残留量；其次活化过程需要在碱性条件下进行，多糖在碱性条件下易水解，而多糖结构中的O-乙酰基在碱性条件下易自多糖结构中解离，上述两种情况都可能影响最终结合物的免疫原性；最后，利用溴化氰活化多糖的效率并不高，导致最终产物的得率不高，提高了制造成本。近年来，CNBr的取代物质1-氰基-4-二甲基氨基吡啶翁四氟硼酸盐(CDAP)也逐渐普及开来，CDAP同CNBr相比，具有一定的优势，毒性很低，对人员潜在伤害很小，活化条件也相对温和，活化效率较CNBr也有了一定的提升，是一种较为理想的多糖活化剂。但是其高昂的价格(＞1000$/g)显著提高了疫苗的制造成本，制约了其广泛应用。

发明内容

本发明根据传统结合方法中的种种不足，在C群流脑结合疫苗的制备过程中，放弃了传统的溴化氰或CDAP活化多糖的方法，而是从C群多糖的结构出发，利用其分子结构中所含有的羧基，在不活化多糖的情况下使用结合反应中所用到的催化剂EDAC将连接臂ADH共价结合到多糖分子上，随后将此种方法所得到的多糖衍生物与载体蛋白进行结合。该方法采用低毒的EDAC作为催化剂衍生多糖，对环境及人员危害很小；整个制备过程均在弱酸条件下进行，最大程度的减少了多糖与蛋白的水解变性状况，所得结合物收率较高，稳定性好，并具有良好的免疫原性。本发明亦可应用于其他含羧基结构的荚膜多糖结合疫苗的制备中。

该发明涉及到的C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合物的制备方法具体步骤如下：溶解C群脑膜炎球菌多糖，过滤除菌；在多糖溶液中加入ADH，调节溶液pH 5.5～6.3；加入EDAC催化多糖衍生；反应完成后将多糖衍生溶液超滤得到多糖衍生物；将多糖衍生物与载体蛋白溶液混合，调节溶液pH 5.5～6.3，冰浴；加入EDAC冰浴条件下催化结合反应；反应完成后将结合物纯化过滤即得到结合物原液。

附图说明

图1分子筛的方法分离纯化C群流脑多糖结合物(CPS__EDACAH-CRM197)的层析图谱，层析介质为Sepharose 4FF。206nm和280nm波长同时在线监测，峰1为V₀处收集的目的结合峰。

具体实施方式

实施例1

下面结合反应实例描述本发明

C群荚膜多糖溶解至5～10mg/ml，将1～3倍于多糖质量的ADH加入到多糖溶液中，搅拌混匀，用稀盐酸将溶液pH调节至pH 5.5～6.3；加入与多糖质量比为0.2～0.6mg/mg的EDAC，室温搅拌反应；反应期间用稀盐酸保持溶液pH 5.5～6.3。

反应1～2小时后，将多糖衍生溶液用30KD超滤膜包超滤去除小分子物质。0.45μm滤膜过滤后2～8℃保存。

称取CRM197蛋白溶解至10～20mg/ml，取多糖衍生物溶液与CRM197蛋白溶液混合，使多糖与蛋白质量比为1～2mg/mg，冰浴；用稀盐酸将混合溶液pH调节至pH 5.5～6.3；随后向混合溶液中加入终浓度为10～30mmol/L的EDAC，冰浴搅拌反应，用稀盐酸保持溶液pH5.5～6.3。反应1～3小时。

反应完成后用NaOH将溶液pH调至中性终止反应，用100KD超滤膜包超滤反应溶液去除小分子物质，用Sepharose 4FF纯化结合物，收集V₀处洗脱峰，0.22μm滤膜过滤后即为C群流脑多糖-蛋白结合物原液，纯化图谱见图1，将结合物记为CPS__EDACAH-CRM197。

实施例2

本研究所采用的多糖衍生方法与传统的使用CNBr或CDAP的活化方法相比，条件比较温和，操作相对简单。但该方法制备的C群多糖结合物在糖蛋白比、得率、游离多糖水平等方面能否达到乃至超过传统方法制备的结合物也值得关注，因此，本实例对本研究与其他方法制备所得结合物开展了主要指标的检测，并将检测结果进行对比。

不同方法制备的结合物的生化特性对比

为与传统方法进行比较，本研究采用CDAP活化多糖的方法为对照方法制备结合物。

主要操作步骤如下：

CDAP活化多糖与蛋白间接结合制备C群多糖蛋白结合物

C群荚膜多糖溶解至5～10mg/ml，向其中加入100mg/ml的CDAP溶液，使CDAP与多糖质量比为0.5～1.0mg/mg，搅拌均匀后加入与CDAP等体积的TEA溶液，使用NaOH溶液将溶液调节至pH8.5～9.5，室温反应1～5min。

向多糖活化溶液加入1～3倍于多糖质量的ADH，用HCl调节溶液至pH 8.5～8.9，室温搅拌反应两小时后置于2～8℃反应过夜。

将反应过夜的多糖衍生溶液用30KD超滤膜包超滤去除小分子物质。0.45μm滤膜过滤后2～8℃保存。

反应完成后用NaOH将溶液pH调至中性终止反应，用100KD超滤膜包超滤反应溶液去除小分子物质，用Sepharose 4FF纯化结合物，收集V₀处洗脱峰，0.22μm滤膜过滤后即为C群流脑多糖-蛋白结合物原液，记为CPS__CDAPAH-CRM197。

所得结合物原液检测结果与本研究结合方法的结果进行比较

参照2015版药典通则3102及通则0731第二法(福林酚法)对实施例1中原液及上述两种方法制备的原液取样测定其多糖、蛋白、游离多糖含量，并计算其收率，检测结果如表1所示。

表1.不同方法制备的C群流脑多糖结合物原液检测结果

如表1所示，本研究制备的结合物各项主要生化指标与实例2中采取的方法制备的结合物相差不大，但在游离多糖方面前者明显优于后者，两种方法游离多糖差别大的原因在于在多糖衍生的过程中CPS__CDAPAH-CRM197容易产生交联导致最终的结合产物分子量较大，游离多糖比较高；本方法制备的结合物的产物收率接近CDAP法的一倍，具有明显的优势，显示出该方法良好的适用性与优越性。

实施例3

C群流脑多糖结合物稳定性考察

针对在未来的生产条件下制品可能暴露的温度为2～8℃和短暂的室温，我们考察了上述实例中两批原液在2～8℃保存3、6、8个月和20～25℃保存4周、6周后的质量稳定性，以及在极端环境下37℃3天、7天、14天的稳定性，并将两者进行比较。

两批结合疫苗原液样品于2～8℃保存3个月、6个月和8个月以及37℃3天、7天、14天后分别进行各项指标的检测，检测方法同上，检测结果见表2和表3。

如表2所示，两批C群结合物原液于2～8℃保存8个月后多糖含量、蛋白含量和糖蛋白比等指标均无明显变化，随着样品放置时间的的延长，两批结合物游离多糖都有所增加，CPS__CDAPAH-CRM197结合物的游离多糖增幅明显大于CPS__EDACAH-CRM197，在2～8℃稳定性方面后者要优于前者。

表3所示两批C群结合物原液于20～25℃保存6周后多糖含量、蛋白含量和糖蛋白比等指标也无明显变化，游离多糖的变化也与2～8℃保存8个月的变化基本一致。在常温条件下C群多糖结合物均显示一定的热稳定性。

表4所示两批C群结合物原液于37℃保存3天、7天和10天后多糖含量、蛋白含量和糖蛋白比等指标无明显变化，但在游离多糖检项上CPS__CDAPAH-CRM197结合物在3天后游离多糖就明显增加，7天后超过40％，而CPS__EDACAH-CRM197结合物在14天后游离多糖仍未超过10％，说明在高温环境下本方法制备的结合物的稳定性要远高于CDAP活化法制备的结合物。

根据实例1、实例2和实例3的研究结果显示本方法相较于CDAP法，除成本较低，操作方便等优点外，在产物的理化特性、产物收率、稳定性方面也具有明显的优势。从方法原理上分析，CDAP法在活化多糖的过程中，主要利用多糖结构中的羟基基团，但C群多糖中比羟基更活泼的羧基结构对该活化过程可能会有负面影响，而且ADH与多糖活化后产生的氰基的共价结合反应是一种自发的反应过程，没有催化剂的促进作用，反应较为缓慢，往往需要过夜，而且效率很低，所产生的连接臂由于数量过少很容易就被多糖自身交联而被屏蔽掉，从而影响结合效率。相比之下，EDAC催化多糖直接利用了多糖结构中最活泼的羧基基团，并且EDAC作为一种催化剂，可有目的性促进ADH与多糖羧基的共价结合反应，反应迅速，效率较高，最终产物的衍生率很高，即使多糖自身交联对最终结合反应的影响也有限，从而提高了最终结合物的收率。另外，CDAP法活化多糖后多糖以C＝N基团与ADH上NH₂相连，稳定性与EDAC法催化形成的酰胺键相比较差，这可能是EDAC法制备的结合物稳定性优于CDAP法结合物的原因。

表2.两种C群脑膜炎球菌多糖结合物原液于2～8℃存放不同时间的各项质量指标检定结果

表3.两种C群脑膜炎球菌多糖结合物原液于20～25℃存放不同时间的各项质量指标检定结果

表4.两种C群脑膜炎球菌多糖结合物原液于37℃存放不同时间的各项质量指标检定结果

实施例4

不同方法制备的C群流脑多糖-蛋白结合物的免疫原性测定。

选取的试验动物为4～6周龄的SPF级BALB/C小鼠，小鼠体重12～14g，雌性。后腿皮下注射，按0，14天分别注射1针，共2针次。样品组注射各含2.5μg的C群多糖的结合物；阳性组为市售的A+C流脑多糖结合疫苗，剂量同上；多糖对照组注射各含5.0μg的A、C群多糖；阴性对照组注射相同剂量的生理盐水。每组10只小鼠。第2针注射后7天眼眶采血，分离收集血清，-20℃以下保存待用。

采用多糖直接包被的间接ELISA法测定各组小鼠单个血清中IgG抗体滴度。将C群多糖用碳酸盐缓冲液包被酶标板，于37℃放置4小时，然后于4℃放置过夜。次日37℃封闭1小时。血清样品第1针起始稀释倍数20倍，第2针免疫血清起始稀释倍数100倍，之后依次进行2倍系列稀释，37℃孵育2小时；洗板后加入适宜稀释度的碱性磷酸酶标记的羊抗鼠IgG抗体，37℃孵育1小时后用酶底物对硝基苯酚磷酸盐显色(1mg/ml)室温显色后用终止液终止反应，在酶标仪上测定，于405nm波长下读数，以生理盐水阴性对照组血清OD405值计算Cutoff值，其它血清OD值超过Cutoff值的血清最高稀释度即为该份血清的抗体滴度。抗体滴度进行对数转换后计算各组动物血清抗体几何平均滴度。然后用统计软件SPSS13.0进行方差分析计算各组间差异性，结果见表5。

表4的结果显示，制备的样品可诱导小鼠产生针对C群多糖的IgG抗体应答。第1针免疫后结合物与对照疫苗之间抗体水平没有差异，但均比多糖组高；2针次免疫后两批结合物以及对照疫苗诱导的抗体水平也相当，虽然2种结合物制备工艺不同，糖蛋白比相差较大，游离多糖含量相差也很大，但抗体水平之间没有明显差异(p＞1.000)且均比第1针和多糖对照组抗体滴度有显著提高(p＝0.000)，显示结合疫苗的加强效应。

表4.免疫小鼠诱导的针对C群多糖抗体GMT

Claims

1.一种C群脑膜炎球菌多糖蛋白结合疫苗。其特征在于：充分利用C群脑膜炎球菌荚膜多糖的结构特点在不活化的情况下，在碳二亚胺(EDAC)存在下催化连接臂己二酰肼ADH与多糖共价偶联形成多糖衍生物，将多糖衍生物超滤后与载体蛋白使用EDAC催化结合形成多糖-蛋白结合物，经超滤、纯化、过滤得到C群脑膜炎球菌结合疫苗原液。

2.根据权利要求1所述要求，其特征在于：所衍生的多糖为结构中含有羧基的荚膜多糖包括但不限于C/Y/W135群脑膜炎球菌多糖、伤寒Vi多糖、1/3/4/5/8/9/12F型肺炎链球菌荚膜多糖。

3.根据权利要求1所述要求，其特征在于：多糖衍生时EDAC与多糖质量比为0.2～0.6mg/mg。

4.根据权利要求1所述要求，其特征在于：多糖衍生时ADH与多糖质量比为1～3mg/mg。

5.根据权利要求1所述要求，其特征在于：多糖衍生时的反应pH为pH 5.5～6.3。

6.根据权利要求1所述要求，其特征在于：多糖衍生物超滤时所用超滤膜包类型为10～30KD。

7.根据权利要求1所述要求，其特征在于：结合时所用载体蛋白为白喉类毒素、破伤风类毒素、白喉毒素无毒突变体CRM197及B型脑膜炎球菌外膜蛋白。

8.根据权利要求1所述要求，其特征在于：结合反应溶液中多糖与蛋白质量比为1～2mg/mg。

9.根据权利要求1所述要求，其特征在于：结合反应溶液中EDAC终浓度为10～30mmol/L。

10.根据权利要求1所述要求，其特征在于：结合反应溶液的pH应为pH 5.5～6.3。

11.根据权利要求1所述要求，其特征在于：结合物超滤时超滤膜包类型为100KD。