CN103820475A

CN103820475A - 枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因及其编码的蛋白质和应用

Info

Publication number: CN103820475A
Application number: CN201310555823.6A
Authority: CN
Inventors: 季静; 王罡; 贾翠翠; 吴电云; 曹海燕
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2013-11-11
Filing date: 2013-11-11
Publication date: 2014-05-28
Anticipated expiration: 2033-11-11
Also published as: CN103820475B

Abstract

本发明涉及一种枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因及其编码的蛋白质和应用，具体为枸杞（LyciumchinenseMiller）中牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的克隆。通过提取新鲜枸杞叶片中的总RNA，克隆了枸杞中的牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2，得到基因完整的序列为1246bp；构建了大肠杆菌表达载体pET28a-LmGGPS2，通过大肠杆菌异源表达系统，得到了LmGGPS2表达蛋白；并构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmGGPS2，电击法将载体转入农杆菌C58细胞，用这种细胞转化烟草，得到转基因烟草，通过测试，发现转基因烟草大大提高了植物西红柿红素的含量，类胡萝卜素的含量也有所提高。

Description

枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因及其编码的蛋白质和应用

技术领域

本发明涉及一种枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因及其编码的蛋白质和应用，具体为枸杞（Lycium chinense Miller）中牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的克隆。

背景技术

牦牛儿基牦牛儿焦磷酸( GGPP) 是生物界普遍存在的重要中间代谢产物. 在植物中，GGPP参与叶绿素、类胡萝卜素、赤霉素、质体醌、维生素E、单萜和苯醌等产物的合成，对植物光合作用、生长发育和产品品质等有重要影响。该产物由GGPS 直接催化合成。GGPP不仅是类胡萝卜素生物合成的最直接的前体物质，还是植物体内赤霉素、叶绿素和质体醌等前体物质。GGPP 的合成是类胡萝卜素合成中的限速过程。通过一系列的酶促反应，产生的西红柿红素不仅赋予西红柿鲜艳的色泽，而且具有重要的营养保健价值。医学研究表明，血清中高含量的西红柿红素可显着地降低各种癌症的发病率，血液中的西红柿红素含量与前列腺癌、消化道癌、乳腺癌、肺癌、膀胱癌、皮肤癌等多种癌症的发生几率呈负相关，研究表明人体中高西红柿红素含量能显着的降低前列腺癌的发生几率。西红柿红素保护心脑血管的作用主要是通过其抗氧化作用, 降低血清脂质和低密度脂蛋白的过氧化作用, 从而减少动脉硬化和冠心病的发病率，高西红柿红素的摄入能显着的降低心脑血管疾病的发病几率。西红柿红素还具有提高免疫力、延缓衰老等作用。

西红柿红素能够猝灭单线态氧、清除自由基，防止蛋白质和 DNA 受到氧的破坏等作用。西红柿红素清除单线态氧的能力是目前常用抗氧化剂维生素 E 的 10 倍，β-胡萝卜素的 2 倍。西红柿红素分子在所有类胡萝卜素中含有的共轭双键的数量最多，其淬灭单线态氧速率常数是维生素 E 的 100 倍，是抗氧化能力最强的类胡萝卜素。西红柿红素的化学结构决定了其具有很强的去除活性氧和自由基的能力,是一种有效的抗氧化剂。而且类胡萝卜素，尤其是β-胡萝卜素能抑制、清除体内自由基，可以延缓衰老和预防肿瘤、血栓、动脉粥样硬化等疾病。类胡萝卜素能增加免疫系统中B细胞的活力、消灭外源入侵的病原菌，能提高淋巴辅助T细胞的活力，协助B细胞产生抗体，并提高其它免疫组分的活性；还能增加自然杀伤细胞的数目，以消除机体内被感染的细胞或癌细胞。

在植物中，GGPS基因与其它酶共同作用下生成二萜、四萜和多萜化合物。GGPS是合成二萜、四萜和多萜的关键酶。烟草萜类化合物与烟叶香气密切相关，它们不但作为重要的烟草香气前体物存在于烟叶中，而且在烟气中也发现了烟叶中具有的大部分类萜化合物。如二萜是叶面腺体胶质分泌物的主要组成成分，其主要成分是西柏三烯二醇，它的降解产物茄酮及其衍生物是重要的香味物质；四萜化合物类胡萝卜素是烟叶中重要的致香物前体物，其降解产物如大马酮、紫罗兰酮、巨豆三烯酮等是烟叶中重要致香成分。在我国烟叶生产中，增加烟叶萜类化合物含量，特别是与香气品质密切相关的香气前体物质如二萜、类胡萝卜素等在烟叶中的积累，可增加烟叶香气量，改善烟叶香气品质。因此，研究转基因GGPS烟草具有重要意义。

植物类胡萝卜素合成的步骤如下：3-甲基-3，5-二羟基戊酸(MVA)在酶的催化作用下合成异戊烯焦磷酸(IPP)，异戊烯焦磷酸(IPP)首先在异戊烯焦磷酸异构酶（IPI）的作用下生成带有丙烯基结构的同分异构体二甲基丙烯焦磷酸（DMAPP）, 它是异戊稀合成途径中必需的前体物质，DMAPP 和 IPP 经过连续的缩合依次生成牦牛儿基焦磷酸（GPS）、法呢基焦磷酸（FPP）、牦牛儿基牦牛儿基焦磷酸（GGPP）。两分子的 GGPP 由八氢西红柿红素合成酶（PSY）催化聚合成八氢西红柿红素。八氢西红柿红素经过连续的脱氢反应生成顺式结构的原西红柿红素（prolycopene），原西红柿红素在胡萝卜素异构酶（CRTISO）的作用下异构成反式结构西红柿红素。西红柿红素随后相应环化酶的催化下，生成 a、β-胡萝卜素，并进一步生成其它类型的色素（Tanaka et al., 2008）。

随着人类对西红柿红素和类胡萝卜素药用价值及医疗保健作用的不断发现，对西红柿红素和类胡萝卜素的种类和产量的需求也将越来越大，然而，西红柿红素类胡萝卜素很难用化学方法合成。现代分子生物学研究手段的发展，使得西红柿红素和类胡萝卜素生物合成途径中的一系列关键酶的基因被陆续分离鉴定，为通过DNA重组技术和遗传工程调控生产西红柿红素和类胡萝卜素开辟了道路，特别是通过类胡萝卜素基因工程获得“金色水稻”和“金油菜”，极大地增强了人们开展植物类胡萝卜素基因工程的信心。

萜类化合物是植物代谢物中数量最多的一类化合物，由异戊二烯为结构单元组成。在植物体的呼吸作用、光合作用，以及生长、发育、繁殖、信号转导和防御中发挥着重要作用。某些萜类化合物具有重要的经济价值，还有些可被用作天然香料和香味化合物或抗肿瘤化疗药。在植物中，萜类化合物的生物合成发生在细胞质和质体中，其前体物质是C5 结构的异戊烯基焦磷酸（Isopentenyl pyrophosphate ，IPP ）及其同分异构体——二甲基烯丙基焦磷酸酯（Dimethylallyl pyrophosphate ，DMAPP）。经由甲羟戊酸（Mevalonic acid，MVA）途径合成的 IPP 是合成法呢基焦磷酸（Farnesyl pyrophosphate ，FPP ，C15）的前体物，FPP 最终在细胞质中合成为倍半萜、三萜以及甾醇。在质体中甲基赤藓糖醇磷酸（methyl-erythritol-phosphate，MEP）途径合成的IPP 和DMAPP 是生成牻牛儿基焦磷酸（Geranyl pyrophosphate ，GPP ，C10）的前体物。GPP 在单萜合成酶的作用下生成单萜；在牻牛儿基牻牛儿焦磷酸合成酶（Geranylgeranyl pyrophosphate Synthase，GGPPS）作用下生成牻牛儿基牻牛儿焦磷酸（Geranylgeranyl pyrophosphate ，GGPP，C20），进而在酶的作用下生成二萜、四萜和多萜化合物。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因。

本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。

本发明的目的还在于提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。

本发明提供了一种枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2，如序列表中SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列构成。

本发明提供了一种上述枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2编码的蛋白质，如序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

本发明提供了一种上述枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2重组克隆载体pMD18-T-LmGGPS2。

含有上述的枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的重组载体，这些重组载体包括质粒。

所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-LmGGPS2。

所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-LmGGPS2。

所述的质粒表达载体双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmGGPS2。

含有上述枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。

所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或烟草细胞。

本发明提供了一种含有LmGGPS2基因的工程菌。

上述枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的应用包括该基因编码的蛋白在植物中的应用；用所述的重组载体，如植物表达载体转化玉米细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与玉米、大豆、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜等细胞共培养，得到转基因的再生植株；或者用所述的LmGGPS2遗传转化获得上述物种转基因植株。

本发明的技术方案具体概述如下：

本发明的克隆方法包括下述步骤：

从枸杞新鲜叶片中提取总RNA，根据转录组Unigene序列中枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的核苷酸序列设计上游引物LmGGPS2-F1:5’-GTCATGTCTATGCTAATAGGTGT-3’， LmGGPS-R1:5’-GGTCA

GTTTCTGATGGAGAAATT-3’，PCR扩增获得该基因全长序列1246bp。

本发明构建含有牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的大肠杆菌表达载体pET28a- LmGGPS2和植物表达载体pCAMBIA2300-LmGGPS2，由下述步骤组成：

1）构建含有牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因的中间载体pMD18-T-LmGGPS2。

以LmGGPS-F1/ LmGGPS-R1为引物，以枸杞cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得含有序列表中SEQ ID NO.1所示的LmGGPS2基因的中间载体pMD18-T-LmGGPS2。

2）构建大肠杆菌表达载体pET28a- LmGGPS2

以LmGGPS-F1/ LmGGPS-R1为引物，以枸杞cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，并转化到感受态大肠杆菌TOP10中，菌落PCR验证后，提取质粒，用BamHI和SalI双酶切该质粒，将pET28a空载体用BamHI和SalI双酶切，分别纯化后进行连接，得到大肠杆菌表达载体pET28a- LmGGPS2。

3）构建植物表达载体pCAMBIA2300-LmGGPS2

以LmGGPS-F1/ LmGGPS-R1为引物，以枸杞cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，并转化到感受态大肠杆菌TOP10中，菌落PCR验证后，提取质粒，用BamHI和SalI双酶切该质粒，将pCAMBIA2300-35S-OCS空载体用BamHI和SalI双酶切，分别纯化后进行连接，得到植物表达载体pCAMBIA2300-LmGGPS2。

本发明提供了一种枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因及其编码的蛋白质和应用。首次从枸杞中分离出编码牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因的完整cDNA，连接到大肠杆菌表达载体上，利用外源表达系统验证枸杞LmGGPS2基因的表达蛋白；然后连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化烟草，获得转基因植株，通过研究表明转基因植株的类胡萝卜素含量有所提高，即本发明在增强植物类胡萝卜素含量等方面具有广泛应用。

本发明所述的枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2可望用于制备转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜植株。

附图说明

图1. 为LmGGPS2全长PCR扩增电泳图。

图2. 为pMD18-T-LmGGPS2载体示意图。

图3. 为pET-28a-LmGGPS2载体示意图。

图4. 为pCAMBIA2300-LmGGPS2载体示意图。

图5. 为转基因烟草基因组PCR。

图6. 为转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、小麦、棉花基因组PCR。

图7. 为转基因月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶兰基因组PCR。

图8. 为转基因杨树基因组PCR。

具体实施方式

实施例1

枸杞中牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的克隆

从枸杞新鲜叶片中提取总RNA，利用3’FULLRACE Core Set Ver.2.0(TaKaRa，Japan) 试剂盒将RNA反转录合成cDNA, 具体步骤参照说明书，反应体系如下：

RNA	2μL.
		OligdT	1μL
5×M-MLV Buffer	2μL
		dNTP Mixture	1μL
Rnase Inhibitor	0.25μL
		Reverse Transcriptase M- MLV	0.25μL
Rnase Free ddH₂O	3.5μL

反应条件:42℃，60min；70℃，15min。

根据转录组Unigene序列中枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因LmGGPS2的核苷酸序列设计上游引物LmGGPS-F1:5’-GTCATGTCTATGCTAATAGGTGT-3’， LmGGPS-R1:5’-GGTCAGTTTCTGATGGAGAAATT-3’，以合成的cDNA为模板，PCR反应体系如下：

1 st Strand cDNA	1μL
		LmGGPS2-F1	0.5μL
LmGGPS2-R1	0.5μL
		2.5mM dNTP Mixture	2μL
10×LA Taq PCR buffer	2.5μL
		TaKaRa LA Taq DNA聚合酶	0.25μL
ddH₂O	18.25μL
		Total volume	25μL

一共配置4管反应液，反应条件如下：94℃，4min； 94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，lmin20 Sec；72℃，10min；30个循环。反应后利用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒对PCR反应产物进行纯化，得到纯化的LmGGPS PCR片段，如图1，试剂盒说明书操作。

实施例2

克隆载体pMD18-T-LmGGPS2的构建过程

将序列表所示的LmGGPS2基因与pMD19-T载体连接，反应体系如下:

LmGGPS2全长回收产物	4μL
		pMD18-T载体	1μL
SolutionI	5μL

LmGGPS2 PCR片段为实施例1中的回收的GGPS全长产物。

反应条件:16℃，30min。连接产物转化感受态E-Coli.TOP10，涂布在含有40ml 25mg/ml的X-Gal、16ml50mg/ml 的IPTG、100mg/L Amp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落，菌落PCR法确认T载体中插入片段的长度大小，如图2，与预期一致，将该载体送往华大基因公司测序，我们得到了1074bp的该基因碱基序列，在NCBI进行blast，与茄科同源性高，表明为该基因克隆成功。

实施例3

大肠杆菌表达载体pET28a-LmGGPS2的构建过程

扩大培养实验例2中所获得的含有pMD19-T-LmGGPS2质粒的大肠杆菌，提取质粒，用BamHI和SalI双酶切该质粒，将pET28a空载体用BamHI和SalI双酶切，分别纯化后进行连接，得到大肠杆菌表达载体pET28a- LmGGPS2，将二者的酶切产物连接。

连接体系如下：

pET28a空载体片段	2μL
		pMD19-T-LmGGPS2酶切片段	5μL
5×T4 DNA ligase buffer	2μL
		T4 DNA ligase	1μL

连接产物转化感受态大肠杆菌BL21。涂布于含100mg/L kana抗性的LB平板上，37℃培养。12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，如图3，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pET28a- LmGGPS2构建正确。

实施例4

双元植物表达载体 pCAMBIA2300- LmGGPS2的构建

扩大培养实验例2中所获得的含有pMD19-T-LmGGPS2质粒的大肠杆菌，提取质粒，用BamHI和SalI双酶切该质粒，将 pCAMBIA2300空载体质粒也用BamHI和SalI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接体系如下：

pCAMBIA2300空载体片段	2μL
		pMD19-T-LmGGPS2酶切片段	5μL
5×T4 DNA ligase buffer	2μL
		T4 DNA ligase	1μL

连接产物转化E-Coli.DH5α，涂布于含100mg/L 浓度kana抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，如图4。

实施例5

用于植物转基因的农杆菌工程菌种C58: pCAMBIA2300- LmGGPS2的构建。

农杆菌感受态细胞制备

1. 将农杆菌C58单菌落接种于5mLYEP液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养。

2. 将上述菌液转入l00mLYEP液体培养基中，28℃，180r/min，振荡培养至(OD₆₀₀值约为0.5)。

3. 冰浴30min后，4℃，4000r/min离心l0min，收集菌体，重悬于20mL预冷的H₂O中。

4. 4℃，4000r/min离心10min，收集菌体，重悬于预冷的10%甘油中，每管200μL速冻，存于-80℃备用。

植物表达载体的电击转化

1. 将-80℃取出的C58感受态细胞置于冰上，使其缓慢融化;

2. 加入 4μL质粒，混匀，冰浴5min;

3. 转移至电击杯中;

4. 设置电击转化仪参数 :1500V，0.2s，电击转化;

5. 室温静置2min后加入500μLYEB液体培养基，28℃，180r/min振荡培养3h;

6. 室温4000r/min离心10min，吸出400μL上清液，将剩下的菌液混匀，涂布于含 100mg/L 卡那霉素和100mg/L利福平抗性的YEB平板上，倒置平板，28℃培养，48h，直至看到清晰的单菌落。

7. 挑取单菌落，菌落PCR验证。

实施例6

农杆菌介导的烟草遗传转化

烟草苗的无菌培养：选饱满、健康的烟草种子，用75%乙醇浸泡lmin，25%的安替福明(有效氯2.5%)水溶液灭菌8min，无菌水漂洗三次，将种子放在MS培养基中，25℃光培养，16h/8h光周期。

本实验用到的培养基如下表所示

烟草的农杆菌转化

侵染菌液的制备

1. 挑取阳性农杆菌单菌落，接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃、200r/min的摇床上过夜培养。

2. 次日，取3ml菌液，接种到含100mg/L卡那霉素的50mlYEP液体培养基中，当菌液处于旺盛生长期(OD₆₀₀=0.6-0.9)时，将菌液倒入50ml离心管，在3500r/min，4℃下离心10min，弃上清液，收集菌体。用等量的MS液体培养基重悬，使OD₆₀₀=0.9-1。

外植体浸染

1. 将烟草叶片去除主脉和叶边缘，然后将叶片切成0.5cm×0.5cm大小，浸入制备好的农杆菌菌液，浸泡15-20min，其间摇动2-3次，使叶片充分接触菌液，取出叶片，用无菌的滤纸吸净多余的菌液，叶面朝下、叶背朝上接种于共培培养基中，25℃左右暗培养2天。

2. 将叶片转移至筛选培养基中，20天左右更换一次培养基，诱导抗性芽产生，当抗性芽从愈伤组织上长到1cm左右，从愈伤上切取抗性芽，接种于抗性苗生根培养基中。

转基因苗移栽

将根系生长良好、生命力旺盛的烟草组培苗从组培瓶中取出，用自来水冲洗培养基(尽量减少根系损伤)，种植在蛙石和腐殖土的培养土中，覆盖薄膜保温保湿15天，然后揭开薄膜，定期浇水、施肥，使之在温室中正常生长。

实施例7

转基因烟草分子检测及胡萝卜素含量的测定

转基因烟草基因组DNA的PCR检测:1.CTAB法提取烟草总DNA;2.以基因组DNA为模板行PCR检测，引物为GGPS-F3和GGPS-R-FULL，反应条件: ：94℃，4min； 94℃，30Sec；54℃，30Sec；72℃，lmin10 Sec；72℃，10min；30个循环。取上述PCR产物5μl进行电泳检测，如图5，说明LmGGPS2基因已成功转入烟草。

提取转基因烟草的类胡萝卜素，通过HPLC测定转基因烟草类胡萝卜素含量明显高于野生型烟草，说明该基因在提高类胡萝卜素含量具有重要作用。

实施例8

本实验室通过生长点侵染法对玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、大麦、小麦、棉花等农作物成熟胚转基因(LmGGPS2)，成功获得转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、大麦、小麦、棉花植株，基因组PCR电泳图，如图6，B:阴性对照，1-8分别为玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、大麦、小麦、棉花的基因组PCR。

在温室正常生长的，转基因幼苗和野生型对照苗，分别提取西红柿红素和类胡萝卜素，HPLC测定转基因组幼苗西红柿红素和类胡萝卜素含量明显高于野生型组。不仅如此，转基因组幼苗生长壮硕，野生型生长相对缓慢，生物量相对较少。

实施例9

本实验室利用农杆菌侵染法对月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶兰等花卉进行转基因(LmGGPS1)，获得转基因月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶兰植株，基因组PCR电泳图，如图7，B:阴性对照，1-4分别为月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶兰的基因组PCR。在温室正常生长的转基因花卉苗比野生型生长壮硕，花色鲜艳，花瓣类胡萝卜素含量增高。

实施例10

本实验室利用农杆菌侵染法对杨树等乔木类树木进行转基因（LmGGPS2），获得转基因杨树植株，基因组PCR电泳图，为杨树基因组PCR，如图8。

在温室正常生长的转基因树苗和野生型对照苗，转基因植株比野生型植株生长好，转基因植株西红柿红素和类胡萝卜素含量比野生型植株明显增高。

序列表

<110> 天津大学

<120> 枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因及其编码的蛋白质和应用

<130> 20131025

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1246

<212> DNA

<213> 人工系列

<220>

<221> gene

<222> (1)..(1246)

<400> 1

gtcatgtcta tgctaatagg tgtaatccac aatcttgcaa gaggtactat aaatagatcc 60

agatctgcag gaacaaagtt gcttctttct tcagaggaaa caccagaagc tctattgttc 120

ctcccaaaag caagaacctt ttgtaatagc aaagatgttt ccaagaatga ggctgaagtt 180

atcaaacatg aaaacacatt cagacaagct ggtgtatttg atttcaaaag ttacatgctt 240

caaaagatca agtctgtcaa tacagcctta gatgctgctg tcccaatcag agaaccaatc 300

aagttccatg aagcaatgag atattcgctc ctttctgaag gtaagcgggt ttgtcctgta 360

ctctgcatag ccacctgtga gcttgttggt ggccaagaat caacagcaat gcctgctgct 420

tgcggaatgg agatgataca tgctatgtgt atgatgcacg acgaccttcc gtgcatggac 480

aatgatgatc tccgtcgagg aaagttgtca catcacaagg tttatggcga aaatgtcact 540

gttctagctg gttattccct tgttgcctta gcatttgagc atatcgcaat agccactaaa 600

ggggtccacc cgaaaacaat ggttcgtgct gttggagaac tagcaagatt gataggacca 660

gagggggcga cagctggcca ggtggttgac ttgctgtgtg gaggtaaatc gggtaccaga 720

ttagaagagc tcgagtatat tcatcgtcac aagacagcgg actttgcaga ggcagcgtcc 780

attgtaggag caattcttgg tggtgcttcc gaggatgaga ttaatagact taggaaattc 840

tcccagtgta ttgggctgct gtttcaggtt gtggatgaca ttcttgatgt gactaaatcc 900

tctgagcaat taggaaagac agcagggaag gatttgttgg ctaacaagtt gacgtacccg 960

aagatgattg gcattgacaa gtctaaaaaa tatgctcaaa aacttagcaa ggaggctaag 1020

gagcagcttg tcggttttga tccagaaaag gcagctccac tactttctat ggcggatttc 1080

gttcttcatc ggcaaaaatg atctccttag gatgataata cctgtactat ttaacattag 1140

ttgtgcgcat ttatgtaagg acataggagg gagtgaagct attccagttc cttgagatat 1200

atcaggaaat atggttgctg cttaatttct ccatcagaaa ctgacc 1246

<210> 2

<211> 365

<212> PRT

<213> MUTAGEN

<220>

<221> MUTAGEN

<222> (1)..(365)

<400> 2

Met Ser Met Leu Ile Gly Val Ile His Asn Leu Ala Arg Gly Thr Ile

1 5 10 15

Asn Arg Ser Arg Ser Ala Gly Thr Lys Leu Leu Leu Ser Ser Glu Glu

20 25 30

Thr Pro Glu Ala Leu Leu Phe Leu Pro Lys Ala Arg Thr Phe Cys Asn

35 40 45

Ser Lys Asp Val Ser Lys Asn Glu Ala Glu Val Ile Lys His Glu Asn

50 55 60

Thr Phe Arg Gln Ala Gly Val Phe Asp Phe Lys Ser Tyr Met Leu Gln

65 70 75 80

Lys Ile Lys Ser Val Asn Thr Ala Leu Asp Ala Ala Val Pro Ile Arg

85 90 95

Glu Pro Ile Lys Phe His Glu Ala Met Arg Tyr Ser Leu Leu Ser Glu

100 105 110

Gly Lys Arg Val Cys Pro Val Leu Cys Ile Ala Thr Cys Glu Leu Val

115 120 125

Gly Gly Gln Glu Ser Thr Ala Met Pro Ala Ala Cys Gly Met Glu Met

130 135 140

Ile His Ala Met Cys Met Met His Asp Asp Leu Pro Cys Met Asp Asn

145 150 155 160

Asp Asp Leu Arg Arg Gly Lys Leu Ser His His Lys Val Tyr Gly Glu

165 170 175

Asn Val Thr Val Leu Ala Gly Tyr Ser Leu Val Ala Leu Ala Phe Glu

180 185 190

His Ile Ala Ile Ala Thr Lys Gly Val His Pro Lys Thr Met Val Arg

195 200 205

Ala Val Gly Glu Leu Ala Arg Leu Ile Gly Pro Glu Gly Ala Thr Ala

210 215 220

Gly Gln Val Val Asp Leu Leu Cys Gly Gly Lys Ser Gly Thr Arg Leu

225 230 235 240

Glu Glu Leu Glu Tyr Ile His Arg His Lys Thr Ala Asp Phe Ala Glu

245 250 255

Ala Ala Ser Ile Val Gly Ala Ile Leu Gly Gly Ala Ser Glu Asp Glu

260 265 270

Ile Asn Arg Leu Arg Lys Phe Ser Gln Cys Ile Gly Leu Leu Phe Gln

275 280 285

Val Val Asp Asp Ile Leu Asp Val Thr Lys Ser Ser Glu Gln Leu Gly

290 295 300

Lys Thr Ala Gly Lys Asp Leu Leu Ala Asn Lys Leu Thr Tyr Pro Lys

305 310 315 320

Met Ile Gly Ile Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Ala Gln Lys Leu Ser Lys

325 330 335

Glu Ala Lys Glu Gln Leu Val Gly Phe Asp Pro Glu Lys Ala Ala Pro

340 345 350

Leu Leu Ser Met Ala Asp Phe Val Leu His Arg Gln Lys

355 360 365

。

Claims

1.一个枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因编码的蛋白质，其特征在于所述的蛋白质为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

3. 一种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因的全序列或部分片段。

4. 一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-LmGGPS。

5. 一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是重组植物表达载体pCAMBIA2300-LmGGPS。

6. 一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求1所述的牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因全序列或部分片段。

7. 一种权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于它是农杆菌细胞，烟草细胞。

8. 一种权利要求1所述的枸杞牦牛儿基牦牛儿焦磷酸合成酶基因应用于制备转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜植株。