CN105420248A - 花青苷调控基因PyMYB10.2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种植物花青苷调控基因PyMYB10.2，以及其在调控植物花青苷合成中的应用。本发明所提供的花青苷调控基因来源于梨，具体品种为“早红酥”，克隆到的基因命名为PyMYB10.2。本发明包括(1)克隆一个花青苷调控基因PyMYB10.2；(2)提供该基因及其编码蛋白的序列；(3)提供将该基因转入烟草或拟南芥中的转基因方法；(4)提供该基因在调控植物花青苷合成中的应用。通过对PyMYB10.2的研究，可对该类基因进行挖掘，研究其花青苷调控机理，有利于了解梨花青苷合成调控的分子基础。同时，本申请提供的应用在关于花青苷的科研和农业研究中具有深入挖掘的前景。

Description

花青苷调控基因PyMYB10.2及其应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种植物花青苷调控基因PyMYB10.2及其应用。

背景技术

花青苷是一类水溶性类黄酮物质，广泛存在于植物中，是叶、花和果实呈色的主要色素成分。花青苷对植物本身具有重要的生理作用，可以提升植物对盐胁迫、干旱胁迫和紫外线胁迫的抗性；花瓣和果实中的花青苷可以吸引动物进行授粉和种子传播。除此之外，花青苷还具有重要的医疗保健功能，可以改善肝功能、预防心血管疾病、抗癌、抗炎、抗氧化和保护视力等。因此，对花青苷的相关研究，尤其是花青苷的合成调控研究引起了人们极大的关注，也是目前研究的一个热点。

花青苷合成途径是植物中研究最为清楚的次生代谢途径。参与花青苷合成的基因分为结构基因和调控基因两大类。其中，结构基因编码花青苷合成酶，调控基因编码花青苷调控蛋白。越来越多的研究表明花青苷的合成主要受转录水平的调控，花青苷结构基因之间的表达存在一定的协同效应，其表达强度和模式受调控基因的控制。由此可见，调控基因在花青苷合成中发挥十分关键的作用。因此，发掘和鉴定花青苷调控基因，开展花青苷调控基因克隆和作用机理等方面的研究，对实现植物花青苷含量的定向改良，具有十分重要的理论意义和应用价值。

MYB是植物中最大的一类转录因子，根据含有MYB结构域的个数，可以将其分为R1-MYB，R2R3-MYB和R1R2R3-MYB三类。其中R2R3-MYB是植物中数目最多的一类MYB转录因子，它们在植物生命活动中发挥重要的作用，如调控细胞分化、形态建成、环境应答和次生代谢等。自从1987年Paz-Ares首次报道玉米花青苷调控R2R3-MYB转录因子Cl以来，相继从拟南芥、苹果、葡萄等十几种植物中克隆鉴定了花青苷调控R2R3-MYB转录因子，发现这些转录因子可以单独或与bHLH、WD40形成蛋白复合体共同控制结构基因的时空表达，在花青苷合成调控中起中心作用。通过基因工程手段，已经将花青苷调控R2R3-MYB转录因子成功应用于改良花色，提升蔬菜水果中花青苷的含量等作物育种领域。另外，这类基因还可以作为植物遗传转化的报告基因加以利用。

富含花青苷的红梨资源稀少珍贵，鉴于花青苷在呈色和营养保健上的重要功能，近几年人们提出了梨花青苷含量改良的育种目标。随着国内外红梨新品种的选育和推广，人们开始了梨花青苷合成调控的基础生物学研究。但是，R2R3-MYB类花青苷调控基因在梨中的研究还比较少，对该类基因进行挖掘，研究其花青苷调控机理，有利于了解梨花青苷合成调控的分子基础。

发明内容

本发明的目的是提供一种花青苷调控基因PyMYB10.2，以及其在调控植物花青苷合成中的应用。本发明所提供的花青苷调控基因来源于梨(Pyrusspp)，具体品种为“早红酥”，克隆到的基因命名为PyMYB10.2。本发明包括(1)克隆一个花青苷调控基因PyMYB10.2；(2)提供该基因及其编码蛋白的序列；(3)提供将该基因转入烟草或拟南芥中的转基因方法；(4)提供该基因在调控植物花青苷合成中的应用。

一种花青苷调控基因PyMYB10.2，所述调控基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

应当理解，本领域人员可根据本发明公开的花青苷调控基因PyMYB10.2的核苷酸序列(SEQIDNO:1)，在保证其活性的前提下，取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸，得到该基因的突变序列。因此，本发明的花青苷调控基因PyMYB10.2还包括SEQIDNO:1所示的核苷酸序列经取代、缺失和/或添加一个或几个核苷酸残基，具有与花青苷调控基因PyMYB10.2编码的蛋白相同活性的由PyMYB10.2衍生得到的基因。SEQIDNO:1所示的核苷酸序列是由855个核苷酸组成的基因。

本发明还提供上述编码权利要求所述的PyMYB10.2基因编码的蛋白。所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

SEQIDNO:2所示的氨基酸序列是由284个氨基酸残基组成的蛋白质。

含有权利要求1所述基因的重组质粒。

可选的，如上所述的重组质粒，所述质粒为pMD18-T、pBI121或pGreenII62-SK。

本发明的一个实施例中，将核苷酸序列为SEQIDNO:1的基因片段链接到克隆载体PMD-18T中；再通过限制酶剪切并连接到表达载体pBI121中构建重组质粒。

含有权利要求3或4所述重组质粒的宿主细胞。

可选的，所述宿主细胞为大肠杆菌和农杆菌GV3101。

一种将权利要求1中所述基因转入烟草中的转基因方法，包括以下步骤：

1)、提取梨总基因组DNA作为模板，以SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物进行扩增；

2)、将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO:1的基因片段定向克隆到pGreenII62-SK上，得到重组质粒；

3)、将所述重组质粒转化至农杆菌GV3101后用所述农杆菌GV3101对烟草进行侵染转化，得到转基因烟草。

一种将权利要求1中所述基因转入拟南芥中的转基因方法，包括以下步骤：

1)、提取梨总基因组DNA作为模板，以SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物进行扩增；

2)、将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO:1的基因片段定向克隆到pBI121上，得到重组质粒；

3)、将所述重组质粒转化至农杆菌GV3101中，随后用所述农杆菌GV3101对拟南芥进行侵染转化，得到转基因拟南芥。

可选的，如上所述的拟南芥转基因方法，步骤2)具体包括：

将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO:1的基因片段定向克隆到pMD18-T克隆载体中，对所述克隆载体进行扩增；将PyMYB10.2基因片段从克隆载体上酶切下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的表达载体pBI121上，得到重组质粒。

本申请先将目的片段连接到克隆载体上，再酶切并与表达载体连接。此操作有主要两方面的原因：

进克隆载体比进表达载体容易很多，可以尽快拿到目的片段，一旦克隆不成功，或者因为Taq酶的错配出现了碱基突变，会需要重复几次，样本即耗材都会大量消耗；

克隆载体的最大优点是它一般都有成熟的筛选系统，这样在一些连接效率较低、特异性不强的时候容易筛选。

同时可选的，对所述克隆载体进行扩增时，所用的宿主细胞为大肠杆菌DH5α。

权利要求1所述的基因在调控植物花青苷合成中的应用。

本领域技术人员可知，基于此应用可拓展出其他应用，如开展花青苷调控基因克隆和作用机理等方面的研究，对实现植物花青苷含量的定向改良、改良花色、提升蔬菜水果中花青苷的含量、作为植物遗传转化的报告基因等等。

所述植物可以为烟草和拟南芥，但本申请所述的应用范围包括不仅限于这两种植物。

与现有技术相比，本发明的有益效果为：

1)、R2R3-MYB类花青苷调控基因在梨中的研究还比较少，本发明提供了一种植物花青苷调控基因PyMYB10.2，该基因与已知调控转录因子的同源性均低于50％，和bHLH转录因子在调控花青苷结构基因的表达过程中存在协同效应，可为相关研究提供新的思路。

2)、本申请提供的应用在关于花青苷的科研和农业研究中具有深入挖掘的前景。可在本申请提供的转基因方法和应用的基础上，进一步进行改良花色、作为植物遗传转化的报告基因、提升蔬菜水果中花青苷的含量等应用。大大增加了花青苷的应用前景。

附图说明

图1为构建的PyMYB10.2与其它R2R3-MYB转录因子的进化树；

图2为PyMYB10.2对花青苷结构基因AtDFR启动子的调控活性的统计结果，纵坐标为荧火虫荧光素酶(fireflyluciferase)和海肾萤光素酶(renillaluciferase)活性比值；

图3为瞬时表达烟草的表型观察示意图；叶片上的深灰色斑点为侵染激活载体农杆菌的烟草温室培养8天后形成的大量花青苷积累。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。

实施例1

本实施例提供了PyMYB10.2基因的克隆方法。

S11：采用多糖多酚RNA提取试剂盒进行“早红酥”叶片总RNA提取

取50mg新鲜叶片，在液氮中研磨成粉末，转移至1.5ml离心管中，添加500μLSL(含25μLβ-巯基乙醇)，经过去蛋白、除DNA和漂洗，最后溶解至500μLddH₂O中。

利用1％浓度的琼脂糖检测RNA的完整性，利用紫外分光光度计测定230nm、260nm和280nm波长下RNA的吸光值，确定RNA的浓度和纯度。

S12：RACE-PCR

取1-5μg的总RNA，按照SMARTRACEcDNAAmplificationKit(Clontech)的说明书进行反转录，将反应液稀释10倍作为RACE-PCR的模板。

根据已知花青苷调控R2R3-MYB转录因子保守区设计兼并引物(F：5’-TGYATHRAYAARTAYGGIGARGGIAARTGG-3’，R：5’-GTRTTCCARTARTTYTTIACRTCRTTNGC-3’)。

PCR反应体系：总体积50μL，包括cDNA模板2μL，0.2mMdNTP，1μM兼并引物，1×ExTaqBuffer，1UExTaq(Takara)。

反应程序为：

①94℃2min

②94℃30s

③45℃30s

④72℃1min

⑤goto②③④for35个循环

⑥72℃5min

⑦4℃保存

PCR产物纯化回收，片段大小约为250bp。

将回收片段连接至pMD18-T(Takara)克隆载体，转化至DH5α中，在含氨苄青霉素的LB培养基培养(LB培养基的配方为：1L培养基中含有10g胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g氯化钠和12g琼脂)，取阳性克隆送上海生物工程有限公司测序。将测序结果进行BLAST分析，选择与已知花青苷调R2R3-MYB转录因子同源性高的序列进行RACE-PCR扩增。

用于3’RACE的引物为F：GCACTTCGTTCAACAGCATGGTG，用于5’RACE的引物为R：CCTACTAGTTTGCGAAGTCTGATC，UPM通用引物由RACE试剂盒提供。按照SMARTRACEcDNAAmplificationKit的说明书进行5’和3’RACEPCR扩增。将获得的PCR产物纯化回收、克隆测序。对5’和3’序列进行比对拼接。设计特异引物F：ATGGAAGAGCGTAATTCGTTGGGAG，R：TCAAATACATGCTTTTGAGTTGTTC，扩增基因全长。

PCR反应体系总体积50μL，包括2μLcDNA模板，0.2mMdNTP，1μM特异引物，5μLTaqBuffer，1UTaq酶(Takara)。反应程序为：

①94℃2min

②94℃30s

③56℃30s

④72℃1min

⑤goto②③④for35个循环

⑥72℃10min

⑦4℃保存

PCR产物纯化回收，克隆测序。利用NCBIORFfinder确定获得的基因具有完整的开放读码框(序列为SEQIDNO:1)，并推导出其编码的氨基酸序列(序列为SEQIDNO:2)。

S13、序列比对分析

对分离的基因序列进行序列分析，发现该序列含有保守的R2R3-MYB结构域，在R3-MYB结构域中有bHLH结合域。Blastx分析发现它与花青苷调控R2R3-MYB转录因子同源性最高，与AtMYB90有39％的相似性，与PyMYB10和PyMYB10.1的相似性分别为32.7％和43.4％。认为分离了PyMYB10新的同源基因，命名为PyMYB10.2。进化树将PyMYB10.2与花青苷调控R2R3-MYB转录因子聚为一类(如图1所示)。

实施例2

为了检测PyMYB10.2对花青苷结构基因AtDFR是否具有调控能力，本申请在实施例2中提供了双荧光素酶检测试验。

本试验使用的转录因子为梨PyMYB10.2、拟南芥AtbHLH2和杨梅MrbHLH1，使用的启动子为拟南芥AtDFR(Tairaccession:AT5G42800)。

S21、报告载体的构建

利用DNA提取试剂盒(Tiangen)提取哥伦比亚生态型拟南芥的基因组DNA，以提取的基因组DNA为模板扩增AtDFR的启动子，引物为：

F:GAGATTGGCACCACCTTCGCCTC；

R:TTTTGTGGTTATATGATAGATTGTGCT。

将AtDFR的启动子连接至pMD18-T(Takara)克隆载体，转化至DH5α中，在含氨苄青霉素的LB培养基上挑取阳性克隆，进行测序。将测序正确的克隆提取质粒，SacI和KpnI双酶切。将双酶切后的AtDFR启动子克隆至报告载体pGreenII0800-LUC中，进行重组质粒的酶切鉴定和测序鉴定，提取序列正确的重组质粒存放至-20℃备用。

S22、激活载体的构建

克隆梨PyMYB10.2、拟南芥AtbHLH2和杨梅MrbHLH1的ORF序列，所用引物如下：

PyMYB10.2.F:SEQIDNO:3，PyMYB10.2.R:SEQIDNO:4；

AtbHLH2.F:ATGAGCTCATGGCAACCGGAGAAAACAG，AtbHLH2.R:GCGGTACCTTAACATATCCATGCAACCC；

MrbHLH1.F:TAGAATTCATGGCTGCACCGCCGAGTAGC，MrbHLH1.R:CGAAGCTTCTACGAGTCATTGTGGGGTAT。

将扩增PCR产物进行纯化、回收测序。挑选测序正确的克隆提取质粒，然后利用SacI/KpnI双酶切将PyMYB10.2和AtbHLH2克隆至激活载体pGreenII62-SK中，利用EcoRI/HindIII双酶切将MrbHLH1克隆至pGreenII62-SK载体中，并对重组质粒进行酶切和测序鉴定序列的正确性。最后通过利用电击转化方法将构建好的载体导入农杆菌GV3101中。在添加25mg/L利福平(Rifampicin)和25mg/L庆大霉素(Gentamicin)以及50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的YEP培养基上进行抗性筛选，通过PCR对抗性农杆菌进行鉴定。将转化成功的农杆菌保存在-20℃或-80℃备用。

S23、转基因烟草的构建

农杆菌侵染的烟草材料为本式烟草，具体的侵染方法如下：烟草种植在温室中，温室的条件为平均光强为100μmolm^-2s^-1，光照/黑暗的时数为16h/8h，温度为25℃。同时播种且至少含有6片叶片的成熟烟草用于瞬时表达，选择幼嫩的叶片作为侵染对象。制备农杆菌侵染夜，将含有构建好表达载体的GV3101单克隆挑至含有50mg/L卡那霉素(Kanamycin)液体YEP中，28℃过夜培养。取出部分农杆菌培养液与10mMMgCl₂和0.5μM乙酰丁香酮混合，调整OD至0.2，室温放置2h后即可进行侵染。含有报告载体的农杆菌与含有激活载体的农杆菌菌液按体积比1：9的比例混合，取300μL的农杆菌混合液针注射到烟草幼叶上，每个叶片上注射2～3个点。侵染后3d，利用双荧光素酶检测试剂盒(promega公司)测定萤火虫荧光素酶(fireflyluciferase)和海肾荧光素酶(renillaluciferase)的酶活性。方法为：取大小为2cm左右的烟草叶片，放在500μL裂解液中研磨，取5μL的粗提液(稀释100倍)与40μLluciferaseassaybuffer混合，利用OrionMieroplateLuminomete(BertholdNetectionSystem)测定荧光强度，然后再加40μLStopandGlowbuffer，测定荧光强度，Luc/Ren的比值作为衡量转录因子对AtDFR启动子调控能力的指标。以仅侵染AtDFR启动子报告载体农杆菌的烟草作为对照，每个处理设置3个重复。试验结果表明PyMYB10.2能够调控AtDFR启动子活性，在花青苷调控相关bHLH存在时，大大增强PyMYB10.2的调控功能，在所有组合中，以PyMYB10.2-AtbHLH2的激活活性最大(统计结果如图2所示)。由此可见，PyMYB10.2和bHLH转录因子在调控花青苷结构基因的表达过程中存在协同效应。

侵染激活载体农杆菌的烟草温室培养8天后，观察注射区域颜色的变化并拍照。发现PyMYB10.2-AtbHLH2注射区域有花青苷的积累最多(如图3所示)。

实施例3

为进一步验证PyMYB10.2基因的花青苷调控功能，本发明在实施例3中进一步提供了PyMYB10.2的转基因试验。具体来说是将PyMYB10.2过量表达于拟南芥中，观察转基因拟南芥表型的变化。

S31：PyMYB10.2过表达载体的构建

将5’含有BamHI，3’含有SacI酶切位点的PyMYB10.2连接至克隆载体pMD18-T(Takara)中，转化至大肠杆菌DH5α中，挑取阳性克隆测序。利用BamHI/SacI双酶切将PyMYB10.2的序列克隆至过量表达载体pBI121中，通过测序鉴定重组质粒的正确性。最后利用电击转化方法将构建好的载体导入农杆菌GV3101中，在添加25mg/L利福平(Rifampicin)和50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的YEP培养基上进行抗性筛选，通过PCR对抗性农杆菌进行鉴定。最后分别将含有35s：PyMYB10.2表达载体和空载体存放至-20℃备用。

S32：对拟南芥进行农杆菌侵染转化:

侵染的拟南芥为哥伦比亚生态型，在温室内培养。培养条件为光强为120-150μmolm^-2s^-1，光照/黑暗的时数为16h/8h，温度为25℃。待拟南芥花序抽苔约1cm时，将主花序的顶端剪掉，以诱导侧花序的生成。在侧花序生长至花蕾期时，进行农杆菌侵染。应在转化前一天进行农杆菌的准备，含有35s：PyMYB10.2表达载体和空载体的农杆菌各取5ml，在添加25mg/L利福平(Rifampicin)和50mg/L卡那霉素(Kanamycin)的YEP培养液中进行活化，取1-3mL活化后的菌液加到200-600mL含抗生素的YEP培养液中过夜培养。农杆菌活化培养的温度为28℃。第二天，室温下5000-6000rpm离心5-8min收集菌体，用侵染夜悬浮(5％蔗糖+0.05％SilwetL-77)，最后将侵染夜的OD值调整为0.8，PH调整为5.8。将拟南芥的花序完全浸到浸染液中，放入真空泵，抽真空1min，缓慢放气，重复一次再抽30s，放气。然后将侵染后的拟南芥放到箱子里，移至温室中，覆膜黑暗培养一天。第二天取出放到光下继续生长。根据浸染过的植株的长势，隔5-7天再浸一次，可重复侵染3次。后几次浸染不必抽真空。一个月后收种子，将种子放在4℃条件下保存。

S33、转基因拟南芥筛选鉴定

先将T₀代收获的种子进行消毒处理，消毒程序为75％酒精消毒2-3min，然后用2.6％NaClO消毒10min，再用无菌水冲洗3-4次。将消毒后的拟南芥种子平铺至含100mg/LKan抗生素的培养基上进行筛选。选择Kan筛选后生长良好的植株进行培养，提取DNA进行PCR鉴定。将获得的T₀代阳性植株收种子，播种获得T₁代植株，提取DNA再次进行PCR鉴定，对阳性植株进行表型观察。发现T₁阳性植株幼苗有红色、紫红色表型，意味着有大量花青苷的积累。但是，生长状态不是很好，所以我们选取生长状态好的T1代阳性植株作为观察对象，值得注意的是这些植物主要营养器官的表型未发现特别的变化，而未成熟种子有红色表型的变化，表明有花青苷的积累。转化空载体的拟南芥未出现这样的现象，表明PyMYB10.2能调控花青苷的合成。

综上所述，本申请根据已知花青苷调控R2R3-MYB转录因子保守区域设计兼并引物，以“早红酥”梨叶片总RNA反转录得到的cDNA为模板，进行PCR扩增。筛选与花青苷调控R2R3-MYB转录因子同源性高的基因片段进行RACE-PCR扩增，获得cDNA全长。通过与拟南芥、梨中的R2R3-MYB转录因子Blast比对分析，发现它与拟南芥AtMYB90、梨PyMYB10和PyMYB10.1具有很高的同源性。其中，与PyMYB10和PyMYB10.1的相似性分别为32.7％和43.4％，该基因被命名为PyMYB10.2，其核苷酸序列为SEQIDNO:1所示，其编码的氨基酸序列为SEQIDNO:2所示。PyMYB10.2含有R2R3-MYB结构域和bHLH结合域，并与花青苷调控R2R3-MYB转录因子聚为一类。利用双荧光素酶检测试验分析，发现PyMYB10.2可以激活花青苷结构基因二氢黄酮醇还原酶基因(AtDFR)的表达，在花青苷调控相关bHLH转录因子存在时，大幅增强PyMYB10.2的调控能力。

利用酶切、连接技术将PyMYB10.2连入含有CaMV35S强启动子的表达载体中。在烟草或拟南芥中过量表达PyMYB10.2基因，发现超表达PyMYB10.2基因的材料积累大量的花青苷。说明PyMYB10.2具有花青苷调控功能。

尽管已用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以作出许多其它的更改和修改。因此，这意味着在所附权利要求中包括属于本发明范围内的所有这些变化和修改。

Claims (10)

1.一种花青苷调控基因PyMYB10.2，其特征在于，所述调控基因的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示。

2.权利要求1所述的花青苷调控基因PyMYB10.2编码的蛋白，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO:2所示。

3.含有权利要求1所述基因的重组质粒。

4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述质粒为pMD18-T、pBI121、pGreenII62-SK。

5.含有权利要求3或4所述重组质粒的宿主细胞。

6.权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌和农杆菌GV3101。

7.一种将权利要求1中所述基因转入烟草中的转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、提取梨总基因组DNA作为模板，以SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物进行扩增；

2)、将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO:1的基因片段定向克隆到pGreenII62-SK上，得到重组质粒；

3)、将所述重组质粒转化至农杆菌GV3101后用所述农杆菌GV3101对烟草进行侵染转化，得到转基因烟草。

8.一种将权利要求1中所述基因转入拟南芥中的转基因方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)、提取梨总基因组DNA作为模板，以SEQIDNO:3、SEQIDNO:4所示核苷酸序列的引物进行扩增；

2)、将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO:1的基因片段定向克隆到pBI121上，得到重组质粒；

3)、将所述重组质粒转化至农杆菌GV3101中，随后用所述农杆菌GV3101对拟南芥进行侵染转化，得到转基因拟南芥。

9.如权利要求8所述的转基因方法，其特征在于，步骤2)具体包括：

将扩增PCR产物进行纯化并将核苷酸序列为SEQIDNO:1的基因片段定向克隆到pMD18-T克隆载体中，对所述克隆载体进行扩增；将PyMYB10.2基因片段从克隆载体上酶切下来，连接到经过相同限制性内切酶切割的表达载体pBI121上，得到重组质粒。

10.权利要求1所述的基因在调控植物花青苷合成中的应用。