CN105255914A

CN105255914A - 枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶及增强植物耐盐碱应用

Info

Publication number: CN105255914A
Application number: CN201510827033.8A
Authority: CN
Inventors: 季静; 王罡; 吴电云; 金超; 宋馨宇
Original assignee: Tianjin University
Current assignee: Tianjin University
Priority date: 2015-11-25
Filing date: 2015-11-25
Publication date: 2016-01-20

Abstract

本发明涉及一种枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶及其在增强植物耐盐碱能力方面的应用。通过提取新鲜枸杞叶片中的总RNA，利用3’RACE方法克隆枸杞中的有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因LmMAPKK，得到基因完整的序列为1074bp；构建了大肠杆菌表达载体pET28a-LmMAPKK，通过大肠杆菌异源表达系统，得到了39KD大小的LmMAPKK表达蛋白；并构建了双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmMAPKK，电击法将载体转入农杆菌C58细胞，用这种细胞转化烟草，得到转基因烟草，通过测试，发现转基因烟草对盐碱、低温及病原菌侵染的抗性大大提高，对玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、大麦、小麦、棉花等农作物；月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶兰等花卉；杨树、香花槐等乔木类树木转基因，发现其转基因植株耐盐碱能力大大提高。

Description

枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶及增强植物耐盐碱应用

技术领域

本发明涉及一种枸杞(LyCiumChinenseMiller)中有丝分裂原活化蛋白激酶激酶及其在增强植物耐盐碱能力方面的应用，具体为枸杞中有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK）的克隆、重组及应用。

背景技术

植物在生长发育过程中不断遭受各种生物及非生物的胁迫。如干旱、盐碱、寒冷、高温及病原菌的侵染等，与能移动的动物不同，植物在长期进化过程中发展起一套完善和适合其自身需要的信号转导系统以适应环境变化，更好地生存。植物受到刺激后，会产生物理或化学信号，这些信号到达靶细胞后转换成胞内信号，并启动细胞内各种信号转导系统，继而对原初信号进行级联放大，使一些基因的表达受逆境调控，最终导致生理生化变化，增强机体对逆境的胁迫抗性，其中促分裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases，MAPK)级联途径是信号从细胞表面传递到细胞核内部的重要途径。

MAPK级联途径包括三种蛋白激酶：即MAPKKK、MAPKK和MAPK。它们以逐级磷酸化的方式构成信号放大途径，特异性的感受上游刺激，并将信号放大向下传递给靶蛋白。在植物中，MAPK级联途径参与植物的生长发育及病原物侵染、机械伤害、触摸、低温、高盐、渗透胁迫以及活性氧胁迫等各种响应(Popescuetal.,2009)。

植物对干旱和高盐等逆境的抗性是受多基因控制的一个复杂的过程，而这些抗逆基因的表达多是受逆境环境调控的，当植物感受到外界的生物、非生物胁迫信号时，机体的逆境调控的抗逆相关基因才会表达，所以将外界的刺激信号有效地传递到细胞内，是提高植物抗逆性的关键步骤。MAPK级联途径可将细胞外信号有效地传递到细胞内，在多层次上调控抗逆基因的表达，如磷酸化水平、转录水平、转录后可变剪接等。因此利用MAPK级联途径增强植物抗逆性成为改良植物抗逆性的重要途径。在抗逆基因工程领域，MAPK级联途径一直备受关注，研究者们通过转基因手段将MAPK级联途径中的相关基因导入植物基因组中，得到了许多抗性增强的转基因品种。

MAPKK（mitogen-activatedproteinkinasekinase）基因是MAPK级联途径中间的一个基因，人们从拟南芥、水稻、白杨等多种植物中发现了大量MAPK家族成员，研究发现，在MAPKKKs、MAPKKs和MAPKs三种蛋白激酶中，MAPKKs的数量最少，接近MAPKs的二分之一，且MAPKK所处MAPK级联途径的中间，在细胞信号传导过程中起着举足轻重的作用。根据MAPK氨基酸序列中Ser/Thr保守亚结构域的特征和已揭示的功能，制订了一套分类命名法。将植物MAPKKs分为A、B、C、D四组(Hameletal.,2006)，其中拟南芥的MKK1、MKK2和MKK6都属于A类，MKK1/MKK2-MPK4/MPK6级联在高盐、冷胁迫以及对病原菌的应急防疫上起很大的作用。通过CLUSTALX比对发现，LmMAPKK属于A类，通过农杆菌介导的转基因方法，在转基因烟草中验证其功能。发现该基因能够有效地提高植物的抗盐、抗低温及病原菌侵染的能力。

发明内容

本发明的目的在于提供一种枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因(LmMAPKK)。

本发明的第二个目的是提供该基因编码的蛋白质。

本发明的目的还在于提供含有该基因的重组载体和宿主细胞。

本发明的另一个目的在于提供该基因的用途。

本发明提供的一种枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK），如序列表中SEQIDNo.1所示的核苷酸序列构成。

本发明提供的一种枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK）编码的蛋白质，如序列表中SEQIDNo.2所示的氨基酸序列的蛋白质。

本发明提供的一种枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK）的重组克隆载体pMD18-T-LmMAPKK。

含有上述的枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK）的重组载体，这些重组载体包括质粒。

所述的质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-LmMAPKK。

所述的质粒表达载体双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmMAPKK。

含有上述枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK）的完整编码阅读框序列的宿主细胞，如含有上述重组载体的宿主细胞也属于本发明的保护范围。

所述的宿主细胞选自大肠杆菌细胞、农杆菌细胞或烟草细胞。

本发明提供了一种含有LmMAPKK基因的工程菌。

上述枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因（LmMAPKK）的应用包括该基因编码的蛋白在植物中的应用；用所述的重组载体，如植物表达载体转化玉米细胞；或者用所述含有该基因的农杆菌与玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、马铃薯、棉花、谷子、大麦以及花卉和蔬菜等细胞共培养，得到转基因的再生植株；或者用所述的LmMAPKK遗传转化获得上述物种转基因植株。

本发明的技术方案具体概述如下：

本发明的克隆方法由下述步骤组成：

从枸杞新鲜叶片中提取总RNA，根据转录组Unigene序列中枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因的核苷酸序列设计上游引物LmMAPKKF:5’ATGAAGAAAGGATCTTTTGCTCCTAATC-3’，然后利用3’RACE方法扩增得到完整的基因序列为1074bp。

本发明构建含有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因LmMAPKK的大肠杆菌表达载体pET28a-LmMAPKK和植物表达载体pCAMBIA2300-LmMAPKK，由下述步骤组成：

1）构建含有有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因的中间载体pMD18-T-LmMAPKK。

设计由SEQIDNO.3所示的上游引物P1（P1：atgaagaaaggatcttttgctcctaatc），设计由SEQIDNO.4所示的下游引物P2（P2：taccgtcgttccactagtgattt），以枸杞cDNA为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物连接于pMD18-T载体，获得含有序列表中SEQIDNO.1所示的LmMAPKK基因的中间载体pMD18-T-LmMAPKK。

2）构建大肠杆菌表达载体pET28a-LmMAPKK

设计由SEQIDNO.5所示的上游引物P3（P3:cgcggatccatgaagaaaggatcttttgctcctaatc），设计由SEQIDNO.6所示的下游引物P4（P4：acgcgtcgacaattatagctcattgagtgttgcca），以pMD18-T-LmMAPKK为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物用BamHI和SalI双酶切，将pET28a空载体用BamHI和SalI双酶切，分别纯化后进行连接，得到大肠杆菌表达载体pET28a-LmMAPKK。

3）构建植物表达载体pCAMBIA2300-LmMAPKK

设计由SEQIDNO.5所示的上游引物P3，设计由SEQIDNO.6所示的下游引物P4，以pMD18-T-LmMAPKK为模板，进行PCR扩增，将PCR扩增产物用BamHI和SalI双酶切，将pCAMBIA2300-35S-OCS空载体用BamHI和SalI双酶切，分别纯化后进行连接，得到植物表达载体pCAMBIA2300-LmMAPKK。

本发明提供了一种枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因及包括该基因的重组载体和宿主细胞及应用，首次从枸杞中分离出编码有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因的完整cDNA，连接到大肠杆菌表达载体上，利用外源表达系统验证枸杞LmMAPKK基因的表达蛋白；然后连接到植物表达载体上，利用农杆菌侵染法转化烟草，获得转基因植株，对转基因植株进行了抗逆性分析，结果表明转基因烟草的盐碱，低温及病原菌侵染的抗性能力得到很大提高，即本发明在增强植物耐盐碱能力等方面具有广泛应用。

附图说明

图1.用P1、P2引物对枸杞cDNA的PCR电泳图。

图2.LmMAPKK连接pMD18-T载体的PCR验证结果。

图3.pMD18-T-LmMAPKK载体示意图。

图4.LmMAPKK连接pET-28a载体的PCR验证结果。

图5.pET28a-LmMAPKK在大肠杆菌BL21中蛋白表达电泳图

图6.pCAMBIA2300-LmMAPKK酶切验证电泳图。

图7.pCAMBIA2300-LmMAPKK载体示意图。

图8.转基因烟草基因组PCR。

图9.转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、大麦、小麦、棉花基因组PCR。

图10.转基因月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶兰基因组PCR。

图11.转基因杨树、香花槐基因组PCR。

具体实施方式

实施例1

枸杞中有丝分裂原活化蛋白激酶激酶LmMAPKK基因的克隆

利用Trizol试剂，从100mg的新鲜的枸杞叶片中提取totalRNA，根据转录组的Unigene序列设计上游引物，枸杞中有丝分裂原活化蛋白激酶激酶LmMAPKK基因的上游引物为：LmMAPKK：5-’ATGAAGAAAGGATCTTTTGCTCCTAATC-3’，利用3’FULLRACECoreSetVer.2.0(TaKaRa，Japan)试剂盒扩增得到完整的基因序列。具体步骤:①以totalRNA为模板，利用3’RACEAdaptor引物进行反转录反应，合成1stStrandcDNA，反应体系如下：

反应条件:42℃，60min；70℃，15min。

根据基因的上游引物与试剂盒提供的下游引物3’RACEoutprimer:5’-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3’，以1stStrandcDNA为模板，进行PCR反应，反应体系如下：

一共配置4管反应液，反应条件如下：94℃，4min；94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，lmin20Sec；72℃，10min；30个循环。反应后利用天根公司普通DNA产物纯化试剂盒对PCR反应产物进行纯化，得到纯化的LmMAPKKPCR片段，按照试剂盒说明书操作。

实施例2

克隆载体pMD18-T-LmMAPKK的构建过程

将序列表所示的LmMAPKK基因与pMD18-T载体连接，反应体系如下:

LmMAPKKPCR片段为实施例1中的纯化回收产物。

反应条件:16℃，30min。连接产物转化E-Coli.DH5α，涂布在含有40ml25mg/ml的X-Gal、16ml50mg/ml的IPTG、100mg/LAmp的LB琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。挑选白色菌落，菌落PCR法确认T载体中插入片段的长度大小，如图2，与预期一致，将该载体送往华大基因公司测序，我们得到了1074bp的该基因碱基序列，在NCBI进行blast，与茄科同源性高，表明为该基因克隆成功。

实施例3

大肠杆菌表达载体pET28a-LmMAPKK的构建过程

首先以pMD18-T-LmMAPKK质粒为模板，P3，P4为分别为上下游引物，扩增LmMAPKK基因，其反应条件为：94℃，4min；94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，lmin20Sec；72℃，10min，30个循环，在P3中引入BamHI酶切位点(GGATCC），在P4中引入SalI酶切位点（GTCGAC），然后PCR产物和pET28a空载体质粒分别用BamHI和SalI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接体系如下：

LmMAPKKPCR片段为实施例1中的纯化回收产物。

实施例3

大肠杆菌表达载体pET28a-LmMAPKK的构建过程

LmMAPKKPCR片段为实施例1中的纯化回收产物。

实施例3

大肠杆菌表达载体pET28a-LmMAPKK的构建过程

连接产物转化E-Coli.DH5α，涂布于含100mg/Lkana抗性的LB平板上，37℃培养。12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，如图4，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pET28a-LmMAPKK构建正确。

将构建好的植物表达载体pET28a-LmMAPKK转化大肠杆菌BL21。进行蛋白表达验证，得到预期大小（39KD）的LmMAPKK表达蛋白，如图5：1.蛋白Marker；2.pET28a-LmMAPKK(IPTG诱导)；3.pET28a-LmMAPKK(未诱导)；4.pET28a空载体（IPTG诱导）5.pET28a空载体（未诱导）。

实施例4

双元植物表达载体pCAMBIA2300-LmMAPKK的构建

首先以pMD18-T-LmMAPKK质粒为模板，P3，P4为分别为上下游引物，扩增LmMAPKK基因，其反应条件为：94℃，4min；94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，lmin20Sec；72℃，10min，30个循环，在P3中引入BamHI酶切位点(GGATCC），在P4中引入SalI酶切位点（GTCGAC），然后PCR产物和pCAMBIA2300空载体质粒分别用BamHI和SalI双酶切，将二者的酶切产物连接，连接体系如下：

连接产物转化E-Coli.DH5α，涂布于含100mg/L浓度kana抗性的LB平板上。37℃培养，12h后挑取单菌落进行菌落PCR验证，将菌落PCR验证阳性的菌，摇菌提取质粒，酶切鉴定得到目的条带，如图6，最后送华大基因测序公司测序，结果表明载体pCAMBIA2300-LmMAPKK构建正确。

实施例5

用于植物转基因的农杆菌工程菌种C58:pCAMBIA2300-LmMAPKK的构建。

农杆菌感受态细胞制备

1.将农杆菌C58单菌落接种于5mLYEP液体培养基中，28℃，180r/min振荡培养。

2.将上述菌液转入l00mLYEP液体培养基中，28℃，180r/min，振荡培养至(OD₆₀₀值约为0.5)。

3.冰浴30min后，4℃，4000r/min离心l0min，收集菌体，重悬于20mL预冷的H₂O中。

4.4℃，4000r/min离心10min，收集菌体，重悬于预冷的10%甘油中，每管200μL速冻，存于-80℃备用。

植物表达载体的电击转化

1.将-80℃取出的C58感受态细胞置于冰上，使其缓慢融化;

2.加入4μL质粒，混匀，冰浴5min;

3.转移至电击杯中;

4.设置电击转化仪参数:1500V，0.2s，电击转化;

5.室温静置2min后加入500μLYEB液体培养基，28℃，180r/min振荡培养3h;

6.室温4000r/min离心10min，吸出400μL上清液，将剩下的菌液混匀，涂布于含100mg/L卡那霉素和100mg/L利福平抗性的YEB平板上，倒置平板，28℃培养，48h，直至看到清晰的单菌落。

7.挑取单菌落，菌落PCR验证。

实施例6

农杆菌介导的烟草遗传转化

烟草苗的无菌培养：选饱满、健康的烟草种子，用75%乙醇浸泡lmin，25%的安替福明(有效氯2.5%)水溶液灭菌8min，无菌水漂洗三次，将种子放在MS培养基中，25℃光培养，16h/8h光周期。

本实验用到的培养基如下表所示

烟草的农杆菌转化

侵染菌液的制备

1.挑取阳性农杆菌单菌落，接种到5ml含100mg/L卡那霉素的YEP液体培养基中，于28℃、200r/min的摇床上过夜培养。

2.次日，取3ml菌液，接种到含100mg/L卡那霉素的50mlYEP液体培养基中，当菌液处于旺盛生长期(OD₆₀₀=0.6-0.9)时，将菌液倒入50ml离心管，在3500r/min，4℃下离心10min，弃上清液，收集菌体。用等量的MS液体培养基重悬，使OD₆₀₀=0.9-1。

外植体浸染

1.将烟草叶片去除主脉和叶边缘，然后将叶片切成0.5cm×0.5cm大小，浸入制备好的农杆菌菌液，浸泡15-20min，其间摇动2-3次，使叶片充分接触菌液，取出叶片，用无菌的滤纸吸净多余的菌液，叶面朝下、叶背朝上接种于共培培养基中，25℃左右暗培养2天。

2.将叶片转移至筛选培养基中，20天左右更换一次培养基，诱导抗性芽产生，当抗性芽从愈伤组织上长到1cm左右，从愈伤上切取抗性芽，接种于抗性苗生根培养基中。

转基因苗移栽

将根系生长良好、生命力旺盛的烟草组培苗从组培瓶中取出，用自来水冲洗培养基(尽量减少根系损伤)，种植在蛙石和腐殖土的培养土中，覆盖薄膜保温保湿15天，然后揭开薄膜，定期浇水、施肥，使之在温室中正常生长。

实施例7

转基因烟草分子检测和抗盐性检测

转基因烟草基因组DNA的PCR检测:1.CTAB法提取烟草总DNA;2.以基因组DNA为模板行PCR检测，引物为P3、P4，反应条件:：94℃，4min；94℃，30Sec；56℃，30Sec；72℃，lmin20Sec；72℃，10min；30个循环。

取上述PCR产物5μl进行电泳检测，图8，说明LmMAPKK基因已成功转入烟草。

在温室正常生长的，5-7cm转基因烟草苗和野生型对照苗，分别浇上含300mmol/L及500mmol/L浓度的NaCI的水，在温室中保持85%的湿度。检测发现，在300mmol/LNaCI的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢，生物量相对较少，而转基因烟草能够正常生长，生物量大，能够开花结实，500mmol/L浓度的NaCI的条件下，生长一周以后，野生型烟草叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基因烟草的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型烟草那样明显，基本能正常生长。

实施例8

本实验室通过生长点侵染法对玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、大麦、小麦、棉花等农作物成熟胚转基因(LmMAPKK)，成功获得转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、大麦、小麦、棉花植株，基因组PCR电泳图，如图9，自左向右依次为玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、大麦、小麦、棉花的基因组PCR。

在温室正常生长的，5-7个真叶转基因幼苗和野生型对照苗，分别浇上含300mmol/L及500mmol/L浓度的NaCI的水，在温室中保持85%的湿度。检测发现，在300mmol/LNaCI的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢，生物量相对较少，而转基因幼苗能够正常生长，生物量大，能够开花结实，500mmol/L浓度的NaCI的条件下，生长一周以后，野生型幼苗叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基因幼苗的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型幼苗那样明显，基本能正常生长。

实施例9

本实验室利用农杆菌侵染法对月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶兰等花卉进行转基因(LmMAPKK)，获得转基因月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶兰植株，基因组PCR电泳图如图10，自左向右依次为月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶兰的基因组PCR。

在温室正常生长的，5-7cm转基因幼苗和野生型对照苗，分别浇上含300mmol/L及500mmol/L浓度的NaCI的水，在温室中保持85%的湿度。检测发现，在300mmol/LNaCI的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢，不能正常开花，而转基因幼苗能够正常生长，能够开花，500mmol/L浓度的NaCI的条件下，生长一周以后，野生型幼苗叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基因幼苗的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型幼苗那样明显，基本能正常生长开花。

实施例10

本实验室利用农杆菌侵染法对杨树、香花槐等乔木类树木进行转基因（LmMAPKK），获得转基因杨树、香花槐植株，基因组PCR电泳图，如图11,自左向右依次为杨树、香花槐的基因组PCR。

在温室正常生长的转基因树苗和野生型对照苗，分别浇上含300mmol/L及500mmol/L浓度的NaCI的水，在温室中保持85%的湿度。检测发现，在300mmol/LNaCI的生长条件下，野生型植株生长相对缓慢。而转基因树苗能够正常生长。500mmol/L浓度的NaCI的条件下，生长一周以后，野生型苗叶片发黄，萎蔫，组织坏死，不能正常生长。虽然转基树苗的生长也受到一定程度的抑制，但不像野生型幼苗那样明显，基本能正常生长。

序列表

<110>天津大学

<120>枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶及增强植物耐盐碱应用

<130>2013420

<160>6

<170>PatentInversion3.3

<210>1

<211>1074

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(1074)

<400>1

atgaagaaaggatcttttgctcctaatcttaaactttctcttccacctcctgatgaagtt60

aatctctccaaattcctgactgaatcagggacatttaaggatggagatcttttggtgaat120

agagatggagttcgaattgtctcgcagagtgaagttgcagctcctacagttatacagcca180

tcagacaaccagttatgcttagctgattttgaagcagttaaagttattggaaagggaaat240

ggtggtattgtgcggctggttcagcataaatggactgggcaatttttcgctctcaaggtt300

attcagatgaatattgaagagtccatgcgcaagcatatagctcaagaactgagaattaat360

cagtcatcccagtgtccatatgttgtcgtatgctatcagtcattctttgataatggtgct420

atctcaatcattttggagtatatggacggtggttccctagcagattttctgaaaaaagtg480

aatacaatacccgaacggtatcttgctgccatctgcaaacaggttctcaaaggcttgtgg540

tatcttcatcatgagaagcatattattcacagggatttgaaaccttcgaatttgctaatc600

aatcacagaggtgatgtcaaaatcaccgactttggtgtgagtgcagtactggcaagcaca660

tctggactggctaataccttcgtcggcacatacaactatatgtctccagagagaatttca720

ggaggtgcctatggttacaaaagtgacatttggagcttgggtttagttttgctcgagtgt780

gcaacaggtcatttcccatataccccacccgagggagatgaaggatgggttaatgtttat840

gaacttatggaaactatagttgaccaaccagcaccttgtgcacctcctgaccaattttct900

cctcacttctgctcattcatatctgcatgtgtccagaaggaccaggaggacagattgtca960

gcaaatgaactcatgagtcaccctttcatcaccatgtacgatgacctggatgttgatctt1020

ggatcgtacttcacatccgcaggacctccattggcaacactcaatgagctataa1074

<210>2

<211>357

<212>PRT

<213>人工系列

<220>

<221>MUTAGEN

<222>(1)..(357)

<400>2

MetLysLysGlySerPheAlaProAsnLeuLysLeuSerLeuProPro

151015

ProAspGluValAsnLeuSerLysPheLeuThrGluSerGlyThrPhe

202530

LysAspGlyAspLeuLeuValAsnArgAspGlyValArgIleValSer

354045

GlnSerGluValAlaAlaProThrValIleGlnProSerAspAsnGln

505560

LeuCysLeuAlaAspPheGluAlaValLysValIleGlyLysGlyAsn

65707580

GlyGlyIleValArgLeuValGlnHisLysTrpThrGlyGlnPhePhe

859095

AlaLeuLysValIleGlnMetAsnIleGluGluSerMetArgLysHis

100105110

IleAlaGlnGluLeuArgIleAsnGlnSerSerGlnCysProTyrVal

115120125

ValValCysTyrGlnSerPhePheAspAsnGlyAlaIleSerIleIle

130135140

LeuGluTyrMetAspGlyGlySerLeuAlaAspPheLeuLysLysVal

145150155160

AsnThrIleProGluArgTyrLeuAlaAlaIleCysLysGlnValLeu

165170175

LysGlyLeuTrpTyrLeuHisHisGluLysHisIleIleHisArgAsp

180185190

LeuLysProSerAsnLeuLeuIleAsnHisArgGlyAspValLysIle

195200205

ThrAspPheGlyValSerAlaValLeuAlaSerThrSerGlyLeuAla

210215220

AsnThrPheValGlyThrTyrAsnTyrMetSerProGluArgIleSer

225230235240

GlyGlyAlaTyrGlyTyrLysSerAspIleTrpSerLeuGlyLeuVal

245250255

LeuLeuGluCysAlaThrGlyHisPheProTyrThrProProGluGly

260265270

AspGluGlyTrpValAsnValTyrGluLeuMetGluThrIleValAsp

275280285

GlnProAlaProCysAlaProProAspGlnPheSerProHisPheCys

290295300

SerPheIleSerAlaCysValGlnLysAspGlnGluAspArgLeuSer

305310315320

AlaAsnGluLeuMetSerHisProPheIleThrMetTyrAspAspLeu

325330335

AspValAspLeuGlySerTyrPheThrSerAlaGlyProProLeuAla

340345350

ThrLeuAsnGluLeu

355

<210>3

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(28)

<400>3

atgaagaaaggatcttttgctcctaatc28

<210>4

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(23)

<400>4

taccgtcgttccactagtgattt23

<210>5

<211>37

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(37)

<400>5

cgcggatccatgaagaaaggatcttttgctcctaatc37

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<221>gene

<222>(1)..(35)

<400>6

acgcgtcgacaattatagctcattgagtgttgcca35。

Claims

1.一个枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因，其特征在于该基因为SEQIDNO.1所示的核苷酸序列。

2.权利要求1所述的枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因编码的蛋白质，其特征在于所述的蛋白质为SEQIDNO.2所示的氨基酸序列。

3.一种重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的枸杞有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因的全序列或部分片段。

4.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是质粒表达载体大肠杆菌表达载体pET28a-LmMAPKK。

5.一种权利要求3所述的重组载体，其特征在于它是重组植物表达载体pCAMBIA2300-LmMAPKK。

6.一种宿主细胞，其特征在于含有权利要求1所述的有丝分裂原活化蛋白激酶激酶基因全序列或部分片段。

7.一种权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于它是农杆菌细胞，烟草细胞，玉米细胞或者大豆细胞。

8.一种权利要求1所述基因的应用，其特征在于它用于制备转基因玉米、大豆、水稻、花生、向日葵、谷子、大麦、小麦、棉花等农作物；月季、洋桔梗、安祖花、蝴蝶兰等花卉；杨树、香花槐。