CN110241122A - 中间锦鸡儿CiCPK10基因在调控植物抗逆性的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物基因工程领域，具体而言，涉及中间锦鸡儿CiCPK10基因，同时涉及该基因的功能研究和在调控植物抗逆性的应用。本发明利用中间锦鸡儿的转录组数据库，从中间锦鸡儿中克隆得到与非生物胁迫相关的CiCPK10基因，在拟南芥中过表达后，进行干旱、高盐和高温等胁迫处理，并揭示其功能，为其今后应用于改善农林草植物耐受逆境能力提供理论依据和支持。

Description

中间锦鸡儿CiCPK10基因在调控植物抗逆性的应用

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体而言，涉及中间锦鸡儿CiCPK10基因，同时涉及该基因的功能研究和在调控植物抗逆性的应用。

背景技术

低温、干旱、土地盐碱化等环境条件是影响植物生长发育的主要逆境胁迫因子，植物在逆境胁迫下的生理生化变化以及对逆境适应能力的研究是近年来的研究热点。探索如何提高植物的抗逆性已经成为急需解决的关键问题。植物为了适应逆境环境，会在分子、细胞、器官、生理生化等水平上做出及时调节。随着生物的进化，植物体内产生了复杂的信号传递系统，从而提高了植物的抗逆能力。钙离子是胞内的第二信使，是植物体内一种重要的信号转导因子，参与植物生长发育、免疫防御和激素调节，并且对光和各种胁迫信号均有响应。目前，在植物中有钙调素、钙依赖蛋白激酶(CDPK)和钙调磷酸酶B类蛋白这三种钙受体蛋白，其中钙依赖蛋白激酶是目前研究的热点。钙依赖蛋白激酶是主要的初级钙离子感受器之一，同时也是Ca²⁺响应蛋白，植物中分布广泛，在植物钙信号转导过程中具有重要作用，同时在植物应答逆境信号传递过程中起重要作用。

CDPK是植物和原生生物所特有的、在动物体内尚未发现的一类丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶，它的全称为：钙依赖和钙调素不依赖的蛋白激酶(Calcium-dependent andcalmodulin-independent protein kinase)或类钙调素结构域的蛋白激酶(Calmodulin-like protein kinase)，是一种特殊的钙离子结合蛋白。该蛋白首次在豌豆(Pisumsativum)中报道，并在大豆(Glycine max)中首次得到纯化和鉴定。随着对CDPK的研究的不断深入，人们发现CDPK是一个大的基因家族，目前，在水稻(Oryza sativa)、小麦(Triticumaestivum)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、杨树(populus trichocarpa)和葡萄(Vitisvinifera)等多种植物中均鉴定出CDPK蛋白，例如，在模式植物拟南芥基因组中已经鉴定出34个CDPK家族成员，分别位于五条染色体上，其中CPK2/17/20/34被证实与花粉管伸长有关；而且在早期研究中表明，矮牵牛的两个基因PiCPK1和PiCPK2也可能参与对花粉管生长的调节，拟南芥CPK28基因被认为是赤霉素(Gibberellic acid，GA)和茉莉酸(Jasmonicacid，JA)的调节基因，CPK4和CPK11在乙烯的生物合成中发挥着重要作用，CPK21和CPK23在植物的耐盐和耐旱途径起负调控作用，该基因缺失增强了对相应非生物胁迫的耐受性，而过表达的株系则表现出相反的表型。在水稻中，目前为止已鉴定出31个CDPK家族成员，大豆中发现50个CDPK基因成员，玉米(Zea mays)中克隆得到40个CDPK基因，普通小麦和杨树中分别发现20个CDPK基因，蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)基因组中鉴定出25个CDPK基因，谷子(Setaria italica)中发现29个CDPK基因，马铃薯(Solanum tuberosum)中鉴定出21个CDPK基因，此外，在甜瓜(cucumis melo)、苹果(Malus pumila Millapple)、葡萄和花生(Arachis hypogaea)中均鉴定出CDPK基因。随着研究的不断深入，发现CDPK参与花期调节、植物根系发育和激素的合成及信号通路的调节，同时也在调控细胞分化、程序性死亡中发挥重要功能，如StCDPK5转基因马铃薯增强了对晚疫病病原体的抗性。

中间锦鸡儿(Caragana inermedia)属于豆科锦鸡儿属多年生灌木。根系较发达，地下根近5米，茎干直立或斜向上，株高1-2米；羽状复叶，小叶12-16片，倒卵形或椭圆形，多有被毛；中间锦鸡儿4月中旬开始生长，花期为5月中旬，花冠蝶形，黄色，果期为6月份，种子为肾形，有淡绿褐色和黄褐色两种颜色。在我国内蒙古、山西、宁夏和陕西等地区分布广泛，具有耐旱、耐高温、耐盐碱和耐寒等特性，是干旱、荒漠地区防风固沙和保持水土的优良植物；另外，中间锦鸡儿还可以作为饲料、燃料、造纸、肥料和板材原料，同时还具有药用价值。干旱、高盐和冷冻等其他的极端环境严重影响着植物的生长发育和农作物的产量。植物不像动物可以灵活主动地去躲避各种逆境胁迫，因此，为了适应各种不良生长环境，植物也逐渐进化形成了一系列复杂的抗逆机制，从而增强了植物自身的抗逆性。CDPKs被认为是胞质钙离子下游多种植物信号转导通路的重要调控因子，可能起到增强植物抗逆性的作用。本发明从中间锦鸡儿中克隆得到一个与抗逆相关的CiCPK10基因，并对其功能进行了初步研究，从分子和生理等各个水平上探究其抗逆机理。

发明内容

本发明利用中间锦鸡儿的转录组数据库，从中间锦鸡儿中克隆得到与非生物胁迫相关的CiCPK10基因，在拟南芥中过表达后，进行干旱、高盐和高温热激等胁迫处理，并揭示其功能，为其今后应用于改善农林草植物耐受逆境能力提供理论依据和支持。

本发明的第一个目的是提供一个能增加植物抗逆性的中间锦鸡儿CiCPK10基因及其编码蛋白。

本发明所阐述的中间锦鸡儿CiCPK10基因，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQID NO.1所示，其基因核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的是提供中间锦鸡儿CiCPK10在提高植物对抗逆性中的应用。特别地，所述抗逆性是指抗旱胁迫、抗盐胁迫以及抗高温胁迫。

插入有CiCPK10基因的重组表达载体，所述CiCPK10基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1蛋白质的核苷酸序列。

插入有CiCPK10基因的瞬时和稳定表达载体，所述CiCPK10基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

插入有CiCPK10基因的超表达和干扰表达载体，所述CiCPK10基因为如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ IDNO.1的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供CiCPK10基因在植物育种中的应用。

CiCPK10基因，或其重组表达载体，或其瞬时表达和稳定表达载体，或其超表达和干扰表达载体在改良植物对抗逆性的遗传育种中的应用，所述CiCPK10基因为如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ IDNO.1的核苷酸序列。

本发明的另一目的是一种将上述中间锦鸡儿CiCPK10基因应用于植物基因工程中，得到CiCPK10的超表达和干扰的转基因植株，用于改变植物的抗逆性，特别地，所述抗逆性是指抗旱胁迫、抗盐胁迫以及抗高温胁迫。

本发明的另一目的是提供一种提高植物的抗逆性的生物制剂，特别地，所述抗逆性是指抗旱胁迫、抗盐胁迫以及抗高温胁迫。

一种提高植物的抗逆性的生物制剂，其活性成分来源于CiCPK10的重组表达载体或超表达和干扰表达载体，或其活性成分含有调控CiCPK10基因表达的生物制品，所述CiCPK10基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

本发明的另一目的是提供一种调控植物的抗逆性的方法，特别地，所述抗逆性是指抗旱胁迫、抗盐胁迫以及抗高温胁迫。

一种调控植物的抗逆性的方法，该方法包括调控CiCPK10基因表达，所述CiCPK10基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

本发明构建CiCPK10的超表达和干扰表达载体，并通过农杆菌介导法的遗传转化方法，将超表达和干扰表达载体转化至正常植物品种，最后获得CiCPK10的超表达和干扰表达的转基因植物。

特别地，所述植物优选为陆生植物。所述陆生植物可为双子叶植物和/或单子叶植物。所述双子叶植物具体可为十字花科植物；所述十字花科植物可为拟南芥。在一个具体实施方案中，植物优选为豆科锦鸡儿植物，所述豆科锦鸡儿植物可为中间锦鸡儿。

在本发明中，我们获得的一个中间锦鸡儿CiCPK10并进行应用性探索，阐述了该基因以下应用方式：

(1)应用RACE技术克隆得到中间锦鸡儿CiCPK10基因。

(2)CiCPK10基因受脱水、NaCl、ABA的胁迫诱导。

(3)脱水处理下，过表达CiCPK10基因各株系的失水率明显低于对照；干旱处理后，过表达株系存活率明显高于野生型。

(4)在高盐处理下，CiCPK10过表达株系对盐胁迫耐受性增强，抽薹未受影响。

(5)在高温处理下，CiCPK10过表达株系存活率高于对照。

(6)高盐处理下，过表达CiCPK10基因株系中胁迫相关基因的表达量均明显高于野生型。

本发明的有益效果如下：从中间锦鸡儿中克隆得到与非生物胁迫相关的CiCPK10基因，并揭示其抗逆性功能，为其今后应用于改善农林草植物耐受逆境能力提供方向。

附图说明

图1：CiCPK10基因全长cDNA克隆电泳图(从左到右分别是CiCPK10 3'RACE，CiCPK10 5'RACE，CiCPK10ORF，pCanG-CiCPK10)。

图2：CiCPK10在不同脱水、盐、ABA处理下的表达模式分析。

图3：CiCPK10与其他物种的CDPK的进化关系(括号内为氨基酸登录号；分支上的数字表示Bootstrap验证中基于1000次重复该节点的可信度的百分比；标尺代表演化距离)。

图4：CiCPK10转基因株系表达水平检测。

图5：对照和CiCPK10过表达株系抗旱性和失水率分析；上图:干旱胁迫处理前2周大的幼苗、干旱处理10天的幼苗和复水3天后的幼苗；下图:各株系的存活率统计和各株系地上部分失水率统计。

图6：CiCPK10过表达株系在干旱胁迫时的生理指标(MDA，可溶性糖和GSH)检测。

图7：NaCl处理下对照和CiCPK10过表达株系表型检测。

图8：高温热激处理下对照和CiCPK10过表达株系表型检测。

图9：NaCl处理下对照和CiCPK10过表达株系各胁迫相关基因的表达量检测。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1.中间锦鸡儿CiCPK10基因cDNA全长的克隆

从中间锦鸡儿干旱转录组数据库中筛选得到CiCPK10的EST片段长度为1458bp，利用RACE技术获得cDNA未知序列。通过5'RACE扩增得到725bp的5'端序列，通过3'RACE扩增得到657bp的3'端cDNA序列。将3'RACE和5'RACE扩增得到的序列测序后，将获得的序列通过Vector NTI10同EST序列拼接，得到cDNA全长序列。以中间锦鸡儿cDNA为模板，用特异性引物扩增cDNA序列，测序验证后拼接结果正确。中间锦鸡儿CiCPK10基因cDNA全长2763bp，包括1662bp的开放阅读框，5'端非编码区，3'端非编码区，3'端以polyA结尾。起始密码子为ATG，终止密码子为TGA，编码553个氨基酸。

利用含有酶切位点的特异引物CiCPK10-OE-F和CiCPK10-OE-R克隆得到CiCPK10基因的ORF片段，回收目的片段与-Blunt Simple Cloning Vector连接，测序验证后，分别用相应的内切酶Sal I与Spe I双酶切重组质粒pEASY-CiCPK10和植物表达空载体质粒pCanG-HA，回收酶切产物，用T4DNA连接酶将目的基因连入用相应内切酶酶切的表达载体pCanG-HA，并对重组质粒pCanG-CiCPK10进行双酶切和PCR鉴定，结果表明过表达载体构建成功(图1)。

所用引物序列如下：

实施例2、中间锦鸡儿CiCPK10基因表达特性分析

为了进一步确定CiCDPK10基因是否受非生物胁迫的诱导，我们检测了不同胁迫处理下目的基因表达量的变化情况。挑选籽粒饱满、大小一致、质地均匀的中间锦鸡儿种子,播种于混合营养土(蛭石和营养土体积比为2:1)中,置于22℃、16h光照/8h黑暗条件下培养。选取长势一致的1个月苗龄柠条锦鸡儿植株进行脱落酸(100μM ABA)、盐(200mM NaCl)和脱水胁迫处理，取叶片和茎段部分用于RNA提取，利用荧光定量PCR技术对CiCPK10基因在不同胁迫下的表达进行分析。

结果显示，CiCPK10在各种胁迫条件下都有不同程度的诱导表达。盐处理后，目的基因的表达量明显降低，处理6h时达到最低，12h时依然明显低于未处理时的表达量；脱水处理后CiCPK10的表达被迅速诱导，12h时目的基因的表达量达到最高，是未处理时的3.5倍；ABA处理后，6h时目的基因的表达量升高到未处理时的2倍。以上检测结果说明CiCPK32基因可能参与脱水、盐和ABA胁迫的响应(图2)。

实施例3.CiCPK10系统进化分析

利用MEGA5构建系统进化树，如图3所示，CiCPK10与GmCDPK10(XP_003522347.1)被聚类在一起，序列比对结果显示二者蛋白序列相似度91.9％。此外，CaCDPK10-like(XP_004508790.1)，MtCDPK30(XP_013457869.1)与它们聚类在同一分支上，与CiCPK10的蛋白序列相似度分别是85.5％和83.9％。与拟南芥亲缘关系最近的两个成员AtCPK10(AT1G18890)和AtCPK30(AT1G74740)蛋白序列相似度分别为81.2％和78.9％。AtCPK10和AtCPK30均与植物响应干旱等逆境胁迫相关。

实施例4.转CiCPK10基因拟南芥的筛选与鉴定

利用电转化法将构建好的重组质粒pCanG-CiCPK10转入农杆菌GV3101，通过浸花法转化野生型拟南芥。用含有25mg/L Kan的1/2MS培养基筛选转基因植株，根据孟德尔遗传定律，得到T₃代阳性植株。提取转基因阳性植株的总RNA，利用qRT-PCR检测CiCPK10在转基因拟南芥中的表达量(图4)，数据采用2^-ΔCT算法，结果如图所示，CiCPK10基因在转基因株系中均有表达，选取OE-1、OE-11和OE-32这3个表达量不同的株系用于后续实验。

实施例5.过表达CiCPK10基因提高了拟南芥的抗旱性

为进一步研究CiCPK10基因在干旱胁迫中的功能，对转空载体对照株系和CiCPK10过表达株系进行了干旱处理。正常生长条件下，对照株系和转基因株系在表型上没有区别，停止浇水干旱10d后，对照组叶片开始失水卷曲，萎蔫严重，而转基因株系萎蔫程度低于野生型，表现出更强的抗旱性。复水3d后，对照存活率仅为15.28％，转基因株系的存活率显著高于对照株系，OE-1、OE-11和OE-32的存活率分别是100％、98.61％、61.11％(图5)，说明CiCPK10过表达后提高了拟南芥的抗旱性。

对4周大的离体叶片的失水率进行检测发现，过表达株系的失水率也低于对照植株。干旱胁迫会使植物体内产生大量活性氧，导致膜脂过氧化，MDA是膜脂过氧化的一种产物。MDA含量检测结果如图6所示，正常生长条件下，过表达株系OE-11和OE-32的MDA含量均低于野生型植株且达到显著水平，说明过表达CiCPK10减少了拟南芥中MDA的生成，降低了膜脂过氧化程度。可溶性糖和GSH含量检测结果如图5所示，脱水处理5h时，过表达株系可溶性糖含量高于野生型，脱水处理前后过表达株系中GSH含量均高于对照株系。以上结果说明CiCPK10过表达后，拟南芥中GSH和可溶性糖含量增加，膜脂过氧化程度降低，MDA的生成减少，转基因拟南芥抗旱性也随之增强。

实施例6.过表达CiCPK10增强了拟南芥对NaCl的耐受性

为检测转CiCPK10基因拟南芥对NaCl的耐受程度，对生长3周左右的拟南芥进行了NaCl胁迫。将转基因株系种子和对照拟南芥种子同时4℃春化3天，播种到蛭石中。生长3周左右浇灌浓度为250mM NaCl，继续生长2周，观察表型。如图7所示，当受到NaCl胁迫后，对照株系生长受到抑制，没有抽薹，而CiCPK10过表达株系与未受到盐胁迫时的表型一致，抽薹未受到影响。说明高浓度NaCl胁迫对野生型拟南芥抽苔起到明显的抑制作用，但是对CiCPK10过表达株系的抽苔无明显影响。以上结果说明在拟南芥中过表达CiCPK10能够增强拟南芥对NaCl胁迫的抗性。

实施例7.过表达CiCPK10增强了拟南芥对热激胁迫的耐受性

拟南芥AtCPK10能够与热激响应蛋白HSP1互作，为检测CiCPK10是否参与热激响应过程，对CiCPK10过表达株系和对照拟南芥对高温胁迫的耐受性进行了实验验证。将在1/2MS培养基中生长5d大的幼苗进行热激处理。先进行37℃热驯化1h，放置于人工气候室培养培养2h，之后进行44℃热激处理2.5h。2d后观察表型变化，对照株系叶片变白，部分植株死亡，3个过表达株系受高温影响较小(图8)。以上结果说明，过表达CiCPK10能够增强拟南芥对热激胁迫的耐受性。

实施例8.胁迫响应基因表达量检测

将消毒处理好的种子4℃放置3d后，播种于预先灭菌的1/2MS液体培养基中生长6d，再将小苗移至含有6mL培养液的20mL GC瓶中继续培养6d，培养条件：22℃，光周期16h光照/8h黑暗。12d苗龄的小苗用250mM NaCl进行处理，检测胁迫响应基因的变化。通过qRT-PCR检测发现，在正常生长条件，各个株系中基因表达没有明显区别。NaCl处理后，ABF1、CBF3、COR15A表达量均升高，对照株系中ABF1表达量高于过表达株系，而CBF3和COR15A的表达量均低于过表达株系(图9)。说明CiCPK10在拟南芥中过表达后，在正常生长情况下对这些基因的影响不大；当植物盐胁迫时，会诱导这些基因表达发生变化，从而抵御外界不良环境的影响。

Claims (8)

1.一种中间锦鸡儿CiCPK10基因，其特征在于，所述CiCPK10基因的核苷酸序列如SEQID NO.2所示，其编码如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

2.插入有CiCPK10基因的重组表达载体，所述CiCPK10基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

3.插入有CiCPK10基因的瞬时和稳定表达载体，所述CiCPK10基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

4.插入有CiCPK10基因的超表达和干扰表达载体，所述CiCPK10基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

5.权利要求1中所述CiCPK10基因、权利要求2-4任一所述CiCPK10基因的表达载体在调控植物中对抗逆性中的应用。

6.一种提高植物的抗逆性的生物制剂，其特征是，其活性成分来源于CiCPK10的重组表达载体或超表达和干扰表达载体，或其活性成分含有调控CiCPK10基因表达的生物制品，所述CiCPK10基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

7.一种调控植物抗逆性的方法，其特征是，该方法包括调控CiCPK10基因表达，所述CiCPK10基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ ID NO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。

8.权利要求1所述的CiCPK10基因，或权利要求2所述重组表达载体，或权利要求3所述的瞬时和稳定表达载体，或权利要求4所述的超表达和干扰表达载体在改良植物抗逆性的遗传育种中的应用，所述CiCPK10基因为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，或为与SEQ IDNO.2互补配对的核苷酸序列，或为编码SEQ ID NO.1的核苷酸序列。