CN102464708B

CN102464708B - 与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN102464708B
Application number: CN 201010548622
Authority: CN
Inventors: 刘公社; 程丽琴; 李晓峰; 彭献军; 齐冬梅
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2010-11-17
Filing date: 2010-11-17
Publication date: 2013-09-04
Anticipated expiration: 2030-11-17
Also published as: CN102464708A

Abstract

本发明公开了与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白的表达受干旱、低温、高盐或ABA等逆境诱导，可以参与羊草对多种逆境胁迫的响应，提高植物的抗逆性。与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因对于培育抗逆性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义。

Description

与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

不良自然环境，如低温、高温、干旱和盐渍等作用于植物会引起植物体内发生一系列的生理代谢反应，表现为代谢和生长的可逆性抑制，严重时甚至引起不可逆伤害，从而导致整个植株死亡。各种胁迫中，干旱、盐碱、冷(冻)害对植物的影响尤为突出，是影响植物生长和农作物产量的最主要的环境因子。利用基因工程手段改良作物的低温耐性，尽量避免或减轻不良环境因素的危害，是当前生物和现代农业技术领域的研究热点，也是我国以及世界农业急需解决的重大课题。植物对胁迫的抵抗和忍耐能力称为抗逆性，抗逆性是植物在长期演化过程中形成的对不良环境的适应性。多年来，人们从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度进行了大量研究，积累了丰富的资料，特别是随着分子生物学的发展，人们能够在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上认识植物对胁迫的耐逆性机理，为利用基因工程手段改良植物的抗胁迫性能开拓了新的途径。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗逆性十分困难，随着分子生物学的发展，基因工程手段开辟了植物抗逆育种的新途径，但高效抗逆基因的分离成为限制植物抗逆基因工程的主要因素。过去，抗逆基因的克隆及应用主要是单一的功能基因，如甜菜碱合成酶基因、脯氨酸合成酶基因等，虽然取得了一定的效果，但植物的抗逆性没有得到全面的提高。

植物抗逆性受多基因控制，要使众多对植物抗逆性状产生影响的功能基因充分表达和发挥作用，才能更有效的改良植物的抗逆性。随着生物技术的不断发展，研究重点已经从一般的功能基因转向各种专一性或高效性的调控因子(如启动子和转录因子)。由于一个转录因子可以调控植物中多个与抗逆性相关基因的表达，增强一个转录因子的作用，就可使植株的抗逆性状获得综合改良。

发明内容

本发明的一个目的是提供与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物抗逆性相关的蛋白，名称为LcMYB13355，来源于羊草(Leymus chinensis)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。

所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)序列表中序列2自5’末端起第133位到第2388位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列2由2697个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第133-2388位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白。

含有所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体是在p3301-121载体的多克隆位点间插入所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体；

所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA3301载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收载体大片段；

(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含GUS基因的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GUS基因的片段连接，得到重组载体p3301-121。

所述pCAMBIA3301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。

所述重组菌为重组酵母菌。

扩增所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因导入目的植物中，得到抗逆性增强的转基因植物。

所述与植物抗逆性相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥；所述抗逆性为对低温、高盐、干旱、脱落酸和/或茉莉酸甲酯的抗性；所述低温为4℃。

可用现有的植物表达载体构建含有LcMYB13355基因的重组表达载体。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pCAMBIA1302、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。携带有本发明的羊草低温诱导转录因子编码基因LcMYB13355的植物表达载体可通过Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化到植物细胞或组织中。被转化的植物宿主既可以是小麦、水稻、玉米、短柄草等单子叶植物，也可以是拟南芥、烟草、大豆、黄瓜、番茄、棉花、杨树、苜宿等双子叶植物。

本发明所提供的与植物抗逆性相关蛋白的表达受干旱、低温、高盐或ABA等逆境诱导，可以参与羊草对多种逆境胁迫的响应，提高植物的抗逆性。与植物抗逆性相关蛋白及其编码基因对于培育抗逆性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义。

附图说明

图1为经4℃低温处理的羊草幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2为PCR扩增LcMYB13355的3’端序列的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图3为PCR扩增LcMYB13355的5’端序列的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图4为PCR扩增LcMYB13355全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图5为LcMYB13355基因在不同低温、高盐、干旱和刈割等胁迫条件下的诱导表达结果。

图6为LcMYB13355基因的组织特异性表达分析结果。

图7为LcMYB13355基因的转录激活活性分析结果。

图8为重组表达载体p3301-121-LcMYB13355的构建过程图。

图9为低温胁迫处理条件下转LcMYB13355基因拟南芥的生长情况。

图10为p3301-121载体的构建过程。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因的获得和功能验证

一、与植物抗逆性相关的蛋白及其编码基因的获得

1、LcMYB 13355基因的3’端序列的克隆

(1)植物材料处理及总RNA的提取

以羊草(吉生一号，购自吉林省吉生羊草良种站)幼苗为材料，4℃处理6小时和12小时后，混合6小时和12小时两个不同处理时间的样品，提取其总RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。结果表明，所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

(2)LcMYB 13355基因3’端序列的克隆

根据GS-FLX 454(简称454)测序羊草MYB的氨基酸残基序列设计引物，具体的引物序列如下：

LC13355racef：5′-GCCAAATCGCCACCTCAAAGTGACA-3′，

以上述步骤(1)提取的经低温处理的羊草幼苗的总RNA为模板，用PrimeScript^TM1st Strand cDNA Synthesized Kit试剂盒(Takara公司)并参照试剂盒说明书的要求，反转合成其第一链cDNA。反应体系及反应条件如下：Oligo-dT(10pmol/μl)1μl，Total RNA(≤1μg)2μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)1.0μl，5×Buffer 4.0μl，RNaseInhibitor(40U/μl)0.5μl，PrimeScript RTase(200U/μl)0.5μl，RNase-free distilled water11μl；65℃5min，42℃45min，70℃15min。将合成的第一链cDNA贮存于-20℃备用。

再以获得的第一链cDNA为模板，引物LC13355racef与引物OligodT-adaptor 5′-GATTTCTGTCCGACGACTTTTTTTTTTTTTTTTTT-3′配对进行PCR扩增；PCR反应体系为：cDNA模板、引物LC1与引物OligodT-adaptor各1μl，10×Buffer 2.5μl，dNTP Mixture(10mmol/l each)2μl，Taq酶0.25μl，ddH₂O 12.25μl；反应条件为：先94℃预变性5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃60s，共36个循环；最后72℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为3’RACE PCR扩增产物，结果表明，经PCR扩增获得了长度约为1300bp左右的目的片段。回收并纯化3’RACE产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，对测序结果进行BLAST分析。结果表明，该片段的长度为1346bp，该片段的序列与植物中已知的MYB类基因的3’端序列具有较高的同源性，表明该片段可能为羊草MYB类结合蛋白编码基因的3’端序列。

2、LcMYB 13355基因5’端序列的克隆

根据上述步骤一获得的LcMYB 13355基因3’端cDNA序列设计引物：13355racer：5′-TTCGTTCCAGCAGCCCCCAGTCGTCG-3′，以步骤1提取的经低温处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用Promega公司的5’RACE试剂盒并参照试剂盒说明书，反转录合成其第一链cDNA。反应体系及条件如下：1μl RNA，1μl 5′-CDS primerA，1μl SMARTII A oligo，1μl DTT(20mM)，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl MMLV ReverseTranscriptase，2μl 5X First-Strand Buffer，2μl sterile H₂O；70℃2min，冰上2min，42℃1.5h，72℃7min。

以获得的第一链cDNA为模板，引物13355racer与引物UPM(Promega公司：Long(0.4μM)：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′，Short(2μM)：5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′)配对进行PCR扩增；PCR反应体系为：1μl 50X Advantage 2Polymerase Mix，34.5μl PCR-Grade Water，5μl 10XAdvantage 2PCR Buffer，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl 50XAdvantage 2Polymerase Mix，5μlUPM，1μl引物R，2.5μlcDNA模板；反应条件为：先94℃30s，然后68℃30s，70℃60s，共40个循环；最后70℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图3所示。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为5’RACE PCR扩增产物，结果表明，经PCR扩增获得了长度约为1600bp的目的片段。回收并纯化5’RACE产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，对测序结果进行BLAST分析。结果表明，该片段的长度为1597bp，该片段的序列与植物中已知的MYB类基因的5’端序列具有较高的同源性，表明该片段可能为羊草MYB类结合蛋白编码基因的5’端序列。

3、LcMYB 13355基因全长cDNA序列的获得及PCR检测

利用上述步骤1和步骤2获得的长度为1346bp和1597bp片段之间的重叠区，借助Contig软件拼接得到的LcMYB基因的全长cDNA序列，其脱氧核糖核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2由2697个碱基组成，自5’端第133位-第2388位为编码序列，编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质，序列表中序列1由751个氨基酸残基组成。根据LcMYB基因全长cDNA序列设计如下引物：

13355fullf：5′-CTCCAAATCCCTAACTCCCCAAT-3′和

13355fullr：5′-GACTCCAATTGACCCAAGCTC-3′。

以上述步骤一提取的经低温处理的羊草幼苗的总RNA经反转录合成的第一链cDNA为模板，进行PCR扩增。对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图4所示。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物。结果表明，经PCR扩增获得了长度约为2700bp的片段。回收并纯化该产物，将其连接到PMD-18T载体上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序。测序结果表明，该PCR扩增产物与上述拼接得到的序列在扩增部分完全相同，PCR扩增产物序列全长为2675bp，表明所克隆的3’RACE片段和5’RACE片段属于同一基因，将该基因命名为LcMYB13355，该基因的核苷酸序列如序列表中序列2所示；将该基因编码的蛋白命名为LcMYB 13355，该蛋白的氨基酸序列如序列表中序列1所示。

二、LcMYB 13355基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式分析

将正常生长8周的羊草(吉生一号，购自吉林省吉生羊草良种站)幼苗分别进行不同时间(0、0.5、3、6、12、24和48小时)的低温(4℃)、高盐(400mM NaCl)、干旱(20％聚乙二醇6000)、脱落酸(ABA，100μM)及茉莉酸甲酯(MJ，100μM)胁迫处理。分别将各处理不同时间的样品混合，提取各处理的羊草幼苗的总RNA，半定量PCR方法分析LcMYB13355基因在不同非生物胁迫因子条件下的表达模式，结果如图5所示，图5中NaCl代表盐胁迫、PEG代表干旱胁迫、ABA代表脱落酸胁迫、MJ代表茉莉酸甲酯胁迫、cold代表低温胁迫。结果表明，LcMYB13355基因的转录水平明显受低温和盐胁迫的诱导。

三、LcMYB 13355基因的组织特异性表达分析

分别提取实施例1中经低温胁迫处理的羊草幼苗的根、根茎、叶鞘、叶、茎、根茎芽和幼穗七种组织的总RNA，利用引物5′-AATCGCCACCTCAAAGTG-3′和5′-TGTATTAGCAACAAGCAGCC-3′进行RT-PCR分析，同时以Actin基因作为内标。反应结束后，对RT-PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图6所示。结果表明，LcMYB13355基因在不同组织中的表达存在明显差异，以叶鞘中表达量最低，茎、叶和根中含量其次，根茎芽、幼穗和根茎中表达量较高。

四、LcMYB13355基因的转录激活活性分析

根据上述实施例1扩增得到的LcMYB13355基因设计引物，加入EcoRI和BamHI酶切位点，引物序列如下：

引物1：GGAATTCATGGAGAAGGAGGTGTGTGAA(下划线部分为EcoRI酶切位点)，

引物2：CGGGATCCCTACATGATGGGTGGAAGAA(下划线部分为BamHI酶切位点)，

以人工合成的序列表中序列2所示的LcMYB13355基因为模板，进行PCR扩增，将扩增产物经EcoRI和BamHI酶切，回收酶切后的LcMYB13355基因片段；同时，用EcoRI和BamHI酶切酵母表达载体pBridge(购自CAMBIA公司)，回收载体大片段；将回收的载体大片段与回收的酶切后的LcMYB13355基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pBridge的EcoRI和BamHI酶切位点间插入了序列表中序列2第133到2388位所示的LcMYB13355基因片段，证明质粒构建正确，将得到的重组载体命名为pBridge-BD-LcMYB13355。将重组载体pBridge-BD-LcMYB13355导入到含有His3和LacZ报道子的酵母AH109株系(购自美国Clontech公司，商品目录号K1612-1)中，同时将酵母表达载体pBridge转入酵母AH109株系作为转空载体对照，将pGAL4(购自美国Clontech公司)转入酵母AH109株系作为正对照。将转基因酵母菌在不含组氨酸(His)和色氨酸(Trp)的SD培养基(SD/-His-Trp)上进行培养，结果如图7中a和b所示。图7中a表示转LcMYB13355基因的酵母菌株(C)、转入pGAL4作为正对照的酵母菌株(B)以及转空载体对照酵母菌株(A)在缺少组氨酸和色氨酸的选择培养基生长状况；图7中b为图7中a的酵母用含有X-gal的Z-buffer显色后的情况，(β-半乳糖苷酶活性滤纸分析)。结果表明，转空载体对照酵母菌株(A)在不含His和Trp的SD培养基上不能生长，而转LcMYB13355基因的酵母菌株(C)和转入pGAL4作为正对照的酵母菌株(B)能够在不含His和Trp的SD培养基上生长并显蓝色。结果表明，LcMYB13355具有转录激活活性。

实施例2、转LcMYB13355基因拟南芥植株的抗逆性分析

一、获得转LcMYB13355基因拟南芥植株

根据上述实施例1扩增得到的LcMYB13355基因设计引物，加入BamHI和SmaI酶切位点，引物序列如下：

引物3：CGGGATCCATGGAGAAGGAGGTGTGTGAA(下划线为BamHI位点)(序列表中序列3)，

引物4：TCCCCCGGGCTACATGATGGGTGGAAGAA(下划线为SmaI位点)(序列表中序列4)，

以人工合成的序列表中序列2所示的LcMYB13355基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物克隆入pMD18Simple-T(TaKaRa公司)载体，命名为pMD18-LcMYB13355。将pMD18-LcMYB13355利用BamHI和SmaI进行双酶切，回收约2.3kb的片段，同时用BamHI和SmaI双酶切p3301-121载体回收载体大片段，将回收的载体大片段与回收的2.3kb的LcMYB13355基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体p3301-121的BamHI和SalI酶切位点间插入了序列表中序列2第133到2388位所示的LcMYB13355基因片段，证明质粒构建正确，将获得的含有LcMYB13355基因完整阅读框的植物双元表达载体，命名为p3301-121-LcMYB13355，构建过程如图8所示。构建好的植物表达载体p3301-121-LcMYB13355通过冻融法转入农杆菌EHA105(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，进行除草剂抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，用阳性克隆菌液浸染拟南芥花序来进行拟南芥转化，转化后暗培养2天，进行第二次浸染，然后正常培养到收获种子。收获的种子在含除草剂的平板(1/2MS+10mg/L草胺磷)上进行抗性筛选，筛选为阳性的苗，收获种子(T1)，收获的种子在含除草剂的平板(1/2MS+10mg/L草胺磷)上种植，筛选后代分离比为3∶1的株系，收获其种子(T2)，用其小苗(T3)来做抗逆实验。按照获得转LcMYB13355基因拟南芥的方法，将空载体p3301-121转化拟南芥植株，得到转空载体对照拟南芥植株。

所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA3301载体(购自CAMBIA公司)经过HindIII和EcoRI双酶切，回收11246bp的载体大片段；

(2)将pBI121载体(购自Clontech公司)(含35S启动子，GUS报告基因，Tnos)也经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含GUS基因的2942bp的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GUS基因的片段经T4DNA酶连接，得到重组载体p3301-121(图10)。

二、转LcMYB13355基因拟南芥植株的抗逆性分析

将上述步骤一获得的转LcMYB13355基因拟南芥植株的种子、转空载体对照拟南芥植株的种子和野生型拟南芥种子分别种于含除草剂培养基(1/2MS+10mg/L草胺磷)上，萌发生长(生长条件为：温度为22-24℃，16小时光照-8小时黑暗的光周期，空气湿度为60％-80％)一周后，移栽到土中，在培养室培养(培养室培养的条件：温度为22-24℃，16小时光照-8小时黑暗的光周期，空气湿度为50-60％)一周后，在4℃进行低温胁迫处理。胁迫处理4小时后观察表型，观察到胁迫处理第7天。胁迫处理前6天转基因拟南芥植株、转空载体对照拟南芥植株和野生型拟南芥植株都没有明显的表型变化，从胁迫处理第7天开始，野生型拟南芥植株有95％的植株出现叶片失水萎蔫症状(图9中A)；而转LcMYB13355基因拟南芥苗植株有85％的植株没有明显的表型变化(图9中B)，转空载体对照拟南芥植株与野生型拟南芥植株的表型一致。该实验结果表明转LcMYB13355基因拟南芥与转空载体对照拟南芥和野生型拟南芥相比，具有更强的抗低温能力。