CN104098663B

CN104098663B - 大豆蛋白及其编码基因在调节植物抗旱性中的应用

Info

Publication number: CN104098663B
Application number: CN201310513678.5A
Authority: CN
Inventors: 陈李淼; 郝青南; 周新安; 沙爱华; 张婵娟; 陈海峰; 单志慧; 周蓉; 邱徳珍; 陈水莲
Original assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Oil Crops Research Institute of Chinese Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2013-10-25
Filing date: 2013-10-25
Publication date: 2016-07-06
Anticipated expiration: 2033-10-25
Also published as: CN104098663A

Abstract

本发明公开了一种大豆GmSYP24蛋白及其编码基因在调节植物抗旱性中的应用。本发明所提供的应用具体为序列2所示的蛋白质或其编码基因在调控植物抗旱性中的应用。实验证明，在正常供水条件下，野生型烟草、转入空载体烟草与GmSYP24转基因烟草株系生长状态良好，但是转基因烟草株系比野生型烟草叶片和转入空载体烟草叶片绿；在干旱胁迫条件下，野生型烟草叶片、转入空载体烟草叶片比转基因烟草叶片更容易萎蔫、黄化；转基因烟草植株比野生型烟草及转入空载体烟草的生长状态好。这暗示大豆GmSYP24基因为潜在的大豆抗旱基因，为后续在大豆中过表达该基因，获得抗旱转基因大豆新品种奠定了基础。本发明对于缓解粮食危机，节约水资源，降低农业灌溉成本等具有重要意义。

Description

大豆蛋白及其编码基因在调节植物抗旱性中的应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，涉及一种大豆GmSYP24蛋白及其编码基因在调节植物抗旱性中的应用。

背景技术

干旱是长期存在的世界性难题。全球干旱、半干旱地区约占陆地面积的35%，遍及世界60多个国家和地区。中国每年有将近2.5×10⁶hm²耕地受到干旱影响。特别是中国主要粮食生产区华北、东北、西北刚好处于中国缺水比较严重的地区，导致作物大幅度减产。干旱成为诱发粮食危机的主要因素之一。根据IPCCAR4多模式对中国地区干旱变化的预测：2011-2050年，中国地区表现为持续的干旱化趋势，总体干旱面积和干旱频率持续增加。通常改善干旱对农作物影响的手段是采用农业灌溉措施，这不仅增加成本也无法适应水资源短缺日益严重形势。因此，选育出抗旱农作物新品种对解决粮食问题具有重大意义。

获得抗旱农作物新品种的途径包括利用经典遗传学方法的常规选育技术和利用基因工程手段培育转基因新品种技术。常规选育技术周期长，不定向，优异性状难控制；相比之下，转基因技术更快速，可以定向改良单一性状。因此，利用分子生物学技术改造农作物，提高农作物的抗旱能力已经成为近年来的研究热点。

干旱是非生物逆境胁迫中的重要因子之一。在干旱胁迫下，农作物产量均会遭受不同程度的影响，重旱时甚至会导致农作物颗粒无收。大豆是我国重要的粮食作物和油料作物，也是我国供需矛盾最为突出的农作物。由于大豆在生长发育过程中需水量较多，在豆类作物中对缺水最敏感。干旱逆境胁迫会严重影响大豆产量。因此，提高大豆抗旱能力对于大豆高产具有重要意义。

自1988年Hinchee等获得抗草甘膦大豆后，美国Monsanto公司获得了抗不同基因的除草剂大豆，得到了大面积产业化，但还没有抗干旱、高盐等逆境胁迫的转基因大豆获得并应用于生产。

发明内容

本发明的目的是提供一种大豆GmSYP24蛋白及其编码基因在调节植物抗旱性中的应用。

本发明所提供的应用，具体为由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质（GmSYP24蛋白）或其编码基因（GmSYP24基因）在调控植物抗旱性中的应用。

所述GmSYP24蛋白或其编码基因调控植物抗旱性具体体现为：促进所述GmSYP24蛋白或其编码基因的表达，则所述植物的抗旱性提高。

由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质（GmSYP24蛋白）或其编码基因（GmSYP24基因）在选育抗旱性提高的植物品种中的应用也属于本发明的保护范围。

在实际应用中，当所选育抗旱性提高的植物品种时，需将所述GmSYP24蛋白表达量较高的植株作为亲本进行杂交。

本发明的再一个目的是提供一种培育抗旱性提高的转基因植物的方法。

本发明所提供的培育抗旱性提高的转基因植物的方法，可为如下a）和b）的步骤：

a）向目的植物中导入由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因（GmSYP24基因），得到表达所述编码基因的转基因植物；

b）从步骤a）所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗旱性提高的转基因植物。

在上述的应用或方法中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因（GmSYP24基因）是如下（1）至（4）中任一所述的DNA分子：

（1）编码序列为序列表中序列1的第49-699位的DNA分子；

（2）序列表中序列1包含的DNA分子；

（3）在严格条件下与（1）或（2）所限定的DNA分子杂交且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子；

（4）与（1）-（3）任一限定的DNA分子具有90%以上同源性且编码由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的DNA分子。

其中，序列1由775个核苷酸组成，其中第49-699位为所述GmSYP24基因的编码序列（ORF），编码序列表中序列2所示的蛋白质，序列2由216个氨基酸残基组成。

在所述方法中，所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因（GmSYP24基因）是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

所述重组表达载体可用现有的植物表达载体构建。所述植物表达载体包括双元农杆菌载体和可用于植物微弹轰击的载体等，如pGreen0029、pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、pBI121、pBin19、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN或其它衍生植物表达载体。所述植物表达载体还可包含外源基因的3’端非翻译区域，即包含聚腺苷酸信号和任何其它参与mRNA加工或基因表达的DNA片段。所述聚腺苷酸信号可引导聚腺苷酸加入到mRNA前体的3’端。使用所述基因构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，例如花椰菜花叶病毒（CAMV）35S启动子、泛素基因Ubiquitin启动子（pUbi）、胁迫诱导型启动子Rd29A等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建重组表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用重组表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因、具有抗性的抗生素标记物或是抗化学试剂标记基因等。也可不加任何选择性标记基因，直接以逆境筛选转化植株。

所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子可为35S启动子。

在本发明中，所述启动子具体为CaMV35S启动子。

更为具体的，所述重组表达载体为将所述GmSYP24基因正向插入到pCXSN载体的酶切位点XcmI处后得到的重组质粒。在该重组表达载体中，启动所述GmSYP24基因转录的启动子为所述CaMV35S启动子。

在上述方法中，将携带有所述GmSYP24基因的所述重组表达载体导入所述目的植物，具体可为：通过使用Ti质粒、Ri质粒、植物病毒载体、直接DNA转化、显微注射、电导、农杆菌介导等常规生物学方法转化植物细胞或组织，并将转化的植物组织培育成植株。

在上述应用或方法中，所述植物可为双子叶或单子叶植物。

在本发明的一个实施例中，所述植物为双子叶植物烟草，具体为烟草品种（Nicotianabenthaminana）。

本发明构建出由CaMV35S启动子驱动基因GmSYP24表达的植物表达载体，并通过转化模式植物烟草及在转基因烟草中的功能分析发现，在正常供水条件下，野生型烟草、转空载体烟草与转基因烟草株系生长状态良好，但是转基因烟草叶片比野生型烟草、转空载体烟草叶片绿。在干旱胁迫条件下，野生型烟草叶片和转空载体烟草叶片比转基因烟草叶片更容易萎蔫、黄化。转基因烟草植株比野生型烟草和转空载体烟草的生长状态好。暗示大豆GmSYP24基因为潜在的大豆抗旱基因，为后续在大豆中过表达该基因，获得抗旱转基因大豆新品种奠定了基础。本发明对于缓解粮食危机，节约水资源，降低农业灌溉成本等具有重要意义。

附图说明

图1为T₀代GmSYP24转基因烟草的PCR检测。其中，泳道M为DNA分子量标准Trans2KDNAMarker；泳道1-9为T₀代GmSYP24转基因烟草；泳道10为转入pCXSN空载体的烟草；泳道11为未转基因的野生型烟草对照；泳道12为阳性对照（pCXSN-GmSYP24质粒）。

图2为5个GmSYP24转基因烟草纯合株系的实时荧光定量PCR检测结果。

图3为正常供水条件下GmSYP24转基因烟草纯合株系、转入pCXSN空载体的烟草与未转基因的野生型烟草的生长状况。其中，A为GmSYP24转基因烟草纯合株系TL11；B为转pCXSN空载体的转基因烟草（TL0）；C为未转基因的野生型烟草（WT）。

图4为干旱胁迫下GmSYP24转基因烟草纯合株系、转入空载体的烟草与未转基因的野生型烟草的生长状况。其中，A为GmSYP24转基因烟草纯合株系TL11；B为GmSYP24转基因烟草纯合株系TL10；C为转pCXSN空载体的转基因烟草（TL0）；D为未转基因的野生型烟草（WT）。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

pCXSN载体：购自TheArabidopsisBiologicalResourceCenter，Stock#：CD3-1250。pCXSN载体经限制性内切酶XcmI酶切后会形成具有3’突出T碱基的线性TA克隆载体。

烟草（Nicotianabenthaminana）：参见“HuangFC,SchwabW.MolecularcharacterizationofNbEH1andNbEH2,twoepoxidehydrolasesfromNicotianabenthamiana.Phytochemistry,2013,90:6-15.”一文。

农杆菌GV3101：参见“FigueiredoJFL,LahayeT,GrahamJH,WhiteFF,JonesJB.Agrobacterium-mediatedtransientexpressionincitrusleaves:arapidtoolforgeneexpressionandfunctionalgeneassay.PlantCellReport,2011,30:1339-1345.”一文。

实施例1、大豆GmSYP24基因的克隆

用Trizol法提取大豆（Glycinemax（L.）Merr.）品种晋豆21号的总RNA，并反转录为cDNA，以其为模板，利用如下引物对进行PCR扩增。

上游引物：5’-ACATCATTTCCCACTCCCG-3’（序列1的第1-19位）；

下游引物：5'-GGACCTATGTCCAAAAGTAACCA-3'（序列1的第753-775位的反向互补序列）。

反应体系：模板cDNA2μL，上游引物（10μmol/L）0.5μL，下游引物（10μmol/L）0.5μL，10×Buffer2μL，氯化镁（25mM）1.2μL，dNTPs（2.5mM）0.4μL，DNA聚合酶（5U/μL）0.2μL，无菌水补足至20μL。

反应程序：94℃预变性5min；94℃变性0.5min，58℃退火0.5min，72℃延伸1min，30个循环；72℃终延伸10min；4℃保存。

反应结束后，通过琼脂糖凝胶电泳回收目的DNA片段（775bp），回收方法参照北京原平皓生物技术有限公司的DNA琼脂糖凝胶回收试剂盒，具体操作步骤详见说明书。

对PCR扩增产物进行序列测定，结果表明，所得PCR产物的序列为序列表中序列1所示，将该基因命名为GmSYP24。序列1编码序列表中序列2所示的蛋白质，将该蛋白命名为GmSYP24。

实施例2、GmSYP24转基因烟草的获得及鉴定

一、GmSYP24转基因烟草的获得

1、重组表达载体pCXSN-GmSYP24的构建

用限制性内切酶XcmI酶切pCXSN载体，得到具有3’突出T碱基的线性TA克隆载体。将酶切后的pCXSN线性载体与实施例1获得的纯化回收后的PCR产物（序列1）连接。

连接体系（10μL）：酶切后的pCXSN载体1μL，纯化回收后的PCR产物4μL，DNA连接酶5μL。其中，DNA连接酶为Takara公司产品，其产品目录号为6024。

16℃反应过夜。

用10μL连接产物转化大肠杆菌DH5α的感受态细胞，然后均匀涂布到含有卡那霉素的LB平板上，37℃倒置培养12-16小时。挑选转化平板上的单克隆菌落，摇菌，提取质粒，命名为pCXSN-GmSYP24。以实施例1中的上游引物和下游引物进行PCR扩增，对所提重组质粒进行检测，反应条件同实施例1。结果显示，经琼脂糖电泳检测产生大小为775bp的GmSYP24基因片段，与预期结果一致。

进一步，将重组质粒pCXSN-GmSYP24送样测序，测序结果表明，所得重组质粒pCXSN-GmSYP24为在pCXSN载体的酶切位点XcmI处正向插入序列表中序列1所示DNA片段后得到的重组质粒。

在重组表达载体pCXSN-GmSYP24中，启动所述GmSYP24基因转录的启动子为CaMV35S启动子（pCXSN载体自带）。

2、转化农杆菌

用冻融转化法（参见“余云舟，杜娟，王罡，季静.重组质粒导入根癌农杆菌冻融法的研究.吉林农业大学学报，2003，25(3):257-259.”一文）将步骤1获得的重组表达载体pCXSN-GmSYP24转化农杆菌GV3101。将所得重组农杆菌命名为GV3101/pCXSN-GmSYP24。

对重组农杆菌GV3101/pCXSN-GmSYP24进行PCR检测，采用引物为实施例1中的上游引物和下游引物，反应条件同实施例1。结果显示，经琼脂糖电泳检测产生大小为775bp的GmSYP24基因片段，与预期结果一致。同时设置转入pCXSN空载体的对照，将所得重组农杆菌命名为GV3101/pCXSN。

3、重组农杆菌转化烟草

按照“范媛媛，庞永珍，吴为胜等.双价抗虫植物表达载体p3300-bt-pta的构建及转基因烟草的初步检测.上海交通大学学报.2004,1671-9964.”一文中所述的叶盘法，将无菌培养的烟草（Nicotianabenthaminana.）的叶片与含有重组表达载体pCXSN-GmSYP24的农杆菌（GV3101/pCXSN-GmSYP24）共培养，将重组表达载体pCXSN-GmSYP24中的T-DNA（包括潮霉素抗性基因和GmSYP24基因）转入到烟草染色体组中，获得抗潮霉素的GmSYP24转基因烟草再生植株（T₀代）。同时设置转入农杆菌GV3101/pCXSN的空载体对照。

二、GmSYP24转基因烟草的鉴定

1、PCR分子检测

以步骤一获得T₀代的GmSYP24转基因烟草、转入pCXSN空载体的烟草、未转基因的野生型烟草（Nicotianabenthaminana.）为实验材料。分别剪取各烟草植株的叶片，参考《分子克隆实验指南（第三版）》（黄培堂,等译.《分子克隆实验指南》（第三版），北京：科学出版社，2002）方法提取叶片基因组DNA，以实施例1中的上游引物和下游引物进行PCR扩增，反应条件同实施例1。同时设置以pCXSN-GmSYP24质粒为模板的阳性对照。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。

结果如图1所示，从图中可以看出，步骤一获得的T₀代GmSYP24转基因烟草与作为阳性对照的pCXSN-GmSYP24质粒均扩增得到大小为775bp的目的条带，而未转基因的野生型烟草、转入pCXSN空载体的烟草均未得到目的扩增条带。证明目的基因GmSYP24已经整合到转基因烟草的基因组中。

2、实时荧光定量PCR检测

从经步骤1鉴定阳性的T₀代GmSYP24转基因烟草的各株系单株上收获种子，播种后，用浓度为10mg/L的潮霉素进行抗性筛选，所有自交后代均能正常生长（即所有后代均具潮霉素抗性）的亲本植株为纯合系，经过连续2代筛选，最终获得GmSYP24转基因烟草的纯合植株。

从所得的GmSYP24转基因烟草的纯合植株中随机选取5个株系，分别记为TL1、TL2、TL9、TL10和TL11。以这5个转基因株系、转入pCXSN空载体的烟草（TL0）和未转基因的野生型烟草（Nicotianabenthaminana.）（WT）为实验材料。剪取各烟草植株的叶片，分别提取总RNA，反转录获得cDNA，以cDNA为模板，用特异引物clmRTG24-F和clmRTG24-R对GmSYP24基因的cDNA进行实时荧光定量PCR扩增，以β-actin为内参，引物为actin-F和actin-R。实时荧光定量PCR在StepOnePlus^TM实时荧光定量PCR仪上进行，一次平行试验设3次重复。分析方法参照MIQEprécis（参见“BustinS,BeaulieuJF,etal.MIQEprécis:Practicalimplementationofminimumstandardguidelinesforfluorescence-basedquantitativereal-timePCRexperiments.BMCMolecularBiology.2010.11(1):74-79.”一文）。

用于扩增GmSYP24基因的引物：

clmRTG24-F：5’-TCTGGCTCATAGTCCGTCCG-3’（序列1的第215-234位）；

clmRTG24-R：5’-GCCTCTTGTTGGGGTTTCG-3’（序列1的第334-352位的反向互补序列）。

用于扩增β-actin基因的引物：

actin-F：5’-ATTGGACTCTGGTGATGGTG-3’；

actin-R：5’-TCAGCAGAGGTGGTGAACAT-3’。

结果如图2所示，从图中可以看出，未转基因的野生型烟草植株（WT）和转入pCXSN空载体的烟草（TL0）中均不表达GmSYP24基因；而5个GmSYP24转基因烟草纯合植株中GmSYP24基因的表达量都很高。

实施例3、GmSYP24转基因烟草的抗旱性鉴定

按照如下方法对实施例2中的5个GmSYP24转基因烟草纯合植株TL1、TL2、TL9、TL10和TL11进行抗旱性鉴定。具体操作如下：

1、分别将5个GmSYP24转基因烟草纯合植株TL1、TL2、TL9、TL10和TL11，转入pCXSN空载体的烟草（TL0），未转基因的野生型烟草（Nicotianabenthaminana.）的种子消毒后铺于1/2MS培养基中，长日照（16h光照/8h黑暗），22℃光照培养12天。各烟草植株同条件正常供水。

2、将各烟草幼苗移栽至营养土中长日照（16h光照/8h黑暗），22℃光照培养15天。各烟草植株同条件正常供水。

3、观察各烟草植株的表型，并拍照记录。

4、对各烟草植株停止浇水，进行干旱处理。

5、持续观察各烟草植株的表型，如叶片萎蔫程度，黄化程度等，并拍照记录。

实验重复三次。

结果显示：正常供水条件下，未转基因的野生型烟草、转入空载体烟草与GmSYP24转基因烟草纯合株系生长状态良好，但是GmSYP24转基因烟草纯合株系的生长期比野生型烟草和转入空载体烟草长，叶片更绿（图3）。干旱胁迫后，未转基因的野生型烟草和转入空载体烟草比GmSYP24转基因烟草纯合株系的长势差，野生型烟草、转入空载体烟草与GmSYP24转基因烟草纯合株系相比，叶片更易萎蔫，黄化，植株开花早，结荚率低（图4）。而转入pCXSN空载体的烟草（TL0）与未转基因的野生型烟草结果基本一致，无统计学差异。

以上结果表明，与野生型烟草和转入空载体烟草相比，GmSYP24转基因烟草对干旱胁迫的耐受性更强。

Claims

1.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在提高植物抗旱性中的应用；

所述植物为双子叶植物。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下(1)或(2)：

(1)编码序列为序列表中序列1的第49-699位的DNA分子；

(2)序列表中序列1所示的DNA分子。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为烟草。

4.由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质或其编码基因在选育抗旱性提高的植物品种中的应用；

所述植物为双子叶植物。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下(1)或(2)：

(1)编码序列为序列表中序列1的第49-699位的DNA分子；

(2)序列表中序列1所示的DNA分子。

6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于：所述双子叶植物为烟草。

7.培育抗旱性提高的转基因植物的方法，包括如下a)和b)的步骤：

a)向目的植物中导入由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因，得到表达所述编码基因的转基因植物；

b)从步骤a)所得转基因植物中得到与所述目的植物相比，抗旱性提高的转基因植物；

所述植物为双子叶植物。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是如下(1)或(2)：

(1)编码序列为序列表中序列1的第49-699位的DNA分子；

(2)序列表中序列1所示的DNA分子。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述由序列表中序列2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的编码基因是通过含有所述蛋白质的编码基因的重组表达载体导入所述目的植物中的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：所述重组表达载体中启动所述编码基因转录的启动子为35S启动子。

11.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：所述双子叶植物为烟草。