CN102477089B

CN102477089B - 与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因与应用

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Publication number: CN102477089B
Application number: CN 201010565795
Authority: CN
Inventors: 刘公社; 赵爱国; 程丽琴; 李晓峰; 陈双燕; 齐冬梅
Original assignee: Institute of Botany of CAS
Current assignee: Institute of Botany of CAS
Priority date: 2010-11-30
Filing date: 2010-11-30
Publication date: 2013-05-29
Anticipated expiration: 2030-11-30
Also published as: CN102477089A

Abstract

本发明公开了与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因与应用。本发明所提供的与植物耐低温性相关的蛋白是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与植物耐低温性相关的由(a)衍生的蛋白质。实验证明，LcWRKY5具有组织表达特异性，受低温诱导表达，可以参与羊草对多种逆境胁迫的响应，提高植物的抗逆性。LcWRKY5及其编码基因对于培育耐低温性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值。

Description

与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因与应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域中与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因与应用。

背景技术

低温胁迫是影响植物正常生长的主要障碍因子之一，植物尤其是经济作物的抗低温性强弱直接影响作物产量。目前抗冷基因的鉴定多集中于拟南芥、水稻等模式植物以及玉米和棉花等重要农作物。他们多为热带起源的植物，都不能忍受冷环境，0℃～12℃即造成伤害。因此，亟需从其它抗低温性强的植物中挖掘相关基因。我国是世界上生物多样性最丰富的国家和主要作物的起源中心之一，不仅植物遗传资源种类多，而且许多是适应恶劣极端环境的野生种，这些物种在抗寒、抗旱和耐盐碱等方面具有明显的优势，是当前和未来农业可持续发展的基础。羊草又名碱草，是欧亚大陆草原区东部草甸草原及干旱草原上的重要建群种之一。羊草为禾本科多年生草本植物，具有非常发达的地下横走根茎，根深可达1米～1.5米，主要分布在20厘米以上的土层中。羊草抗寒、抗旱，耐盐碱、耐土壤瘠薄，适应范围很广，在土壤冻结占全年一半时间的松嫩平原生长良好。羊草与抗冷有关基因的克隆及功能分析对提高农作物和经济作物的抗低温性方面有着一定的应用价值。

长期以来，人们对植物响应冷胁迫的机制已经从生理、生化、代谢、生态、以及遗传、进化等角度进行了很多研究，积累了丰富的知识。近年来，随着分子生物学的发展，人们进一步在基因组成、表达调控及信号传导等分子水平上加深了对植物抗冷机理的认识，为利用基因工程方法改良植物的抗低温性能提供了坚实的基础。由于植物抗逆性状的复杂性，采用传统的育种方法提高植物的抗低温性十分困难。转基因等基因工程方法为植物抗冷育种提供了有效途径，但高效抗冷基因的分离是限制植物抗冷基因工程的关键因素。

植物抗低温性受多基因调控，要使众多对植物抗逆性状产生作用的功能基因协调发挥作用，才能有效改良植物抗低温性。由于一个抗冷相关转录因子可以调控多个基因的表达，因此增强一个转录因子的作用，就可使植株的抗低温性状得到综合改善。

发明内容

本发明的一个目的是提供与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因。

本发明所提供的与植物耐低温性相关的蛋白，名称为LcWRKY5，来源于羊草(Leymus chinensis)，是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中序列1的氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且与抗逆性相关的由(a)衍生的蛋白质。

序列表中序列1由328个氨基酸残基组成。

为了便于LcWRKY5的纯化，可在由序列表中序列1的氨基酸残基序列组成的蛋白质的氨基末端或羧基末端连接上如表1所示的标签。

表1标签的序列

标签	残基	序列
			Poly-Arg	5-6(通常为5个)	RRRRR
Poly-His	2-10(通常为6个)	HHHHHH
			FLAG	8	DYKDDDDK
Strep-tag II	8	WSHPQFEK
			c-myc	10	EQKLISEEDL

上述b)中的LcWRKY5可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。上述b)中的LcWRKY5的编码基因可通过将序列表中序列2的自5′末端第1位-第984位碱基所示的DNA序列中缺失一个或几个氨基酸残基的密码子，和/或进行一个或几个碱基对的错义突变，和/或在其5′端和/或3′端连上表1所示的标签的编码序列得到。

所述与植物耐低温性相关蛋白的编码基因也属于本发明的保护范围。

所述与植物耐低温性相关蛋白的编码基因为如下1)-4)中任一所述的基因：

1)序列表中序列2自5’末端起第1位-第984位核苷酸所示的DNA分子；

2)序列表中序列2所示的DNA分子；

3)在严格条件下与1)或2)所示的DNA分子杂交且编码所述蛋白的基因；

4)与1)或2)或3)的基因具有90％以上的同源性且编码所述蛋白的基因。

上述严格条件可为用6×SSC，0.5％SDS的溶液，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列2由987个碱基组成，其开放阅读框架(ORF)为自5′末端第1位-第984位碱基，编码氨基酸序列是序列表中序列1所示的蛋白。

含有所述与植物耐低温性相关蛋白的编码基因的表达盒、重组表达载体、转基因细胞系或重组菌也属于本发明的保护范围。

所述重组表达载体是在p3301-121载体的多克隆位点间插入所述与植物耐低温性相关蛋白的编码基因得到的重组表达载体；

所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA3301载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收载体大片段；

(2)将pBI121载体经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含GUS基因的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GUS基因的片段连接，得到重组载体p3301-121。

所述pCAMBIA3301载体购自CAMBIA公司；所述pBI121载体购自Clontech公司。

所述重组菌为重组酵母菌。

扩增所述与植物耐低温性相关蛋白的编码基因全长或其任一片段的引物对也属于本发明的保护范围。

所述引物对中，一条引物序列如序列表中序列3所示，另一条引物序列如序列表中序列4所示。

本发明的另一个目的是提供一种培育转基因植物的方法。

本发明所提供的培育转基因植物的方法，是将所述与植物耐低温性相关蛋白的编码基因导入目的植物中，得到耐低温能力高于目的植物的转基因植物。

所述与植物耐低温性相关蛋白的编码基因是通过所述重组表达载体导入目的植物中。

所述目的植物为双子叶植物或单子叶植物；所述双子叶植物为拟南芥；

所述低温为0℃或4℃。

本发明提供了一个羊草LcWRKY5转录因子及其编码基因。实验证明，LcWRKY5具有组织表达特异性，受低温诱导表达，可以参与羊草对多种逆境胁迫的响应，提高植物的抗逆性。LcWRKY5及其编码基因对于培育耐低温性提高的羊草及其他植物新品种具有重要的理论和实际意义，可用于农牧业和生态环境治理所需的抗性植物品种的培育与鉴定，具有较高的实际应用价值。

附图说明

图1为经4℃低温处理的羊草幼苗总RNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图2为PCR扩增LcWRKY5基因全长cDNA的琼脂糖凝胶电泳检测结果。

图3为LcWRKY5基因在各种非生物胁迫处理条件下的诱导表达结果。

图4为LcWRKY5基因在各种激素处理条件下的诱导表达结果。

图5为LcWRKY5基因的组织特异性表达分析结果。

图6为酵母单杂验证LcWRKY5基因的转录激活功能结果。

图7为低温胁迫处理条件下转LcWRKY5基因拟南芥的生长情况。

图8为重组表达载体p3301-121-LcWRKY5的构建过程图。

图9为p3301-121载体的构建过程图。

图10为转LcWRKY5基因拟南芥植株的PCR鉴定结果。

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因的获得和功能验证

一、与植物耐低温性相关的蛋白及其编码基因的获得

1、植物材料处理及总RNA的提取

以羊草(吉生一号，购自吉林省吉生羊草良种站)幼苗为材料，4℃处理2小时后提取总RNA，进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1所示。所提取的RNA有两条明显的电泳条带，从上到下依次为28S RNA和18S RNA，表明获得了纯度较高、较完整的总RNA。

2、羊草LcWRKY5基因全长cDNA序列的获得及PCR检测

由GS-FLX 454(简称454)测序得到羊草WRKY转录因子的3’端序列。用获得的WRKY转录因子3’端cDNA序列在NCBI上进行BLAST比对，发现其同源基因在5’端很保守，故根据其同源基因翻译起始位置设计上游引物LcWRKY5F：5′-ATGGAAACGGCGCGGTGGT-3′，根据获得的WRKY转录因子3’端cDNA序列设计下游引物LcWRKY5R：5′-CTAATAATCCGGCAGCTTCCGCA-3′，以步骤1提取的经4℃处理的羊草幼苗的总RNA为模板，采用takara公司反转录试剂盒并参照试剂盒说明书，反转录合成其第一链cDNA。反应体系及条件如下：1μl RNA，1μl Oligo dT Primer(50μM)，Buffer，0.5μl RNase Inhibitor(40U/μl)，1μl dNTP Mix(10mM)，1μl

RTase(200U/μl)，11.5μl RNase free dH₂O；65℃ 2min，冰上2min，42℃1.5h，72℃ 7min。

以获得的第一链cDNA为模板，引物LcWRKY5F与引物LcWRKY5R配对进行PCR扩增；PCR反应体系为：1μl50X HIFI Polymerase(北京全式金生物技术有限公司)，33.5μl PCR-Grade Water，5μl 10X HIFI Polymerase Buffer II，4μl dNTP Mix(10mM)，2μlLcWRKY5F，2μl引物LcWRKY5R，2.5μlcDNA模板；反应条件为：先94℃30s，然后60℃30s，72℃90s，共35个循环；最后70℃延伸10min。

反应结束后，对PCR扩增产物进行1％琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图2所示。其中，泳道M为DL2000DNA分子量标准(北京全式金生物技术有限公司)的DNA分子量标准，泳道1为PCR扩增产物，结果表明，经PCR扩增获得了长度约为990bp的目的片段。回收并纯化PCR产物，将其连接到PMD-18T载体(购自TaKaRa公司)上，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，筛选阳性克隆进行菌液PCR鉴定，提取阳性克隆的质粒进行测序，对测序结果进行BLAST比对分析。结果表明，该片段的长度为987bp，该片段在3’端与上述获得的羊草WRKY转录因子的3’端序列完全相同，表明该片段可能为羊草WRKY转录因子的编码基因。借助Contig软件拼接得到LcWRKY5基因的全长cDNA序列，其核苷酸序列如序列表中序列2所示。序列表中序列2由987个碱基组成，自5’端第1位-第984位为其编码序列，编码具有序列表中序列1所示的氨基酸残基序列的蛋白质。序列表中序列1由328个氨基酸残基组成。将该基因命名为LcWRKY5，将其编码的蛋白命名为LcWRKY5。

二、LcWRKY5基因在不同非生物胁迫及激素处理条件下的表达模式分析

将正常生长9周的羊草(吉生一号，购自吉林省吉生羊草良种站)幼苗分别进行以下处理：不同非生物胁迫处理：低温(4℃)、高盐(400mM NaCl)、高温(42℃)和干旱(20％PEG)条件下分别处理3小时，同时设未经任何胁迫处理的羊草幼苗为对照(CK)；不同激素处理：100μM 6-苄基腺嘌呤(BAP)、100μM乙烯利(ETH)、100μM水杨酸(SA)、100μM茉莉酸甲酯(MJ)、100μM赤霉素(GA)和100μM脱落酸(ABA)分别处理6小时，同时设未经任何胁迫处理的羊草幼苗为对照(CK)。分别提取上述处理羊草幼苗的总RNA，分别使用LcWRKY5基因引物：

LcRKY5-1：5′-ACGCTAACCAGAGTTTCGC-3′和

LcWRKY5-2：5′-AGGAGTTGACGGAGATGGA 3′；

以Actin基因为内参，引物序列为：Actin-1：5′-TGGACTCTGGTGATGGTGTGAG-3′和Actin-2：5′-GTGCTAAGGGAGGCAAGGATG-3′，通过RT-PCR(94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，25个循环)方法分析LcWRKY5基因在不同非生物胁迫及激素处理条件下的表达模式，结果如图3和图4所示。结果表明，LcWRKY5基因具有一定的组成型表达，但其转录水平明显受低温(4℃)、干旱(20％PEG)和乙烯利(ETH)诱导。

三、LcWRKY5基因的组织特异性表达分析

分别提取正常生长9周的羊草幼苗的根、根茎、茎、叶和叶鞘五种组织的总RNA。分别使用LcWRKY5基因引物：

LcRKY5-1：5′-ACGCTAACCAGAGTTTCGC-3′和

LcRKY5-3：5′-AGGAGTTGACGGAGATGGA-3′；

以Actin基因为内参，引物序列为Actin-1和Actin-2，通过RT-PCR(94℃4min；94℃30s，60℃30s，72℃30s，25个循环)进行半定量分析。结果如图5所示。结果表明LcWRKY5基因在羊草幼苗的根和叶中较明显表达，在根茎、茎和叶鞘中的表达不明显。

四、酵母单杂验证LcWRKY5基因的转录激活功能

将上述步骤一扩增得到的LcWRKY5基因设计引物，加入Ecor I和SalI酶切位点，引物序列如下：

引物1：5′-CGGAATTCATGGAAACGGCGCGGTGGTC-3′(下划线部分为EcoRI酶切位点)，

引物2：5′-GCGTCGACCTAATAATCCGGCAGCTTCC-3′(下划线部分为SalI酶切位点)，

以人工合成的序列表中序列2所示的LcWRKY5基因为模板，进行PCR扩增，将扩增产物经EcoRI和BamHI酶切，回收酶切后的LcWRKY5基因片段；同时，用EcoRI和SalI酶切酵母表达载体pBridge-BD(Clotech公司)，回收载体大片段；将回收的载体大片段与回收的酶切后的LcWRKY5基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体pBridge-BD的EcoRI和SalI酶切位点间插入了序列表中序列2第1到984位所示的LcWRKY5基因片段，证明质粒构建正确，将得到的重组载体命名为pBridge-LcWRKY5。将重组载体pBridge-LcMYB13355导入到含有His3和LacZ报道子的酵母AH109株系(购自美国Clontech公司，商品目录号K1612-1)中，同时将酵母表达载体pBridge-BD转入酵母AH109株系作为转空载体对照(CK-)，将pGAL4(购自美国Clontech公司)转入酵母AH109株系作为正对照(CK+)。

将转基因酵母菌在不含组氨酸(His)和色氨酸(Trp)的SD培养基(SD/-His-Trp)上进行培养，然后后用β-半乳糖苷酶活性滤纸显蓝分析。结果如图6所示。图6中a表示转LcWRKY5基因的酵母菌株(WRKY5)、正对照的酵母菌株(CK+)以及转空载体对照酵母菌株(CK-)在缺少组氨酸和色氨酸的选择培养基生长状况；图6中b为图6中a的酵母用含有X-gal的Z-buffer显色后的情况，(β-半乳糖苷酶活性滤纸分析)。图6中c指示a和b中各酵母菌株的位置。结果表明，转空载体对照酵母菌株(CK-)在不含His和Trp的SD培养基上不能生长，而转LcWRKY5基因的酵母菌株(WRKY5)和正对照的酵母菌株(CK+)能够在不含His和Trp的SD培养基上生长并显蓝色。结果表明，LcWRKY5基因具有转录激活活性。

实施例2、转LcWRKY5基因拟南芥植株的耐低温性分析

一、获得转LcWRKY5基因拟南芥植株

根据上述实施例1扩增得到的LcWRKY5基因设计引物，加入BamHI和SmaI酶切位点，引物序列如下：

引物3：CGGGATCCATGGAAACGGCGCGGTGGTCG(下划线为BamHI位点)(序列表中序列3)，

引物4：TCCCCCGGGATAATCCGGCAGCTTCCGCAGG(下划线为SmaI位点)(序列表中序列4)，

以人工合成的序列表中序列2所示的LcWRKY5基因为模板，进行PCR扩增，将扩增得到的PCR产物克隆入pMD19-T Simple(TaKaRa公司)载体，命名为pMD19-LcWRKY5。将pMD19-LcWRKY5利用BamHI和SmaI进行双酶切，回收约1kb的片段，同时用BamHI和SmaI双酶切p3301-121载体回收大片段，将回收的载体大片段与回收的约1kb的LcWRKY5基因片段连接，得到目的质粒。将目的质粒转入大肠杆菌中，抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，提取阳性克隆质粒进行测序验证，测序结果表明在载体p3301-121的BamHI和SmaI酶切位点间插入了序列表中序列2第1到984位所示的LcWRKY5基因片段，证明质粒构建正确，将获得的含有LcWRKY5基因完整阅读框的植物双元表达载体，命名为p3301-121-LcWRKY5，构建过程如图8所示。构建好的植物表达载体p3301-121-LcWRKY5通过冻融法转入农杆菌EHA105(购自北京拜尔迪生物技术有限公司)，进行除草剂抗性筛选，挑取阳性克隆，将阳性克隆进行液体培养，用阳性克隆菌液浸染拟南芥花序来进行拟南芥转化，转化后暗培养2天，进行第二次浸染，然后正常培养到收获种子。收获的种子在含除草剂的平板(1/2MS+10mg/L草胺磷)上进行抗性筛选，筛选为阳性的苗，收获种子(T1)，收获的种子在含除草剂的平板上种植，筛选后代分离比为3∶1的株系，收获其种子(T2)，用其小苗(T3)来做抗逆实验。按照获得转LcWRKY5基因拟南芥的方法，将空载体p3301-121转化拟南芥植株，得到转空载体对照拟南芥植株。用来做抗逆实验的转基因拟南芥苗全部经过PCR检测，分别以转基因拟南芥苗和转空载体对照拟南芥植株的基因组DNA为模板，PCR检测用的引物为上述引物3和引物4。

PCR检测结果如图10所示(图10中，泳道1-5为不同的转基因株系，6为转空载体对照拟南芥植株，M为trans plus 2000Marker)，从图10中可见，不同的转基因株系均扩增得到了长度约为984bp的片段，而转空载体对照拟南芥植株未扩增到该片段。用同样的引物对野生型拟南芥植株进行PCR检测，未得到上述扩增片段。此结果表明，转基因株系均为阳性。

所述p3301-121载体是通过包括如下步骤的方法得到的：

(1)将pCAMBIA3301载体(购自CAMBIA公司)经过HindIII和EcoRI双酶切，回收11246bp的载体大片段；

(2)将pBI121载体(购自Clontech公司)(含35S启动子，GUS报告基因，Tnos)也经过HindIII和EcoRI双酶切，回收包含GUS基因的2942bp的片段；

(3)将步骤(1)中回收的载体大片段与步骤(2)中回收的包含GUS基因的片段经T4DNA酶连接，得到重组载体p3301-121(图9)。

二、转LcWRKY5基因拟南芥植株的抗低温性分析

将上述步骤一获得的转LcWRKY5基因拟南芥植株的种子、转空载体对照拟南芥植株的种子和野生型拟南芥种子分别种于含除草剂培养基(1/2MS+10mg/L草胺磷)上，萌发生长(生长条件为：温度为22-24℃，16小时光照-8小时黑暗的光周期，空气湿度为60％-80％)一周后，移栽到土中，在培养室培养(培养室培养的条件：温度为22-24℃，16小时光照-8小时黑暗的光周期，空气湿度为50-60％)一周后，在0℃进行低温胁迫处理。胁迫处理4小时后开始观察表型，观察到胁迫处理第7天。从胁迫处理开始时计起第7天时，野生型拟南芥植株有95％的植株出现叶片失水萎蔫症状，叶片颜色变暗黄绿色，并皱缩(图7中A)；而转LcWRKY5基因拟南芥苗植株有90％的植株生长正常，没有出现叶片失水萎蔫症状(图7中B)，转空载体对照拟南芥植株与野生型拟南芥植株的表型一致。将低温胁迫处理后的转LcWRKY5基因拟南芥植株，放入正常生长条件下恢复生长14天，观察植株表型，95％的植株都生长正常；而将转空载体对照植株和野生型植株低温胁迫处理后，放入正常生长条件下恢复生长14天，均不能恢复正常生长。实验设3次重复，结果均与上述一致。该实验结果表明转LcWRKY5基因拟南芥与转空载体对照拟南芥和野生型拟南芥相比，具有更强的耐低温能力。