CN103214566A - 一种g因子的分离纯化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种G因子的分离纯化方法，其包括从鲎全血中分离提取血细胞步骤及将血细胞崩解后利用亲和层析法对鲎血细胞中包括G因子的各种血细胞成分进行初级分离纯化的步骤，其还包括对初级分离纯化所得的主要含G因子的合并组分进一步分离纯化的步骤，籍以制备去除凝固原的高纯度G因子组分。本发明的技术方案实现了对鲎资源的充分利用，同时克服了凝固原难以从G因子组分中除去的难题。

Description

一种G因子的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及鲎试剂的技术领域，特别是一种G因子的分离纯化方法。

背景技术

1968年Levin J和Bang F B创建鲎试剂以来，使内毒素的检测成为灵敏、快速、简便的方法，已被举世公认，并被美、日、中、欧洲药典以《细菌内毒素试验》收载。但1981年日本学者Kakinuma A发现非热原物质（1-3）-β-D-葡聚糖也可使鲎试剂凝聚，这极大影响了普通鲎试剂检测内毒素的特异性，因而目前检测内毒素的鲎试剂主要为特异鲎试剂，其生产工艺的特点是利用亲和层析方法将普通鲎试剂中存在的可以和（1-3）-β-D-葡聚糖产生凝聚反应的G因子分离去除，如本发明人申请的中国专利CN1621841A中披露的“抗干扰鲎试剂的制备工艺”。

因为葡聚糖是真菌细胞壁的主要成分，而患者的真菌感染检测在医学上一直是个难题，所以葡聚糖与G因子发生凝聚反应的原理很快被用于真菌感染的检测上，如本发明人申请的中国专利CN101880706A披露的“一种直接真菌检测鲎试剂盒及方法”。该检测方法对G因子的纯度要求较高，尤其是鲎血细胞中含有的凝固原（coagulogen）不能混杂其中，而常规亲和层析法分离的G因子和凝固原是在同一区间洗脱的，因此G因子的合并组分中通常含有凝固原组分，并不能直接作为真菌检测的试剂来使用。所以，要么以获取高纯度G因子组分为目标开发一种从鲎全血中特异性分离纯化G因子的方法，要么以特异鲎试剂生产过程中产生的含有凝固原的G因子合并组分为基础发明进一步分离纯化的方法。显然，后一种方法更能够充分利用宝贵的鲎资源，但是从G因子组分中去除性质相近的凝固原是一个技术难题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种G因子的分离纯化方法，其包括从鲎全血中分离提取血细胞步骤及将血细胞崩解后利用亲和层析法对鲎血细胞中包括G因子的各种血细胞成分进行初级分离纯化的步骤，其还包括对初级分离纯化所得的主要含G因子的合并组分进一步分离纯化的步骤，籍以制备去除凝固原的高纯度G因子组分。

该进一步分离纯化的步骤为：

第一步：制备ConA-Sepharose琼脂糖凝胶柱，该ConA-Sepharose琼脂糖凝胶柱规格为柱为Ф2×16cm，用含有pH=8.0、0.25 mol/L NaCl的20 mM Tris-HCl 溶液进行预平衡，接着以上述主要含G因子的合并组分作为样品上样；

第二步：用0.5 mol/L NaCl溶液充分冲洗及0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl-α-D-glucoside溶液洗脱，该0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl-α-D-glucoside溶液用pH=8.0、20 mM Tris-HCl 溶液配制；

第三步：收集第二步产生的洗脱液，用Amicon PM-10超滤膜浓缩；

第四步：收集第三步产生的浓缩液，用Sephacryl S-200HR柱进一步提纯，该Sephacryl S-200HR柱为Ф2.7×98cm，用pH8.0、50mM Na₃PO₄缓冲液预平衡；

第五步：收集第四步产生的高纯度G因子合并组分，用冷冻干燥机低温浓缩。

本发明的技术方案实现了对鲎资源的充分利用，同时克服了凝固原难以从G因子组分中除去的难题。

附图说明

图1为本发明的ConA-Sepharose琼脂糖凝胶柱洗脱曲线。

图2为本发明的Sephacryl S-200HR柱洗脱曲线。

具体实施方式

本发明揭示一种G因子分离纯化方法，其包括从鲎全血中分离提取血细胞步骤及将血细胞崩解后利用亲和层析法对鲎血细胞中包括G因子的各种血细胞成分进行初级分离纯化的步骤，还包括对初级分离纯化所得的主要含G因子的合并组分进一步分离纯化的步骤，籍以制备去除凝固原的高纯度G因子组分。

如中国专利申请CN1632580A中的具体实施方式部分披露的，典型的从鲎全血中分离提取血细胞步骤及将血细胞崩解后利用亲和层析法对鲎血细胞中包括G因子的各种血细胞成分进行初级分离纯化的步骤为：

活鲎加抗凝剂采血后，于1000rpm下离心，弃上清液，收集细胞，再加入含NaCl 3 mol/L和Tris-HCl 0.05 mol/L pH 8.0的洗涤液洗涤，弃去上清液；收集的细胞加入含有NaCl 0.1 mol/L和Tris-HCl 0.02 mol/L pH 8.0的崩解液进行细胞崩解，之后进行离心，收集提取液；提取液进行亲和层析，用不同盐浓度的NaCl和Tris-HCl洗脱液洗柱，收集洗脱液；对洗脱液进行鉴别后，将相同成分的洗脱液进行合并。

再如，初级分离纯化的步骤还可以如中国专利申请CN1621841A中的具体实施方式部分披露的：采用亲和层析法，利用凝胶Dextran sulfate Sepharose CL-6B制备的无菌无热原亲和层析柱以及收集分离成份的设备，将鲎血细胞中各因子如C因子、B因子、G因子、抗内毒素因子、凝固酶原等成份分别分离出来。

在利用上述技术方案或本领域技术人员熟知的类似技术方案获得主要含G因子的合并组分后，本发明的技术方案进行进一步的分离纯化步骤，在本实施例中采取的具体步骤为：

第一步：制备ConA-Sepharose琼脂糖凝胶柱，该ConA-Sepharose琼脂糖凝胶柱规格为柱为Ф2×16cm，用含有0.25 mol/L NaCl的pH=8.0、20 mM Tris-HCl 溶液进行预平衡，接着以上述主要含G因子的合并组分作为样品上样；

第二步：用0.5 mol/L NaCl溶液充分冲洗及0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl-α-D-glucoside溶液洗脱，该0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl-α-D-glucoside溶液用pH=8.0、20 mM Tris-HCl 溶液配制。参阅图1所示的ConA-Sepharose琼脂糖凝胶柱洗脱曲线可知，G因子与凝固原的洗脱峰重叠（图1中空心圆圈连成的洗脱峰所示），图1中的α-MG是甲基葡萄糖苷methyl-α-D-glucoside的简写；

第三步：收集第二步产生的洗脱液，用Amicon PM-10超滤膜浓缩。“第二步产生的洗脱液”指图1中0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl-α-D-glucoside溶液洗脱的洗脱液，不包括0.5 mol/L NaCl溶液充分冲洗产生的溶液；

第四步：收集第三步产生的浓缩液，用Sephacryl S-200HR柱进一步提纯，该Sephacryl S-200HR柱为Ф2.7×98cm，用pH 8.0、50mM Na₃PO₄缓冲液预平衡。参阅图2所示的Sephacryl S-200HR柱洗脱曲线，可见第二步中亦即图1中所示的洗脱峰重叠的G因子与凝固原两个组分明显分开（图2中空心圆圈连成的洗脱峰表示G因子组分）；

第五步：收集第四步产生的高纯度G因子合并组分，用冷冻干燥机低温浓缩。

上述步骤中，ConA-Sepharose琼脂糖凝胶柱填料购买自美国Bio-Rad公司，Amicon PM-10超滤膜购买自美国Millipore公司，Sephacryl S-200HR柱填料购买自美国GE公司，其他试剂及耗材均为本领域技术人员熟知。

上述仅为本发明的具体实施例，但本发明的设计构思并不局限于此，凡利用此构思对本发明进行非实质性的改动，均应属于侵犯本发明保护范围的行为。

Claims (1)

1.一种G因子的分离纯化方法，其包括从鲎全血中分离提取血细胞步骤及将血细胞崩解后利用亲和层析法对鲎血细胞中包括G因子的各种血细胞成分进行初级分离纯化的步骤，其特征在于：还包括对初级分离纯化所得的主要含G因子的合并组分进一步分离纯化的步骤，籍以制备去除凝固原的高纯度G因子组分；

该进一步分离纯化的步骤为：

第一步：制备ConA-Sepharose琼脂糖凝胶柱，该ConA-Sepharose琼脂糖凝胶柱规格为柱为Ф2×16cm，用含有pH=8.0、0.25 mol/L NaCl的20 mM Tris-HCl溶液进行预平衡，接着以上述主要含G因子的合并组分作为样品上样；

第二步：用0.5 mol/L NaCl溶液充分冲洗及0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl-α-D-glucoside溶液洗脱，该0.5 mol/L甲基葡萄糖苷methyl-α-D-glucoside溶液用pH=8.0、20 mM Tris-HCl ()溶液配制；

第三步：收集第二步产生的洗脱液，用Amicon PM-10超滤膜浓缩；

第四步：收集第三步产生的浓缩液，用Sephacryl S-200HR柱进一步提纯，该Sephacryl S-200HR柱为Ф2.7×98cm，用pH 8.0、50mM Na₃PO₄缓冲液预平衡；

第五步：收集第四步产生的高纯度G因子合并组分，用冷冻干燥机低温浓缩。

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