CN111511756B - 使用烷基糖苷类进行蛋白质纯化和病毒灭活 - Google Patents
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Abstract
纯化重组蛋白的方法，包括以下步骤：i)提供包含所述重组蛋白的溶液；ii)添加烷基糖苷到所述溶液中；和iii)纯化所述重组蛋白。烷基糖苷的添加提供了对与过程相关的杂质的清除改善。本发明的纯化的重组蛋白具有低水平的宿主细胞DNA、宿主细胞蛋白质和病毒污染。
Description
技术领域
本发明属于重组表达多肽的领域，特别是这些多肽的纯化以用于药物用途。
背景技术
重组表达的多肽的大规模、经济的纯化对于生物技术工业而言日益成为重要的问题。这些多肽是通过细胞培养产生的，通常使用哺乳动物、酵母或细菌细胞系，通过插入含有该多肽的基因的重组质粒，所述细胞系经工程改造以生产目的多肽。将所需多肽与细胞组分例如宿主细胞DNA和蛋白质分离至足以用作人用治疗剂的纯度构成一个艰巨的挑战。理想地，所使用的纯化技术将是可规模化的、有效的、具有成本效益的、可靠的，并且满足最终产品的任何纯度要求。当前的纯化技术通常涉及多次层析分离。典型的处理可能包括所有或至少一些以下步骤：沉淀，超滤，渗滤，免疫亲和以及亲和层析，阳离子交换层析，阴离子交换层析，疏水相互作用层析，多元层析，金属螯合层析和尺寸排阻层析。
使用重组技术，特别是用哺乳动物细胞系制造的多肽也可能被病毒污染，包括对健康有害的病原性病毒。如果所述多肽将要施用于个体，则消除任何污染性病毒活性是重要的。当前有许多不同的方法用于灭活病原性病毒，包括例如湿或干热灭活、溶剂/去污剂(S/D)灭活、pH灭活、化学灭活和/或紫外线/γ射线灭活。在这些方法中，S/D灭活可能是使用最广泛的杀病毒方法，因为几乎所有重要的人类病原体都是对溶剂和去污剂的膜破坏敏感的包膜病毒。在S/D灭活方法中，将有机溶剂和去污剂与包括被纯化的多肽的流体混合和孵育。溶剂创造了促进去污剂和包裹病毒的脂质膜之间聚集的环境，而去污剂破坏了在该脂质膜中分子之间的相互作用。一旦被破坏，包膜病毒不再结合并感染细胞，并且无法繁殖，因为完整的脂质膜对于这些活性至关重要。根据世界卫生组织(WHO)指南使用的典型条件是0.3％磷酸三正丁酯(TNBP)和1％聚山梨酯80(PS 80，也称为聚氧乙烯(80)脱水山梨醇单油酸酯或80)在24℃孵育最少6个小时，或0.3％TNBP和1％聚氧乙烯辛基苯基醚(X-100)在24℃孵育最少4小时(参见参考文献1)。
尽管S/D处理已成为灭活包膜病毒的标准技术，但其应用仍存在一些缺点。在产生最终产品之前，必须基本上去除制造期间添加的S/D混合物。例如，TNBP在所使用的浓度构成健康风险，因此对于制造过程和最终产品而言是一个健康和安全问题。此外，常规使用的去污剂例如X-100构成严重的环境威胁并不得不停用。这种病毒灭活步骤的加入还增加了处理时间，可能使产品产率降低多达10％(参见参考文献2)，并且需要仪器在孵育期间搅动混合物。为了最小化或消除这些问题，已经提出了更简单、更有效的病毒灭活程序。常见的选择涉及使用脂肪酸辛酸(辛酸酯)，例如在参考文献2、3和4中提出的。在参考文献5和6中描述了其他选择。特别地，参考文献6测试了建议在环境上更相容的多种去污剂。使用不同的去污剂对病毒灭活的效果是可变的。而且，尽管特定的去污剂可能能够使病毒灭活，但是不能预测其对进一步纯化方法的影响，例如在DNA或宿主细胞蛋白质减少方面。
因此，需要纯化重组表达的多肽的进一步和改善的方法，尤其是实现减少的DNA和蛋白质污染并灭活病原性病毒的方法。
发明内容
本发明基于向重组多肽中添加烷基糖苷的纯化方法。本发明人已经发现，烷基糖苷，特别是正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷，在纯化步骤(例如当在纯化步骤之前添加到进料中时)期间可以提供与过程相关的杂质的改善的清除率。例如，本发明人已经发现，与使用诸如TNBP/PS80之类的替代试剂或对照缓冲溶液相比，层析纯化步骤的进料流中存在烷基糖苷可以导致在洗脱液阶段显著更低的宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白质水平。而且，烷基糖苷即使在没有任何搅拌而存在短时间时也能够有效的病毒灭活，从而减少了处理时间和成本。所述方法可以在广泛的工艺参数下进行，同时保持这种有效的病毒灭活。除了正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷以外，本发明人已经发现正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-麦芽糖苷，正十二烷基-β-D-麦芽糖苷，正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷和正癸基-β-D-麦芽糖苷是用于本发明的特别有效的烷基糖苷。
因此，本发明提供了纯化重组多肽的方法，包括以下步骤：i)提供包含所述重组多肽的溶液；ii)添加烷基糖苷到所述溶液中；和iii)纯化所述重组多肽。
所述重组多肽通常将包含在溶液中，所述溶液进一步包含可测量的量的宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质。在这些实施方案中，本发明提供了分离所述重组多肽与宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质的方法，其中步骤(iii)导致这种分离。与没有烷基糖苷的相同方法相比，添加烷基糖苷到溶液中可以改善这种分离，例如将分离改善至少10％(尤其是至少20％)。本发明人已经发现，当通过对溶液进行层析的步骤执行步骤(iii)时，能够实现特别有效的分离。层析可以选自任何合适的层析，例如免疫亲和层析、亲和层析、疏水相互作用层析、离子交换层析、多元层析(multimodal chromatography)、尺寸排阻层析或金属螯合层析。在以下进行本发明的方式中，本发明人特别使用了免疫亲和层析的步骤。疏水相互作用层析和/或离子交换层析也是特别有用的。
添加到包含重组多肽的溶液中的烷基糖苷在该溶液中的浓度可以优选地是0.1至1000mM(例如1至500mM、3至400mM、5至200mM、10至100mM、20至90mM)，并且通常是约25至80mM。
当通过对溶液进行层析的步骤来执行步骤(iii)时，烷基糖苷可以另外地包含在层析步骤的洗涤缓冲液中。在其他实施方案中，在层析步骤的洗涤缓冲液中包含烷基糖苷可以用作以单独步骤进行步骤(ii)的替代方案。在这些实施方案中，本发明因此提供了纯化重组多肽的方法，包括以下步骤：i)提供包含重组多肽的溶液；和iii)通过对溶液进行层析的步骤来纯化所述重组多肽，其中在层析步骤的洗涤缓冲液中包含烷基糖苷。与使用没有烷基糖苷的相应洗涤缓冲液的参考方法相比，通过在层析的洗涤缓冲液中包含烷基糖苷可以进一步降低宿主细胞DNA水平和/或宿主细胞蛋白质(HCP)水平和/或其他蛋白质杂质。
可以在方法中包括进一步的纯化步骤，这样的步骤可以在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前或在步骤(iii)之后。纯化步骤通常是层析的步骤。层析可以选自任何合适的层析，例如免疫亲和层析、亲和层析、疏水相互作用层析、离子交换层析、多元层析、尺寸排阻层析或金属螯合层析。
例如，方法中可以包括一个或多个疏水相互作用层析步骤。通常，在步骤(iii)之后对溶液进行疏水相互作用层析步骤，特别是当步骤(iii)是免疫亲和层析步骤时。类似地，方法中可以包括一个或多个离子交换层析步骤。通常，在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前，对溶液进行离子交换层析步骤。也可以在步骤(iii)之后对溶液进行离子交换层析步骤，特别是当步骤(iii)是免疫亲和层析步骤时。在该实施方案中，免疫亲和层析步骤之后通常是疏水相互作用层析步骤(如上所述)，其后是离子交换层析步骤。
例如，本发明人发现，将重组多肽与宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质分开的一种特别有效的方法包括以下步骤：a)提供包含所述重组多肽的溶液；b)通过对溶液进行离子交换层析步骤来纯化重组多肽；c)添加烷基糖苷到溶液中；d)通过对溶液进行免疫亲和层析的步骤来纯化所述重组多肽；e)通过对溶液进行疏水相互作用或多元层析的步骤来纯化所述重组多肽；和f)通过对溶液进行离子交换层析的进一步步骤来纯化所述重组多肽。
因此，本发明在纯化溶液中的重组多肽的方法中提供了改善，所述改善包括添加烷基糖苷到溶液中。这种添加可以导致在该方法之后减少的宿主细胞DNA和/或蛋白质污染。另外地或可替代地，添加可以提供有效的病毒灭活。此外，可以改善通过该方法获得的重组多肽的产率。
本发明还提供了烷基糖苷作为添加剂用于包含重组多肽的溶液中的用途。该用途可导致在随后纯化重组多肽之后减少的宿主细胞DNA和/或蛋白质污染。另外地或备选地，该用途可以提供有效的病毒灭活。
本发明的方法可以提供重组多肽的溶液，其中包含宿主细胞DNA污染的水平小于5000pg/ml(例如≤4000pg/ml、≤3000pg/ml、≤2500pg/ml、≤2000pg/ml、≤1500pg/ml、≤1000pg/ml、≤500pg/ml、≤200pg/ml、≤100pg/ml、≤50pg/ml等)。通常，宿主细胞DNA污染的水平小于500pg/ml，特别是小于200pg/ml。
本发明的方法可以提供重组多肽的溶液，其与除了不使用烷基糖苷或除了采用常规S/D处理例如TNBP/PS 80以外与本发明的方法相同的参考方法相比，包含的宿主细胞DNA污染的水平减少至少1.5，优选地至少2、至少5、至少10、至少20、至少50、至少100、至少150或至少200倍。
本发明的方法可以提供重组多肽的溶液，优选地在根据步骤iii)的重组多肽纯化之后，与优选地根据步骤iii)的重组多肽纯化之前宿主细胞DNA污染的水平相比，包含的宿主细胞DNA污染水平减少至少10，优选地至少100、至少1000、至少10,000、至少15,000、至少20,000或至少25,000倍。例如，当步骤(iii)是免疫亲和层析步骤时，可以看到这种降低。
本发明的方法可以提供重组多肽的溶液，其中包含的宿主细胞蛋白质(HCP)污染水平小于5000ng/ml(例如≤4000ng/ml、≤3500ng/ml、≤3000ng/ml、≤2500ng/ml、≤2000ng/ml、≤1800ng/ml、≤1500ng/ml、≤1000ng/ml等)。通常，宿主细胞蛋白质污染的水平小于5000ng/ml，特别是小于3000ng/ml。
本发明的方法可以提供重组多肽的溶液，当与除了不使用烷基糖苷或除了常规S/D处理例如TNBP/PS 80以外与本发明的方法相同的参考方法相比，包含的宿主细胞蛋白质(HCP)污染的水平减少至少1.5，优选地至少2、至少2.5、至少3或至少3.5倍。
本发明的方法可以提供重组多肽的溶液，优选地在根据步骤iii)纯化重组多肽之后，其与纯化重组多肽(优选地根据步骤iii))之前宿主细胞DNA污染的水平相比，包含的宿主细胞蛋白质(HCP)污染水平减少至少10，优选地至少100、至少200、至少300、至少400、至少500、至少700、至少800、至少900或至少1,000倍。例如，当步骤(iii)是免疫亲和层析步骤时，可以看到这种降低。
特别地，本发明的方法可以提供重组多肽的溶液，其中：(a)宿主细胞DNA污染的水平小于5000pg/ml(如上所述)；和(b)宿主细胞蛋白质(HCP)污染的水平小于5000ng/ml(如上所述)。
本发明的方法可以提供重组多肽的溶液，其与通过除了不使用烷基糖苷或除了使用常规S/D处理例如TNBP/PS 80之外与本发明的方法相同的参考方法获得的重组多肽的产率相比，获得的重组多肽的产率改善至少1.05、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9或至少2倍。
根据本文所述的一种或多种方法的重组多肽的溶液优选作为本文所述重组多肽的纯化的结果，特别是作为根据步骤iii)的纯化的结果提供。备选地或另外，烷基糖苷可以包含在层析步骤的洗涤缓冲液中。
本发明还提供了包含重组多肽和烷基糖苷的溶液，特别是从本发明方法的步骤(ii)获得或可获得的溶液。
本发明还提供了包含纯化的重组多肽的溶液，特别是从本发明的方法获得或可获得的溶液。所述溶液可以包含残留量的烷基糖苷。烷基糖苷的量可以低于检测限，例如当使用质谱分析时。例如，烷基糖苷的量可以小于1.5μg/ml(或小于40ng/mg纯化的重组多肽)。烷基糖苷的量尤其可以小于10ng/mg纯化的重组多肽。
本发明还提供了包含重组多肽的溶液，其中所述溶液包含的宿主细胞DNA污染的水平小于5000pg/ml(例如≤4000pg/ml、≤3000pg/ml、≤2500pg/ml、≤2000pg/ml、≤1500pg/ml、≤1000pg/ml、≤500pg/ml、≤200pg/ml、≤100pg/ml、≤50pg/ml等)。通常，宿主细胞DNA污染的水平小于500pg/ml，特别是小于200pg/ml。
本发明还提供了包含重组多肽的溶液，其中所述溶液包含的宿主细胞蛋白质污染的水平小于5000ng/ml(例如≤4000ng/ml、≤3500ng/ml、≤3000ng/ml、≤2500ng/ml、≤2000ng/ml、≤1800ng/ml、≤1500ng/ml、≤1000ng/ml等)。通常，宿主细胞蛋白质污染的水平小于5000ng/ml，特别是小于3000ng/ml。
本发明还提供了包含重组多肽的溶液，其中：(a)宿主细胞DNA污染的水平小于5000pg/ml(如上所述)；和(b)宿主细胞蛋白质污染的水平小于5000ng/ml(如上所述)。
本发明还提供了烷基糖苷作为添加剂用于包含重组多肽的溶液的用途，其中添加烷基糖苷而没有任何有机溶剂，例如TNBP。在本文中，有机溶剂可以例如是任何碳基溶剂。根据本发明，可以不与除水或缓冲水溶液等以外的溶剂预先混合而提供烷基糖苷。
本发明还提供了烷基糖苷作为洗涤缓冲液的添加剂用于本文所述的层析步骤的用途。
本发明还提供了用于层析步骤的洗涤缓冲液，其中缓冲液包含烷基糖苷作为添加剂。优选地将洗涤缓冲液配置为可用于纯化根据本发明的重组多肽的方法中。
烷基糖苷在这种洗涤缓冲液中的浓度可以是0.1至1000mM(例如0.2至500mM、0.5至300mM、1至200mM、1.5至100mM、2至80mM)，并且通常是约10至100mM。
因此，根据本发明的一个优选实施方案，提供了包含重组多肽的溶液，并且如果需要的话可以进行孵育；所述溶液用于加载层析柱并且在洗脱前用含有烷基糖苷的洗涤缓冲液洗涤柱。洗涤缓冲液中烷基糖苷的最终浓度通常是0.1至1000mM(例如，0.2至500mM、0.5至300mM、1至200mM、1.5至100mM、2至80mM)，并且通常是约10至100mM。本发明人已经发现在这种情况下，浓度也可以低于烷基糖苷的临界胶束浓度(critical micelleconcentration，CMC)。与使用没有烷基糖苷的相应洗涤缓冲液的参考方法相比，使用该洗涤程序可以将宿主细胞DNA和/或HCP和/或其他蛋白质杂质减少超过5倍、超过10倍、超过25倍、超过50倍或甚至超过100倍。在下面的实施例3中证明了这种蛋白质杂质的减少超过100倍。蛋白质杂质可以是例如目的重组多肽的一个或多个片段、目的重组多肽的前肽、任何共表达的蛋白质等
在本发明的另一方面，本发明人已经发现烷基糖苷当用于病毒灭活时具有特别有利的效果。包膜病毒对烷基糖苷敏感，并且与备选试剂例如TNBP/PS 80相比，烷基糖苷当在低温使用时灭活能力几乎没有损失或没有损失。它们甚至可以在没有搅拌，例如没有振摇的情况下使用。为此目的的示例性烷基糖苷为正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷和正癸基-β-D-麦芽糖苷，其中正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷特别有效。
本发明的该另一方面可以与本发明的用于纯化重组多肽的方法一起应用。例如，该方法的步骤ii)(即，添加烷基糖苷到包含重组多肽的溶液中)可以进一步包括孵育溶液。孵育导致溶液中可能存在的一种或多种病毒的灭活。可以如下所述进行孵育。病毒通常是从环境进入溶液或存在于制造溶液的材料中的污染性病毒。溶液中是否存在病毒可能是未知的，并因此本发明可以用于通过灭活溶液中可能存在的一种或多种病毒来降低病毒污染的风险。当溶液中存在病毒时，孵育导致这些病毒中一种或多种的灭活。
备选地，本发明的这个方面可以作为独立方法应用。以此方式，本发明提供了灭活包含重组多肽的溶液中可能存在的一种或多种病毒的方法，包括添加烷基糖苷到所述溶液中并孵育该溶液的步骤。所述一种或多种病毒通常是包膜病毒。孵育可以进行任何合适的时间长度，通常是达到有效病毒减少所需的时间长度。以log10表示的达到的病毒减少倍数可以例如是至少4。在典型的实施方案中，孵育进行1分钟至24小时，2分钟至12小时，优选地10分钟至5小时，并且通常约30分钟或更长时间。孵育在室温方便地进行，尽管在更低温度例如≤20℃，甚至在4至10℃也能达到好的结果。如果蛋白质对温度敏感，则这些更低的温度特别有利。孵育前烷基糖苷的终浓度通常是0.1至1000mM(例如1至500mM、3至400mM、5至200mM、10至100mM、20至90mM)，并且通常是约25至80mM。本发明人已经发现高于烷基糖苷的临界胶束浓度(CMC)的浓度是有用的，特别是对于病毒灭活。通常，浓度将是此CMC的1.5、2、3或4倍高。
上面已经对于包含重组多肽的溶液描述了灭活一种或多种病毒的该方法。然而，本领域技术人员将理解所述方法可以应用于任何合适的进料，特别是(人)血浆来源的材料等。血浆来源的材料特别容易受到病毒污染。因此，在更一般的方面，本发明提供了灭活溶液中可能存在的一种或多种病毒的方法，包括添加烷基糖苷到溶液中并孵育溶液的步骤。所述溶液可以特别地衍生自生物学组合物，例如全血、红细胞浓缩物、血小板浓缩物、白细胞浓缩物、血细胞蛋白质、血浆、富含血小板血浆、血浆浓缩物、来自血浆任何级分的沉淀物、来自血浆任何级分的上清液、血浆蛋白质级分、纯化的或部分纯化的血液蛋白质或其他组分、血清、精液、哺乳动物初乳、乳、唾液、胎盘提取物、冷沉淀、冷上清、细胞裂解液、哺乳动物细胞培养物或培养基、发酵产物、腹水、血细胞中存在的蛋白质以及通过正常或转化的细胞(例如，通过重组DNA或单克隆抗体技术)在细胞培养物中产生的产物。
根据一个优选的实施方案，烷基糖苷用于灭活一种或多种包膜病毒，特别是在本文所述的一种或多种方法中，其中所述一种或多种病毒优选地选自MuLV(鼠白血病病毒)、BVDV(牛病毒性腹泻病毒)、PRV(伪狂犬病病毒)、VSV(水泡性口炎病毒)和VACV(牛痘病毒)。
重组多肽
本文使用的术语“多肽”是指任何长度的氨基酸的聚合物。聚合物可以是直链或支链的，它可以包含修饰的氨基酸，并且可以被非氨基酸间隔。该术语还涵盖已经天然地修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物，例如，二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化、硫酸化或任何其他操作或修饰，例如与标记或半衰期延长组分的缀合。该术语还包括例如包含一种或多种氨基酸类似物(包括例如非天然氨基酸等)以及本领域已知的其他修饰的多肽。多肽可以是以单个多肽的多聚体形式。
本发明的多肽可以是任何感兴趣的多肽，特别是其中希望消除任何污染性病毒活性的多肽。本发明的多肽可以优选地是水溶性多肽，特别地不是膜插入的多肽。
所述多肽可以是有治疗目的的任何多肽。所述多肽特别地可以选自抗体、血液蛋白质、酶、受体、激素、调节因子、抗原、细胞因子和其他目的多肽。例如，它可以是单克隆抗体、其结构域、此类抗体或其结构域的二聚体或寡聚体、双特异性抗体、单链抗原结合结构域(ScFv)或嵌合多肽。
多肽尤其也可以是血液蛋白质，例如凝血蛋白、白蛋白或免疫球蛋白。血液蛋白质的非限制性实例包括ADAMTS-13、α1-抗纤溶酶、α2-抗纤溶酶、抗凝血酶III、癌症促凝剂、促红细胞生成素、因子II、因子V、因子VII、因子VIII、因子IX、因子X、因子XI、因子XII、因子XIII、纤连蛋白、纤维蛋白原、肝素辅因子II、高分子量激肽原、免疫球蛋白、纤溶酶原、纤溶酶原激活物抑制剂-1、纤溶酶原激活物抑制剂-2，前激肽释放酶、蛋白C、蛋白S、蛋白Z、蛋白Z相关的蛋白酶抑制剂、组织因子、组织纤溶酶原激活剂、尿激酶或血管性血友病因子。所述多肽可以是其融合蛋白。
所述多肽也可以是天然存在的多肽的变体，例如上述多肽之一的变体。变体可以包含所述天然存在的多肽的片段。本发明人最初开发了本发明方法用于纯化血管性血友病因子融合蛋白的重组变体。参考文献7中描述了变体的一般类别，并且来自该文件的“D’D3-FP”变体(在此被命名为SEQ ID NO：2)是本发明人在以下进行本发明的方式中使用的代表性多肽。
所述多肽可以与异源氨基酸序列融合。所述异源氨基酸序列包含选自如下的多肽或由其组成：免疫球蛋白恒定区及其部分例如Fc片段、转铁蛋白及其片段、人绒毛膜促性腺激素的C末端肽、具有大流体动力学体积的溶剂化随机链(称为XTEN)、同型氨基酸重复序列(HAP)、脯氨酸-丙氨酸-丝氨酸重复序列(PAS)、白蛋白、afamin、甲胎蛋白、维生素D结合蛋白、在生理条件下能够结合白蛋白或免疫球蛋白恒定区的多肽，及其组合。根据一个优选的实施方案，所述多肽与白蛋白或Fc片段，特别是与白蛋白融合。
所述多肽可以备选地或另外地与另外的部分缀合。所述部分选自羟乙基淀粉(HES)、聚乙二醇(PEG)、聚唾液酸(PSA)、弹性蛋白样多肽、肝素聚合物、透明质酸和白蛋白结合配体例如脂肪酸链或白蛋白结合肽，及其组合。
本文使用的术语“重组多肽”是指已经重组表达的多肽。特别地，所述多肽已经获自经基因工程改造以表达所述多肽的转基因生物体，或获自重组产生所述多肽的细胞系。生物体的非限制性实例包括鸟类和哺乳动物，如小鼠、大鼠、山羊、绵羊、马、驴、牛、灵长类动物和人类。转基因生物体的非限制性实例包括经基因工程改造以表达所述多肽的生物体。来自转基因生物体的多肽可以使用本领域已知的常规方法从生物的生物流体、组织或器官提取物或其他来源获得。然而，更通常地，使用原核生物和/或真核表达系统来重组表达多肽。表达系统可以包括多种特征中的任何，包括但不限于诱导型表达、非诱导型表达、组成型表达、组织特异性表达、细胞特异性表达、病毒介导的表达、稳定整合的表达和瞬时表达。如何制备和使用这样的表达系统是本领域已知的。
通常，将编码目的多肽的多核苷酸克隆到表达载体中。原核生物表达载体通常包含复制起点、合适的启动子和/或增强子元件，还有核糖体结合、聚腺苷酸化、转录终止所需的位点，以及5'侧翼非转录序列和其他非转录遗传元件。示例性的原核载体包括使用启动子例如噬菌体T7启动子的pET和pRSET。真核表达载体通常包含复制起点、合适的启动子和/或增强子元件，还有核糖体结合、聚腺苷酸化、剪接、转录终止所需的位点，以及5'侧翼非转录序列和其他非转录遗传元件。示例性的酵母载体包括使用启动子例如AOX1、AUG1、GAP和GALL的pAO、pMET、pPIC、pPICZ和pYES。示例性的昆虫载体包括使用启动子例如PH、p10、MT、Ac5、OpeE2、gp64和polh的pAc5、pBAC、pIB、pMIB、pMT。示例性的哺乳动物载体包括使用启动子例如β-酪蛋白、β-乳球蛋白、乳清酸启动子、HSV胸苷激酶、早期和晚期猿猴病毒40(SV40)、来自逆转录病毒的LTR和小鼠金属硫蛋白-1的启动子的pBPV、pCMV、pCMVTNT、pDNA、pDisplay、pMSG、pOG44、PQBI25、pRc/RSV、pSECTag、pSECTag2、pSG、pSV2cat、pSVK3、pSVL、pUCIG-MET、pVAX1、pWLneo和pXT1。选择标记包括氨苄青霉素、氯霉素转移酶、卡那霉素、新霉素和四环素。合适的表达载体是本领域已知的并且商购可得。
能够表达相容性载体的细胞包括原核细胞、真核细胞以及衍生自原核和真核细胞的细胞系。原核株系的非限制性实例包括衍生自例如大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis,)、脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)、产气荚膜梭菌(Clostridia perfringens)、艰难梭菌(Clostridia difficle)、新月柄杆菌(Caulobacter crescentus)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、扭脱甲基杆菌(Methylobacteriumextorquens)、曼尼奈瑟氏菌(Neisseria meningirulls)、脑膜炎奈瑟氏菌(Neisseria meningitidis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和鼠伤寒沙门菌(Salmonella typhimurium)的那些。酵母菌株的非限制性实例包括衍生自例如巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、甲醇毕赤酵母(Pichia methanolica)、安格斯毕赤酵母(Pichia angusta)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)和解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)的那些。植物细胞和衍生自植物的细胞系包括来自例如单子叶植物的物种例如玉米(Zea mays)和双子叶植物的物种例如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、普通小麦(Triticum aestivum)、膨胀浮萍(Lemnagibba)和水浮萍(Lemna minor)的细胞。昆虫细胞和衍生自昆虫的细胞系包括来自例如草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)、粉纹夜蛾(Trichoplusiani)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和烟草天蛾(Manduca sexta)的细胞。昆虫细胞系的非限制性实例包括High-Five、Kc、Schneider's Drosophila系2(S2)、SF9和SF21细胞系。哺乳动物细胞和衍生自哺乳动物细胞的细胞系包括来自例如小鼠、大鼠、仓鼠、猪、牛、马、灵长类动物和人的细胞。哺乳动物细胞系的非限制性实例包括1A3、3T3、6E6、10T1/2、APRT、BALB/3T3、BE(2)-C、BHK、BT、C6，C127，CHO、CHP3、COS-1、COS-7、CPAE、ESK-4、FB2、GH1、GH3、HeLa、HEK-293、HepG2、HL-60、IMR-32、L2、LLC-PK1、LM、MCF-7、NB4、NBL-6、NCTC、Neuro 2A、NIE-1 15、NG108-15、NIH3T3、PC12、PK15、SBAC、SH-SY5Y、SK-Hep、SK-N-DZ、SK-N-F1、SK-N-SH、ST、SW-13和VV-1细胞系。细胞系可以从美国典型培养物保藏中心、欧洲细胞培养物保藏中心和/或德国微生物和细胞培养物保藏中心获得。
重组多肽通常将包含在含有宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质(最通常两者)的溶液中。溶液通常是水溶液，因为多肽天然存在于水性环境中。宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质存在于来自重组表达所述多肽的转基因生物体或细胞系的溶液中。当多肽由细胞系表达时，溶液可以包含来自细胞系培养物的培养基。重组多肽可能已经转移到特定的介质中以进行后续纯化。
通常，步骤(i)中包含重组多肽的溶液中的宿主细胞DNA的量是0.01μg/ml至100μg/ml，例如0.1μg/ml和50μg/ml。类似地，步骤(i)中宿主细胞蛋白质的量通常是5μg/ml至5mg/ml，例如50μg/ml至1000μg/ml。如上所讨论的，通常同时存在这两种污染物质，使得溶液具有0.01至100μg/ml的宿主细胞DNA(如上所述，例如至少100pg/ml)和5μg/ml至5mg/ml的宿主细胞蛋白质(如上所述，例如至少100ng/ml)。
在添加烷基糖苷之前的纯化步骤
如上所讨论的，在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前或步骤(iii)之后，方法中可以包括进一步的纯化步骤。每个进一步的纯化步骤通常是层析的步骤。层析可以选自任何合适的层析，例如免疫亲和层析、亲和层析、疏水相互作用层析、离子交换层析、多元层析、尺寸排阻层析或金属螯合层析。
例如，可以在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前对溶液进行离子交换层析步骤。在以下用于进行本发明的模式中提供了该方法的实例。本发明人已经发现，阴离子交换层析法(如下所述)特别适合于该步骤，例如使用PorosTM XQ层析基质。
本发明通常使用阴离子交换层析作为离子交换层析。在阴离子交换层析中，带负电荷的分子被吸引到带正电荷的固体支持物上。带正电的固体支持物可以通过本领域技术人员已知的任何方法来制备，并且通常涉及将带正电的功能性配体共价附着到固体支持物上。合适的带正电荷的官能配体将始终取决于待从溶液中分离的多肽。合适的阴离子交换树脂的实例是包含官能季胺基团(Q)和/或叔胺基团(DEAE)或二乙氨基丙基(ANX)的那些。商购可得的阴离子交换层析基质包括但不限于来自ThermoFisher的DEAE纤维素、PorosTMPI 20、PI 50、HQ 10、HQ 20、HQ 50、D 50、XQ，来自GE Healthcare的MonoQTM、MiniQTM、SourceTM 15Q和30Q、Q、DEAE和ANX Sepharose Fast FlowTM、Q Sepharose highPerformanceTM、QAE SEPHADEXTM和FAST Q SEPHAROSETM，来自J.T.Baker的WP PEITM、WPDEAMTM、WP QUATTM，来自Biochrom Labs Inc.的HydrocellTM DEAE和HydrocellTM QA，来自Biorad的UNOsphereTM Q、Macro-PrepTM DEAE和Macro-PrepTM High Q，来自PallTechnologies的Ceramic HyperDTM Q、陶瓷HyperDTM DEAE、Q HyperZTM、TrisacrylTM M和LSTM DEAE、SpherodexTM LS DEAE、QMA SpherosilTM LS，QMA SpherosilTM M，来自DowLiquid Separations的DOWEXTM Fine Mesh Strong Base Type I和Type II Anion Matrix和DOWEXTM MONOSPHER E 77，弱碱阴离子，来自Millipore的MatrexCellufmeTM A200、A500、Q500和Q800，来自EMD的FractogelTM EMD TM AE3、FractogelTM EMD DEAE和FractogelTMEMDDMAE，来自Sigma-Aldrich的AmberliteTM弱和强阴离子交换剂I和II型、DOWEXTM弱和强阴离子交换剂I和II型、DiaionTM弱和强阴离子交换剂I和II型、DuoliteTM，来自Tosoh的TSKTM凝胶Q和DEAE 5P和5PW-HR、ToyopearlTM SuperQ-650S、650M和650C3 QAE-26-Tosoh的550C和650S、DEAE-650M和650C，以及来自Whatman的QA52TM、DE23TM、DE32TM、DE51TM、DE52TM、DE53TM、Express-IonTM D和Express-IonTM Q。
如果需要，可以使用阴离子交换层析膜代替阴离子交换层析基质。商购可得的阴离子交换膜包括但不限于来自Sartorius的SartobindTM Q、来自Pall Technologies的MustangTM Q和来自Millipore的InterceptTM Q膜。
作为阴离子交换层析的替代，在某些实施方案中可以使用阳离子交换层析。在阳离子交换层析中，带正电的分子被吸引到带负电的固体支持物上。可以使用与适合于形成阳离子交换基质的固相附着的任何带负电荷的配体，例如，如下所述的羧酸盐，磺酸盐等。商购可得的阳离子交换基质包括但不限于例如具有磺酸盐基团的那些(例如，来自GEHealthcare的MiniS、SourceTM 15S和30S、Fast FlowTM、High Performance，来自Tosoh的SP-650S和SP-650M，来自BioRad的High S，来自Pall Technologies的CeramicS、M和LS SP以及LS SP)；基于磺乙基的基团(例如来自EMDMillipore的SE，来自ThermoFisher的(S-10和S-20))；基于磺丙基的基团(例如来自Tosoh的TSKSP 5PW和SP-5PW-HR，来自ThermoFisher的HS-20和HS 50)；基于磺基异丁基的基团(例如来自EMD Millipore的EMD SO3)；基于硫氧乙基的基团(例如来自Whatman的SE52、SE53和Express-IonTM S)，基于羧甲基的基团(例如来自GE Healthcare的CMFast Flow，来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell CM，来自BioRad的CM，来自PallTechnologies的CeramicCM、Trisacryl M CM、Trisacryl LS CM，来自Millipore的MatrexCellufine C500和C200，来自Whatman的CM52、CM32、CM23和Express-IonTM C，来自Tosoh的CM-650S、CM-650M和CM-650C)；基于磺酸和羧酸的基团(例如来自J.T.Baker的Carboxy-Sulfon)；基于羧酸的基团(例如来自J.T Baker的WP CBX，来自Dow Liquid Separations的MAC-3，来自Sigma-Aldrich的AmberliteTM Weak Cation Exchangers、Weak CationExchanger和Diaion Weak Cation Exchangers以及来自EMD的EMD COO-)；基于磺酸的基团(例如来自Biochrom Labs Inc.的Hydrocell SP，来自Dow LiquidSeparations的Fine Mesh Strong Acid Cation Matrix，来自J.T.Baker的S、WP Sulfonic，来自Sartorius的S膜，来自Sigma-Aldrich的AmberliteTM Strong Cation Exchangers、Strong Cation和Diaion Strong Cation Exchanger)；以及基于正磷酸盐的基团(例如来自Whatman的PI1)。
如果需要的话，可以使用阳离子交换膜代替阳离子交换基质，例如，S(Sartorius；Edgewood,NY)。
备选地，可以在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前对溶液进行免疫亲和层析步骤。
免疫亲和层析利用抗原-抗体相互作用的高特异性来分离和纯化多肽。本发明中的免疫亲和层析步骤通常涉及固定化在固相支持物上的抗体或抗体片段，包含重组多肽的溶液在固相支持物上通过并且对固定化的抗体特异的多肽被捕获。洗掉非特异性蛋白质和肽，然后洗脱抗原。在其他实施方案中，例如当重组多肽本身是抗体时，可以将针对该抗体的特异性抗原偶联至柱上并使抗体溶液通过柱。
可以通过多种技术将抗体(或在其他实施方案中，抗原)固定化在固相支持物上，包括通过胺或巯基残基使抗体或抗原与活化的固相支持物化学偶联。存在商购可得的各种商业活化琼脂糖，其中使用多种不同的偶联化学方法。另一种技术使用包被有抗体结合蛋白(例如蛋白A或G)的固体支持物，其捕获并固定所述抗体。然后，借助化学交联剂将抗体与树脂共价连接。
在本发明中，免疫亲和层析步骤可以用于进一步减少宿主细胞蛋白质。该步骤通常保持好的多肽产率，例如大约60-90％。所述方法通常使用免疫亲和层析柱。柱载量可基于溶液中重组多肽的浓度来计算，例如通过UV吸收。在一些实施方案中，在免疫亲和层析步骤之前对溶液进行调节，例如通过添加乙二胺四乙酸二钠(EDTA)或柠檬酸钠。
备选地，可以在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前对溶液进行亲和层析步骤。
亲和层析是一种基于固定化的配体与其结合伴侣之间特异性结合相互作用的分离方法。实例包括抗体/抗原、酶/底物和酶/抑制剂相互作用。取决于相互作用的特异性，纯化的程度可以是高的，因此亲和层析有时可能是纯化策略中的唯一步骤。
亲和层析可大致分为两种方法。第一种方法使用目的多肽上氨基酸的天然存在的结构或序列作为结合位点。亲和层析材料的实例包括用蛋白A或蛋白G衍生的材料。其他选择包括专门开发的结合剂(肽、修饰的肽、核酸、合成的化合物等)，它们允许与多肽充分牢固的结合并因此可以充当亲和树脂中的结合剂。第二种方法涉及结合工程改造成目的多肽的特定氨基酸序列，通常称为“标签”。有许多不同的标签可供利用。两个最常用的蛋白质标签是聚组氨酸标签，它结合某些含金属的复合物例如IMAC树脂中的那些，以及谷胱甘肽S-转移酶(GST)序列，它结合GST培养基中存在的谷胱甘肽。
亲和层析材料的特定实例包括Prosep-VA、Prosep-VA Ultra Plus(Merck)、Protein A Sepharose快速流、MAbSelect、MAbSelectSuRe、MAbSelectSuRe LX、VIIISelect、Capto Blue、Capto Heparin(GE Healthcare)、Toyopearl蛋白A(Tosoh)、CaptureSelect Human Albumin或其他CaptureSelect树脂(ThermoFisher Scientific)、Mimetic Blue SA和Albupure(Prometic)。此外，可以使用诸如ThermoFisher、Merck或Avitide等公司的定制亲和树脂。亲和层析材料可以以亲和层析柱的形式使用。在其他实施方案中，亲和层析材料以亲和层析膜的形式使用。
烷基糖苷
如本领域中已知的，在本文中使用的术语“烷基糖苷”通常是指通过键连接至任何疏水性烷基的任何糖。疏水性烷基链和亲水性糖之间的键可以包括糖苷、酯、硫糖苷、硫酯、醚、酰胺或脲键合(bond)或键(linkage)。本发明中糖的典型选择包括葡萄糖(作为吡喃葡萄糖苷)和麦芽糖。疏水性烷基的典型选择包括正辛基、正癸基和正十二烷基。键特别可以是糖苷键，特别是β糖苷键(例如β-D糖苷键)。本发明人特别使用了烷基糖苷，其中糖是葡萄糖，疏水性烷基是正辛基并且键是β-D糖苷键。本发明人已经使用的其他各个组合包括：葡萄糖、正癸基和β-D糖苷键；麦芽糖、正辛基和β-D糖苷键；麦芽糖、正十二烷基和β-D糖苷键；葡萄糖、正十二烷基和β-D糖苷键；以及麦芽糖、正癸基和β-D糖苷键。
可用于本发明的烷基糖苷的一般结构是R1-O-(CH2)x-R，其中R可以是例如CH3、环己基(C6H11)或另一烷基链，包括其异构体，x通常是5至13，特别是7至11，并且R1是糖，通常是葡萄糖或麦芽糖。优选地，用于本发明的烷基糖苷为正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(即R1是葡萄糖，R是CH3且x是7)。本发明人认为这是优选的选择，因为正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷是具有有利的物理化学和毒理学性质的温和去污剂。本发明人使用的其他烷基糖苷包括正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷(即R1是葡萄糖，R是CH3且x是9)，正辛基-β-D-麦芽糖苷(即R1是麦芽糖，R是CH3且x是7)，正十二烷基-β-D-麦芽糖苷(即R1是麦芽糖，R是CH3且x是11)，正十二烷基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷(即R1是葡萄糖，R是CH3且x是11)和正癸基-β-D-麦芽糖苷(即R1是麦芽糖，R是CH3且x是9)。
示例性的备选烷基糖苷包括其中R1是葡萄糖，R3是CH3且x是：5(正己基-β-D-吡喃葡萄糖苷)；6(正庚基-β-D-吡喃葡萄糖苷)；或8(正壬基-β-D-吡喃葡萄糖苷)的那些。有时将吡喃葡萄糖苷称为葡萄糖苷。
示例性的烷基糖苷另外地包括其中R1是麦芽糖，R是CH3且x是：5(正己基-β-D-麦芽糖苷)；8(正壬基-β-D-麦芽糖苷)；10(正十一烷基-β-D-麦芽糖苷)；12(正十三烷基-β-D-麦芽糖苷)；13(正十四烷基-β-D-麦芽糖苷)或15(正十六烷基-β-D-麦芽糖苷)的那些。有时麦芽糖苷被称为麦芽吡喃糖苷。
示例性的烷基糖苷还包括其中R1是葡萄糖，x是3且R是环己基(3-环己基-1-丙基-β-D-葡萄糖苷)以及其中R1是麦芽糖，x是4且R是环己基(4-环己基-1-丁基-β-D-葡萄糖苷)的那些。
本领域技术人员将理解，诸如此类的烷基糖苷的化学合成可以产生化合物的异质混合物，而不是完全均质的制备物。因此，本文提及所用的特定烷基糖苷是指任何异质混合物的至少大部分组分是该烷基糖苷。
添加烷基糖苷到包含重组多肽的溶液中
如上所述，用烷基糖苷处理包含重组多肽的溶液。在特定的实施方案中，烷基糖苷是正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷。通过将溶液与烷基糖苷的储备溶液(例如预期最终浓度的10倍)混合，可以方便地实现该处理。与溶剂/去污剂处理(例如使用TNBP/PS 80)不同，可以在水溶液中提供烷基糖苷；不需要额外的溶剂，尤其是像TNBP这样的有机溶剂。当烷基糖苷为正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷时，使用浓度是200至1000mM的储备溶液是方便的。如果包含重组多肽的溶液是来自层析步骤的洗脱液，则可以根据需要在添加烷基糖苷之前用其他洗脱缓冲液稀释溶液。
烷基糖苷的最终浓度通常是0.1至1000mM(例如1至500mM、3至400mM、5至200mM、10至100mM、20至90mM)。对于正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷，最终浓度通常是约25至80mM。技术人员将能够确定其他烷基糖苷的合适浓度。可以通过测试一定范围的这样的浓度来确定最佳浓度。本发明人已经发现，高于烷基糖苷的临界胶束浓度(CMC)的浓度是有用的，特别是对于病毒灭活。通常，浓度将是此CMC的1.5、2、3或4倍高。
在添加烷基糖苷之后，优选地将混合物均质化以确保好的混合。该均质化通常需要2至10分钟。
通常将混合物过滤(例如使用0.45/0.2μm的过滤器孔径)，这是有利的，因为这确保去除潜在地遮蔽病毒不受烷基糖苷处理的颗粒。本发明人发现该步骤保持了多肽的好产率，例如大约90-100％。
如上所述，可以孵育混合物以使病毒灭活。孵育可以进行任何合适的时间长度，通常是达到有效病毒减少所需的时间长度。以log10表示，达到的病毒减少倍数可以例如是至少4。在典型的实施方案中，孵育进行1分钟至24小时、2分钟至12小时、优选地10分钟至5小时，并且通常进行约30分钟或更长时间。孵育可以在室温方便地进行，尽管在更低温度，例如≤20℃和甚至在4℃至10℃也能达到好的结果。如果蛋白质对温度敏感，则这些更低的温度特别有利。应注意不要在可能使重组多肽变性的温度孵育混合物(如果要保留活性)。在孵育期间，不需要进一步搅拌，尽管如果需要可以进行。
孵育后，溶液可以任选地冷冻以保存直到进一步使用，例如至低于-20℃或更优选低于-65℃。理想地，冷冻应尽可能快地进行，并且冷冻持续时间应尽可能短，以保存重组多肽。
纯化重组蛋白
如上所讨论的，步骤(iii)中纯化重组多肽通常通过对溶液进行层析的步骤来执行。层析可以选自任何合适的层析，例如，免疫亲和层析、亲和层析、疏水相互作用层析、离子交换层析、多元层析、尺寸排阻层析或金属螯合层析。
层析的步骤尤其可以是免疫亲和层析或亲和层析的步骤。备选地，可以作为步骤(iii)执行的层析步骤是疏水相互作用层析步骤或离子交换层析步骤。此外，在步骤(iii)之后的方法中可以包括进一步的纯化步骤。例如，方法中可以包括一个或多个疏水相互作用层析步骤。在一个实施方案中，在步骤(iii)之后对溶液进行疏水相互作用层析步骤，例如，当步骤(iii)是免疫亲和层析步骤时。类似地，方法中可以包括一个或多个离子交换层析步骤。通常，在步骤(iii)之后对溶液进行离子交换层析步骤，特别是当步骤(iii)是免疫亲和或亲和层析步骤时。在一个优选的实施方案中，免疫亲和层析步骤通常之后是疏水相互作用层析步骤(如上所述)，其然后是离子交换层析步骤。
步骤的其他顺序也是可能的。例如，在第一个实施方案中，在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前对溶液进行阳离子交换层析步骤，然后步骤(iii)是免疫亲和层析步骤，并且此步骤之后是疏水性相互作用层析步骤，其进而之后是阴离子交换层析步骤。在第二个实施方案中，在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前对溶液进行免疫亲和层析步骤，然后步骤(iii)是阴离子交换层析步骤，并且此步骤之后是阳离子交换层析步骤。在第三实施方案中，在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前对溶液进行免疫亲和层析步骤，然后步骤(iii)是疏水相互作用层析步骤，并且此步骤之后是阴离子交换层析步骤。在第四实施方案中，在添加烷基糖苷到溶液中的步骤之前对溶液进行阳离子交换层析步骤，然后步骤(iii)是疏水相互作用层析步骤，并且此步骤之后是阴离子交换层析步骤。其他顺序对于技术人员将是显而易见的，并且可以根据目的重组多肽进行优化。上面已经描述了离子交换层析的方法。本发明通常使用阴离子交换层析(例如用于步骤(iii)和/或当在步骤(iii)之后使用离子交换层析时)，尽管阳离子交换层析在一些实施方案中可能是合适的。以下以进行本发明的方式提供使用阴离子交换层析的实例。本发明人已经发现步骤(iii)之后的阴离子交换层析是特别有用的。
在上文已经类似地描述了免疫亲和层析和亲和层析的方法。多元层析、尺寸排阻层析、金属螯合层析和疏水相互作用层析如下所述。
步骤iii)可以任选地包括修饰包含重组多肽的溶液，例如在纯化重组多肽之前。修饰可以涉及改变溶液电导率和/或包括一种或多种添加剂。添加剂可以例如是螯合剂，例如EDTA。修饰可以涉及溶液的稀释或其他调节。
多元层析
多元或混合模式层析基于已经被能够以多种模式相互作用的配体所官能化的介质支持物：离子交换、羟基磷灰石、亲和、尺寸排阻和疏水性相互作用。组合这些分离方法的能力可以增强多肽纯化方法中的选择性。有许多商购可得的混合模式介质，这些介质组合不同的层析元素，特别是基于羟基磷灰石(静电和钙配位络合物)或基于疏水性离子交换配体。
多元层析材料的特定实例包括Capto MMC Imp Res、Capto MMC ImpAct和CaptoAdhere(均来自GE Healthcare)；Toyopearl NH2-750F、Toyopearl MX Trp-650M(Tosoh)；NuviacPrime(BioRad)和HEA HyperCel、MEP HyperCel、PPA HyperCel、CMM HyperCel(Pall)。
尺寸排阻层析
尺寸排阻层析(SEC)通过凝胶的过滤根据分子尺寸来分离分子。凝胶由含有特定尺寸分布的孔的球形珠组成。当从基质内的孔中包括或排除不同尺寸的分子时，发生分离。小分子扩散到孔中并且它们通过柱的流根据其尺寸而受阻，而大分子则不会进入孔中并且被洗脱在柱的空隙体积中。因此，分子在它们通过柱时根据其尺寸进行分离并按照分子量递减的顺序得到洗脱。
操作条件和凝胶选择取决于应用和所需的分辨率。通过SEC执行的两种常见分离类型是分级和脱盐(或缓冲液交换)。分级涉及在凝胶基质内分离分子量不同的分子。选择凝胶的分级范围以涵盖目的分子。脱盐涉及使用SEC对样品进行脱盐。目的分子被洗脱在空隙体积中，而更小的分子保留在凝胶孔中。为了获得所需的分离，凝胶的排阻限应显著地小于目的分子。
尺寸排阻层析材料的具体实例包括Bio-Gel P聚丙烯酰胺介质。
金属螯合层析
金属螯合层析可以用于纯化加组氨酸标签的蛋白质，并且也可用于纯化具有暴露的组氨酸、半胱氨酸和色氨酸残基的其他蛋白质。固定化的亲和层析(IMAC)树脂用于纯化多肽。取决于所使用的金属离子，例如Cu2+、Zn2+、Ca2+、Co2+或Fe3+，可以实现高度选择性的亲和力。靶多肽与树脂的结合强度主要受所使用的缓冲液的金属离子和pH值影响。结合的蛋白质可通过与咪唑的竞争性洗脱或降低pH值得到洗脱。
疏水相互作用层析
通常执行疏水相互作用层析(HIC)以去除蛋白质聚集体和其他与过程相关的杂质。在执行分离时，使样品混合物与HIC材料接触，例如使用批量纯化技术或柱。在HIC纯化之前，可能需要去除任何离液剂或非常疏水的物质，例如通过使混合物通过预装柱。
例如，在批量纯化的情况下，将HIC材料制备在所需的平衡缓冲液中或平衡至所需的平衡缓冲液。获得HIC材料的浆液。使包含重组多肽的溶液与浆液接触以将待分离的多肽吸附至HIC材料。从浆液中分离出包含不结合HIC材料的杂质的溶液，例如通过使浆液沉降并除去上清液。浆液可以进行一个或多个洗涤步骤。如果需要，可以使浆液与较低电导率的溶液接触以解吸结合到HIC材料上的多肽。为了洗脱结合的多肽，可以降低盐浓度。
离子交换层析依赖多肽的电荷来分离多肽，而疏水相互作用层析利用多肽的疏水性。多肽上的疏水基团与柱上的疏水基团相互作用。多肽疏水性越强，它将与柱相互作用越强。因此，HIC步骤能够例如去除宿主细胞衍生的杂质并且有时还去除产物相关的杂质。
高盐浓度有利于多肽吸附到HIC柱上，但是实际浓度可以根据多肽的性质和所选的特定HIC配体在很宽的范围内变化。HIC柱通常包含基础基质(例如，交联的琼脂糖或合成的共聚物材料)，疏水性配体(例如，烷基或芳基)与之缀合。合适的HIC柱包含被苯基取代的琼脂糖树脂(例如Phenyl SepharoseTM柱)。许多HIC柱是商购可得的。实例包括但不限于具有低取代度或高取代度的Phenyl SepharoseTM 6Fast Flow柱(GE Healthcare LifeSciences)；PhenySepharoseTM High Performance柱(GE Healthcare Life Sciences)；Octyl SepharoseTM High Performance柱或Butyl Sepharose Fast Flow或HighPerformance柱(GE Healthcare Life Sciences)；FractogelTM EMD Propyl或FractogelTMEMD Phenyl柱(E.Merck,Germany)；Macro-PrepTM Methyl或Macro-PrepTM t-ButylSupports(Bio-Rad,California)；WP H1-Propyl(C3)TM柱(J.T.Baker,New Jersey)；和ToyopearlTM醚、苯基或丁基柱(TosoHaas,PA)。
以下以进行本发明的方式提供使用HIC的实例。本发明人已经发现步骤(iii)之后的HIC层析是特别有用的，例如使用Butyl SepharoseTM High Performance柱(GEHealthcare Life Sciences)。
包含重组多肽的溶液的进一步处理
溶液可在步骤(iii)和上述任何额外的纯化步骤之后进行进一步处理。
例如，可以进行病毒过滤的步骤。在本发明的某些方面，对包含来自先前步骤的重组多肽的溶液进行过滤以去除病毒颗粒，包括完整病毒(如果存在的话)。合适的过滤器的非限制性实例是来自Pall Corporation的Ultipor DV50TM过滤器或来自Asahi KaseiMedical Co.,Ltd的Planova 20N过滤器。其他病毒过滤器可以用于该过滤步骤并且是本领域技术人员众所周知的。在某些实施方案中，在过滤方法之后，使用例如在之前步骤中使用的洗脱缓冲液洗涤过滤器，以除去保留在过滤器外壳中的任何重组多肽。
超滤和/或渗滤的一个或多个步骤也可以用于纯化重组多肽。这些步骤可以浓缩重组多肽和/或交换其缓冲液。通常，在上述病毒过滤步骤之后进行一个或多个超滤和/或渗滤步骤。
超滤在参考文献8和9中有详细描述。一种过滤方法是切向流过滤，如参考文献10中所述。通常认为超滤是指使用孔径小于0.1μm的过滤器进行过滤。通过使用具有这种小孔径的过滤器，可以通过使样品缓冲液渗透通过过滤器来减少样品的体积，同时将重组多肽保留在过滤器后面。
渗滤是使用超滤器以去除和交换盐、糖和非水溶剂，从结合物质中分离出来，去除低分子量物质和/或引起离子和/或pH环境快速变化的方法。通过以近似等于超滤速率的速率向正在超滤的溶液中添加溶剂，可以最有效地去除微溶质。这样可以以恒定的体积从溶液中洗涤微物质(microspecies)，从而有效地纯化保留的多肽。在本发明的某些实施方案中，任选地在进一步纯化步骤之前，采用渗滤步骤来交换与本发明的方法结合使用的多种缓冲液，以及从重组多肽中去除杂质。
药物组合物和方法
可以通过将本发明的纯化的重组多肽与本领域通常使用的任选的药学上可接受的运载体、赋形剂或稳定剂(在本文中将其全部称为“运载体”)，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型去污剂、抗氧化剂和其他各种添加剂(参见参考文献11)混合来制备本发明的药物组合物，以冻干制剂或水溶液的形式进行存储。这样的添加剂在所采用的剂量和浓度必须对接受者无毒。
除了纯化的本发明的重组多肽之外，本发明的药物组合物还可以包含第二治疗试剂。
组合物可以以多种形式制备。例如，可以将组合物制备成可注射的、液体溶液或悬浮液。也可以制备适合于在注射之前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式。可以制备组合物用于局部施用，例如作为软膏、乳剂或粉末。可以制备组合物用于口服施用，例如作为片剂或胶囊剂，或者作为糖浆(可选地添加味道)。可以制备组合物用于肺部施用，例如作为吸入剂，使用细粉或喷雾剂。可以制备组合物为栓剂或阴道栓剂。可以制备组合物用于鼻、耳或眼的施用，例如作为滴剂、喷雾剂或粉末[例如12]。
药物组合物通常是无菌的。它优选地是无热原的。
在许多实施方案中，组合物被缓冲在例如pH 6至pH 8，通常在pH 7附近。组合物可以是水性的，或者可以是冻干的。
本发明还提供了包含本发明的药物组合物的递送装置。装置可以是例如注射器或吸入器。
一旦配制，本发明的组合物可以直接施用给受试者。待治疗的受试者可以是动物；特别地，可以治疗人类受试者。
通用
术语“包括”涵盖例如“包含”以及“由……组成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成或者也可以包含其他，例如X+Y。
涉及数值x的术语“约”是指例如x±10％。
单词“基本上”不排除“完全地”，例如“基本上不含”Y的组合物可以完全不含Y。必要时，在本发明的定义中可以省略“基本上”一词。
在本发明提供涉及多个连续步骤的方法的情况下，以所指示的顺序，即以数字或字母顺序进行这些步骤。然而，技术人员将理解，可以改变步骤的顺序，同时仍然获得有用的结果。本发明还可以提供涉及少于步骤总数的方法。例如，如果包含重组蛋白的溶液已经通过对该溶液进行离子交换层析的步骤得到了纯化，则该步骤可以从本发明的方法中省略。类似地，可以进行添加烷基糖苷到包含重组多肽的溶液中的步骤以得到准备用于步骤(iii)的材料，但是不需要执行步骤(iii)。步骤(iii)不必为了落入本发明的范围而执行，因为经预处理的材料具有用作随后的纯化的中间体的用途，并且可以被使用、储存、出口等以供以后使用，例如用于免疫亲和层析或一般的层析。这些不同的步骤可以由不同地点(例如不同国家)的不同人员在不同时间执行。
附图说明
图1显示了使用OG/TNBP和仅使用OG的MuLV灭活：空心三角形显示在21℃有搅拌下，使用200mM OG+0.3％TNBP在4.4mg/ml D'D3-FP中的MuLV灭活，空心正方形显示在6℃没有搅拌下，使用20m M OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的MuLV灭活。
图2显示了使用OG/TNBP和仅使用OG的BVDV灭活：空心三角形显示在21℃有搅拌下，使用200mM OG+0.3％TNBP在4.4mg/ml D'D3-FP中的BVDV灭活，空心正方形显示在6℃没有搅拌下，使用20mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的BVDV灭活。
图3显示了使用OG/TNBP以及仅使用OG的PRV灭活：空心三角形显示在21℃有搅拌，使用200mM OG+0.3％TNBP在4.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心正方形显示在6℃没有搅拌，使用20mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活。
图4显示了在6℃有搅拌或没有搅拌下，使用OG的PRV灭活：空心三角形显示在6℃有搅拌下，使用20mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心正方形显示在6℃没有搅拌，使用20mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心菱形显示在6℃没有搅拌，使用20mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活。
图5显示了在5-6℃有搅拌下，使用不同浓度的OG的PRV灭活：空心正方形显示在5-6℃有搅拌下，使用15mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心菱形显示在5-6℃有搅拌下，使用20mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心三角形显示在5-6℃有搅拌下，使用30mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活。
图6显示了在18-19℃，使用多种浓度的OG的PRV灭活：空心三角形显示在21,5℃有搅拌下，使用10mM OG在4.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心正方形显示在18℃有搅拌下，使用20mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心菱形显示在18℃有搅拌下，使用30mMOG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心圆显示在18℃有搅拌下，使用40mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，实心菱形显示在19℃有搅拌下，使用60mM OG在13.5mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，实心三角形显示在18℃有搅拌下黑暗储存7d，使用20mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，实心正方形显示在18℃有搅拌下光照储存7d，使用20mM OG在8.4mg/mlD'D3-FP中的PRV灭活，实心圆显示在18℃有搅拌下黑暗储存7d，使用10mM OG在8.4mg/mlD'D3-FP中的PRV灭活。
图7显示了在18或5-6℃，使用相等mM浓度的OG的PRV灭活：空心三角形显示在18℃有搅拌下，使用30mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心正方形显示在5-6℃有搅拌下，使用30mM OG在8.4mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活。
图8显示了多种烷基糖苷的PRV灭活能力：空心正方形显示在60mM OG的11.9mg/mlD'D3-FP中的PRV灭活，空心三角形显示在60mM正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷的11.9mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心菱形显示在60mM正辛基-β-D-麦芽糖苷的11.9mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，实心正方形显示在60mM正十二烷基-β-D-麦芽糖苷的11.9mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，实心三角形显示在60mM正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷的11.9mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，实心菱形显示在60mM正癸基-β-D-麦芽糖苷的11.9mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活。
图9显示了正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-β-D-麦芽糖苷和正辛基-β-D-麦芽糖苷在低浓度(约为其CMC值的两倍高)的PRV灭活能力：空心三角形显示在5mM正癸基-β-D-葡萄糖吡喃糖苷的11.9mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心正方形显示在40mM正辛基-β-D-麦芽糖苷的11.9mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活，空心菱形显示在5mM正癸基-β-D-麦芽糖苷的11.9mg/ml D'D3-FP中的PRV灭活。
图10比较：a)在使用正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)、正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷(DG)、聚山梨酯80和磷酸三正丁酯(PS80/TNBP)或缓冲液对照处理后，通过免疫亲和层析获得的白蛋白融合蛋白(rD'D3-FP)的样品中残留宿主细胞蛋白质浓度；和b)与PS80/TNBP(透明条)或缓冲液对照(阴影条)处理相比，在步骤ii)中使用OG或DG时，宿主细胞蛋白质清除率的相对改善(HCP清除率的改善倍数)。
图11比较：a)在使用正辛基-β-D吡喃葡萄糖苷(OG)、聚山梨酯80和磷酸三正丁酯(PS80/TNBP)或缓冲液对照处理后，通过免疫亲和层析获得的白蛋白融合蛋白(rD'D3-FP)的样品中残留宿主细胞DNA浓度；和b)与PS80/TNBP(透明条)或缓冲液对照(条纹条)处理相比，使用OG时，宿主细胞DNA清除率的相对改善(宿主细胞DNA清除率的改善倍数)。
图12显示了与OG相比，通过SD处理的VSV灭活：实心三角形显示在24.5℃，在10.4mg/ml D'D3-FP中通过40mM OG的VSV灭活，并且空心正方形显示在26.5℃，在10.4mg/ml D'D3-FP中通过1％PS80+0.3％TNBP的VSV灭活。
图13显示了与OG相比，通过SD处理的牛痘病毒灭活：实心三角形显示在24.5℃，在10.4mg/ml D'D3-FP中通过40mM OG的牛痘病毒灭活，并且空心正方形显示在26.5℃，在10.4mg/ml D'D3-FP中通过1％PS80+0.3％TNBP的牛痘病毒灭活。
进行本发明的方式
实施例1
将正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷与溶剂/去污剂混合物和缓冲液作对照进行比较
概述
将使用聚山梨酯80和磷酸三正丁酯(PS80/TNBP)的典型溶剂/去污剂混合物的处理重组D'D3-FP(参考文献7)与使用烷基糖苷，正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)的处理进行比较。初步实验表明，使用烷基糖苷处理后，rD’D3-FP保持稳定。重要的是，在没有磷酸三正丁酯(TNBP)的情况下，使用烷基糖苷观察到三种模型病毒的快速灭活。在低至5℃的温度、有或没有搅拌下，一小时内即可完成病毒灭活。有效的程序允许使用意想不到的宽范围的过程参数，产生有效的病毒灭活(OG的测试范围是4-25℃，少于或等于30分钟(通常其后为120分钟)在大于或等于20mM的浓度)。出乎意料的是，与使用PS80/TNBP或对照缓冲液相比，后续层析纯化步骤的进料流中烷基糖苷的存在导致在洗脱液阶段显著更低的宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白质水平。
方法和结果
rD′D3-FP包含通过重组DNA技术生成的血管性血友病因子(von-Willebrand-Factor，vWF)蛋白的FVIII结合位点。将rD′D3-FP cDNA序列转染到中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中并表达该多肽以执行所述研究。使用一系列代表性病毒模型进行实验室研究以评估烷基糖苷步骤的病毒灭活能力。使用逆转录病毒MuLV(鼠白血病病毒)作为相关病毒与CHO细胞衍生产品特别相关，因为已知这些产品含有内源性逆转录病毒样颗粒。通常对S/D处理更稳定的黄病毒BVDV(牛病毒性腹泻病毒)和疱疹病毒PRV(伪狂犬病病毒)用于病毒评估研究，以证明烷基糖苷处理的广泛的病毒灭活能力。
在生成样品后立即使用终点稀释测定法确定并根据参考文献13中给出的方法计算所研究的所有样品的病毒滴度。
对于这些OG研究，选择了两个过程控制参数来测试与病毒灭活有关的挑战条件：1)OG去污剂浓度是20mM；和2)温度是6℃±1℃。将rD′D3-FP中间体的样品(蛋白质浓度是约14mg/ml)适当稀释或不稀释使用并使用待研究的病毒进行加标从而得到所需的去污剂浓度。
在添加去污剂之前(未处理)以及在添加去污剂之后的不同时间点取样。通过在细胞培养基中以1:100稀释以终止反应并在病毒测定法中使样品无毒，立即测定样品。
获得了以下减少倍数(对于所有病毒，这些减少倍数仅受测试系统限制，尤其是检测极限以及用于加标的病毒的量)：
表1
图1-3(分别为表2-4)中的病毒保持控制结果表明在孵育期间病毒稳定性样品中没有显著减少，这证实了降低的原因是烷基糖苷去污剂处理的作用。另外，这些图证明病毒灭活非常迅速并且在所有情况下都观察到大于4log的病毒灭活。在第一个研究的15分钟时间点，MuLV和BVDV在6℃±1℃的温度被20mM浓度的OG去污剂完全灭活，而完全PRV灭活则需要60分钟。
表2：通过例如OG的MuLV灭活
表3：通过例如OG的BVDV灭活
表4：在6℃以例如20mM OG的PRV灭活
在使用PRV(一种更具抗药性的包膜病毒)的其他稳健性研究中，研究了以下参数：
·蛋白质浓度的变化对PRV灭活没有影响(图3，表4)。
·在6℃的20mM OG孵育期间搅拌导致略快的PRV灭活(图4，表5)。然而，在OG孵育期间中，通过20mM OG处理没有搅拌完全可靠地灭活PRV。
·在6℃将OG浓度降低至15mM(低于CMC)没有产生显著的PRV灭活(图5，表6)。
·在21℃以10mM OG得到相似的观察(图6，表7)。OG浓度增加到30mM或更高导致快速PRV灭活。此外，将OG储备溶液保存7天(在黑暗中)对灭活能力没有影响。
·在30mM OG将孵育温度从6℃升高到18℃没有产生更快的PRV灭活(图7，表8)。60mM的几种其他烷基糖苷非常快地完全灭活PRV(图8，表9)。特别是，少量的烷基糖苷(约为CMC的两倍高)非常快地完全灭活PRV(图9，表10a)。
表5：在6℃有或没有搅拌下以20mM OG的PRV灭活
表6：在6℃以多种mM OG的PRV灭活
表7：在18-22℃多种mM OG下以log10表示的PRV载量
表8：在6℃或18℃以30mM OG的PRV灭活
表9：多种烷基糖苷的PRV灭活能力
表10a：正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-β-D-麦芽糖苷和正辛基-β-D-麦芽糖苷在低浓度(约为其CMC值的两倍高)的PRV灭活能力
在评估的所有稳健性条件下，病毒灭活动力学与标准条件相似。总体而言，显示OG处理步骤是有效而强大的，并且具有灭活包膜病毒(包括特别相关的逆转录病毒MuLV)的高能力。对于其他烷基糖苷也可以显示出它们有效灭活相关病毒的能力。
此外，研究了使用牛痘病毒(VACV)(对SD灭活最有抵抗力的包膜病毒[14])和水泡性口炎病毒(VSV)的稳健性研究。示于图12(表10b)的关于VSV的结果和示于图13(表10c)的关于VACV的结果证明与SD(1％PS80+0.3％TnBP)相比，通过OG具有更快得多的病毒灭活。特别是在SD不能于4小时内有效地灭活VACV的情形下，仅仅OG就非常快速地完全灭活VACV(图13)。
表10b：与OG处理相比，通过SD的VSV(水泡性口炎病毒)灭活
表10c：与OG处理相比，通过SD的VACV(牛痘病毒)灭活
结论
观察到的快速灭活动力学表明OG和其他烷基糖苷有效地并可靠地灭活包膜病毒。
免疫亲和层析(IAC)实验
在加载到IAC树脂上之前，使用OG或PS80/TNBP处理D'D3-FP。为此，将rD'D3-FP样品用OG储备溶液(600mM)稀释以产生包含60mM OG的病毒灭活溶液。在对照实验中，添加PS80/TNBP储备溶液(3％PS80/0.9％TNBP)以产生最终浓度是1％PS80，0.3％TNBP。然后将溶液过滤并在室温孵育2小时。随后，根据表11进行IAC实验。对于层析，使用免疫亲和树脂CaptureSelect Human Albumin(ThermoFisher)。使用的层析单元是系统(GE Healthcare)。
表11：免疫亲和层析的实验条件
PS80/TNBP处理导致预洗脱(第5步)级分中rD'D3-FP显著损失60％，而洗脱液级分中只有40％rD’D3-FP。相比之下，OG处理的产率更高得多，洗脱液级分中存在83％的rD'D3-FP。在使用OG的纯化步骤中，洗脱液级分中的宿主细胞DNA清除率为1700倍(180pg/mL)。在其他实施例中，当将具有更高浓度宿主细胞DNA的不同原料rD'D3-FP批次与OG一起孵育时，免疫亲和层析步骤的洗脱液中宿主细胞DNA含量相当，从而得到约25,000的纯化倍数。与PS80/TNBP处理相比，OG处理产生高7.4倍的宿主细胞DNA清除率。对于OG处理的样品，此步骤中标准化的宿主细胞蛋白质清除率是1270倍，导致洗脱液中为117ppm(比PS80/TNBP处理好1.9倍)。为使去污剂或溶剂/去污剂处理后相同rD'D3-FP浓度的洗脱液级分之间具有更好的可比性，在第二组实验中从方案中省略了步骤5(表11)，以避免在经过PS 80/TNBP处理的进料的情况下rD'D3-FP被分到两个级分中。
免疫亲和层析(IAC)实验(没有预洗脱步骤5)
使用60mM OG或表12中指定的其他烷基糖苷、1％PS 80、0.3％TNBP或缓冲液对照(500mM NaCl，20mM Tris pH 7.4)处理rD'D3-FP。然后将溶液过滤并在室温孵育2小时。
表12：用于免疫亲和纯化之前的孵育的烷基糖苷概述
孵育2小时后，将病毒灭活的样品加载到装有CaptureSelect Human Albumin(ThermoFisher)树脂的层析柱上。使用的层析单元是Avant系统(GEHealthcare)。层析方案描述于表11中，在该组实验中省略了步骤5以在避免在PS80/TNBP处理的级分中的产率损失。
所有处理选择均导致洗脱液级分中rD'D3-FP的产率和蛋白质浓度相当，并对其进行了宿主细胞DNA(HC DNA)和蛋白质(HCP)分析(表13，图10a和11a)。
表13：使用不同烷基糖苷和对照获得的分析数据的概述
对于除了使用60mM OG以外的所有样品，宿主细胞DNA的结果与缓冲液对照相当或稍差。这导致洗脱液样品具有特别低的宿主细胞DNA含量，是缓冲液对照的1/126倍，是PS80/TNBP对照的1/214(图11b)。在该特定实施例中，宿主细胞DNA清除的倍数是约2000(DNA水平标准化为蛋白质含量)。
类似地，与缓冲液对照处理相比，OG处理导致宿主细胞蛋白质水平降低高3.5倍。标准化为rD'D3-FP含量，整个纯化步骤的HCP减少是725倍。如果使用PS80/TNBP，则与OG相比，HCP清除率降低了32％(表13，图10b)。在测试的其他烷基糖苷中，与缓冲液对照相比只有DG和OM在60mM时改善了HCP清除率。对于OM，效果很小(1.7倍)，而对于DG可见14.6倍改善。该效果强烈地取决于浓度，因为洗脱液中5mM DG HCP含量与缓冲液对照相当。
总之，在随后的层析步骤之前将rD'D3-FP与OG一起孵育得到的洗脱液样品与缓冲液或PS80/TNBP对照相比，在宿主细胞DNA和宿主细胞蛋白质方面显著更纯。OG处理还允许使用额外的洗涤步骤(表1，步骤5)，在PS80/TNBP处理的情况下，该步骤产生显著的损失。
实施例2
多种烷基糖苷的病毒灭活能力
概述
类似于实施例1中所述进行了进一步的实验室研究，以评估除OG以外烷基糖苷的病毒灭活能力。发现正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷、正辛基-β-D-麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-麦芽糖苷、正十二烷基-β-D-吡喃葡萄糖苷和正癸基-β-D-麦芽糖苷都是有效的(图8)，并且在较低的浓度(它们的CMC值的约两倍高，图9)也是有效的。
将理解的是，仅通过实例的方式描述了本发明并且可以在保持在本发明的范围和精神内的情况下进行修改。
实施例3
通过使用含有OG的洗涤步骤减少与过程相关的杂质
概述
执行了其他研究以评估在层析设置中使用烷基糖苷作为洗涤剂并研究了对与过程相关的杂质的效果，特别是蛋白质杂质清除率。在此实施例中，将来自生物反应器过程的rD'D3-FP的无细胞收获材料装载到阴离子交换柱(Poros XQ，Thermo Scientific)上。rD'D3-FP与血管性血友病因子(VWF)前肽一起表达，该前肽在细胞中被切割掉但与rD'D3-FP一起分泌到细胞上清液中，因此以与该产品相当的水平存在。因此，降低这种蛋白质杂质的水平很重要。修改层析方案并将OG添加到一种洗涤缓冲液中。
方法和结果
阴离子交换层析的纯化细节见表14。进行了两个实验。在选项1中，没有OG的情况下执行了步骤5(洗涤步骤2)，在选项2中洗涤缓冲液中还包含60mM OG。
表14：免疫亲和层析的实验条件
在洗涤步骤中添加OG显著地降低主要蛋白质杂质VWF前肽的含量(参见表15)。
表15：在洗涤缓冲液中有或没有OG的情况下实验的主要洗脱级分的分析结果。
不添加OG，则VWF前肽根本不与rD'D3-FP分离。在洗涤步骤2中添加60mM OG后，洗脱液中的VWF前肽浓度降低近150倍。由于洗涤步骤2中OG的存在是这些实验中的唯一变量，因此这是改善的蛋白质杂质清除率的原因。
参考文献
[1]WHO Technical Report,Annex 4Guidelines on viral inactivation andremoval procedures intended to assure the viral safety of human blood plasmaproducts Series No.924,p 151-224,(2004).
[2]Korneyeva et al.(2002)Biologicals.30(2):153-62.
[3]Lebing et al.(2003)Vox Sang.84(3):193-201.
[4]Johnston et al.(2003)Biologicals.31(3):213-21).
[5]Bosley et al.(2008)Proteomics Clin Appl.2(6):904-7.
[6]WO 2015/073633
[7]WO 2016/188907
[8]Microfiltration and Ultrafiltration:Principles and Applications,L.Zeman and A.Zydney(Marcel Dekker,Inc.,New York,N.Y.,1996).
[9]Ultrafiltration Handbook,Munir Cheryan(Technomic Publishing,1986；ISBN No.87762-456-9).
[10]Millipore catalogue entitled"Pharmaceutical Process FiltrationCatalogue"pp.177-202(Bedford,Mass.,1995/96).
[11]Remington's Pharmaceutical Sciences,16th edition(Osol,ed.1980).
[12]Almeida&Alpar(1996)J.Drug Targeting 3:455-467.
[13]et al.(2012)Transfusion 52:2104-2112
[14]Roberts(2000)Biologicals 28:29–32。
Claims (30)
1.纯化重组多肽的方法，其中所述重组多肽不是膜插入的多肽，所述方法包括以下步骤：i)提供包含所述重组多肽的溶液；ii)添加烷基糖苷到所述溶液中；和iii)通过对所述溶液进行免疫亲和层析的步骤纯化所述重组多肽；
其中与不添加烷基糖苷到溶液中的相同方法相比，步骤(iii)导致所述重组多肽与溶液中的宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质的分离得到改善；
其中所述烷基糖苷是正辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷(OG)或正癸基-β-D-吡喃葡萄糖苷(DG)。
2.权利要求1的方法，其中所述烷基糖苷另外地包含在层析步骤的洗涤缓冲液中。
3.权利要求1或权利要求2的方法，其中步骤(iii)导致所述重组多肽与溶液中的宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质和/或与溶液中的其他蛋白质杂质分离。
4.权利要求1的方法，其中在添加所述烷基糖苷到所述溶液中的步骤之前，对溶液进行离子交换层析步骤。
5.权利要求1的方法，其中在步骤(iii)之后，对所述溶液进行疏水相互作用层析步骤。
6.权利要求1的方法，其中在步骤(iii)之后，对所述溶液进行多元层析步骤。
7.权利要求5或权利要求6的方法，其中在疏水相互作用或多元层析步骤之后，对所述溶液进行离子交换层析步骤。
8.权利要求1的方法，其中所述方法用于将所述重组多肽与宿主细胞DNA和/或宿主细胞蛋白质分离开，并且包括以下步骤：a)提供包含所述重组多肽的溶液；b)通过对溶液进行离子交换层析的步骤纯化所述重组多肽；c)添加烷基糖苷到所述溶液中；d)通过对溶液进行免疫亲和层析的步骤纯化所述重组多肽；e)通过对溶液进行疏水相互作用或多元层析的步骤纯化所述重组多肽；和f)通过对所述溶液进行离子交换层析的进一步步骤纯化所述重组多肽。
9.权利要求4或8的方法，其中离子交换层析是阴离子交换层析。
10.权利要求1的方法，其中所述方法提供了包含宿主细胞DNA污染的水平小于5000pg/ml的溶液；和/或其中所述方法提供了与除了不使用烷基糖苷或除了使用TNBP/PS 80以外与所述方法相同的参考方法相比，包含的宿主细胞DNA污染的水平减少至少1.5倍的重组多肽溶液。
11.权利要求1的方法，其中所述方法提供了包含的宿主细胞蛋白质污染的水平小于5000ng/ml的溶液；和/或其中所述方法提供了与除了不使用烷基糖苷或除了使用TNBP/PS80以外与所述方法相同的参考方法相比，包含宿主细胞蛋白质(HCP)污染的水平减少至少1.5倍的重组多肽溶液。
12.权利要求1的方法，其中所述多肽来自重组地产生所述多肽的细胞系。
13.权利要求1的方法，其中所述多肽是凝血蛋白、白蛋白、免疫球蛋白或融合蛋白。
14.权利要求1的方法，其中步骤(i)中的溶液具有0.1μg/ml至50μg/ml的宿主细胞DNA和/或50μg/ml至1000μg/ml的宿主细胞蛋白质。
15.权利要求1的方法，其中在步骤(iii)和任何其他纯化步骤之后，通过病毒过滤的步骤进一步处理所述溶液。
16.权利要求1的方法，其中在步骤(iii)和任何其他纯化步骤之后，通过超滤和/或渗滤的一个或多个步骤进一步处理所述溶液。
17.权利要求1的方法，其中将所述纯化的重组多肽与药学上可接受的运载体混合以制备药物组合物。
18.权利要求1的方法，其中在没有任何有机溶剂的情况下添加所述烷基糖苷和/或在没有与有机溶剂的任何预先混合的情况下添加所述烷基糖苷。
19.权利要求10的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含的宿主细胞DNA污染的水平减少至少2倍的重组多肽溶液。
20.权利要求10的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含的宿主细胞DNA污染的水平减少至少5倍的重组多肽溶液。
21.权利要求10的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含的宿主细胞DNA污染的水平减少至少10倍的重组多肽溶液。
22.权利要求10的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含的宿主细胞DNA污染的水平减少至少20倍的重组多肽溶液。
23.权利要求10的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含的宿主细胞DNA污染的水平减少至少50倍的重组多肽溶液。
24.权利要求10的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含的宿主细胞DNA污染的水平减少至少100倍的重组多肽溶液。
25.权利要求10的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含的宿主细胞DNA污染的水平减少至少150倍的重组多肽溶液。
26.权利要求10的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含的宿主细胞DNA污染的水平减少至少200倍的重组多肽溶液。
27.权利要求11的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含宿主细胞蛋白质(HCP)污染的水平减少至少2倍的重组多肽溶液。
28.权利要求11的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含宿主细胞蛋白质(HCP)污染的水平减少至少2.5倍的重组多肽溶液。
29.权利要求11的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含宿主细胞蛋白质(HCP)污染的水平减少至少3倍的重组多肽溶液。
30.权利要求11的方法，其中所述方法提供了与所述参考方法相比，包含宿主细胞蛋白质(HCP)污染的水平减少至少3.5倍的重组多肽溶液。
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| CN111110876A (zh) * | 2020-01-20 | 2020-05-08 | 华兰生物工程重庆有限公司 | 一种特异性人免疫球蛋白病毒灭活工艺 |
| MX2023010523A (es) * | 2021-03-09 | 2023-09-20 | Japan Chem Res | Metodo para producir una proteina de fusion de anticuerpo-enzima lisosomica. |
| EP4448022A2 (en) * | 2021-12-16 | 2024-10-23 | Bristol-Myers Squibb Company | Detergent for viral inactivation |
| TW202403043A (zh) | 2022-03-18 | 2024-01-16 | 美商健臻公司 | 重組人類酸性鞘磷脂酶醫藥組合物及方法 |
| CN117866038B (zh) * | 2024-03-11 | 2024-05-28 | 北京百力格生物科技有限公司 | 纯化含有宿主核酸的带亲和标签的酸性蛋白的方法 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2008200700A1 (en) * | 1997-04-15 | 2008-03-13 | Daiichi Sankyo Co., Ltd | Novel Protein and Process for Producing The Same |
| CN103214566A (zh) * | 2013-03-30 | 2013-07-24 | 福州新北生化工业有限公司 | 一种g因子的分离纯化方法 |
| WO2015073633A1 (en) * | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Genentech, Inc. | Methods for viral inactivation using eco-friendly detergents |
| AU2015204304A1 (en) * | 2010-12-15 | 2015-08-06 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Viral Inactivation Using Improved Solvent-Detergent Method |
| AU2015252110A1 (en) * | 2009-12-18 | 2015-11-26 | Csl Limited | Method of purifying polypeptides |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5759855A (en) | 1988-09-14 | 1998-06-02 | La Jolla Cancer Research Foundation | Methods for modifying the binding activity of cell adhesion receptors |
| EP0531639B1 (en) * | 1991-07-18 | 1999-09-01 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Tocopherol cyclase |
| KR100402379B1 (ko) * | 1993-08-06 | 2004-03-24 | 코노트 래보러토리즈 리미티드 | 불활성화된호흡기신시튬바이러스백신 |
| CA2211650A1 (en) | 1995-01-27 | 1996-08-01 | Genencor International, Inc. | Surfactant-based extraction process |
| DE19528221C2 (de) | 1995-08-01 | 1998-10-22 | Blutspendedienst Der Drk Lande | Verfahren zur Herstellung eines virussicheren, therapeutischen Präparates aus Humanplasma |
| AU1583397A (en) | 1996-01-30 | 1997-08-22 | Brigham And Women's Hospital | Antibodies for modulating cd47-mediated neutrophil transmigration |
| EP0912746A2 (en) | 1996-07-12 | 1999-05-06 | Schering Corporation | MAMMALIAN TNF-$g(a) CONVERTASES |
| AT405939B (de) * | 1997-02-24 | 1999-12-27 | Immuno Ag | Verfahren zur inaktivierung von lipidumhüllten viren |
| US6610316B2 (en) * | 1997-05-30 | 2003-08-26 | Shanbrom Technologies, Llc | Disinfection by particle-bound and insolubilized detergents |
| US6174704B1 (en) | 1998-12-23 | 2001-01-16 | Pierce Chemical Company | Method for recovery of proteins prepared by recombinant DNA procedures |
| SE9904803D0 (sv) | 1999-12-27 | 1999-12-27 | Amersham Pharm Biotech Ab | Method for the isolation of hydrophobic proteins |
| ATE494909T1 (de) * | 2002-11-20 | 2011-01-15 | Bestewil Holding Bv | Zusammensetzungen mit antigen-komplexen,verfahren zu ihrer herstellung und verfahren zur verwendung derantigen-komplexe zur vakzinierung |
| US20100216161A1 (en) | 2009-02-26 | 2010-08-26 | Vertex Pharmaceuticals Incorporated | Method for identifying protease inhibitors |
| EP2027875A1 (en) | 2007-08-23 | 2009-02-25 | Octapharma AG | A Process for Isolation and Purification of a Target Protein free of Prion Protein (PrPSC) |
| AU2010202125B1 (en) * | 2010-05-26 | 2010-09-02 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield |
| CA2841604C (en) | 2011-07-20 | 2020-01-21 | Abbott Biologicals B.V. | Process for producing viral antigen and vaccines |
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|---|---|---|---|---|
| AU2008200700A1 (en) * | 1997-04-15 | 2008-03-13 | Daiichi Sankyo Co., Ltd | Novel Protein and Process for Producing The Same |
| AU2015252110A1 (en) * | 2009-12-18 | 2015-11-26 | Csl Limited | Method of purifying polypeptides |
| AU2015204304A1 (en) * | 2010-12-15 | 2015-08-06 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Viral Inactivation Using Improved Solvent-Detergent Method |
| CN103214566A (zh) * | 2013-03-30 | 2013-07-24 | 福州新北生化工业有限公司 | 一种g因子的分离纯化方法 |
| WO2015073633A1 (en) * | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Genentech, Inc. | Methods for viral inactivation using eco-friendly detergents |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Uratani Y等.Immunoaffinity Purification and Reconstitution of Sodium-couple Branched-chain Amino Acid Carrier of Pseudomonas aeruginosa.《Journal of Biological Chemistry》.1992,摘要、第5178页左栏倒数第1段-右栏第2段. * |
| 郑云.烷基糖苷与蛋白质相互作用的研究.《中国优秀硕士学位论文全文数据库》.2012,全文. * |
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