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CN103200813B - 源于蓝细菌的耐盐性SyGT基因及其用途 - Google Patents

源于蓝细菌的耐盐性SyGT基因及其用途 Download PDF

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CN103200813B CN201180052330.XA CN201180052330A CN103200813B CN 103200813 B CN103200813 B CN 103200813B CN 201180052330 A CN201180052330 A CN 201180052330A CN 103200813 B CN103200813 B CN 103200813B
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Abstract

本发明涉及对源于集胞藻属PCC6906SyGT蛋白质进行编码的基因、增加植物体耐盐性的方法，以及由所述方法制备的耐盐性得到增加的植物体及其种子。所述方法包括以下步骤：用包含SyGT基因的重组植物表达载体转化植物细胞，使SyGT过表达。

Description

源于蓝细菌的耐盐性SyGT基因及其用途
技术领域
本发明涉及源于蓝细菌的集胞藻属葡糖基转移酶（Synechocystisglucosyl transferase，SyGT）基因、将所述基因在植物体中过表达，从而增加植物体耐盐性的方法，以及由所述方法制备的耐盐性得到增加的植物体及其种子。
背景技术
包含蓝细菌的藻类被开发为有效遗传资源、生物能源（红藻类乙醇及海藻类生化柴油）及有效的生物材料（红藻类浆料）。最近，通过应用海藻类生物工程拓宽了海藻类的应用性，正在进行有关海藻类方面的研究。例如利用分子育种的新产品开发、作为医药或者工业上重要的有效蛋白质或有效物质生产的生物反应器。
最近报道有很多在蓝藻类中发现的基因，成功应用于农作物的研究结果。源于蓝细菌的基因具有能显著增加胁迫抗性的功能，例如耐盐性等，还发现若将其导入至植物时具有能增加植物的生产率等效果。这些意味着将源于蓝细菌的有效基因导入植物体内，不仅能改良植物体特性，还能提高生产能力、且有效物质的生产及其实用化的可能性显著提高。例如有以下报道，集胞藻属（Synechocystis）sp.PCC6906的组氨酸激酶（histidine kinases）和同源反应调节器（cognateresponse regulators）能调节高渗胁迫（hyperosmotic stress）及盐诱导性基因（salt-inducible gene）的表达。
集胞藻属PCC6906与淡水种类不同，其是一种栖息于海洋，适应了海洋环境的种，被认为有可能具有发达的应对盐胁迫（salt stress）的敏感性（sensitivity）或抵抗性（sensitivity）机制，因此推测它拥有很多与盐胁迫调节及抵抗性相关的基因。
为了栽培农作物而进行灌溉后，耕地内的钠、钙、镁、钾、硫酸盐、氯等水溶性盐的浓度会增加。这些盐在土壤中蓄积至一定水平以上时，会损害农作物通过根部吸收水分的功能，从而使植物细胞无法进行正常的代谢活动。盐的浓度越高，植物吸收的水分量越少，不仅会导致农作物的生产量减少，甚至还可能引起农作物的死亡。
灌溉田的农作物产量是普通农田的3倍以上，且目前的情况为灌溉田的比率逐渐增加。因此持续性的使用灌溉用水，会引起土壤盐分浓度的增加，农作物生产率显著降低，种子使用量及施肥量也随之增加。由于只能耕作流动性不高、具有高耐盐性的农作物，因此导致其经济性降低，并且盐分引起的土壤腐蚀严重的灌溉田有机化，导致粮食资源的枯竭、而农作物生产率的降低，也同时导致劳动力的浪费。
这些由于盐分引起的损害，是严重制约农作物生产能力的主要原因之一，属于农业领域不好解决的难题。据美国农业部（U.S.Dept.ofAgriculture）的报告，由每年灌溉（irrigation）引起的盐化作用，导致全世界1,000万公顷面积农田消失。为解决农田盐化的问题，许多科学家通过例如杂交的品种改良方法，试图开发出耐盐性农作物，但未取得显著成果。
因此，需要开发出一种能够诱导重要植/农作物耐盐性的新型、革新性的技术。很多科学家正在进行通过将外源基因转化至植/农作物，从而提高耐盐性的研究。
发明内容
本发明要解决的技术问题
本发明是依据上述要求提出的。本发明中分离源于蓝细菌的SyGT基因，并确认将其在植物体中过表达时植物体耐盐性会增加，从而完成了本发明。
技术方案
为了解决上述问题，本发明提供源于集胞藻属PCC6906的SyGT蛋白质。
并且，本发明提供编码SyGT蛋白质的基因。
并且，本发明提供包含SyGT基因的重组载体。
并且，本发明提供用上述重组载体转化的宿主细胞。
并且，本发明提供一种增加植物体耐盐性的方法，上述方法包括以下步骤：利用上述重组载体转化植物细胞，使SyGT基因过表达。
并且，本发明提供由上述方法制备的耐盐性得到增加的转化植物体及其种子。
并且，本发明提供用于增加植物体耐盐性的组合物，其包含SyGT基因。
并且，本发明提供用于扩增SyGT基因的引物集。
有益效果
根据本发明的内容，通过将本发明的SyGT基因在植物体中过表达，能够增加植物体的耐盐性。上述耐盐性得到增加的转化植物，尤其在开垦地及山间坡地较多的韩国，其应用可能性非常高。
附图说明
图1为SyGT基因的碱基序列。
图2为SyGT基因的氨基酸序列。
图3表示多种蓝细菌间的SyGT基因氨基酸序列的亲缘关系（relationship）（A）及同源关系（B）。
图4是用于本发明的转化载体。
图5示出了为筛选SyGT转化烟草的PCR（A）及DNA印迹（southern blotting）（B）分析的结果图片。
图6示出了SyGT转化拟南芥基因表达程度的实时定量PCR（Real-time PCR）（A）及耐盐性（B：NaCl处理后的叶绿素含量）结果。
图7示出了为筛选SyGT转化浮萍的PCR（A）及耐盐性（B：转化浮萍在含有100mM NaCl的培养基中生存及分化结果图片。
图8示出了为筛选SyGT转化白杨的PCR（A）及基因表达程度的实时定量PCR（B）结果。
图9为表示SyGT转化白杨的耐盐性结果（A～C）及叶绿素含量变化（D）的图片。A：SyGT基因转化白杨在包含NaCl的培养基中的耐盐性；B：SyGT基因转化白杨在包含NaCl的新梢（shoot）再生培养基中的新梢再生结果；C：用450mM NaCl溶液处理24小时后，SyGT基因转化白杨的耐盐性（C-1）及Fv/Fm值变化（C-2）；D：SyGT基因转化白杨叶绿素含量的变化。
具体实施方式
为了实现本发明的目的，本发明提供源于集胞藻属PCC6906的SyGT蛋白质，其由SEQ ID NO.2氨基酸序列构成。
本发明的SyGT蛋白质范围包含从集胞藻属PCC6906分离，具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的蛋白质及上述蛋白质的功能等同物。“功能等同物”是指由氨基酸的添加、取代或者缺失的结果，与上述SEQ ID NO.2所示氨基酸序列至少有70%以上的序列同源性，优选80%以上，更优选90%以上，最优选95%以上，且具有与SEQ IDNO.2所示蛋白质类似功能特性的蛋白质。
并且，本发明提供编码上述SyGT蛋白质的基因。本发明的基因包括编码SyGT蛋白质的基因组DNA和cDNA。更优选地，本发明的基因可包含SEQ ID NO.1所表示的碱基序列。并且，上述碱基序列的变异体也包含在本发明的范围内。更确切地说，上述基因可包含与SEQ ID NO.1的碱基序列具有70%以上序列同源性的碱基序列，优选80%以上，更优选为90%以上，最优选95%以上。
对于多聚核苷酸“序列同源性的%”是通过比较两个以最优方式排列的序列和比较区域得以确认。比较区域中的部分多聚核苷酸序列与对于两个序列的最优排列的参考序列（不包括添加或者删除）相比，可包含添加或者删除（即间隙（gap））。
并且，本发明提供包含本发明的SyGT基因的重组载体。上述重组载体优选重组植物表达载体。更优选地，可为具有图4所记载酶切图的转化载体。
术语“重组”是指细胞复制异种核酸或表达上述核酸或表达由肽、异种肽或者异种核酸编码的蛋白质的细胞。重组细胞能将在上述细胞的天然形态中不被发现的基因或者基因片段表达为正义引物或者反义引物形态中的一个。另外，重组细胞可表达从天然状态的细胞中发现的基因，但上述基因是发生变形的，是通过人为手段再导入至细胞内的基因。
术语“载体”是在表示向细胞内传递的DNA片段、核酸分子时使用。载体能够复制DNA，并在宿主细胞中单独再生产。术语“传递体”通常与“载体”互换使用。术语“表达载体”是指包括适当的核酸序列的重组DNA分子。所述适当的核酸序列为表达目标编码序列、以及在特定宿主生物中表达可操作地连接的编码序列所必需的核酸序列。
本发明的载体可构建成典型的克隆或者表达的载体。并且，本发明中的载体可以原核细胞或真核细胞为宿主构建。例如，本发明的载体是表达载体，以原核细胞作为宿主时，一般包含能使其执行转录的强力启动子（例如，pLλ启动子、trp启动子、lac启动子、T7启动子、tac启动子等），为翻译起始的核糖体结合位点以及转录/翻译终止序列。大肠杆菌（E.coli）作为宿主细胞时，E.coli色氨酸生物合成途径的启动子及操纵位点，还有λ噬菌体的左向启动子（pLλ启动子）可被用作调节部位。
此外，本发明可使用的载体可通过对本领域通常使用的质粒（例：pSC101、ColE1、pBR322、pUC8/9、pHC79、pGEX系列、pET系列及pUC19等），噬菌体（例：λgt4·λB，λ-Charon，λΔz1及M13等）或者病毒（例：SV40等）进行操作制得。
此外，本发明的载体为表达载体，以真核细胞作为宿主时，可以利用源于哺乳动物细胞基因组的启动子（例：金属硫蛋白启动子）或者源于哺乳动物病毒的启动子（例：腺病毒晚期启动子、痘苗病毒7.5K启动子、SV40启动子、巨细胞病毒启动子及HSV的tk启动子），且作为转录终止序列一般包含多聚腺苷酸化序列。
依据本发明的一个具体例的植物表达载体中，启动子可为CaMV35S、肌动蛋白、泛素、pEMU、组蛋白启动子、源于水稻C1p启动子。术语“启动子”是指结构基因中DNA的上游区域，是RNA聚合酶为了启动转录而结合的DNA分子。“植物启动子”是指能在植物细胞中启动转录的启动子。“组成型（constitutive）启动子”是指在大部分的环境条件及生长状态或者细胞分化条件下具有活性的启动子。
作为终止子，可采用通常使用的终止子，例如胭脂碱合酶（NOS）、水稻α-淀粉酶Ramy1A终止子、菜豆碱（phaseoline）终止子、根癌土壤杆菌的章鱼碱（Octopine）基因终止子、大肠杆菌rrnB1/B2终止子等。
本发明的载体可包含本领域通常使用的抗生素抗性基因作为选择性标记，例如有对于氨苄西林、庆大霉素、羧苄西林、氯霉素、链霉素、卡那霉素、遗传霉素、新霉素、凯福隆及四环素的抗性基因。
并且，本发明还提供利用本发明的重组载体转化的宿主细胞。在本发明中可稳定、连续地克隆及表达载体的宿主细胞，可选用本领域公知的任何宿主细胞，例如E.coli JM109、E.coli BL21、E.coli RR1、E.coli LE392、E.coli B、E.coli X1776、E.coli W3110、枯草芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌等病毒属菌株，还有鼠伤寒沙门氏菌，粘质沙雷氏菌及多种假单胞菌等肠杆菌科菌株等。
并且，将本发明的载体转化至真核细胞时，可选用例如酿酒酵母（Saccharomyce cerevisiae）、昆虫细胞、人细胞（例如，CHO细胞系（中国仓鼠卵巢细胞）、W138、BHK、COS-7、293、HepG2、3T3、RIN及MDCK细胞系）及植物细胞等作为宿主细胞。
宿主细胞为原核细胞时，可通过CaCl2方法（Cohen，S.N.et al.，Proc.Natl.Acac.Sci.USA，9:2110-2114（1973）（科恩，S.N.等人，美国国家科学院院刊USA，9:2110-2114（1973）））、哈拿汗（Hanahan）方法（Hanahan，D.，J.Mol.Biol.，166:557-580（1983）（Hanahan，D.，分子生物学杂志，166:557-580（1983）））及电穿孔法（Dower，W.J.et al.Nucleic.Acids Res.，16:6127-6145（1988）（Dower，W.J.等人核酸研究，16:6127-6145（1988）））等方法，将本发明的载体转运至宿主细胞内。宿主细胞为真核细胞时，可通过显微注射法（Capecchi，M.R.，Cell，22:479（1980）（Capecchi，M.R.，细胞，22:479（1980）））、磷酸钙沉淀法（Graham，F.L.et al.，Virology，52:456（1973）（Graham，F.L.等人，病毒学，52:456（1973）））、电穿孔法（Neumann，E.et al.，EMBO J.，1:841（1982）（诺依曼，E.等人，欧洲分子生物学杂志，1:841（1982）））、脂质体介导转染法（Wong，T.K.et al.，Gene，10:87（1980）（Wong，T.K.等人，基因，10:87（1980）））、DEAE-葡聚糖转染法（Gopal，Mol.Cell Biol.，5:1188-1190（1985）（戈帕尔，分子与细胞生物学，5:1188-1190（1985）））及基因枪轰击法（Yang et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，87:9568-9572（1990）（Yang等人，美国国家科学院院刊，87:9568-9572（1990）））等方法，将载体注入至宿主细胞内。
并且，本发明还提供增加植物体耐盐性的方法，所述方法包括以下步骤：利用本发明的重组载体转化植物细胞，使SyGT基因过表达。
植物的转化是指将DNA转移至植物的任意方法。这些转化方法不一定需要经过再生及（或者）组织培养期。目前，植物种的转化不仅对于双子叶植物，包括单子叶植物量子的植物种也非常普遍。原则上，任意的转化方法均可被用于将依据本发明的杂合DNA导入到祖细胞中。所述方法可选自对于原生质体的钙/聚乙二醇方法（Krens，F.A.et al.，1982，Nature296，72-74；Negrutiu I.et al.，June1987，PlantMol.Biol.8，363-373（Krens，F.A.等人.，1982，自然296，72-74；Negrutiu I.等人.，1987年6月，植物分子生物学8，363-373））、原生质体的电穿孔法（Shillito R.D.et al.，1985Bio/Technol.3，1099-1102（Shillito R.D.等人.，1985生物/技术3，1099-1102））、作为植物元素的显微注射法（Crossway A.et al.，1986，Mol.Gen.Genet.202，179-185（克洛斯威A.等人.，1986，分子遗传学和基因组202，179-185））、各种植物元素的（DNA或者RNA-涂布的）微粒轰击法（Klein T.M.etal.，1987，Nature327，70（Klein T.M.等人.，1987，自然327，70））、依据植物的浸润或者成熟花粉或者小孢子转化的，根癌土壤杆菌介导的基因转移（非完整性）中依据病毒的感染（EP0301316号）等。本发明的优选方法包含土壤杆菌介导的DNA转移。更为优选的是利用EPA120516号及美国专利第4,940,838号所记载的所谓双元载体技术的方法。
本发明的转化可由根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefiaciens）介导。并且，本发明的方法包含从上述转化植物细胞再分化转化植物的步骤。从转化植物细胞再分化转化植物的方法，可采用本领域公知的任意方法。
为实现本发明的另一目的，本发明提供由本发明的方法制备的耐盐性得到增加的转化植物体。
更具体地说，本发明的耐盐性植物体可通过以下方法获得。用包含SyGT基因的重组载体转化植物体后，利用通常采用的方法经过新梢的诱导、生根及土壤驯化的过程获得。即，将用包含SyGT基因的重组载体转化的植物外植体接种于本领域公知的适当的培养基中，在适当条件下培养，诱导新梢的形成，新梢形成后将其转至未添加激素的培养基中继续培养。约2周后将上述新梢转至生根用培养基，诱导根部的生成。诱导生根后将其移植到土壤，进行驯化从而可获得耐盐性植物体。
本发明还提供耐盐性得到增加的植物体种子。
本发明还提供用本发明中的载体进行转化，耐盐性得到增加的转化植物体。
本发明的一个具体例的方法中，上述植物可为单子叶植物或双子叶植物。上述单子叶植物包含例如水稻、小麦、大麦、竹笋、玉米、芋、芦笋、洋葱、蒜、葱、韭菜、山蒜、山药、生姜及浮萍，但不局限于此。双子叶植物包含例如烟草、拟南芥、茄子、辣椒、番茄、马铃薯、牛蒡、茼蒿、生菜、桔梗、菠菜、叶用甜菜、红薯、芹菜、胡萝卜、水欧芹、欧芹、白菜、卷心菜、芥菜、萝卜、西瓜、甜瓜、黄瓜、南瓜、瓠瓜、草莓、大豆、绿豆、四季豆、豌豆及白杨等，但不局限于此。优选烟草、拟南芥、白杨或者浮萍。
本发明还提供用于增加植物体耐盐性的组合物，其包含SyGT基因。本发明的组合物包含SyGT作为有效成分，将上述SyGT基因导入到植物体内表达，能使植物体耐盐性增加。更有选地，上述SyGT基因可由SEQ ID NO.1的碱基序列构成。并且，上述SyGT基因可包含SyGT基因序列中发生特定碱基序列的插入、取代、缺失的序列。
本发明中的“耐盐性”是指为了生长在渗透胁迫，或者水和土壤中盐类或离子引起的胁迫下的某些植物的能力。具有耐盐性的植物是指：使用包含对同种的其它植物不利的水和离子混合物的液体供给水分，或者用此类培养基耕种时，与同种及/或者变异植物相比生长速度增加的植物即具有耐盐性。本发明还提供用于扩增SyGT基因的引物集。上述引物集由SEQ ID NO.3及4的寡核苷酸构成。
本发明的“引物”是指与需要复制的核酸链互补的单链寡核苷酸序列，可用作合成引物延长产物的起始点。上述引物的长度及序列应允许启动延长产物的合成。本说明书中被用作引物的寡核苷酸还可包含核苷酸类似物，例如硫代磷酸（phosphorothioate）、烷基硫代磷酸酯或者肽核酸（peptide nucleic acid），或者插入剂（intercalating agent）。
以下，将通过实施例详细说明本发明。但下述实施例仅是为了例示本发明，本发明的内容不会被下述实施例所限定。
实施例
实验方法
1.核转化载体的制备
集胞藻属（Synechocystis）PCC6906的SyGT基因是从集胞藻属PCC6906基因组DNA中，利用引物5’-gctctagaATGCAAATATTAAGCGGGTTGCAA-3’（引物SEQ ID NO.3，XbaI位点（site）用下划线标出）和5’-gctctagaTTATTGGGAAAGGGGAACCATCTT-3’（引物SEQ ID NO.4，XbaI位点（site）用下划线标出），采用PCR技术扩增获得。将扩增获得的基因克隆到TA克隆载体（Solgent，韩国）上，确认碱基序列。确认碱基序列的SyGT基因用XbaI/XbaI酶切后在pHC21B中进行亚克隆化，并命名为pHC21B-SyGT。此时，基因的插入方向根据限制酶的切割大小及PCR结果所确定。利用该载体，对各个植物体进行转化，从而导入SyGT基因。
2.植物的转化和培养条件
2-1.烟草核转化及培养条件
将导入SyGT基因的pHC21B::SyGT转化载体，用冻融（freezethaw）方法转化至土壤杆菌GV3101（Agrobacterium GV3101）。将单一菌落接种于添加了100mg/L利福平（Rifampicin）、50mg/L卡那霉素（Kanamycin）的YEP培养基中培养2天左右（28℃，避光震荡培养箱（dark shaking incubator））。将体外培养中的除了烟草叶子边缘部位以外的部分切成约5×5mm2大小的外植体，并使其在稀释成O.D0.4-0.6的Agro溶液10mL中悬浮，且气孔朝上，在黑暗条件下共培养2天左右。将共培养后的外植体用蒸馏水清晰2次、用添加了500mg/L羧苄青霉素（Carbenicillin）或者凯福隆（Claforan）的溶液清晰1次后，利用灭菌纸巾去除水分，后将其叶孔朝上地接种于新梢（shoot）再分化培养基（MS+2mg/L（或者1mg/L）BA+0.1mg/LNAA+500mg/L羧苄青霉素或者凯福隆+100mg/L卡那霉素）中，在25℃、16小时昼长条件下进行培养。培养3-4周后将外植体生成的新梢（shoot）切下，移至MS生根培养基中（MS+500mg/L羧苄青霉素或者凯福隆+100mg/L卡那霉素），待其生根后移植到土壤中，并在植物生长人工气候室（Phytotron）中培养。
2-2.拟南芥的转化以及培养条件
将拟南芥（Arabidopsis thaliana）种子在4℃、黑暗条件下低温处理4天后，播种于土壤，约4周后用导入了耐盐性基因的根癌土壤杆菌（Agrobacterium tumefaciens）GV3101作为介质，通过真空渗透（vacuum infiltration）方法进行转化。经转化的拟南芥种子在含有卡那霉素作为筛选标记的MS筛选培养基（1/2MS，0.5g/L MES，10g/L蔗糖，50mg/L卡那霉素，100mg/L头孢噻肟）中进行筛选，仅选择均质接合体用于实验。所有的培养在25℃、16小时光周期的约80μmol m-2s-1冷白（cool-white）荧光条件下进行。
2-3.浮萍的转化及培养条件
利用浮萍（Lemnaceae）的叶状体叶子和土壤杆菌对浮萍进行转化。更具体地说，浮萍叶状体置于将MS培养基的所有无机盐类浓度降至1/2，并分别添加有1mg/L BA，0.4mg/L盐酸硫胺（thiamine HCl），100mg/L肌醇（myoinositol），30g/L蔗糖（sucrose）以及4g/L结冷胶（Gelrite）的培养基（1/2MS1BA培养基）中，在25℃条件下进行光照培养（约80μmol m-2s-1光周期16/8时间），从而诱导个体增值。
用刀切开增值的浮萍叶状体，添加导入了耐盐性基因的根癌土壤杆菌GV3101培养液后，在室温感染20分钟。感染完成后去除根癌土壤杆菌，干燥后的叶子移至添加了100μM乙酰丁香酮（Acetosyringon）的植物培养用固体培养基，在25℃条件下，在暗室共培养72小时。共培养的叶子用含有300mg/L羧苄青霉素的液体培养基（broth）清洗3-4次，充分去除粘附于表面的土壤杆菌后放置10-20分钟使其干燥。后将其移至添加了250mg/L卡那霉素和300mg/L羧苄青霉素作为筛选标记的筛选培养基中筛选叶子。置于筛选培养基后分化的叶子，以3周的间隔进行继代培养。
2-4.白杨的转化及培养条件
为了白杨的转化，分离使用了体外增值白杨（Populus alba X P.tremula var.glandulosa（银白杨X P.欧洲山杨var.小化香）雄性不育突变株）的节间组织。具体地，在LB液体培养基中培养的根癌土壤杆菌中加入150μM的乙酰丁香酮后，感染4周龄的白杨节间组织20分钟，感染完成的节间组织放入到0.85%NaCl中清洗，后放在滤纸（filter paper）上吸附残留的根癌土壤杆菌。反复清洗3次后，在没有抗生素的CIM培养基（MS、1mg/L2,4-D、0.1mg/L NAA、0.01mg/LBA，pH5.8）中，24℃条件的培养室中培养2天。后将培养的节间组织置于CIM培养基（MS、50mg/L卡那霉素、300mg/L头孢噻肟、1mg/L2,4-D、0.1mg/L NAA、0.01mg/L BA，pH5.8）中3～4周，诱导愈伤组织（callus）。节间组织中形成愈伤组织后，将其移至SIM培养基（WPM，50mg/L卡那霉素、300mg/L头孢噻肟、1mg/L玉米素（zeatin），0.1mg/L BA，0.01mg/L NAA，pH5.5），培养约8周的时间，诱导新梢的生成。诱导的新梢移植到RIM培养基（MS，50mg/L卡那霉素、300mg/L头孢噻肟、0.2mg/L IBA），诱导其生根。
从RIM培养基（MS，50mg/L卡那霉素、300mg/L头孢噻肟、0.2mg/L IBA）中诱导生根的植物体叶子组织中提取基因组DNA，通过聚合酶连反应（PCR，polymerase chain reaction）筛选转化植物体。
将诱导生根后进行筛选的白杨从培养基中取出，利用蒸馏水将粘附在根部的培养基洗去。在密闭的容器中放入灭菌的土壤，用适量的蒸馏水使其湿润，后种植诱导出的根部，种植时要注意不要损伤根部，之后重新密闭，在24℃的培养室（16小时光照培养，8小时暗培养）中培养约20天。
3.DNA印迹杂交分析
利用DNeasy植物迷你试剂盒（DNeasy Plant Mini Kit）（Qiangen，德国希尔登），从转化植物体叶子中分离出了总基因组DNA，约4μg基因组DNA被EcoRV（烟草转化体时）切割，在1%琼脂糖凝胶中进行电泳后转至Zeta-探针GT印迹膜（Bio-Red，Hercules，加拿大）。从集胞藻属PCC6906基因组中利用5’-TCCATCGCCCAGCAAGATTATCCA-3’引物（SEQ ID NO.5）和5’-ACCGCATCAATGACATAGGGCAAC-3’引物（SEQ ID NO.6），通过PCR法扩增约500bp的片段，后用放射性同位素[32P]dCTP标记，从而确认SyGT基因的插入。预杂交（prehybridizaition）以及杂交（hybridization）在含有7%（w/v）SDS的0.25M磷酸钠（Sodium Phosphate，pH7.2）缓冲液中，65℃条件下进行16小时，并在含有5%（w/v）SDS的0.2M磷酸钠（Sodium Phosphate，pH7.2）缓冲液中，65℃条件下清洗2次，每次清洗30分钟，后在X-线胶片上反应3小时进行确认。
4.实时PCR（Real-time PCR）
利用试剂盒（Trizol Reagent）（GIBCOBRL，美国纽约）从烟草和白杨叶子中提取总RNA。将5μg的总RNA利用oligo dT15和M-MLV逆转录酶（Reverse Transcriptase）（Enzynomics，韩国大田）合成cDNA。
对拟南芥种子进行消毒后使其在MS培养基（1/2MS、0.5g/LMES、10g/L蔗糖、100mg/L头孢噻肟）中发芽，后在25℃下，以16小时的光周期，40μmolm-2sec-1的冷白荧光条件下培养7天。培养出的拟南芥用DNeasy植物迷你试剂盒（QIAGEN，德国希尔登）和脱氧核糖核酸内切酶（RNase-Free DNase Set）（QIAGEN，德国希尔登）提取出总RNA。利用oligo dt15和M-MLV逆转录酶（Enzynomics，韩国大田）将6μg的总RNA合成cDNA。
合成出的烟草、拟南芥、白杨的cDNA，利用SolGentTM实时PCR试剂盒（Solgent，韩国大田）以及DNA Engine Opticon2（MJ研究（MJ Research），美国沃尔瑟姆）进行实时定量PCR。
实时定量PCR中使用的各个引物在下述表1中示出。
表1
5.叶绿素含量的测定
拟南芥的情况下，在含有1%蔗糖（sucrose）的MS培养基中，以16小时：8小时的光周期培养5天的30个植物体中加入500μl的95%乙醇。白杨的情况下，在叶子切块（1.13cm2）中加入2μl的95%乙醇后，4℃黑暗条件下静置培养18小时，从而提取出叶绿素。萃取出的叶绿素利用分光光度计测定OD664.2以及OD648.6的值，从而测定叶绿素A和叶绿素B的含量。叶绿素的含量以叶绿素A以及叶绿素B之和表示。
耐盐性分析
拟南芥的情况下，将50个灭菌的种子置于包含1%蔗糖的MS培养基中培养5天使其发芽，后移至含有特定浓度的NaCl以及1%蔗糖的MS培养基中培养7天，以16小时：8小时（明：暗）光周期使其生长5天。其中取30个植物体，通过叶绿素含量测定方法测定叶绿素含量的变化，从而分析转化拟南芥的耐盐性。
浮萍的情况下，转化植物体以3周的间隔进行继代培养，将分化的植物体置于含特定浓度NaCl的MS培养基，对生存与否以及分化情况与对照组相比，从而分析耐盐性特性。
白杨的情况下，通过观察在含有特定浓度NaCl的新梢再生培养基中，转化植物体以及对照组的新梢形成与否，在体外初次分析耐盐性。将转化植物体在土壤中驯化3周后，在300mM的NaCl溶液中浸渍24小时，后用0.1%花宝（HYPONeX）溶液恢复，利用HandyPEA（波萨科技.美国）设备，测定Fv/Fm值以及叶绿素含量变化，从而分析植物体耐盐性。耐盐性白杨转化植物体中，为筛选耐盐性最佳的植物体，在驯化8周后用450mM的NaCl处理24小时，然后测定Fv/Fm以及叶绿素含量变化，并与对照组比较。
其它未提及的实验方法，是通过通常使用的植物培养、筛选种子、分子生物学方法进行的。
实施例
实施例1：源于集胞藻属PCC6906的SyGT基因
源于集胞藻属PCC6906的SyGT基因的碱基序列，是分离集胞藻属PCC6906基因组，并利用GS-FLX（罗氏公司，美国）获得所有碱基序列信息之后分离及确定。SyGT基因由1,149个的核苷酸构成，编码382个氨基酸序列（图1及2）。源于集胞藻属PCC6906的SyGT基因的氨基酸序列，与产于淡水的集胞藻属PCC6803slr0813的一致性（identity）达到68%，阳性（positivive）显示为83%，其亲缘关系最为接近。此外，与蓝杆藻（Cyanothece）sp.PCC8801以及蓝杆藻sp.ATCC51142的基因也显示出了较高的亲缘关系（图3）。
实施例2：源于集胞藻属PCC6906的SyGT基因转化载体和转化植物体的筛选
为了获得转化植物体，从PCC6906基因组DNA中，利用引物5’-gctctagaATGCAAATATTAAGCGGGTTGCAA-3’（SEQ ID NO.3，XbaI位点用下划线标出）和5’-gctctagaTTATTGGGAAAGGGGAACCATCTT-3’（SEQ ID NO.4，XbaI位点用下划线标出）扩增SyGT基因后，用限制酶切割。将pHC21B载体的XbaI/XbaI位点用限制酶切割，其中插入SyGT基因片段，从而制备出核转化载体（图4）。将导入此转化载体的植物体，在含有卡那霉素作为筛选标记的培养基中进行筛选。筛选出的植物体利用SyGT基因的引物，通过PCR方法确认SyGT基因的插入。并且，对于各个转化植物体的SyGT基因的表达，通过实时定量PCR（Real-time PCR）方法，分析其表达程度。
实施例3：源于集胞藻属PCC6906的SyGT基因转化烟草的制备
从导入了源于集胞藻属PCC6906的SyGT基因的烟草转化植物体中保留及消毒T0代种子，筛选对于含有3%蔗糖和50mg/L卡那霉素的MS培养基具有抗性的植物体，从而保留了T1代种子。从保留的种子中获得植物体，并分离基因组DNA，通过PCR以及DNA印迹杂交分析，确认SyGT的导入，并分离总RNA，通过实时定量PCR方法，确认导入基因的表达程度。如图5A所示，在21种SyGT基因转化烟草植物体中，有14种的转化体确认已导入基因，在这些转化植物体中可确认有4种插入了一个拷贝基因（图5B）。
实施例4：源于集胞藻属PCC6906的SyGT基因转化拟南芥的耐盐性
对SyGT基因转化拟南芥的T1种子进行消毒，后置于含有1%蔗糖的培养基中，在4℃黑暗条件下进行4天的低温处理，然后在25℃，约80μmolm-2sec-1的冷白荧光条件下，以16小时光周期，培养5天。从培养出的植物体中分离总RNA，通过实时定量PCR，分析SyGT基因的表达程度。其中确认在一个独立品系中，SyGT基因过表达（图6A）。
将该独立品系置于含有1%蔗糖的培养基后，进行低温处理及在上述条件下培养5天，再移至含有100、150、150mM NaCl的MS培养基中，相同条件下培养7天。从其中的30个植物体中提取叶绿素，测定其含量的结果显示，在添加了100mM、150mM、200mM NaCl的培养基中，与作为对照组的Col-0相比，转化拟南芥显示出了相对更高的叶绿素含量（图6B）。这表明基因过表达的拟南芥获得了对于NaCl的抗性，即耐盐性特性。
实施例5：源于集胞藻属PCC6906的SyGT基因转化浮萍的耐盐性
为了对用浮萍组织培养方法制备的SyGT基因转化浮萍进行筛选，从转化浮萍中提取基因组DNA，通过PCR方法确认，从而从14种转化体中保留12种转化植物体（图7A）。对这些转化植物体，以3周间隔进行继代培养，并诱导分化。为测定耐盐性，将其置于含有100mM NaCl的MS培养基，在25℃，约80μmolm-2sec-1的冷白荧光条件以及16小时光周期条件下观察生存及分化情况。其结果为，观察到对照组在包含NaCl的培养基中发生死亡，但导入SyGT基因的转化浮萍则可以生存及分化（图7B，平板左侧：对照组（野生型（WT）），平板右侧：转化浮萍（突变体））
实施例6：源于集胞藻属PCC6906的SyGT基因转化白杨的耐盐性
为了筛选导入SyGT基因的转化白杨，利用SyGT引物，通过PCR方法进行确认（图8A）。从筛选出的转化白杨中分离出基因组DNA，用实时定量PCR对导入基因的表达程度进行确认，其结果显示转化白杨中发生过表达（图8B）。
为确认这些转化白杨的耐盐性，将各个转化白杨的叶子置于含有50mM及100mM NaCl的新梢再生SIM培养基（WPM、50mg/L卡那霉素、300mg/L头孢噻肟、1mg/L玉米素、0.1mg/L BA、0.01mg/L NAA、pH5.5）中，在25℃、光照条件下培养8周，从而观察生存以及新梢的再生。其结果可确认，转化白杨的叶子可在含有50mM NaCl的培养基中生存，在有50mM NaCl的培养基中新梢也可再生。而对照组在两种浓度的NaCl中均发生死亡（图9A，B）。将转化白杨在土壤中驯化8周后，在450mM的NaCl溶液中浸渍24小时，然后以2天间隔用0.1%花宝溶液处理，并测定Fv/Fm值。测定结果显示，作为对照组的BH组的Fv/Fm值，从NaCl溶液处理5天后开始急剧降低，而SyGT基因转化白杨却能持续维持0.8左右的正常值（图9C-2）。并且，用转化白杨叶子制备约1.13cm2的叶子圆盘，浸泡于0、250、500、1000mM NaCl溶液中，测定叶绿素含量的变化，其测定结果显示处理5天后在各个浓度中均观察到了叶绿素含量的显著变化。即对照组随着处理NaCl浓度的增加，其叶绿素含量急剧减少，但SyGT转化白杨能相对维持较高的叶绿素含量（图9D）。导入源于集胞藻属PCC6906的SyGT基因的转化白杨，与对照组相比显示出了极佳的耐盐性特征。

Claims (12)

1.一种源于集胞藻属（Synechocystis）PCC6906的集胞藻属葡糖基转移酶（Synechocystis glucosyl transferase，SyGT）蛋白质，其特征在于，其由SEQ ID NO.2的氨基酸序列构成。
2.一种编码权利要求1所述SyGT蛋白质的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因由SEQ IDNO.1的碱基序列构成。
4.一种包含权利要求2所述基因的重组载体。
5.一种利用权利要求4所述重组载体转化的宿主细胞。
6.一种增加植物体耐盐性的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：利用权利要求4所述载体转化植物细胞，使SyGT基因过表达。
7.一种耐盐性得到增加的转化植物体的制备方法，其特征在于，该方法包括使用权利要求4所述的重组载体转化植物细胞，使SyGT基因过表达的步骤。
8.根据权利要求7所述的耐盐性得到增加的转化植物体的制备方法，其特征在于，所述植物体为双子叶植物或单子叶植物。
9.根据权利要求7所述的耐盐性得到增加的转化植物体的制备方法，其特征在于，所述植物体为烟草、拟南芥、浮萍或白杨。
10.一种耐盐性得到增加的转化植物体的制备方法，其特征在于，该方法包括使用权利要求4所述的重组载体转化植物体。
11.一种用于增加植物体耐盐性的组合物，其特征在于，其包含权利要求2所述的基因。
12.一种用于扩增SyGT基因的引物集，其由SEQ ID NO.3及SEQ ID NO.4的寡核苷酸构成。
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