KR101341932B1 - 동해 및 가뭄 저항성 고추 전사인자 ＣａＷＲＫＹ1 유전자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 동해 및 가뭄 저항성 폴리펩티드의 세포 내 수준을 증가시켜 식물의 동해 및 가뭄 저항성을 향상시키는 방법에 관한 것으로, 본 발명에 따라 동해 및 가뭄에 대한 저항성 유전자로 형질전환된 식물체는 동해 및 가뭄 저항성 품종으로 육성 가능하다.

Description

동해 및 가뭄 저항성 고추 전사인자 ＣａＷＲＫＹ1 유전자 및 이의 용도{Gene encoding pepper transcription factor CaWRKY1 having resistance to frost damage and drought disaster, and use thereof}

본 발명은 동해(凍害) 및 가뭄 저항성 고추 전사인자 CaWRKY1 유전자 및 이의 용도에 관한 발명이다. 보다 상세하게는 특정 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 세포 내 수준을 조절하여 식물, 특히 가지과 식물의 동해 및 가뭄 저항성을 증진시키는 방법, 상기 방법에 따라 제조된 식물 및 이의 종자 또는 영양체에 관한 것이다.

식물은 이동성이 거의 없으므로 생존과정에 직면하는 여러 종류의 환경 스트레스를 회피하는 능력이 동물에 비해 현저히 떨어지므로, 대부분의 식물은 저온, 염, 및 건조와 같은 스트레스에 스스로 내성을 발휘할 수 있는 다양한 방어기작을 가진다. 최근 식물의 스트레스에 대한 반응이나 방어기작에 대한 연구가 활발히 진행되고 있으며, 식물의 스트레스와 관련된 많은 유전자들이 탐색되고 그 기능이 밝혀지고 있다. 이러한 연구를 통해 밝혀진, 식물 스트레스에 대한 내성을 가진 유전자는 궁극적으로 식물이나 작물에 미치는 환경 스트레스에 저항성을 부여하는데 유용한 유전자원으로 활용될 수 있다.

특별히 전사인자들의 발현 변화는 스트레스 상황에 있는 식물에 많은 영향을 주게 된다. 애기장대에는 DNA와 상호작용할 수 있는 Domain을 가지는 다양한 종류의 전사인자들이 있다. 이들 중에는 EREBP/AP2, bZIP, Myb, WRKY 그리고 Zinc finger 도메인을 갖는 단백질들이 포함되는데, 이들이 어떤 스트레스 상황에서 발현이 유도되는가에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다. 예를 들어 토마토의 에칠렌 반응 인자(ETHYLENE-RESPONSE-FACTOR)인 Pti4가 과발현된 토마토는 식물의 곰팡이 병원체인 Erysiphe orontii와, 식물의 세균 병원체인 Pseudomonas syringae pv. tomato에 대한 저항성이 증가되었다. Pti4는 프로모터에 GCC box를 갖는 유전자들의 발현을 조절하는 기능을 가지고 있는 것으로 추정되고 있다. 또 다른 예로, 애기장대의 EREBP/AP2 type 전사인자인 CBF1/DREBP1과 DREBP1A를 과발현시킨 애기장대가 건조, 고농도의 염, 저온과 같은 환경 스트레스에 내성을 보인다는 연구결과가 보고되었다. 이들 두 전사인자는 저온 반응에 관여하는 프로모터 서열인 CRT/DRE box와 상호작용하고, 표적 유전자들의 발현을 조절하는 것으로 밝혀졌다.

식물 호르몬과 같은 조절물질들은 서로 다른 신호전달체계에 관여한다. 살리실산, 에칠렌 그리고 자스몬산은 병원체 침입후 병 저항성 신호전달 과정 중 이차 신호전달자로 활동하면서 많은 방어-관련 유전자들의 발현을 유도한다. 건조와 고농도의 염은 다량의 abscisic acid 생성을 유도하며, 외부에서 처리한 abscisic acid는 건조와 저온 스트레스에 반응하는 여러 유전자들의 발현을 조절한다. 이러한 현상은 생물적 스트레스와 비생물적 스트레스에 관여하는 유전자들의 발현 유형이 서로 다름을 보여주며, 이는 서로 다른 전사인자와 식물 호르몬의 서로 다른 조절의 결과이다.

한편, 현재 인구 증가에 따라 식량증산은 계속 요구되고 있으나 농수 및 농지는 점점 줄어들고 있는 실정이다. 아울러, 작물은 고착생활을 하기 때문에 주위 환경이 변화하는 경우 생육기간 중 많은 스트레스를 받아 수확량에 큰 차이를 가져 오게 된다. 우리나라는 온대성 기후에 속하지만, 지구 기후변화로 예기치 못한 가뭄 및 동해 등 이상 기상 현상이 빈번히 발생하고 있으며 과거 10년간(1995-2004)의 한해, 풍수해, 냉해 등으로 인한 기상재해면적이 연평균 162.8 천 ha로, 우리나라 총 경지면적 1,836 천 ha의 8.87%에 해당된다. 이같이 자연재해에 의한 농업생산성 저하는 심각한 수준으로 이러한 불량환경에 잘 견디는 작물 개발이 식량증산에 절대적으로 요구되고 있다.

한국공개특허 제10-2004-0096006호

J. Korean Soc. Appl. Biol. Chem. 52(5), 405-411(2009)

이에 발명이 해결하고자 하는 과제는, 동해 및 가뭄 저항성 유전자를 이용하여 식물, 특히 가지과 식물의 저항성을 향상시키는 방법, 이러한 유전자를 이용하여 동해 및 가뭄 저항성이 향상된 식물을 제조하는 방법, 및 이러한 방법으로 제조된 동해 및 가뭄 저항성이 향상된 형질전환 식물을 제공하는 데에 있다.

상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 CaWRKY1 폴리펩티드의 세포 내 수준을 증가시켜 식물의 동해 및 가뭄 저항성을 증진시키는 방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 서열번호 2로 표시되는 CaWRKY1 폴리펩티드를 과발현시키는 발현 벡터를 제조하는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계의 발현 벡터로 식물을 형질전환하는 단계를 포함하는 동해 및 가뭄 저항성이 증진된 식물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 제조방법에 의하여 제조된 식물을 제공한다.

본 발명의 다른 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 상기 식물에서 수득한 식물 종자(seed) 또는 영양체를 제공한다.

즉, 본 발명은 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 세포내 수준(level)을 증가시켜 식물의 동해 및 가뭄 저항성을 향상시키는 방법, 보다 바람직하게 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 과발현시켜 식물의 동해 및 가뭄 저항성을 향상시키는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 식물에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 동해 및 가뭄 저항성 식물의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터, 및 이러한 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 동해 및 가뭄 저항성이 향상된 형질전환체 및 이의 종자 또는 영양체를 제공한다.

상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드(이하, CaWRKY1 폴리펩티드도 동일한 의미로 칭한다)에는 이의 기능적 동등물이 포함된다. 상기 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드와 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체 내에서 동해 및 가뭄 저항성을 증진시키는 활성을 의미한다. 상기 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환이다. 야생형에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산 (Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 CaWRKY1 폴리펩티드의 생리활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치한다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 CaWRKY1 폴리펩티드의 기본 골격 및 이의 생리활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함된다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 GFP와　같은　다른 폴리펩티드와 융합으로 만들어진　융합 폴리펩티드　등이 이에 포함된다. 또한, 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드의 단편(fragment)으로서 야생형의 CaWRKY1 폴리펩티드와 실질적으로 대등한 생리활성을 갖는 폴리펩티드는 야생형 CaWRKY1 폴리펩티드의 기능적 동등물의 또 다른 바람직한 그룹을 형성한다. 상기 "단편"은 폴리펩티드의 일부에 해당하는 아미노산 서열로서, 본 발명의 범위 내에 속하는 공통의 기원 요소, 구조 및 작용 기전을 가진 것을 말하며 야생형에 존재하는 것이거나, 프로테아제를 사용하여 절단한 것이거나 화학적으로 절단된 것이 모두 포함된다.

상기 CaWRKY1 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 염기 서열은 gDNA, cDNA 및 RNA를 모두 포함할 수 있다. 상기 염기 서열은 야생형 폴리펩티드와 그의 기능적 동등물을 암호화하는 염기 서열 및 이들 서열과 고긴축 조건 (high stringent condition) 하에서 하이브리드화하는 서열들을 모두 포함한다. 고긴축 조건은 공지된 문헌(Molecular Cloning, Cold Spring Harbor, New York, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1989)에 기재된 바와 같다. 바람직하게, 본 발명에 따른 CaWRKY1 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열 및 이의 서열 변이체가 포함될 수 있다. 구체적으로, 상기 서열 변이체는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열과 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열이 포함될 수 있다.

본 발명에서의 용어, "상동성"이란 야생형(wild type) 폴리펩티드의 아미노산 서열 또는 이를 암호화하는 염기 서열과의 유사한 정도를 나타내기 위한 것으로서, 본 발명의 아미노산 서열 또는 염기 서열과 상기와 같은 퍼센트 이상의 동일한 서열을 가지는 서열을 포함한다. 이러한 상동성의 비교는 육안으로나 구입이 용이한 비교 프로그램을 이용하여 수행할 수 있다. 시판되는 컴퓨터 프로그램은 2개 이상의 서열 간의 상동성을 백분율(%)로 계산할 수 있으며, 상동성(%)은 인접한 서열에 대해 계산될 수 있다.

상기 "세포 내 수준"이란 세포 내에 존재하는 양을 말하는 것으로, 이는 당업자에게 공지된 여러 방법으로 조절될 수 있다. 예를 들면, 세포 내 수준은 전사 단계에서의 조절 또는 전사 후 단계에서의 조절을 통해 조절될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 전사 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 유전자의 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 프로모터에 목적 유전자 또는 이의 변이체를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 상기 유전자의 발현을 증진시키는 방법 또는 목적 유전자 또는 이의 변이체의 주변에 상기 유전자의 발현이 증진되도록 하는 발현조절서열을 삽입하는 방법 등에 의해 수행될 수 있다. 전사 후 단계에서의 조절은 당업자에게 공지된 폴리펩티드 발현을 증진시키기 위한 방법, 예를 들면, 목적 유전자 또는 이의 변이체를 주형으로 전사된 mRNA의 안정성을 증진하는 방법, 목적 폴리펩티드의 안정성을 증진하는 방법 또는 폴리펩티드의 활성을 증진하는 방법에 의해 수행될 수 있다.

바람직하게, 본 발명에서 서열번호 2의 폴리펩티드 또는 이에 대한 기능적 동등물의 세포 내 수준 증가는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자의 발현을 증가시키는 방법에 의해 수행될 수 있다. 이러한 증가를 위해서 당업자에게 공지된 방법을 사용할 수 있으나, 예를 들면, 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 이의 기능적 동등물을 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현벡터를 제조하여 이를 형질전환함으로써 발현을 증진시킬 수 있다.

본 발명에서의 용어, "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 코딩된 폴리펩티드를 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 야생형 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 야생형 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으나, 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다. 본 발명에서의 용어, "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 본 발명에서의 용어, "재조합 발현 벡터"는 목적한 암호화 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 암호화 서열을 발현하는데 필수적인 적정 염기 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. 상기 재조합 벡터는 바람직하게는 재조합 식물 발현 벡터이다. 식물 발현 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 투머파시엔스와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 116,718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 바람직한 형태는 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다. 적합한 재조합 발현 벡터는 프로모터, 오퍼레이터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서(촉진유전자) 같은 발현 조절 서열 외에도 막 표적화 또는 분비를 위한 시그널 서열 또는 리더 서열을 포함하며 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 또한 재조합 발현 벡터는 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택 마커를 포함하고, 복제 가능한 재조합 발현 벡터인 경우 복제 기원을 포함한다. 상기 선택 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 염기 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포와 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 예컨대, 글리포세이트(glyphosate) 또는 포스피노트리신(phosphinotricin)과 같은 제초제 저항성 유전자, 카나마이신, G418, 블레오마이신(Bleomycin), 하이그로마이신(hygromycin), 클로람페니콜(chloramphenicol)과 같은 항생제 내성 유전자가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에 따른 재조합 발현 벡터에서, 프로모터는 예컨대 CaMV 35S, 액틴, 유비퀴틴, pEMU, MAS 또는 히스톤 프로모터일 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 본 발명에서의 용어, "프로모터"는 정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산 서열의 발현을 조절하는 유전체(genome)를 의미하며, 작동 가능하게 연결된다(operably linked)는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. 상기 프로모터로는 모든 시간대에 상시적으로 목적 유전자의 발현을 유도하는 프로모터(constitutive promoter) 또는 특정한 위치, 시기, 조건에 목적 유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)를 사용할 수 있으며, 그 예로는 RD29A 프로모터, SV40 프로모터, CMV 프로모터, CAG 프로모터(Hitoshi Niwa et al., Gene, 108:193-199, 1991; Monahan et al., Gene Therapy, 7:24-30, 2000), CaMV 35S 프로모터(Odell et al., Nature 313:810-812, 1985), Rsyn7 프로모터(미국특허출원 제08/991,601호), 라이스 액틴(rice actin) 프로모터(McElroy et al., Plant Cell, 2:163-171, 1990), 유비퀴틴 프로모터(Christensen et al., Plant Mol.Biol. 12:619-632, 1989), ALS 프로모터(미국 특허출원 제08/409,297) 등이 있다. 이외에도 미국특허 제 5,608,149; 제5,608,144호 제5,604,121호 제5,569,597호 제5,466,785호, 제5,399,680호 제5,268,463호 및 제5,608,142호 등에 개시된 프로모터들을 모두 사용할 수 있다. 바람직하게, 동해 및 가뭄 유도성 프로모터를 사용할 수 있다. 터미네이터는, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 감자 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 투메파시엔스(agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 공지되어 있다.

바람직하게, 본 발명이 제공하는 재조합 발현 벡터는 프로모터의 하류에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자 또는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자를 작동 가능하게 연결한 것이고, 더욱 바람직하게 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 유전자를 연결한 것이며, 또는 바람직하게 상기 프로모터는 CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터이다. 즉, 본 발명에서는 선발된 유전자를 식물 과발현 벡터인 pB7WG2D를 이용하여 도입하여 재조합 벡터 pB7WG2D/ CaWRKY1을 제조할 수 있으며, 이러한 재조합 벡터는 CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터를 가지므로 도입된 유전자가 식물체 전체에 걸쳐 상시 발현될 수 있다.

본 발명은 상기 재조합 발현 벡터로 형질전환된 동해 및 가뭄 저항성이 향상된 형질전환체를 제공한다.

본 발명에서의 형질전환은 당업자에게 공지된 다양한 형질전환기술에 의해 수행될 수 있다. 바람직하게는 미세사출법(microprojectile bombardment), 입자 총 충격법 (particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 일렉트로포레이션(electroporation), PEG-매개 융합법(PEG-mediated fusion), 미세주입법(microinjection), 리포좀 매개법(liposome-mediated method), 인-플란타 형질전환법(In planta transformation), 진공 침윤법(Vacuum infiltration method), 화아침지법(floral meristem dipping method), 아그로박테리아 분사법(Agrobacteria spraying method)을 이용할 수 있다.

또한 형질전환에 이용될 수 있는 균으로는 대장균(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis), 스타필로코쿠스(Staphylococcus) 및 아그로박테리움 투메파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)가 가능하나 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 형질전환체는 식물 또는 식물세포일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 식물이란 전체 식물(whole plant), 식물의 일부분, 캘러스, 식물 조직, 식물 세포 및 식물 종자 또는 영양체를 모두 포함한다. 상기 식물은 바람직하게는 가지과 식물이며, 예를 들어, 감자, 토마토, 고추, 콩, 가지, 담배 등의 식물일 수 있다.

본 발명에서는 고추 CaWRKY1의 유전자 기능분석을 위하여 담배와 감자에 형질전환하고, 게이트웨이 벡터(Gateway vector)에 35S 프로모터의 조절을 받고 바스타로 선발할 수 있도록 벡터를 제작하여 담배와 감자에 형질전환한 후 도입유전자 발현분석은 노던(Northern) 분석으로 확인한 바, 담배와 감자 형질전환체의 내동성 검정 결과 CaWRKY1 유전자도입 담배와 감자에서 유전자발현이 높은 세포주들은 내동성 및 가뭄 저항성이 증가되었음을 확인할 수 있다.

아울러, 본 발명은 상기 식물에서 수득한 식물 종자(seed) 또는 영양체를 제공하여, 식물 종자 또는 영양체를 수득하기 위한 재배 방법으로는 본 발명이 속한 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 잘 알려진 방법을 사용할 수 있다.

본 발명에 따른 동해 및 가뭄 저항성 유전자로 형질전환된 식물체는 동해 및 가뭄 저항성 품종으로 육성 가능하며, 이로부터 식물, 보다 구체적으로는 가지과 식물의 생산성 등을 획기적으로 향상시킬 수 있다.

도 1은 캘러스를 분화시킨 완전한 식물체 사진이다.
도 2는 CaWRKY1 유전자로 형질전환된 담배 식물체의 노던 블롯 분석결과이다.
도 3은 저온 스트레스 처리한 CaWRKY1 형질전환된 담배 식물체이다.
도 4는 CaWRKY1 형질전환된 감자 식물체의 노던 블롯 분석결과이다.
도 5는 한발 처리한 CaWRKY1 형질전환된 감자 식물체이다.
도 6은 CaWRKY1 형질전환된 감자 식물체의 외형적인 형태를 나타낸 사진이다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예 및 비교예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예들은 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐, 본 발명을 이들만으로 한정하는 것은 아니다.

<실시예 1> 고추의 저온 저항 유전자의 선발

본 실험에 사용되는 유전자의 선발을 위해 이전 실험실에서는 2달간 고추 (재래 고정종인 청룡초 : Capsicum annuum L., cultivar Cheongryong-cho) 식물체를 꽃이 필 때까지 양액 재배한 다음 시간대 별로 저온 스트레스(4℃)를 준 후, RNA를 분리하여, 대조군 및 저온(cold) 라이브러리를 제작하였다. 이 라이브러리의 파지 DNA를 질량 추출(mass excision) 방법에 의해 pBluscript 플라스미드로 전환하여 형질전환시켜 콜로니를 얻었다. 얻어진 콜로니로부터 플라스미드 DNA를 11,000개여 정도 분리하였고 이 중 3,100개의 유전자 클론으로 DNA 칩을 제작하였다.

DNA 칩 분석 및 노던 블롯(Northern blot) 분석으로 저온 스트레스에 의해 발현이 유도 혹은 억제되는 여러 유전자 중 신호전달 체계에 관여한다고 알려진 다수의 유전자 중 CaWRKY1 (AY789641)를 선발하였다.

선발된 유전자는 식물 과발현 벡터인 pB7WG2D를 이용하여 도입하였다. 제작된 벡터 (pB7WG2D/ CaWRKY1)는 CaMV (cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터를 가지므로 도입된 유전자가 식물체 전체에 걸쳐 상시 발현되게 하였다.

<실시예 2> 담배 형질전환체 선발 및 삽입여부 확인

담배 형질전환체의 제작 및 선발은 재료 및 방법에 기술된 과정에 따라 수행하였다(Hwang, 2003). 먼저, 형질전환용 아그로박테리아(Agrobacteria) 액체 배양액을 준비하고, 담배 잎을 잘라 PCM 고체배지에 넣고 24시간 동안 예비 배양하였다. 과발현 벡터 pB7WG2D/ CaWRKY1을 포함하고 있는 A. tumefaciens LBA4404에 감염시켜 CIM 배지에 옮긴 후 암 배양으로 공-배양(co-culture)하여 캘러스를 분화시켰다. 캘러스 유도를 위해 2~3주에 한 번씩 새로운 CIM 고체배지로 계대배양 하였다. 캘러스를 2~3개월 정도 분화시켰을 때 적당한 크기의 캘러스를 형성하였다. 이 캘러스를 SIM배지로 옮겨 3~4주 후 발생한 슈트(shoot)를 세포탁심(cefortaxime)이 포함된 MS배지에 옮겨 완전한 개체로 분화시켰다.

도 1은 캘러스를 분화시킨 완전한 식물체 사진이다. 여기에서, 1은 예비-배양 및 공-배양된 담배 잎의 디스크이고, 2는 캘러스 유도를 나타낸 것이고, 3은 슈트 유도를 나타낸 것이고, 4는 완전한 식물체의 생성을 나타낸 것이다.

형질전환 담배의 게놈 DNA PCR 분석을 이용하여 CaWRKY1 유전자가 식물체내로 도입되었는지를 확인하였다. 이 PCR 분석에는 각각의 유전자의 염기서열에 상보적인 프라이머를 제작하여 사용하였다. 프라이머는 하기 표 1에 나타낸 바와 같이 각 형질전환 식물체 별로 센스와 안티센스(서열번호 3 및 4) 두 개가 제작되었다.

완전한 식물체로 분화한 개체들의 게놈 DNA PCR 분석결과, CaWRKY1 형질전환체에서는 48개 세포주(line) 중에서 12개 세포주를 제외한 세포주에서 CaWRKY1의 도입(75%)이 확인되었다.

Gene	Primer	Primer sequence (5'→3')
CaWRKY1	CaWRKY1-attB1	5'-AAAAAGCAGGCTCCTTCATCTTATTTAAGGAGAAAAAACTG-3'
	CaWRKY1-attB2	5'-AGAAAGCTGGGTCAGACGCAAATCAAATTGGATATATTTC-3'

<실시예 3> 도입유전자의 발현 분석

상기 실시예 2에서 수행한 게놈 DNA PCR 분석결과를 바탕으로 형질전환체를 선발하여 다음과 같이 노던 블롯 분석을 수행하여, 도입된 유전자의 발현정도를 조사하였다.

먼저, 총 RNA를 분리하고, 전기영동으로 분획하고, 멤브레인으로 옮겼다. 분리된 RNA들을 블롯팅하였고, 블롯을 32P-표지된 CaWRKY1 cDNA와 혼성화시켰다.

도 2는 CaWRKY1 형질전환된 담배 식물체의 노던 블롯 분석결과이다. 여기에서, 숫자 1 내지 36은 형질전환 세포주이고, 바닥 판넬은 브롬화 에티디움이 염색된 RNA 아가로즈 겔을 나타낸다. 도 2에서 보듯이, CaWRKY1 형질전환체 36 세포주 중 #3, 4, 7, 8, 12, 26, 27, 30, 31, 32, 34, 35, 36에서 높은 발현을 보였고, #2, 13, 15, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24에서는 발현을 보이지 않았으며, 그 외 모든 세포주에서는 낮은 발현을 보였다. 선별기준은 야생형(wild type)과 비교하였을 때 그 발현량이 상대적으로 높게 관찰된 세포주를 선별하여 형질전환체의 저온 스트레스 내성 분석 실험을 수행하였다.

<실시예 4> 형질전환 담배의 저온 스트레스 내성 분석

상기 실시예 2 및 3에서 게놈 PCR과 노던 블롯 분석을 통하여 유전자의 삽입여부와 발현정도를 확인하고 이 중 각 유전자별로 발현량이 높은 형질전환 담배 식물체를 선발하여 MS 배지에서 3~4주간 키운 후, 원예용 상토(Jiffy pot)에 옮겨 1주일간 순화시켰다.

저온 스트레스 내성 분석을 위해 야생형 식물체와 선발된 담배 형질전환체를 -6℃에서 16시간 처리한 후, 상온조건으로 옮겨 야생형 식물체와 형질전환 식물체의 생존율을 비교 관찰하여 그 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3은 저온 스트레스 처리한 CaWRKY1 형질전환된 담배 식물체이다. 여기에서, (A)는 저온 스트레스 처리 전의 식물체이고, (B)는 저온 스트레스 처리한 지 24시간 후의 식물체이고, WT는 야생형이고, 숫자는 형질전환 세포주이다. 도 3에서 보듯이, CaWRKY1 형질전환체에서 선발된 세포주 #3, 4, 7, 8, 12, 26, 27, 30, 31, 32, 34, 35, 36 중 7개 세포주(#3, 4, 7, 8, 31, 34, 35)에서 저온 스트레스에 대한 강한 저항성을 나타내었다.

<실시예 5> 감자 형질전환체 제작 및 선발

CaWRKY1 유전자를 상시 발현하도록 35S 프로모터의 조절을 받도록 벡터 pB7WG2D/CaWRKY1을 제작하여 A. tumefaciens LBA4404에 감염시켜 감자품종 수미에 형질전환하였다. 형질전환된 10종의 클론을 얻었다. 상기에서 얻어진 형질전환체들을 대상으로 구조유전자 부위가 삽입되었는지의 여부를 확인하기 위해 독립적으로 재분화된 10개의 식물체로부터 분리된 게놈 DNA를 주형으로, 제작된 CaWRKY1 유전자 특이적인 프라이머를 이용하여 중합효소연쇄반응(PCR)을 실시하였다. 형질전환된 클론들의 발현은 CaWRKY1 구조유전자를 프로브(probe)로 사용하여 총 RNA를 분리하고, 전기영동으로 분획하고, 멤브레인으로 옮겼다. 분리된 RNA들을 블롯팅하였고, 블롯을 32P-표지된 CaWRKY1 cDNA와 혼성화시킴으로써 노던 분석으로 비교한 결과 #2, #3, #10 클론을 선발하였다.

도 4는 CaWRKY1 형질전환된 감자 식물체의 노던 블롯 분석결과이다.

<실시예 6> 형질전환 감자의 가뭄 저항성 분석

비생물학적 스트레스 중 하나인 한발(drought stress)에 대한 CaWRKY1 과발현 형질전환 식물체 표현형을 조사하였다. 대조군(야생형)과 형질전환체를 각각 2주간 기내에서 배양하고, 수경재배로 2주간 다시 배양하였다. 원예용 상토에 옮겨 1 주간 키워 순화를 시킨 후, 건조 스트레스를 4주 동안 처리하며 저항성 여부를 관찰하였다. 각각의 화분에서의 건조정도를 동일하게 유지하기 위해 토양 수분계를 사용하였고, 반복 실험을 위해 각각 12 개체씩 사용하여 실험을 수행하였다. 식물체가 20일경부터 건조 스트레스를 받기 시작하여 25일경부터 대조군과 CaWRKY1 과발현 형질전환체가 한발에 대하여 저항성 정도가 차이를 보였다. 건조 스트레스 처리 후 28일 경에 재관수를 실시하여 식물체의 회복력을 관찰하였다.

도 5는 한발 처리한 CaWRKY1 형질전환된 감자 식물체이다. 여기에서 보듯이, CaWRKY1 과발현 형질전환체가 대조군에 비하여 건조 스트레스에 대하여 저항성을 보였음을 알 수 있다.

<실시예 7> 형질전환 감자의 농업적 특성 분석

온실조건에서 CaWRKY1 과발현 형질전환체의 농업적 특성을 조사하였다. 하기 표 2에 나타낸 바와 같이 대조군과 CaWRKY1 과발현 형질전환체의 외형적인 농업적 특성들은 거의 유사한 것으로 조사되었다.

도 6은 CaWRKY1 형질전환된 감자 식물체의 외형적인 형태를 나타낸 사진이다. 여기에서 보듯이, 잎의 형태와 잎의 크기도 거의 유사함을 관찰 할 수 있었으며, 감자의 외형적인 모양은 대조군과 비슷한 연갈색의 둥근 모양으로 관찰되었다.

본 발명에 따르면 저온 스트레스에 대한 저항성을 갖는 유용 식물체를 간편하고 체계적으로 육종할 수 있으며, 본 발명에서 이용되는 식물체에 동해 및 가뭄 저항성을 부여하는 새로운 전사인자 유전자 및 그 단백질은 오랫동안 식용되어 오는 작물인 고추에서 유래된 것이므로 이를 이용하여 보다 안전한 형질전환 식물체 및 농산물을 얻을 수 있을 뿐만 아니라 동해 및 가뭄 저항성 품종육성으로 개발 가능하며 이로 인한 생산성향상 및 안전한 농산물공급이 가능할 것으로 기대된다.

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Claims (10)

1. 삭제
2. 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 과발현시켜 감자 또는 담배의 동해 및 가뭄 저항성을 향상시키는 방법.
3. 제 2항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 과발현시키는 방법은 프로모터에 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 제조하여 감자 또는 담배에 형질전환하거나, 또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 감자 또는 담배세포에 도입하는 방법에 의하는 것에 특징이 있는 방법.
4. 제 2항에 있어서, 상기 폴리펩티드를 암호화하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 것에 특징이 있는 방법.
5. 삭제
6. 삭제
7. 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터를 감자 또는 담배에 형질전환시키는 것을 특징으로 하는 동해 및 가뭄 저항성 감자 또는 담배의 제조방법.
8. 프로모터에 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 암호화하는 유전자를 연결한 재조합 발현 벡터.
9. 제 8항의 재조합 발현 벡터로 형질전환하여 동해 및 가뭄 저항성이 향상된 감자 또는 담배의 형질전환체.
10. 제 9항의 감자 또는 담배의 형질전환체에서 수득한 감자 또는 담배 종자(seed) 또는 영양체.

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