KR102231136B1

KR102231136B1 - 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsCP1 유전자 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102231136B1
Application number: KR1020190133422A
Authority: KR
Inventors: 조용구; 니노 마존; 김미선
Original assignee: 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2019-10-25
Filing date: 2019-10-25
Publication date: 2021-03-23
Anticipated expiration: 2039-10-25

Abstract

본 발명은 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsCP1(Oryza sativa cysteine proteinase 1) 유전자 및 이의 용도에 관한 것으로, 본 발명의 OsCP1 유전자의 발현을 조절하여 식물체의 염 스트레스에 대한 내성을 조절할 수 있으므로, 환경 스트레스에 내성을 갖는 새로운 형질전환 식물체를 개발하는데 유용하게 활용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsCP1 유전자 및 이의 용도{OsCP1 gene from Oryza sativa for controlling salt stress tolerance of plant and uses thereof}

본 발명은 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsCP1 유전자 및 이의 용도에 관한 것이다.

식물은 고착생활을 하면서 다양한 환경 스트레스에 노출되고 있으며, 환경 스트레스는 다른 생물체에 의해 일어나는 생물적(병·충해, 바이러스 등) 스트레스와 물리적 또는 화학적 환경의 변화에 의해 일어나는 비생물적(건조, 염해, 냉해, 가뭄, 공해물질 등) 스트레스로 구분된다. 이러한 환경 스트레스는 식물의 생육과 발달에 큰 영향을 미치고 있다. 예를 들어, 염분의 농도가 낮을 경우에는 생산율에큰 영향을 주지 않지만, 염분의 농도가 높을 경우에는 토양에서 외부 삼투압이 발생하여 물이 뿌리로 흡수되는 것이 저해되어 건조 현상과 비슷한 수분 부족 현상이 발생하여 성장이 저해되거나 고사한다.

이러한 환경 스트레스를 받은 식물체들은 세포의 안정성을 위해 단백질 대사 및 유전자 발현을 조절한다. 최근 염 스트레스에 관여하는 다양한 유전자의 발굴이 진행되고 있으며, 빠르게 변화하는 소비자 및 재배농가의 선호 품종의 개발 필요성을 충족시키기 위해 생명공학 기술을 이용한 다양한 시도가 이루어지고 있다. 기존의 품종개량 기술은 각각 원하는 특성을 지닌 유사한 종들을 교배하여 생성된 잡종 중 목적하는 특성을 지닌 품종만을 선별하는 것으로, 한 품종을 개발하기 위해서는 많은 시행착오와 시간이 소요되지만, 유전자 재조합 기술은 극한 환경에서 내성을 갖는 유전자를 고등 작물에 직접 삽입함으로써 환경 스트레스에 대한 저항성을 갖는 작물을 단기간에 얻을 수 있다. 또한 삽입하고자 하는 유전자는 같은 생물종뿐만 아니라 서로 다른 생물종에서도 얻을 수 있으므로 품종개량의 폭이 넓은 장점이 있다.

한편, 한국공개특허 제1915296호에는 '식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsPHYB 유전자 및 이의 용도'가 개시되어 있고, 한국등록특허 제1270231호에는 '식물의 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시키는 AtSZF2 유전자 및 이의 용도가 개시되어 있으나, 본 발명의 식물의 염 스트레스 내성을 조절하는 벼 유래의 OsCP1 유전자 및 이의 용도에 대해서는 기재된 바가 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로서, 본 발명자들은 벼의 2번 염색체에 존재하는 OsCP1(Oryza sativa cysteine proteinase 1, LOC_Os02g27030) 유전자를 과발현하는 벼 형질전환체를 제조하고 염 스트레스를 처리한 결과, OsCP1 과발현 형질전환체가 대조구(비형질전환) 식물체에 비해 생장이 증가하고, 염 스트레스에 대한 저항성 품종으로 알려진 석정벼와 유사한 수준의 생장 상태를 나타내는 것을 통해 OsCP1 유전자의 과발현에 의해 염 스트레스에 대한 저항성을 증가시킬 수 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP1(Oryza sativa cysteine proteinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 OsCP1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및 상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

또한, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 염 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다.

본 발명의 OsCP1 유전자는 식물의 염 스트레스 내성을 조절할 수 있으므로, 환경 스트레스에 대해 내성을 갖는 식물체를 개발하여 농작물의 생산성을 향상시킬 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 벼 유래 OsCP1 유전자를 포함하는 재조합 벡터의 모식도이다.
도 2는 벼 유래 OsCP1 유전자가 포함된 재조합 벡터를 이용하여 벼 식물체의 형질전환 과정을 나타낸 사진이다. (A) 캘러스 유도 배지에서 벼 캘러스를 유도하는 단계, (B) 유도된 벼 캘러스에 재조합 벡터를 포함하는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobactrium tumefaciens) LBA4404를 공동배양하여 형질전환시키는 단계, (C) 형질전환된 벼 캘러스를 제초제 성분인 포스피노트리신(phosphinotricin)이 첨가된 배지에서 배양하는 단계, (D) 및 (E) 형질전환된 벼 캘러스로부터 재분화된 식물체(신초형성, 뿌리형성 및 신장).
도 3A는 벼(Oryza sativa), 애기장대(Arabidopsis thaliana) 및 배추(Brassica rapa) 유래 CP(cysteine proteinase) 단백질들간의 유연관계를 나타낸 모식도이고, 도 3B 및 도 3C는 CP 패밀리 단백질에 보존된 도메인(Peptidase_C1 superfamily) 및 상기 도메인의 아미노산 서열을 나타낸 그림이다.
도 4는 야생형 벼 식물체의 뿌리(root), 줄기(stem), 잎집(sheath), 잎(leaf), 지엽 잎(flag leaf), 이삭(panicle) 및 종자(grain)에서 OsCP1 유전자의 mRNA 발현량을 확인한 결과이다.
도 5는 OsCP1 유전자가 과발현된 벼 형질전환체로부터 단일 카피(single copy) 도입 형질전환체를 선발한 결과이다. HPT(hygromycin phosphotransferase): 선발 마커 유전자.
도 6은 OsCP1 유전자가 과발현된 벼 형질전환체의 유묘에 물(H₂O), 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo K3a), 살리실산(SA), 메틸 자스모네이트(meJA), 가뭄(5% soil moisture), 고온(42℃) 및 염분(NaCl)을 각각 처리한 후 OsCP1 유전자의 mRNA 발현량을 확인한 결과이다.
도 7은 염 스트레스에 대한 감수성 품종인 동진벼(S, WT), 저항성 품종인 석정벼(T) 및 본 발명의 OsCP1 과발현 벼 형질전환체(계통 1 및 2)에 염 스트레스를 처리하고 10일 후 식물체의 성장 상태를 나타낸 사진이다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP1(Oryza sativa cysteine proteinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환시켜 OsCP1 유전자의 발현을 조절하는 단계를 포함하는 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 방법을 제공한다.

본 발명에 따른 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 방법은, 상기 OsCP1 단백질 코딩 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 염 스트레스에 대한 내성 또는 저항성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명에 따른 OsCP1 단백질의 범위는 벼로부터 분리된 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. 본 발명에 있어서, 용어 "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 서열번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 서열번호 2로 표시되는 단백질과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질을 말한다. "실질적으로 동질의 생리활성"이란 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 활성을 의미한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 OsCP1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 범위는 OsCP1 단백질을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA 및 합성 DNA를 모두 포함한다. 바람직하게는, 본 발명의 OsCP1 단백질을 코딩하는 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열을 포함할 수 있다. 또한, 상기 염기서열의 상동체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 구체적으로, 상기 유전자는 서열번호 1의 염기 서열과 각각 70% 이상, 더 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)을 포함할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로서 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.

본 명세서에서, 용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다.

본 발명의 벡터는 전형적으로 발현 또는 클로닝을 위한 벡터로서 구축될 수 있다. 또한, 본 발명의 벡터는 원핵세포 또는 진핵 세포를 숙주로 하여 구축될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 벡터가 발현 벡터이고, 원핵 세포를 숙주로하는 경우에는, 전사를 진행시킬 수 있는 강력한 프로모터(예를 들면, pLλ 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, T7 프로모터, tac 프로모터 등), 해독의 개시를 위한 리보솜 결합 자리 및 전사/해독 종결 서열을 포함하는 것이 일반적이다. 숙주 세포로서 대장균(Escherichia coli)이 이용되는 경우, E. coli 트립토판 생합성 경로의 프로모터 및 오퍼레이터 부위, 그리고 파아지 λ의 좌향 프로모터(pLλ 프로모터)가 조절 부위로서 이용될 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 상기 프로모터는 형질전환에 적합한 프로모터들로서, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터, 액틴 프로모터, 유비퀴틴 프로모터, pEMU 프로모터, MAS 프로모터 또는 히스톤 프로모터일 수 있으며, 바람직하게는 CaMV 35S 프로모터일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 명세서에서, 용어 "프로모터"란 용어는 구조 유전자로부터의 DNA 업스트림의 영역을 의미하며 전사를 개시하기 위하여 RNA 폴리머라아제가 결합하는 DNA 분자를 말한다. "식물 프로모터"는 식물 세포에서 전사를 개시할 수 있는 프로모터이다. "항시성(constitutive) 프로모터"는 대부분의 환경 조건 및 발달 상태 또는 세포 분화하에서 활성이 있는 프로모터이다. 형질전환체의 선택이 각종 단계에서 각종 조직에 의해서 이루어질 수 있기 때문에 항시성 프로모터가 본 발명에서 바람직할 수 있다. 따라서, 항시성 프로모터는 선택 가능성을 제한하지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터는 당업자에 주지된 방법에 의해 구축될 수 있다. 상기 방법은 시험관 내 재조합 DNA 기술, DNA 합성 기술 및 생체 내 재조합 기술 등을 포함한다. 상기 DNA 서열은 mRNA 합성을 이끌기 위해 발현 벡터 내의 적당한 프로모터에 효과적으로 연결될 수 있다. 또한 벡터는 번역 개시 부위로서 리보솜 결합 부위 및 전사 터미네이터를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 벡터의 바람직한 예는 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)와 같은 적당한 숙주에 존재할 때 그 자체의 일부, 소위 T-영역을 식물 세포로 전이시킬 수 있는 Ti-플라스미드 벡터이다. 다른 유형의 Ti-플라스미드 벡터(EP 0 116 718 B1호 참조)는 현재 식물 세포, 또는 잡종 DNA를 식물의 게놈 내에 적당하게 삽입시키는 새로운 식물이 생산될 수 있는 원형질체로 잡종 DNA 서열을 전이시키는데 이용되고 있다. Ti-플라스미드 벡터의 특히 바람직한 형태는 EP 0 120 516 B1호 및 미국 특허 제4,940,838호에 청구된 바와 같은 소위 바이너리(binary) 벡터이다. 본 발명에 따른 DNA를 식물 숙주에 도입시키는데 이용될 수 있는 다른 적합한 벡터는 이중 가닥 식물 바이러스(예를 들면, CaMV) 및 단일 가닥 바이러스, 게미니 바이러스 등으로부터 유래될 수 있는 것과 같은 바이러스 벡터, 예를 들면 비완전성 식물 바이러스 벡터로부터 선택될 수 있다. 그러한 벡터의 사용은 특히 식물 숙주를 적당하게 형질전환하는 것이 어려울 때 유리할 수 있다.

재조합 발현 벡터는 바람직하게는 하나 이상의 선택성 마커를 포함할 수 있다. 상기 마커는 통상적으로 화학적인 방법으로 선택될 수 있는 특성을 갖는 핵산 서열로, 형질전환된 세포를 비형질전환 세포로부터 구별할 수 있는 모든 유전자가 이에 해당된다. 상기 마커 유전자는 항생제 내성 유전자(antibiotics resistance gene)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 재조합 벡터에서, 통상의 터미네이터를 사용할 수 있으며, 그 예로는 노팔린 신타아제(NOS), 벼 α-아밀라아제 RAmy1 A 터미네이터, 파세올린(phaseoline) 터미네이터, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 옥토파인(Octopine) 유전자의 터미네이터 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 터미네이터의 필요성에 관하여, 그러한 영역이 식물 세포에서의 전사의 확실성 및 효율을 증가시키는 것으로 일반적으로 알려져 있다. 그러므로 터미네이터의 사용은 본 발명의 내용에서 매우 바람직하다.

본 발명의 벡터를 안정되면서 연속적으로 클로닝 및 발현시킬 수 있는 숙주세포는 당업계에 공지된 어떠한 숙주세포도 이용할 수 있으며, 원핵세포의 예로는, E. coli JM109, E. coli BL21, E. coli RR1, E. coli LE392, E. coli B, E. coli X 1776, E. coli W3110, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 바실러스 츄린겐시스(Bacillus thuringiensis)와 같은 바실러스 속 균주, 그리고 살모넬라 티피무리움(Salmonella typhimurium), 세라티아 마르세슨스(Serratia marcescens) 및 다양한 슈도모나스 종과 같은 장내균과 균주 등이 있다.

본 발명의 벡터를 진핵 세포에 형질전환시키는 경우에는 숙주세포로서, 효모(Saccharomyce cerevisiae), 곤충세포, 사람세포(예컨대, CHO 세포주 (Chinese hamster ovary), W138, BHK, COS-7, 293, HepG2, 3T3, RIN 및 MDCK 세포주) 및 식물세포 등이 이용될 수 있다. 숙주세포는 바람직하게는 식물세포이다.

본 발명의 벡터를 숙주세포 내로 운반하는 방법은, 숙주 세포가 원핵 세포인 경우, CaCl₂ 방법, 하나한 방법(Hanahan, D., 1983 J. Mol. Biol. 166, 557-580) 및 전기천공 방법 등에 의해 실시될 수 있다. 또한, 숙주세포가 진핵세포인 경우에는, 미세주입법, 칼슘포스페이트 침전법, 전기천공법, 리포좀-매개 형질감염법, DEAE-덱스트란 처리법, 및 유전자 밤바드먼트 등에 의해 벡터를 숙주세포 내로 주입할 수 있다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP1 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하는 단계; 및

상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체의 제조방법에 있어서, 상기 OsCP1 단백질의 범위는 전술한 것과 같다.

본 발명의 일 구현 예에 따른 방법에 있어서, 식물체의 염 스트레스 내성을 조절하는 방법은 상기 OsCP1 단백질 코딩 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 염 스트레스에 대한 내성 또는 저항성을 증가시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

식물의 형질전환은 DNA를 식물에 전이시키는 임의의 방법을 의미한다. 그러한 형질전환 방법은 반드시 재생 및(또는) 조직 배양기간을 가질 필요는 없다. 식물 종의 형질전환은 이제는 쌍자엽 식물뿐만 아니라 단자엽 식물 양자를 포함한 식물 종에 대해 일반적이다. 원칙적으로, 임의의 형질전환 방법은 본 발명에 따른 잡종 DNA를 적당한 선조 세포로 도입시키는데 이용될 수 있다. 방법은 원형질체에 대한 칼슘/폴리에틸렌 글리콜 방법(Krens, F.A. et al., 1982, Nature 296, 72-74; Negrutiu I. et al., June 1987, Plant Mol. Biol. 8, 363-373), 원형질체의 전기천공법(Shillito R.D. et al., 1985 Bio/Technol. 3, 1099-1102), 식물 요소로의 현미주사법(Crossway A. et al., 1986, Mol. Gen. Genet. 202, 179-185), 각종 식물 요소의 (DNA 또는 RNA-코팅된) 입자 충격법(Klein T.M. et al., 1987, Nature 327, 70), 식물의 침윤 또는 성숙 화분 또는 소포자의 형질전환에 의한 아그로박테리움 튜머파시엔스 매개된 유전자 전이에서 (비완전성) 바이러스에 의한 감염(EP 0 301 316호) 등으로부터 적당하게 선택될 수 있다. 본 발명에 따른 바람직한 방법은 아그로박테리움 매개된 DNA 전달을 포함한다. 특히 바람직한 것은 EP A 120 516호 및 미국 특허 제4,940,838호에 기재된 바와 같은 소위 이원 벡터 기술을 이용하는 것이다.

또한, 상기 형질전환된 식물세포로부터 형질전환 식물을 재분화하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 제조방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 조절된 형질전환 식물체 및 이의 형질전환된 종자를 제공한다.

본 발명의 형질전환 식물체는 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP1 단백질 코딩 유전자를 식물세포에서 과발현시켜 식물체의 염 스트레스에 대한 내성 또는 저항성이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

상기 식물체는 벼, 보리, 밀, 호밀, 옥수수, 사탕수수, 귀리, 양파 등의 단자엽 식물 또는 애기장대, 감자, 가지, 담배, 고추, 토마토, 우엉, 쑥갓, 상추, 도라지, 시금치, 근대, 고구마, 당근, 미나리, 배추, 양배추, 갓무, 수박, 참외, 오이, 호박, 박, 딸기, 대두, 녹두, 강낭콩, 완두 등의 쌍자엽일 수 있고, 바람직하게는 단자엽 식물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 벼일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 또한, 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP1 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 염 스트레스 내성 조절용 조성물을 제공한다. 본 발명의 조성물은 유효성분으로 식물체의 염 스트레스에 대한 내성을 조절할 수 있는 벼 유래 OsCP1 단백질 코딩 유전자를 포함하며, 상기 유전자의 발현이 증가되면, 식물체의 염 스트레스에 대한 내성 또는 저항성을 증가시킬 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명은 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

재료 및 방법

1. 식물재료

아그로박테리움 매개 형질전환 방법(Agrobacterium-mediated transformation)을 이용하여 염 스트레스에 대한 저항성을 나타내는 벼 유래 OsCP1 유전자를 염 스트레스에 감수성 모품종인 동진벼(Oryza sativa cv. Dongjin)에 도입하여 형질전환체를 육성하였으며, 염 스트레스 저항성에 대한 OsCP1 유전자의 기능 검정을 위해 염 스트레스의 저항성 품종인 석정벼와 감수성 품종인 동진벼(국립종자원)를 대조구로 이용하였다(표 1).

염 스트레스 처리, 모품종, 저항성 및 감수성 벼 품종

염분 처리	저항성(Tolerance)	감수성(Susceptible)
200mM	석정	동진(모품종)

2. 재조합 벡터 구축 및 벼 형질전환체의 육성

진백벼 품종으로부터 OsCP1(LOC_Os02g27030) 유전자의 전장 cDNA를 표 2의 프라이머를 사용하여 클로닝한 후 클로닝한 OsCP1 유전자를 pCAMBIA1300::OsCP1 벡터의 35S 프로모터와 Tnos 터미네이터 사이에 삽입하였고, 선발 마커 유전자로 사용된 hptII 유전자를 35S 프로모터와 CamV 터미네이터 사이에 삽입하여 식물 형질전환용 벡터를 구축하였다(도 1).

본 발명에 사용된 프라이머 정보

Gene ID	ORF (bp)	Source	Seq(5'→3') (서열번호)	Size (bp)	Tm (℃)	GC (%)
LOC_Os02g27030	1,122	O.sativa cv. Jinbaek	F:GGGGTACCCAAATCCCCCCACCATGGAT (3)	28	69	61
LOC_Os02g27030	1,122	O.sativa cv. Jinbaek	R:GCTCTAGAGGACTACTGATCAGAATCTAC (4)	29	59	45

그 다음, 아그로박테리움 튜머파시엔스(Agrobacterium tumefaciens)의 균계인 LBA4404 10 ㎕에 상기 pCAMBIA1300::OsCP1 벡터 1 ㎕를 첨가한 후 MicroPulser electroporation system(Bio-Rad Laboratiories, 미국) 기기를 이용하여 아그로박테리움 튜머파시엔스에 형질전환하였다. pCAMBIA1300::OsCP1 벡터를 내재하고 있는 아그로박테리움 튜머파시엔스 균주를 스펙티노마이신(spectinomycine, 50 mg/L)이 첨가된 AB 한천배지에 3일간 28℃의 암조건 생장상에서 배양하였다. 유전자 형질전환은 벼 발아초기 종자를 이용한 고효율 단기형질전환 방법을 이용하여 수행하였으며, 조직배양과 형질전환에 사용한 배지의 조성은 표 3과 같다.

모품종 동진 종자의 껍질을 인습기를 이용하여 분리하고, 70 % 에탄올에서 1분간 1회 세척한 후 4 % 차아염소산나트륨(sodium hypochlorite) 용액으로 10분씩 2회 살균하고 멸균된 증류수로 1분씩 10회 이상 세척하여 최종 살균하였다. 살균된 종자를 페트리디쉬에 옮겨 담아 클린벤치에서 1시간 동안 건조시키고, 캘러스를 유기하기 위해 2N6 배지에 종자를 치상하고 28℃의 광 조건에서 7~10일간 배양하였다.

AB 한천배지에서 배양된 아그로박테리움 튜머파시엔스를 AAM 액체배지에 OD₆₀₀(optical density)=0.1으로 접종 농도를 맞추어 현탁액을 만들고, 유기된 캘러스를 3분간 (LBA4404 균주의 현탁액에) 침종한 후 멸균된 필터페이퍼 위에 올려놓고 캘러스 표면의 아그로박테리움 현탁액 여분을 30분 이상 건조시켰다. 아그로박테리움의 과잉 생장을 막기 위하여 필터페이퍼를 2N6-AS 배지에 깔아주고 그 위에 건조시킨 캘러스를 옮겨 담았다. 공동 배양은 3일 동안 25℃의 암 조건에서 진행하였으며, 배양 후 아그로박테리움 튜머파시엔스를 제거하기 위해 500 mg/L 카르베니실린(carbenicillin)이 포함된 멸균수로 10회 이상 세척하였다. 필터페이퍼로 간단히 건조한 뒤 유전자가 삽입된 캘러스의 선발을 위해 2N6-CP 배지에 옮겨 28℃의 광 조건으로 1주일간 배양하였다. 1주일 뒤 MSR-CP 배지에 캘러스를 옮겨 심어 뿌리와 줄기의 신장을 유도하고 지속적인 계대배양을 실시하였다. 재분화된 식물체를 실내 상온에서 순화한 후 포트에 재이식하여 온실에서 재배하였으며 적합한 생육조건 하에 5개월간 재배하여 얻은 T₁ 종자를 본 실험에 이용하였다(도 2).

3. 게노믹 DNA 추출

액체질소로 냉각시킨 0.25 g의 벼 잎을 1.7 ㎖의 튜브에 담아 분쇄한 후 DNA 추출용액(500 mM NaCl, 100 mM Tris-HCl pH8.0, 50 mM EDTA, 1.25 % SDS, Sodium bisulfite 0.38g/100㎖) 1 ㎖을 첨가하여 65℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 이후 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하여 얻은 상층액에 클로로폼(chloroform): 이소아밀알코올(isoamyl alcohol)이 24:1 비율로 혼합된 용액 500 ㎕을 첨가한 후 볼텍스 기기를 이용하여 충분히 혼합하였다. 다시 12,000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 수득하고 이소프로판올(isopropanol) 300 ㎕을 첨가하여 20분 동안 -20℃ 냉동고에서 반응시켰다. 4℃, 12,000 rpm 조건에서 15분간 원심분리한 후 튜브 바닥의 침전물이 떨어지지 않도록 하여 상층액을 제거하고 70 % 에탄올 400 ㎕을 첨가하여 DNA 세척을 수행한 다음 4℃, 12,000 rpm에서 5분간 원심분리하고 피펫으로 에탄올을 제거하여 건조시켰다. 건조 후 TE buffer 50 ㎕에 DNA를 녹였고, RNase(RNase stock 20 ㎕, nuclease free-water 10 ㎖) 1 ㎕를 첨가하고 37℃에 10분 동안 반응시켰다.

4. PCR 분석

추출된 DNA의 농도를 측정하기 위하여 NanoDropOne(Thermo fisher scientific, 미국) 기기를 이용하여 PCR 실험에 적정 농도인 20 ng/㎕으로 맞추었으며, OsCP1 유전자-특이적 프라이머 세트(표 2)와 HPT 유전자-특이적 프라이머 세트를 사용하여 PCR 분석을 수행하였다. HPT 프라이머의 서열 정보는 다음과 같다: 정방향 프라이머(5'-ATTTGTGTACGCCCGACAGT-3', 서열번호 5), 역방향 프라이머(5'-CACTGGCAAACTGTGATGGA-3', 서열번호 6).

PCR 반응물은 20 ng/㎕의 주형 DNA 2 ㎕, 프라이머 혼합물 4 ㎕(10 pmol의 정방향 프라이머 2 ㎕, 10 pmol의 역방향 프라이머 2 ㎕), 10X buffer 2 ㎕, 5 mM dNTP 2 ㎕, 2.5units/㎕ Taq polymerase 0.2 ㎕ 및 증류수 9.8 ㎕를 혼합하여 총 20 ㎕가 되도록 하였다. PCR 과정은 전변성 94℃ 5분; 변성(denaturation) 94℃ 30초, 결합(annealing) 60℃ 30초, 신장(extension) 72℃ 30초의 과정을 총 35회 반복; 최종 신장 72℃ 1분의 조건으로 수행하였다. PCR 기기는 Thermal Cycler(Bio-Rad laboratory)를 사용하였다.

5. RNA 추출

자포니카 벼 품종인 진백의 종자를 물이 담긴 페트리디쉬에서 발아시키고 유묘를 온실에서 최적의 생육조건으로 재배하였다. 다양한 조직에서 OsCP1 유전자의 발현 특성을 규명하기 위해 발아 종자, 전체 10 일령 유묘, 뿌리, 줄기, 잎집, 잎, 지엽, 이삭 및 종자로부터 RNA를 추출하였다. 액체질소로 냉각시킨 잎 0.25 g을 1.7 ㎖ 튜브에 담아 blue pencil로 곱게 갈은 후 트리졸(trizol) 1 ㎖을 첨가하여 볼텍스 기기로 5초간 섞어주고 상온에서 5분간 반응시켰다. 상기 혼합물을 4℃, 12,000 rpm 조건에서 1분간 원심분리하여 상등액을 수득한 후 클로로폼 200 ㎕을 첨가하고 15초간 세게 흔들어주었다. 다시 4℃, 12,000 rpm으로 10분간 원심분리하고 상등액을 얻어 -20℃에서 냉각한 이소프로판올 500 ㎕을 첨가한 후 가볍게 흔들어주었다. 상온에서 2분간 반응시킨 후 4℃, 12,000 rpm에서 10분간 원심분리하고 침전물이 떨어지지 않게 상등액을 제거하였다. 이후 70% 에탄올 400 ㎕를 첨가하여 침전물이 떨어질 정도로만 볼텍스 기기로 흔들어준 뒤 4℃, 8,000 rpm에서 1분간 원심분리하였다. 에탄올을 제거한 후 마지막으로 스핀다운하여 남은 에탄올을 피펫으로 제거하고 상온에서 건조시켜 Nuclease-free water 50~100 ㎕을 첨가하였다.

6. cDNA 합성 및 RT-PCR 분석

추출된 RNA의 농도를 NanoDrop One으로 측정하여 1 ng/㎕로 맞춘 후 cDNA 합성을 위한 시약(Toyobo Bio-Technology Co., 일본)을 처리하여 65℃에서 5분간 반응시켰다. RNA가 담긴 튜브를 얼음에서 차갑게 유지하고 DNaseⅠ, oligo dT 및 random primer가 함유된 4X master mix(Toyobo) 2 ㎕와 nuclease-free water와 RNA 혼합물 6 ㎕를 첨가하여 총 8 ㎕가 되게 하여 37℃에서 5분간 반응시켰다. 이후 5X RT master mixⅡ를 2 ㎕ 첨가하여 PCR 기기(Bio-Rad, 미국)를 37℃ 1시간, 98℃ 5분으로 설정하여 역전사 PCR 반응을 진행하였다.

SYBR Green Supermix(Bio-Rad) 5㎕와 프라이머 세트(표 2) 2 ㎕를 사용하여 표적 유전자의 전장 cDNA를 증폭시킨 후 CFX Connect 실시간 시스템(Bio-Rad)에 로딩하였다. 반응 조건은 전변성 95℃ 5분; 변성 95℃ 5초, 결합 55℃ 30초, 신장 72℃ 20초의 과정을 총 45회 반복하였고, 유비퀴틴 프라이머는 로딩 제어 및 처리의 발현 수준을 정규화하기 위한 내부 제어로서 사용되었다. 모든 실험군은 3번 반복 수행하였고, 유비퀴틴 프라이머의 서열 정보는 다음과 같다: 정방향 프라이머(5'-TGTATGCCAGTGGTCGTACC-3', 서열번호 7), 역방향 프라이머(5'-CCAGCAAGGTCGAGACGAA-3', 서열번호8).

7. 서던 블롯(Southern blot) 분석

단일 카피 도입 벼 형질전환체를 선발하기 위해 서던 블롯팅을 수행하였다. 10㎍의 게놈 DNA를 제한효소 EcoR1로 밤새 37℃에서 반응시켜 절단하였다. 나일론 블롯팅된 절단된 DNA를 DIG-표지된 프로브(HPT 유전자)와 하이브리드화시켰다. 일련의 세척 후 제조업체의 지침에 따라 DIG-표지된 DNA를 검출하였다. 선발된 단일 카피 벼 계통을 qRT-PCR에 적용하여 다음의 프라이머를 사용하여 삽입된 유전자의 전사체의 수준을 검출하였다: OsCP1, 정방향 프라이머(5'-TGAAATCCGGTGGCCTTG-3', 서열번호 9), 역방향 프라이머(5'-TTCTGAACTGAAGTAACAATCTTCG-3', 서열번호 10).

8. 생물학적 및 비생물학적 스트레스 처리와 mRNA 추출

벼 형질전환체 T₁의 종자를 파종하여 3주된 유묘를 대상으로 물(H₂O), 벼 흰잎마름병균(Xanthomonas oryzae pv. oryzae, Xoo K3a), 100 μM 살리실산(SA, C₇H₆O₃), 100 μM 메틸 자스모네이트(meJA, C₁₂H₁₈O₃, 상업적 jasmonic acid), 가뭄(토양 수분 함량 5%), 고온(42℃) 및 염분(200 mM NaCl, Qiagen)을 각각 처리하였다. 상기 7종류의 스트레스를 처리하고 0, 6, 12 및 24시간 후에 수집된 유묘 조직으로부터 RNA를 분리하였다. RNA 분리는 RNeasy Mini 키트를 사용하여 물, Xoo K3a, 100 μM SA, 100 μM meJA, 가뭄, 열 및 염분이 각각 처리된 유묘로부터 RNA를 추출하고, DNase 1 키트(Invitrogen)를 사용하여 세척함으로써 수행되었다.

9. 벼 형질전환체의 염 스트레스에 대한 저항성 분석

벼 형질전환체의 염 스트레스 내성 평가를 수행하기 위해 염 스트레스에 대한 저항성 벼 품종인 석정(T), 감수성 벼 품종인 동진(S) 및 벼 형질전환체의 4주령 유묘에 200mM 염화나트륨(NaCl) 용액을 처리하였다. 평가는 3번 반복으로 수행하였고, 1번 수행시마다 12 개의 T₁ 유묘로 구성하였다. 감수성 대조군에서 심각한 염 스트레스 증상을 보였을 때 식물의 염 스트레스 저항성 정도를 점수로 매겼다. 점수 기준은 다음의 "IRRI 방법"(IRRI, 1996. Standard Evaluation System for Rice. Fourth edn., The International Rice Research Institute, Manila, The Philippines.)을 이용하였다: 1=정상 성장 및 잎 증상 없음, 3=거의 정상 성장이지만 일부 잎 끝이 약간 변하고 말림, 5=대부분의 잎이 말리고 일부 잎만 생장하여 성장이 심하게 지연됨, 7=일부 잎의 건조 및 일부 식물의 고사와 함께 완전한 성장 정지, 9=거의 모든 식물이 고사함.

10. 전해질 누출률(ion leakage) 측정

식물체의 잎 100 mg을 5 mm 간격으로 잘라서 10㎖의 증류수와 함께 50㎖ 튜브에 넣었다. 32℃로 설정된 중탕기에서 2시간 동안 반응시킨 후 Multi-range EC meter(Hanna instru ments, 루마니아)로 수치를 측정하였으며, 이 때 측정값이 EC1 이다. 이후 오토클레이브로 20분간 고온·고압 처리하고 다시 상온이 되었을 때 한번 더 EC meter로 수치를 측정하여 EC2 값을 얻었다. 구해진 EC1과 EC2로 EL값을 구하고 스트레스 처리 전후의 측정치인 EL1과 EL2 값을 구하여 비교하였다.

11. 통계적 분석

염 스트레스 내성 데이터는 SAS 9.4M5(SAS Institute Inc.)를 사용하여 분석하였다. 던컨의 다중회귀분석법(DMRT)을 사용하여 평균값을 비교했다.

실시예 1. OsCP1 유전자의 분자적 특성 분석

벼의 2번 염색체에 존재하는 OsCP1(Oryza sativa cysteine proteinase 1, LOC_Os02g27030) 유전자는 C1A 군집에 속하는 것으로 알려진 파파인-유사 시스테인 프로테아제(papain-like cysteine protease)의 하나로서, OsCP1 유전자의 형질전환벼를 육성하기 위하여 클로닝하였다. OsCP1 유전자는 1,122bp의 cDNA 및 373개의 아미노산으로 구성되어 있다. 클로닝된 OsCP1과 식물모델 애기장대(Arabidopsis thaliana) 및 배추(Brassica rapa) 등 다른 작물과의 연관관계를 추론하기 위해, 진화학적 관련의 추정치를 계산하고 계통발생학적 유연관계도를 작성하였다.

그 결과, OsCP1은 RD19C(At4g16190)와 RD19D(At2g21430)와 밀접한 관계가 있는 것으로 확인되었으며(도 3A), OsCP1 클론의 펩티다제 도메인(peptidase C1 superfamily; 도 3B)에서 여러 보존된 영역을 확인하였다(도 3C).

실시예 2. 벼 식물체의 부위별 OsCP1 유전자의 발현량 분석

벼의 다양한 조직에서 OsCP1 유전자의 발현 수준을 조사하기 위해, 벼 식물체의 뿌리(root), 줄기(stem), 잎집(sheath), 잎(leaf), 지엽 잎(flag leaf), 이삭(panicle) 및 종자(grain)로부터 mRNA를 분리하여 PCR을 수행하였다.

그 결과, 잎집, 잎, 지엽, 이삭 및 종자에서 OsCP1 유전자의 mRNA가 높은 수준으로 발현되었으며, 특히 잎집과 잎 및 종자에서 OsCP1 유전자의 mRNA 발현량이 현저하게 증가하였다(도 4). 이를 통해 OsCP1 유전자는 주로 벼 식물체의 잎과 잎집에서 생물적 또는 환경적 스트레스에 대하여 반응할 것으로 사료되었다.

실시예 3. 벼 형질전환체의 확인 및 분자적 특성

벼 유래 OsCP1 유전자로 형질전환하여 얻어진 T₀ 식물체를 대상으로 PCR로 분석한 결과, 선발 마커 HPT 유전자와 OsCP1 유전자의 밴드가 증폭되어 OsCP1 유전자가 성공적으로 도입된 것을 확인하였다(도 5A). 또한, 벼 형질전환체로부터 단일 카피(single copy) 도입 개체를 선발하고자 서던 블롯을 수행하여 단일 카피 도입 형질전환체에서 단일 밴드가 나타난 것을 확인하였으며(도 5B), 벼 형질전환체의 mRNA 발현을 qRT-PCR로 분석하여 OsCP1 유전자가 과발현된 벼 형질전환체에서 OsCP1 유전자의 발현이 대조구 식물체에 비해 증가한 것을 확인하였다 (도 5C).

실시예 4. 생물학적 스트레스 및 비생물학적 스트레스에 대한 반응 분석

벼를 파종하여 3주 동안 재배한 벼 형질전환체 유묘에 물, 벼 흰잎마름병균(Xoo K3a), 살리실산(SA), 메틸 자스모네이트(meJA), 가뭄(5% soil moisture), 고온(42℃) 및 염분(NaCl)을 각각 처리한 후 mRNA 추출하여 RT-PCR을 수행하였다.

그 결과, 살리실산 또는 메틸 자스모네이트 처리군은 스트레스를 처리한지 12시간째에 높은 발현량을 보였고, 고온 처리군에서는 6~24시간째에, 염분 처리군에서는 6~12시간째에 높은 발현량을 나타내었다(도 6).

실시예 5. 벼 형질전환체의 염 스트레스 저항성 평가

온실에서 종자를 파종하고 4주 동안 재배한 OsCP1 과발현 벼 형질전환체, 염 스트레스에 대한 감수성(S) 품종으로 알려진 동진벼(야생형, WT) 및 저항성(T) 품종인 석정벼의 유묘에 염 스트레스를 처리하고 10일 후에 벼 식물체의 성장 상태를 관찰하여 식물체 내에서 OsCP1 유전자의 과발현이 염 스트레스 저항성에 미치는 영향을 확인하였다.

그 결과, 동진벼는 완전히 고사하였고 석정벼는 잎의 일부가 변색되었으나 정상적인 성장을 나타내었다. 또한, 벼 형질전환체의 계통 1 및 2는 석정벼와 비슷한 수준으로 정상적인 성장을 보였다(도 7).

또한, OsCP1 과발현 벼 형질전환체, 동진벼 및 석정벼의 유묘에 염 스트레스를 처리하고 10일 후에 전해질 누출량(EC)을 측정한 결과, 벼 형질전환체 계통 1 및 2는 석정벼와 비슷한 수준의 EC 값을 나타내었다(표 4).

상기 결과를 통해, OsCP1 유전자가 식물체에서 과발현되면 염 스트레스에 대한 저항성이 증가되는 것을 알 수 있었고, OsCP1 유전자의 발현 조절을 통해 식물체의 염 스트레스에 대한 내성을 조절할 수 있을 것으로 사료되었다.

<110> Chungbuk National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> OsCP1 gene from Oryza sativa for controlling salt stress tolerance of plant and uses thereof <130> PN19390 <160> 10 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1122 <212> DNA <213> Oryza sativa <400> 1 atggatcacc gcctcctcct cctcggcctc ctcctcctct ccccggcggt ggccgccgcc 60 tcagtccccg gcgaggagga gccgctgatc cggcaggtgg tcggcggcgg cgacgacaac 120 gagctggagc tgaacgcgga gcgccacttc gccagcttcg tccagaggtt cgggaagtcc 180 taccgtgacg ccgacgagca cgcgtaccgg ctctccgtgt tcaaggccaa cctccgccgc 240 gcgcgccgcc accagctgct cgacccctcc gcggagcacg gcgtcaccaa gttctccgac 300 ctcaccccgg ccgagttccg ccgggcctac ctcggcctcc gcacgtcgcg ccgcgccttc 360 ctgcgggggc tcggcgggtc cgcccacgag gcgcccgtcc tccccaccga cggcctcccc 420 gacgacttcg actggagaga ccacggcgcc gtcggccccg tcaagaacca gggatcgtgc 480 gggtcgtgct ggtcgttcag cgcgtcgggg gcgctagagg gagcgaacta cctggcgacg 540 ggcaagatgg acgtgctctc cgagcagcag atggtcgatt gcgaccatga gtgtgattca 600 tcagaacctg attcatgtga tgctggatgc aatggtggat tgatgactaa cgccttcagc 660 tatcttttga aatccggtgg ccttgagagt gagaaggatt acccctacac tgggagggat 720 ggcacctgca aatttgacaa gtcgaagatt gttacttcag ttcagaactt cagtgttgtc 780 tctgtcgatg aggatcagat tgctgccaac cttgtcaaac atgggccact tgcaattggc 840 atcaatgctg cgtacatgca aacatacatt ggtggtgttt cgtgcccgta catctgtggc 900 aggcaccttg atcacggtgt tcttctcgtt ggctacggcg catctggttt tgctccaatc 960 cgcctaaagg ataaggccta ctggatcatc aagaactcct ggggcgagaa ctggggagag 1020 catgggtact acaagatctg caggggctcc aacgtccgca acaaatgtgg cgtggattct 1080 atggtctcca ccgtgtctgc catccacacc tcaaaggagt ag 1122 <210> 2 <211> 373 <212> PRT <213> Oryza sativa <400> 2 Met Asp His Arg Leu Leu Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Ser Pro Ala 1 5 10 15 Val Ala Ala Ala Ser Val Pro Gly Glu Glu Glu Pro Leu Ile Arg Gln 20 25 30 Val Val Gly Gly Gly Asp Asp Asn Glu Leu Glu Leu Asn Ala Glu Arg 35 40 45 His Phe Ala Ser Phe Val Gln Arg Phe Gly Lys Ser Tyr Arg Asp Ala 50 55 60 Asp Glu His Ala Tyr Arg Leu Ser Val Phe Lys Ala Asn Leu Arg Arg 65 70 75 80 Ala Arg Arg His Gln Leu Leu Asp Pro Ser Ala Glu His Gly Val Thr 85 90 95 Lys Phe Ser Asp Leu Thr Pro Ala Glu Phe Arg Arg Ala Tyr Leu Gly 100 105 110 Leu Arg Thr Ser Arg Arg Ala Phe Leu Arg Gly Leu Gly Gly Ser Ala 115 120 125 His Glu Ala Pro Val Leu Pro Thr Asp Gly Leu Pro Asp Asp Phe Asp 130 135 140 Trp Arg Asp His Gly Ala Val Gly Pro Val Lys Asn Gln Gly Ser Cys 145 150 155 160 Gly Ser Cys Trp Ser Phe Ser Ala Ser Gly Ala Leu Glu Gly Ala Asn 165 170 175 Tyr Leu Ala Thr Gly Lys Met Asp Val Leu Ser Glu Gln Gln Met Val 180 185 190 Asp Cys Asp His Glu Cys Asp Ser Ser Glu Pro Asp Ser Cys Asp Ala 195 200 205 Gly Cys Asn Gly Gly Leu Met Thr Asn Ala Phe Ser Tyr Leu Leu Lys 210 215 220 Ser Gly Gly Leu Glu Ser Glu Lys Asp Tyr Pro Tyr Thr Gly Arg Asp 225 230 235 240 Gly Thr Cys Lys Phe Asp Lys Ser Lys Ile Val Thr Ser Val Gln Asn 245 250 255 Phe Ser Val Val Ser Val Asp Glu Asp Gln Ile Ala Ala Asn Leu Val 260 265 270 Lys His Gly Pro Leu Ala Ile Gly Ile Asn Ala Ala Tyr Met Gln Thr 275 280 285 Tyr Ile Gly Gly Val Ser Cys Pro Tyr Ile Cys Gly Arg His Leu Asp 290 295 300 His Gly Val Leu Leu Val Gly Tyr Gly Ala Ser Gly Phe Ala Pro Ile 305 310 315 320 Arg Leu Lys Asp Lys Ala Tyr Trp Ile Ile Lys Asn Ser Trp Gly Glu 325 330 335 Asn Trp Gly Glu His Gly Tyr Tyr Lys Ile Cys Arg Gly Ser Asn Val 340 345 350 Arg Asn Lys Cys Gly Val Asp Ser Met Val Ser Thr Val Ser Ala Ile 355 360 365 His Thr Ser Lys Glu 370 <210> 3 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 3 ggggtaccca aatcccccca ccatggat 28 <210> 4 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 4 gctctagagg actactgatc agaatctac 29 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 5 atttgtgtac gcccgacagt 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 6 cactggcaaa ctgtgatgga 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 tgtatgccag tggtcgtacc 20 <210> 8 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 8 ccagcaaggt cgagacgaa 19 <210> 9 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 9 tgaaatccgg tggccttg 18 <210> 10 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 10 ttctgaactg aagtaacaat cttcg 25

Claims

서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP1(Oryza sativa cysteine proteinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 형질전환된 식물세포에서 OsCP1 유전자를 과발현시키는 단계를 포함하는 식물체의 염 스트레스 내성을 증가시키는 방법.
삭제
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP1(Oryza sativa cysteine proteinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 재조합 벡터로 식물 세포를 형질전환하여 형질전환된 식물세포에서 OsCP1 유전자를 과발현시키는 단계; 및
상기 형질전환된 식물세포로부터 식물을 재분화하는 단계;를 포함하는 염 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체의 제조방법.
제3항의 방법에 의해 제조된 염 스트레스 내성이 증가된 형질전환 식물체.
제4항에 따른 식물체의 형질전환된 종자.
서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 벼 유래 OsCP1(Oryza sativa cysteine proteinase 1) 단백질을 코딩하는 유전자를 유효성분으로 포함하는 식물체의 염 스트레스 내성 증가용 조성물.