CN103074446A

CN103074446A - 一种人类免疫缺陷病毒核酸检测试剂盒

Info

Publication number: CN103074446A
Application number: CN2013100090323A
Authority: CN
Inventors: 戴立忠; 熊晓燕; 邓中平
Original assignee: Sansure Biotech Inc
Current assignee: Sansure Biotech Inc
Priority date: 2013-01-10
Filing date: 2013-01-10
Publication date: 2013-05-01
Anticipated expiration: 2033-01-10
Also published as: CN103074446B

Abstract

本发明提供一种人类免疫缺陷病毒HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括至少两套引物探针，且所述至少两套引物探针分别来自不同的保守区域。优选的是，所述保守区域包括HIV基因的相对保守区：GAG、POL和LTR区。本发明设计组合两个不同区域的两套引物探针配制反应体系对HIV-1RNA进行联合检测以鉴别阳性反应的存在，有效降低了漏检的几率，能够更全面的覆盖所有亚型（包括HIV-1的M、N、O群的所有亚型），并进一步提高检测灵敏度和更准确地定量，其检测灵敏度可达50IU/ml，定量线性范围为50~1.0×10⁸IU/ml。本发明另外提供一种HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括一套引物探针序列，所述引物探针序列选自LTR1、LTR2、GAG1、GAG2、POL1和POL2这六套中的任意一套。

Description

一种人类免疫缺陷病毒核酸检测试剂盒

技术领域

本发明属于诊断试剂技术领域，具体涉及一种人类免疫缺陷病毒HIV-1的荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiencyvirus,HIV）感染而引起的疾病，又称艾滋病。该病患者的免疫功能部份或完全丧失，CD4+细胞（cd4和cd8是T淋巴细胞上的抗原蛋白质，其中cd4+称为辅助性T细胞）数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。

1981年世界报告首例艾滋病病例至今，在短短30年间，艾滋病已肆虐全球，夺去2500多万人的生命。联合国艾滋病规划署21日发布年度报告，全球2010年艾滋病病毒（HIV）携带者大约3400万人，比2009年增加70万。自1985年我国发现首例艾滋病病人以来，我国艾滋病感染人数逐年上升。中国疾控中心性病艾滋病预防控制中心数据显示，我国累计报告艾滋病病毒感染者和病人43.4万人，其中死亡8.8万人。据联合国艾滋病规划署、世界卫生组织和卫生部联合专家组评估，截至2011年底，估计我国存活艾滋病感染者和病人78万。

HIV感染的病毒学诊断技术一般包括病毒分离和病毒成份（如抗原、核酸）的检测。实验室检测包括病毒蛋白抗体检测、抗原检测、病毒分离培养、核酸检测等方法。其中，抗体检测的初筛试剂主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光试验（IFA）；ELISA用去污剂裂解HIV或感染细胞液提取物作抗原，IFA用感染细胞涂片作抗原进行抗体检测，如果发现阳性标本应重复一次；确认试剂通常采用Western blot（WB，蛋白印迹法），即用聚丙烯酰胺凝胶电泳将HIV蛋白进行分离，再经转移电泳将不同蛋白条带转移于硝酸纤维膜上，加入病人血清孵育后，用抗人球蛋白酶标抗体染色，就能测出针对不同结构蛋白抗体，如抗gp120、gp41、P24抗体，特异性较高。抗原检测则用ELISA检测P24抗原，在HIV感染早期尚未出现抗体时，血中就有该抗原存在；但由于P24量太少，阳性率通常较低；现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原来提高敏感性。病毒分离培养的常用方法为共培养法，即用正常人外周血液分离单个核细胞，加PHA刺激并培养后，加入病人单个核细胞进行共培养。核酸检测是用PCR法或基于转录的系列复制方法检测HIV基因，具有快速、高效、敏感和特异等优点，目前该法已被应用于HIV感染早期诊断及艾滋病的研究中。

艾滋病病毒进入人体后，机体需要经过一段时间才会产生抗体，在此期间血液抗体检测呈阴性，抗原抗体通常是在感染后3-6周后才能被检测出来。而近几年发展起来的艾滋病核酸检测技术是检查病毒本身的技术，感染七天之后就能检测出来，残余风险度大大下降，能够提前预防，比传统的试纸检测更精确，时间上更为提前。PCR方法虽然灵敏并能在早期对病毒进行检测，但是因其步骤繁琐且容易造成污染，从而使其在使用上收到一定限制。实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的（终点检测）PCR技术相比，实时定量监测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。

HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA双分子，其单链RNA分子由9749个核苷酸组成，有3组共9个基因。第一组为逆转录病毒共同的基因，即gag、pol和env基因，及侧翼的长末端重复顺序(LTR)等；其中前述三个基因为病毒的结构基因，编码病毒蛋白，而基因组两端的LTRs，不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性。第二组为调节基因表达的基因，即tat、rev和nef基因，可以增强或抑制其它基因的表达。第三组为特有基因，负调控病毒的感染性，成熟或释放，即vif、vpu和vpr。

根据HIV基因结构、免疫学和流行病学的特征，HIV被分为HIV-1和HIV-2两大类，HIV-1的感染力较强，在世界各地广为流行，而HIV-2主要集中在非洲西部、欧洲、美国，南美的一些地区也偶有报道。

在进化树上，HIV-1主要分为三群(group)，分别用M、O和N表示，M的含义是“major”，是全球HIV-1流行的主要形式，超过90%以上的感染属于HIV-1M群。O是“outlier”的意思，O群主要集中在中非，占整个HIV-1感染者的比例不足5%，N代表“non M non B”的意思，全球感染仅在局部地区有报道。HIV-1M群内按照基因序列的差异，又可分为不同的亚型(subtype)，目前已经明确HIV-l M群分为9个亚型，按照发现的先后次序用英文字母A～D、F～H、J和K来表示，E和I亚型已证实为不同亚型重组的产物，所以取消这两种亚型。流行重组型(circulating recombinant form，CRF)是指由不同亚型之间基因相互重组形成的新的具有感染性的重组病毒形式。造成CRF出现的原因除了基因自身突变形成HIV-1基因的变异之外，不同病毒感染同一个细胞后造成DNA序列重组是主要原因。病毒重组后形成新的CRF，重组可发生在HIV不同或相同亚型间，由于重组后的病毒基因组中含有大段的来自不同亲本的基因，所以更容易改变重组毒株的遗传特性和生物学表型，但大部分重组株可能产生缺损毒株，不能造成传播或成为独特重组型(unique re-combinantform，URF)病毒，将逐渐在人群中消失。只有那些因重组而获得生物学表型优势的重组株才能在人群中广泛传播，进而成为CRF。最常出现重组的位置是gag区和env区，目前至少有34个不同的流行重组型(CRF)。

HIV有十分高的遗传变异率，它是一个多态性病毒，从不同的AIDS患者体内分离出的病毒结构表现出一定的差异，事实上，独立分离到的HIV-1和2彼此都不相同，这是由于病毒传播过程中突变，缺失或插入引起的，高度变异区在env基因内，相当于gp120的五个区段，gag和pol基因较少变异，因此，只有选择病毒基因组中高度保守区域作为目的基因加以扩增，才能有效地检测所有HIV的变异性。目前普通的荧光定量PCR检测技术，仅采用一套引物探针较难扩增出所有的基因亚型，它仅能检测几种主要的型别，比如A、B、C、B/C、A/E，其后果是产生漏检或各亚型间的定量不准确。

目前国内已有的HIV荧光定量PCR检测试剂不多，仅有3-4种，且检测灵敏度低，约在1000IU/ml左右；对于低值（小于1.00E+03IU/ml）的样本无法检出或者无法准确定量，不能满足临床检测的需求。国外性能优异的同类试剂是Roche（罗氏）公司的“RocheAmpliPrep-Cobas TaqMan HIV-1Test”诊断系统，使用1ml的样本量，应用磁珠法原理采用全自动化的仪器进行RNA提取，然后自动加样进行RNA的荧光PCR扩增，实现临床样本中HIV-RNA的定量检测。该诊断系统具有自动化程度高、操作简便、检测灵敏度高（大于40copies/ml）等优点；但是样本需求量（1ml）太大，而且全自动化操作的试剂成本和耗材成本太高，很难在临床广泛开展。

发明内容

本发明提供一种人类免疫缺陷病毒HIV核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括至少两套引物探针，且所述至少两套引物探针分别来自不同的保守区域。其中的每一套引物探针是指一个上游引物序列、一个下游引物序列和一个探针序列。

本发明设计组合两个不同区域的两套引物探针配制反应体系对HIV-1RNA进行联合检测以鉴别阳性反应的存在，有效降低了漏检的几率，能够更全面的覆盖所有亚型（包括HIV-1的M、N、O群的所有亚型），并进一步提高检测灵敏度和更准确地定量。

优选的是，所述保守区域包括HIV基因的相对保守区GAG基因、POL基因和LTR区。在一个具体的实施方式中，所述LTR中的引物探针序列为LTR1或LTR2，所述GAG中的引物探针为GAG1或GAG2，所述POL中的引物探针序列为POL1或POL2。最优选的是，所述试剂盒中使用的引物探针序列为LTR1和POL1。本发明的试剂盒因采用用于检测靶多核苷酸的上述引物和/或探针序列，具有很好的特异性。

本发明中，优选所述试剂盒中还包括含磁珠的RNA提取溶液Ⅰ～IV。常规的RNA提取一般采用经典的酚-氯仿法或柱提取方法，酚-氯仿法操作繁琐、对于设备和人员操作要求高、低病毒载量的标本检出率低、且所用试剂具有一定的毒性，柱提取方法无需高速离心，但是需频繁更换离心管、用时长、特异性较差；本发明采用免核酸洗脱的磁珠法进行核酸提取，不涉及到有毒物质，步骤简单，容易实现自动化。另外，常规核酸提取方法无法有效去除复杂样本（如高血脂血液样本、乳汁等样本）中的PCR抑制物，而本发明的方法可以有效去除各种抑制物。

进一步地，本发明所述试剂盒中还包含有内标，该内标序列为：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。其中，进一步优选所述试剂盒中还包括存在于PCR反应液中的内标探针序列，该探针序列为：5’-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCA A-3’。

由于PCR扩增容易受多种因素，比如样本中的抑制物、试验操作或者仪器等问题而导致扩增失败，使试剂盒使用人员得出样本为阴性的错误结论，为避免该类假阴性的出现，本发明使用了阳性内对照（内标），即在样本进行核酸提取时即加入该内标，与样本共同经过裂解、磁珠吸附、洗涤、扩增、检测等步骤。

本发明进一步优选的，所述试剂盒中还包括RT-PCR增强剂，即浓度为10~1000mM/L的醋酸锰。

本发明又提供一种人类免疫缺陷病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括一套引物探针序列，所述引物探针序列选自LTR1、LTR2、GAG1、GAG2、POL1和POL2这六套中的任意一套。

本发明的试剂盒可用于人类免疫缺陷病毒1型感染的辅助诊断和获得性免疫缺陷综合症的抗病毒药物治疗的疗效观察。

具体实施方式

以下仅为本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不局限于此，任何本领域的技术人员在本发明公开的技术范围内，可很容易进行的改变或变化都涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以权利要求书的保护范围为准。

实施例1

本实施例为在HIV病毒的LTR、GAG和POL三个保守区域设计的共六套引物探针序列。本发明中引物探针设计方法为，下载NCBI、HIV database等公布的HIV-1序列，针对HIV-1的基因保守区LTR、GAG和POL基因选取保守区域；经过序列比较，分别设计了如下引物探针：

LTR1：

上游引物LTR-F1：5’-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA-3’，

下游引物LTR-R1：5’-AGTGGTCTGAGGGATCTCTAGTTAC-3’，

探针LTR-P1：5’-AGTCACACAACAGACGGGCACACACT-3’；

LTR2：

上游引物LTR-F2：5’-CCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’，

下游引物LTR-R2：5’-GGCGCCACTGCTAGAGATT-3’，

探针LTR-P2：5’-ACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACC-3’；

GAG1：

上游引物GAG-F1：5’-AGCCCAGAAGTAATACCCATGTT-3’，

下游引物GAG-R1：5’-CATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’，

探针GAG-P1：5’-CATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAG-3’；

GAG2：

上游引物GAG-F2：5’-GCAGCCATGCAAATGTTAAAAGA-3’，

下游引物GAG-R2：5’-GGTTCTCTCATCTGGCCTGGT-3’，

探针GAG-P2：5’-TCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’；

POL1：

上游引物POL-F1：5’-GACATAATAGCAACAGACATACAAACTA-3’，

下游引物POL-R1：5’-ACTGCCCCTTCACCTTTCC-3’，

探针POL-P1：5’-TCTCTGCTGTCCCTGTAATAAACCCG-3’；

POL2：

上游引物POL-F2：5’-CTGGAAAGGTGAAGGGGCAGT-3’，

下游引物POL-R2：5’-ATCCTCATCCTGTCTACCTGCCA-3’，

探针POL-P2：5’-CAATCATCACCTGCCATCTGTTTTCCATA-3’；

在上述六套引物探针序列中，通过不同区域两套引物探针之间的两两组合，一共有十二种可行组合，即LTR1+GAG1、LTR2+GAG1、LTR1+GAG2、LTR2+GAG2、LTR1+POL1、LTR2+POL1；LTR1+POL2、LTR2+POL2；POL1+GAG1、POL2+GAG1；POL1+GAG2、POL2+GAG2；以上组合均可以实现对HIV-1的M、O、N群的各亚型进行等效率扩增，避免亚型间的漏检。对以上十二种组合的综合比较可知，组合LTR1+POL1在检测灵敏度、荧光信噪比性能方面效果最佳。

实施例2

本实施例为使用两套引物探针序列即LTR1+POL1的HIV检测试剂盒的组成及其操作步骤。

该试剂盒的组成包括如下组分①~⑩，

①RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸钠0.2~1.0%（质量/体积）、曲拉通1.0~4.0%（体积/体积），异硫氰酸胍0.2~1.0mol/L和100~400μg/ml的磁珠组成；该组分可裂解血清和血浆标本中的病毒颗粒，释放核酸；

②RNA提取溶液Ⅱ：包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100~300mmol/L、氯化钠100~300mmol/L，溶液Ⅱ的pH值为6.5±0.2；它是提供磁珠吸附核酸的缓冲溶液；

③RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通0.1~1.0%（体积/体积）和氯化钠100~300mmol/L；

④RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油；

其中，RNA提取溶液Ⅲ和Ⅳ均为洗涤溶液；

⑤RNA洗脱液：Tris-HCl为0.8~1.2mol/L和EDTA为0.1~1.0mol/L；

⑥内标（阳性内对照）：由全自动DNA合成仪上合成、纯化后的内标DNA片段（100bp）与T载体（2692bp）连接后转化、克隆，抽提质粒，得到含有内标片段的重组质粒（2792bp）。

内标的序列如下：

5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’

将内标质粒稀释10倍后在紫外分光光度计下测定OD260与OD280值，按照如下公式（1）计算原液质粒拷贝数（copies/ml）：

公式（1）

测定内标质粒的浓度后，用TE Buffer稀释到4.0E+06copies/ml作为试剂盒的内标。

HIV检测为阴性时，若内标检测为阳性，说明反应体系中的PCR扩增反应正常进行，HIV检测为真阴性；若HIV检测为阴性，而内标也检测为阴性，说明可能是样本中存在抑制，或者是PCR扩增反应存在异常，为HIV假阴性，需要复检。因此内标的使用可以有效避免假阴性的检测结果。

⑦PCR反应液：包括5×PCR反应缓冲液10μl，0.2mmol/L脱氧核糖核苷三磷酸dNTP，40~200mmol/L的ROX（参比荧光）溶液、0.2~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸扩增的上下游引物LTR-F1、LTR-R1、POL-F1、POL-R1，0.2~0.4μmol/L的用于靶多核苷酸检测的探针LTR-P1、POL-P1，0.05~0.2μmol/L的用于检测内标的探针IC-P，0.05~0.2μmol/L的用于检测内标的上下游引物IC-F、IC-R，1~5U/μl Tth DNA聚合酶；所述引物探针的碱基序列分别为：

上游引物LTR-F1：5’-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA-3’，

下游引物LTR-R1：5’-AGTGGTCTGAGGGATCTCTAGTTAC-3’，

探针LTR-P1：5’-FAM-AGTCACACAACAGACGGGCACACACT–BHQ1-3’；

上游引物POL-F1：5’-GACATAATAGCAACAGACATACAAACTA-3’，

下游引物POL-R1：5’-ACTGCCCCTTCACCTTTCC-3’，

探针POL-P1：5’-FAM-TCTCTGCTGTCCCTGTAATAAACCCG-BHQ1-3’；

内标上游引物IC-F：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAG-3’

内标下游引物IC-R：5’-CTGATGACATAATTGAGATTGCACC-3’

内标探针IC-P：5’HEX-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA–BHQ13’。上述靶核苷酸探针中FAM表示该探针5’端使用FAM荧光报告基团标记，BHQ1表示3’端用BHQ1淬灭基团标记。事实上，靶核苷酸探针中并不一定使用FAM标记，其它荧光报告基团亦可；同样，其中也不限定要使用BHQ1为其淬灭基团。内标探针标记HEX荧光，其检测信号可以和检测HIV RNA的FAM荧光基团相区别。

本发明的试剂盒在PCR反应液中增加了ROX溶液，通过ROX荧光归一化校正，减少人员操作误差以及设备或耗材引起的实验误差，提高实验结果的稳定性和定量分析的准确性。

⑧RT-PCR增强剂：150mM/L醋酸锰；

⑨人类免疫缺陷病毒定量参考品：标定已知浓度的含有HIV-1目标基因序列的慢病毒，以阴性血清稀释，该人类免疫缺陷病毒定量参考品包括A、B、C、D四个浓度组成的梯度参考品，其浓度分别为1.00~5.00E+03IU/ml（A）、1.00~5.00E+04IU/ml（B）、1.00~5.00E+05IU/ml（C）、1.00~5.00E+06IU/ml（D）；

⑩人类免疫缺陷病毒阳性对照和阴性对照：其中，阳性对照为标定已知浓度的含有HIV-1目标基因序列的慢病毒，以阴性血清稀释，其浓度为1.00~5.00E+02IU/ml；阴性对照为不含有乙肝病毒、丙肝病毒和HIV-1的灭活阴性血清。

所述定量参考品和阳性对照中的慢病毒是由上海驷佳生物技术有限公司人工合成HIV-1目标基因序列，构建慢病毒表达载体，制备含有目标基因的慢病毒，该慢病毒含有HIV-1的LTR区、GAG基因和POL基因保守序列。

上述试剂盒用于检测HIV的操作步骤如下：

一、HIVRNA提取

1）裂解病毒：每管加入300μl~1.2ml RNA提取溶液1-mix（由RNA提取溶液Ⅰ和内标充分混匀而成），然后加入100μl～1ml待测血清或血浆样本，盖上管盖，震荡混匀10秒钟，瞬时离心；

2）磁珠吸附核酸：每管加入50~400μl RNA提取溶液Ⅱ，震荡混匀10秒钟后，室温静置10~40分钟；

3)去除杂质：瞬时离心后，将离心管置于磁珠分离器上进行磁珠分离，3~5分钟后缓慢将溶液吸出；

4）洗涤：每管加入300μl～1.2ml RNA提取溶液Ⅲ和100~500μl RNA提取溶液Ⅳ，震荡混匀3~7秒钟，瞬时离心后将离心管再次置于磁珠分离器上进行磁珠分离；

5）3~5分钟后，上清液分为两层，将吸头插入离心管底部，从底部开始缓慢将液体完全吸出丢弃，静置1~3分钟后，将管底残余液体完全吸出丢弃；

6）带有磁珠的核酸可直接用于后续PCR反应和扩增；也可采用如下洗脱的方式进行处理：加入20～100ul RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，吸打混匀3~4次，室温静置5~30分钟后将离心管再次置于磁珠分离器上3~5分钟，然后将从磁珠上洗脱下来的RNA吸至新的1.5ml灭菌离心管中，该不含磁珠的RNA可用于后续PCR反应和扩增；

二、PCR反应和扩增

试剂盒的RT-PCR扩增采用“一步法”的方式，即逆转录与PCR扩增在同一反应管内进行，采用具有逆转录和DNA聚合作用的TTH DNA聚合酶，在同一个反应体系中进行逆转录和PCR扩增。配合实时荧光定量PCR仪，进行闭管检测，采用Taqman探针的实时荧光检测模式，PCR扩增的目的基因中设计合成标记FAM荧光基团的探针，内标基因设计合成标记HEX荧光基团的探针，加入到RT-PCR反应液中，进行实时荧光检测。每人份取49ul PCR反应液，加入含有Mn²⁺的RT-PCR增强剂配制反应液。可采用50ul反应液直接冲洗上述带有磁珠的核酸，转入PCR反应液管中，在ABI7500、Mx3000P等荧光定量PCR仪上进行反应；或者是取45ul反应液，加入经上述洗脱液洗脱后的核酸5ul，荧光定量PCR仪上完成扩增和检测。

该技术用于定量检测是基于Ct值和模板量的对应关系。Ct值就是在荧光PCR扩增过程中，当扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数；它与模板的拷贝数存在着线性关系，起始拷贝数越多，经过的循环数就越少，Ct值也就越小，反之亦然。利用已知起始拷贝数的标准样品的Ct值做出标准曲线，只要在同一次PCR实验中得到未知样品的Ct值，就可以根据曲线算出该未知样品的起始拷贝数。

本发明的试剂盒采用实时荧光定量PCR技术，可以实现每一轮循环均检测一次荧光信号，采用外标准曲线的定量方法。在绝对定量中，未知样本的量如基因拷贝数可通过梯度稀释的已知量的标准品的Ct值推算出。本试剂盒中设置了4份不同数量水平的工作标准品（即定量参考品），将未知样品和工作标准品在同一荧光PCR实验中进行反应，将工作标准品得到的Ct值构建标准曲线，通过标准曲线可以推算出未知样品的量。阴性、阳性对照品用于质控试剂盒的操作及定量计算。

实施例3~13

为实施例1中除两套引物探针序列为LTR1+POL1外的其余十一种引物探针序列组合的检测试剂盒。

该试剂盒的组分与实施例2中的组分除靶核苷酸的引物探针序列不同外（各自引物探针序列见实施例1），其余组分均相同；试剂盒的操作方法也与实施例2中的操作方法一致。

实施例14~19

这六个实施例分别对应选用实施例1中所述的引物探针序列LTR1、LTR2、GAG1、GAG2、POL1或POL2而形成的检测试剂盒。

该试剂盒的组分与实施例2中的组分大致相同，仅将PCR反应液中的LTR1+POL1两套引物探针序列更换为本实施例中的一套靶核苷酸引物探针序列；该试剂盒的操作方法也与实施例2中的操作方法一致。

按上述实施例中所述方法对HIV和其余多种病毒做出检测分析，本发明的试剂盒能够检测出HIV-1的M、N、O群的所有亚型，而对于近缘种或其他非HIV-1感染病原体则不会检出，说明本发明试剂盒具有很好的特异性。本发明通过采用磁珠法进行核酸提取和纯化，在实施例14~19中，检测灵敏度可达100IU/ml；而实施例2~13中，检测灵敏度可达50IU/ml，定量线性范围为50~1.0×10⁸IU/ml；与实施例14~19中的仅用一套引物探针序列相比，实施例2~13中结合使用两套引物探针序列的检测试剂盒对HIV靶核苷酸的检测灵敏度更高。

Claims

1.一种人类免疫缺陷病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括至少两套引物探针，且所述至少两套引物探针分别来自不同的保守区域。

2.根据权利要求1所述的检测试剂盒，其特征在于，所述保守区域包括HIV基因的相对保守区：GAG基因、POL基因和LTR区。

3.根据权利要求2所述的检测试剂盒，其特征在于，所述LTR中的引物探针序列为LTR1或LTR2，所述GAG中的引物探针为GAG1或GAG2，所述POL中的引物探针序列为POL1或POL2；且其序列分别如下：

LTR1：

上游引物LTR-F1：5’-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA-3’，

下游引物LTR-R1：5’-AGTGGTCTGAGGGATCTCTAGTTAC-3’，

探针LTR-P1：5’-AGTCACACAACAGACGGGCACACACT-3’；

LTR2：

上游引物LTR-F2：5’-CCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’，

下游引物LTR-R2：5’-GGCGCCACTGCTAGAGATT-3’，

探针LTR-P2：5’-ACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACC-3’；

GAG1：

上游引物GAG-F1：5’-AGCCCAGAAGTAATACCCATGTT-3’，

下游引物GAG-R1：5’-CATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’，

探针GAG-P1：5’-CATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAG-3’；

GAG2：

上游引物GAG-F2：5’-GCAGCCATGCAAATGTTAAAAGA-3’，

下游引物GAG-R2：5’-GGTTCTCTCATCTGGCCTGGT-3’，

探针GAG-P2：5’-TCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’；

POL1：

上游引物POL-F1：5’-GACATAATAGCAACAGACATACAAACTA-3’，

下游引物POL-R1：5’-ACTGCCCCTTCACCTTTCC-3’，

探针POL-P1：5’-TCTCTGCTGTCCCTGTAATAAACCCG-3’；

POL2：

上游引物POL-F2：5’-CTGGAAAGGTGAAGGGGCAGT-3’，

下游引物POL-R2：5’-ATCCTCATCCTGTCTACCTGCCA-3’，

探针POL-P2：5’-CAATCATCACCTGCCATCTGTTTTCCATA-3’。

4.根据权利要求3所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中使用的引物探针序列为LTR1和POL1。

5.根据权利要求1~4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括RNA提取溶液Ⅰ~Ⅳ，其中，

RNA提取溶液Ⅰ：由十二烷基硫酸钠0.2~1.0%（质量/体积）、曲拉通1.0~4.0%（体积/体积），异硫氰酸胍0.2~1.0mol/L和100~400μg/ml的磁珠组成；

RNA提取溶液Ⅱ：包括4-羟乙基哌嗪乙磺酸100~300mmol/L、氯化钠100~300mmol/L，溶液Ⅱ的pH值为6.5±0.2；

RNA提取溶液Ⅲ：含曲拉通0.1~1.0%（体积/体积）和氯化钠100~300mmol/L；

RNA提取溶液Ⅳ：含矿物油。

6.根据权利要求1~4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包含有内标，该内标序列为：5’-CACCACTTAAATCCTAAGGTTCCAGCTCTGTCATCCAGTTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAATCTTCTGGAGGTGCAATCTCAATTATGTCATCAG-3’。

7.根据权利要求6所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括存在于PCR反应液中的内标探针序列，该探针序列为：5’-TTTTGCTGACTCACGTATTCGTAGCCAA-3’。

8.根据权利要求1~4中任意一项所述的检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括RT-PCR增强剂，即浓度为10~1000mM/L的醋酸锰。

9.一种人类免疫缺陷病毒核酸检测试剂盒，所述试剂盒中包括一套引物探针序列，所述引物探针序列选自LTR1、LTR2、GAG1、GAG2、POL1和POL2这六套中的任意一套，其序列分别如下：

LTR1：

上游引物LTR-F1：5’-AGCTTGCCTTGAGTGCTTCA-3’，

下游引物LTR-R1：5’-AGTGGTCTGAGGGATCTCTAGTTAC-3’，

探针LTR-P1：5’-AGTCACACAACAGACGGGCACACACT-3’；

LTR2：

上游引物LTR-F2：5’-CCTCAATAAAGCTTGCCTTGA-3’，

下游引物LTR-R2：5’-GGCGCCACTGCTAGAGATT-3’，

探针LTR-P2：5’-ACTCTGGTAACTAGAGATCCCTCAGACC-3’；

GAG1：

上游引物GAG-F1：5’-AGCCCAGAAGTAATACCCATGTT-3’，

下游引物GAG-R1：5’-CATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’，

探针GAG-P1：5’-CATTATCAGAAGGAGCCACCCCACAAG-3’；

GAG2：

上游引物GAG-F2：5’-GCAGCCATGCAAATGTTAAAAGA-3’，

下游引物GAG-R2：5’-GGTTCTCTCATCTGGCCTGGT-3’，

探针GAG-P2：5’-TCCCATTCTGCAGCTTCCTCATTGAT-3’；

POL1：

上游引物POL-F1：5’-GACATAATAGCAACAGACATACAAACTA-3’，

下游引物POL-R1：5’-ACTGCCCCTTCACCTTTCC-3’，

探针POL-P1：5’-TCTCTGCTGTCCCTGTAATAAACCCG-3’；

POL2：

上游引物POL-F2：5’-CTGGAAAGGTGAAGGGGCAGT-3’，

下游引物POL-R2：5’-ATCCTCATCCTGTCTACCTGCCA-3’，

探针POL-P2：5’-CAATCATCACCTGCCATCTGTTTTCCATA-3’。