CN109777891A - 一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合和检测方法，涉及慢病毒检测技术领域，该引物对和荧光探针的组合中的引物对包括：SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物，荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。该组合可以用于检测样品中的来自慢病毒的gag基因，通过对慢病毒的gag基因的检出实现对样品中慢病毒的检出，使用该组合检测慢病毒具有较高的特异性和灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及慢病毒检测技术领域，具体而言，涉及一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合和检测方法。
背景技术
慢病毒属于逆转录病毒科，但其基因组结构复杂，除gag、pol和env这3个和单纯逆转录病毒相似的结构基因外，还包括4个辅助基因，vif、vpr、nef、vpu和2个调节基因tat和rev。
慢病毒载体作为一种有力的基因运载工具兼具多种优点，如基因的长期持续性表达；感染谱广；能够感染分裂期与非分裂期细胞和免疫原性相对较小等。虽然慢病毒载体可将目的基因稳定的整合到宿主细胞的基因组中，但是它们也可能对人的健康构成威胁，例如整合介导转化为可感染非靶细胞的具有复制能力的慢病毒(replication competentlentivirus)。美国食品和药品管理局(FDA)要求所有经逆转录病毒载体转导的细胞产品在使用该产品之前，都必须进行可复制病毒的检测。
常见的检测慢病毒方法存在一定的缺陷，如灵敏度低、特异性差。
鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的目的在于提供一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合，该组合可以用于检测慢病毒的gag基因，使用该组合检测慢病毒具有较高的特异性和灵敏度。
本发明的另一目的在于提供一种快速检测慢病毒残留及可复制慢病毒的方法，该方法可以有效检测样品中的慢病毒残留及可复制慢病毒，具有较高的特异性和灵敏度。
本发明是这样实现的：
本发明提供的一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合，所述gag基因来自慢病毒，所述引物对包括：SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
优选的，所述荧光探针一端标记有FAM荧光基团，另一端标记有TAMRA淬灭基团。
本发明提供的引物对和荧光探针的组合引物对和荧光探针的组合可以通过实时荧光定量PCR的方法，通过对gag基因的检测，实现快速准确的检测样本中慢病毒基因的拷贝数，判断样本的阴阳性，具有更高的灵敏度和特异性。
本发明提供的一种检测gag基因的方法，其包括：在PCR扩增体系中加入如上所述的引物对和荧光探针的组合；所述PCR扩增体系含有提取自待检样品的DNA模板。
优选的，PCR扩增的退火温度为55-65℃；优选的，退火温度为62℃。
优选的，在PCR扩增体系还添加有二甲基亚砜。
本发明的实验结果显示二甲基亚砜有助于提高引物探针的特异性和灵敏度，避免非特异性扩增。
优选的，二甲基亚砜在PCR扩增体系中的浓度为1-10％；
优选的，二甲基亚砜在PCR扩增体系中的浓度为3％。
优选的，所述荧光探针在PCR扩增体系中的浓度为：10-500pmol/ml；
优选的，荧光探针在PCR扩增体系中的浓度为380-420pmol/ml。
优选的，所述正向引物在PCR扩增体系中的浓度为10-500pmol/ml；优选的，所述正向引物在PCR扩增体系中的浓度为240-260pmol/ml。
优选的，所述反向引物在PCR扩增体系中的浓度为：10-500pmol/ml；
优选的，所述反向引物在PCR扩增体系中的浓度为240-260pmol/ml。
根据慢病毒的gag基因序列，设计出的特异性的引物对和荧光探针，可以检测样本中的慢病毒，还可具体检测样本中含有慢病毒基因的拷贝数。
本发明的发明人通过对引物和探针序列的合理优化配置，使其检测结果具有更好的特异性和灵敏度，实现对样品中的慢病毒及其拷贝数的有效检测。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本发明实验例中的对不同浓度的阳性标准质粒的荧光扩增曲线结果，图中：从左往右依次是：1×106copies/μl、1×105copies/μl、1×104copies/μl、1×103copies/μl、1×102copies/μl、1×101copies/μl。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1
本实施例提供的用于检测慢病毒gag基因的引物对和荧光探针的组合，引物对包括：SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物；所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。其中，荧光探针的5’端有荧光基团FAM，3’端有淬灭基团TAMRA。
引物对和荧光探针的碱基序列如下表1所示。
表1
采用本实施例的引物对和荧光探针的组合进行实时荧光定量PCR检测的方法如下：
(1)配制实时荧光定量PCR反应体系(以20ul为例)：
荧光探针(浓度为10μM)0.8μl，正向引物和反向引物(浓度为10μM)各0.5ul，TaqpathTMQpcr Master Mix.CG反应液10μl，二甲基亚砜0.6μl(体系中的浓度为3％)，DNA模板10ng或者标准质粒溶液2μl，加RNase-free Water补足20ul体系(体系中，正向或反向引物终浓度为250pmol/ml，荧光探针终浓度为400pmol/ml)。配制好后，将反应液分装到八连管中。
(2)PCR反应程序：
反应程序为：激活UNG酶：50℃，2min；预变性：95℃，20s；(变性：95℃，15s；退火及延伸：62℃，60s)40个循环；扩增过程中在62℃时收集荧光信号，选择收集荧光信号通道为FAM。
(3)结果判断：
如果样本的三个复孔中有两个复孔检测结果为阴性，此处的阴性为复孔无扩增曲线，另外一个检测结果Ct值大于10copy样本的Ct值，亦认为此样本为阴性。
如果样本三个复孔有两个复孔检测Ct值小于或者等于10copy样本的Ct值，则认为此样本为阳性。
如果样本三个复孔的Ct值均小于10copy样本的Ct值，样本检测结果为阳性。
实验例2
灵敏度检测
(1)配制不同浓度的阳性质粒
使用微量紫外分光光度计检测含有gag质粒(标准质粒)的浓度，并计算拷贝数，计算公式拷贝数(copy/μL)＝(6.02×1023copies/mol)×(浓度g/μL)/(MW g/mol)。含有gag基因的质粒MW g/mol＝7040880。使用RNase-free Water稀释质粒至1×1010copies/μL，并逐级稀释成1×106copies/μL、1×105copies/μL、1×104copies/μL、1×103copies/μL、1×102copies/μL、1×101copies/μL。
(2)采用实施例1的引物对和荧光探针的组合和对应的方法检测上述步骤(1)不同浓度的阳性标准质粒。结果见图1。
从图1中可以看出，采用实施例1的引物对和荧光探针的组合检测的灵敏度可以达到1×101copies/μL。
(3)按步骤(1)方法稀释质粒至：5×109copies/μL、5×108copies/μL、5×107copies/μL、5×106copies/μL、5×105copies/μL、5×104copies/μL、5×103copies/μL、5×102copies/μL、5×101copies/μL、5×100copies/μL。
(4)采用实施例1的引物对和荧光探针的组合和对应的方法检测上述步骤(3)不同浓度的阳性标准质粒。结果见下表2。
表2
| 样本类型 | 基因名称 | 荧光基团 | Ct值 | 拷贝数 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 39.114 | 1.E+01 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 38.834 | 1.E+01 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 37.388 | 1.E+01 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 33.979 | 1.E+02 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 34.096 | 1.E+02 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 34.118 | 1.E+02 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 30.842 | 1.E+03 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 30.636 | 1.E+03 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 30.772 | 1.E+03 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 26.783 | 1.E+04 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 26.886 | 1.E+04 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 26.737 | 1.E+04 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 23.069 | 1.E+05 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 23.045 | 1.E+05 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 23.011 | 1.E+05 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 19.657 | 1.E+06 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 19.625 | 1.E+06 |
| 标准质粒 | gag | FAM | 19.587 | 1.E+06 |
(5)细胞样品检测
样本DNA的提取：
取1×106细胞样品1ml，向样本中加入1μl的核酸酶37℃孵育30min消化培养基中可能存在的DNA基因组或者质粒。然后1000rpm离心5min，弃上清，加入1ml PBS清洗，然后离心弃上清，重复此过程两遍。向清洗后的样本中加入200μl PBS吹打混匀，然后加入20μl的蛋白酶K和RNase A混匀，孵育2min。孵育完成后加入200ul Pure Link Genomic DNALysis/Binding Buffer，震荡混匀，55℃水浴锅中孵育10min。
加入200μl 100％ethanol，震荡混匀，将上述裂解液转移到过滤柱中，10000g离心1min。弃掉收集管中的液体，向过滤柱中加入500ul的基因组清洗液1，10000g离心1min。弃掉收集管中的液体，向过滤柱中加入500ul的基因组清洗液2，10000g离心3min。弃掉收集管，换上1.5ml的EP管，向过滤柱中加入30ul的洗脱液，孵育1min，10000g离心1min，将得到的液体重新加入到过滤柱中，再次孵育和离心，得到样本DNA溶液，并用微量分光光度计检测DNA溶液的浓度。
样本DNA采用实施例1的引物对和荧光探针的组合和对应的方法检测，结果见下表3。样品1为慢病毒感染T细胞后取样进行检测，样本2为慢病毒感染T细胞，培养一段时间后进行清洗后取样检测。
表3
备注：样品1为转染后立刻取样检测，样本中含有大量的含有gag基因的质粒，故检测结果为阳性。
样品2为转染培养后清洗后取样，样本中含有gag基因的质粒在培养和清洗的过程中降解或者洗掉，而样本中未发现可复制慢病毒基因故检测结果阴性。
实验例2
用不同的引物探针，对比表1中的引物探针。实验中用到的引物探针如下表4。
表4
使用实施例1中的反应条件，用表4各个不同的引物对和探针组合同时扩增T细胞DNA，含gag基因的质粒(10copies)，293T细胞DNA，VERO细胞DNA，Jurkat细胞DNA，C8166细胞DNA。检测结果如下表5：
表5
实验结果表明，gag基因1的引物对(SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2)和荧光探针(SEQID NO.3)灵敏度较高，特异性更好。
实验例3
使用实施例1中的实验条件及实验参数，对比分别加入二甲基亚砜和甜菜碱在同样条件下的扩增结果；检测结果如下表6：
表6
备注：标准质粒为含有gag基因的质粒(10拷贝)。
实验结果表明，加二甲基亚砜的实验组检测灵敏度更高。
实验例4
使用实施例1中的引物探针，验证在不同退火温度下标准品的扩增情况。结果如表7所示。
表7
实验结果表明：实施例1中的引物探针在退火温度为62℃时，扩增情况较好，复孔间的重复性更好。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 上海邦耀生物科技有限公司
<120> 一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合和检测方法
<130> 250
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
cccatgtttt cagcattatc ag 22
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
gtcacttccc cttggttctc 20
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aaatcttgtg gggtggctcc tt 22
Claims (9)
1.一种检测gag基因的引物对和荧光探针的组合，所述gag基因来自慢病毒，其特征在于，所述引物对包括：SEQ ID NO.1所示的正向引物和SEQ ID NO.2所示的反向引物，所述荧光探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.根据权利要求1所述的引物对和荧光探针的组合，其特征在于，所述荧光探针一端标记有FAM荧光基团，另一端标记有TAMRA淬灭基团。
3.一种检测gag基因的方法，其特征在于，其包括：在PCR扩增体系中加入权利要求1或2所述的引物对和荧光探针的组合；所述PCR扩增体系含有提取自待检样品的DNA模板。
4.根据权利要求3所述的检测gag基因的方法，其特征在于，PCR扩增的退火温度为55-65℃；优选的，退火温度为62℃。
5.根据权利要求3所述的检测gag基因的方法，其特征在于，在PCR扩增体系还添加有二甲基亚砜。
6.根据权利要求5所述的检测gag基因的方法，其特征在于，
优选的，二甲基亚砜在PCR扩增体系中的浓度为1-10％；
优选的，二甲基亚砜在PCR扩增体系中的浓度为3％。
7.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述荧光探针在PCR扩增体系中的浓度为：10-500pmol/ml；
优选的，荧光探针在PCR扩增体系中的浓度为380-420pmol/ml。
8.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述正向引物在PCR扩增体系中的浓度为10-500pmol/ml；优选的，所述正向引物在PCR扩增体系中的浓度为240-260pmol/ml。
9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述反向引物在PCR扩增体系中的浓度为：10-500pmol/ml；
优选的，所述反向引物在PCR扩增体系中的浓度为240-260pmol/ml。
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Application publication date: 20190521 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |