CN116064922A - 一种人类免疫缺陷病毒1型核酸测定试剂盒及其操作方法 - Google Patents
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Abstract
一种人类免疫缺陷病毒1型核酸测定试剂盒及其操作方法，所述试剂盒包括针对下述保守区的三套引物和探针：Gag区、Pol区和Ltr区；三套引物和探针的具体序列与说明书相同。本公开实施例提供的试剂盒的检测范围能够覆盖中国国内的主要基因型别，可以避免HIV核酸检测中漏检现象的发生；试剂盒的检测灵敏度高，生产成本低。
Description
技术领域
本公开实施例涉及但不限于诊断用具领域，尤指一种人类免疫缺陷病毒1 型核酸测定试剂盒及其操作方法。
背景技术
艾滋病，即获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome，AIDS)，其病原体为人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus，HIV)，亦称艾滋病病毒。HIV主要侵犯人体的免疫系统，包括CD4+T淋巴细胞、单核巨噬细胞和树突状细胞等，主要表现为CD4+T淋巴细胞数量不断减少，最终导致人体细胞免疫功能缺陷，引起各种机会性感染和肿瘤的发生。目前，艾滋病已成为严重威胁中国公众健康的重要公共卫生问题。
据联合国艾滋病规划署估计，截止到2018年底，全球现存活HIV/AIDS 患者3790万例，当年新发HIV感染者170万例，有2450万例正在接受高效联合抗反转录病毒治疗(highlyactive antiretroviral therapy，HAART，俗称“鸡尾酒疗法”，现在又称抗反转录病毒治疗)，有77万例死于与艾滋病相关的疾病。截止到2019年10月底，中国报告的现存活HIV/AIDS患者95.8万例，当年新发现HIV/AIDS患者13.1万例。2010年至2019年间，中国报告存活艾滋病病毒感染者和病人呈持续增加趋势，这对艾滋病的防治、检测与血源筛查造成巨大压力和挑战。目前HIV/AIDS的实验室检测主要包括HIV抗体检测、HIV核酸定性和定量检测、CD4+T淋巴细胞计数、HIV耐药检测等。在技术层面上，HIV核酸定量检测较免疫检测具有更高的灵敏度和更早的感染窗口期，对于需要更早确诊HIV感染、预测疾病进程、评估治疗效果、指导治疗方案调整等方面具有更重要的临床意义。
在法规政策方面，长久以来，艾滋病诊断标准是以HIV抗体筛查试验与补充试验均为阳性才能确诊HIV感染，确证试验不足以确定HIV抗体阳性时患者需在4周后随访，仍不能判定者需继续随访至8周，患者可能需历时3 个月才能确诊是否感染HIV。随着分子诊断技术的发展和临床实践的应用， HIV核酸检测备受重视，新发布的《中国艾滋病诊疗指南(2018版)》和《艾滋病和艾滋病病毒感染诊断(WS 293—2019)》均明确指出，将核酸检测应用于HIV确诊试验或补充试验、18个月龄及以下儿童的确诊试验。
目前HIV核酸检测技术主要有NASBA法、PCR测序法、PCR荧光探针法。其中，NASBA法主要为有一对引物介导多种酶共同参与的一种RNA恒温扩增技术，该方法步骤繁杂，多种酶共同参与，成本较高且无法真正实现病毒载量定量的过程。PCR测序法首先经过特异性引物扩增，再将扩增产物进行一代测序，该法操作繁杂、灵敏度低且易造成产物污染。现有市场上大部分商品化试剂盒均采用荧光PCR法，即在PCR反应体系中加入特异性的引物探针，根据taqman探针工作原理，每一轮的扩增积累一次荧光信号，利用荧光信号来实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定性或定量分析，该方法操作简便、成本低且灵敏度高。
发明内容
以下是对本文详细描述的主题的概述。本概述并非是为了限制本公开的保护范围。
本公开实施例提供一种人类免疫缺陷病毒1型核酸测定试剂盒，所述试剂盒包括针对下述保守区的三套引物和探针：Gag区、Pol区和Ltr区；其中，第一套引物和探针包括以下针对Gag-1和Gag-2的引物和探针中的任意一种：
(1)针对Gag-1的正向引物GagF1：TCCCTCARTCACTCTTTGGCA(SEQ ID NO：1)；反向引物GagR1：CCTCCAATTCCYCCTATCATT(SEQ ID NO：2)；探针GagP1：FAM-TTAGAYACAGGAGCAGATGATACAGT-BHQ1(SEQ ID NO：3)；
(2)针对Gag-2的正向引物GagF2：CTTTGGATGGGNATGAACTC(SEQ ID NO：4)；反向引物GagR2：GTATATCATTGACAGTCCAGCT(SEQ ID NO： 5)；探针GagP2：FAM-ATCCTGACAAATGGACAGTTCAGCCTAT-BHQ1 (SEQ ID NO：6)；
第二套引物和探针包括以下针对Pol-1和Pol-2的引物和探针中的任意一种：
(3)针对Pol-1的正向引物PolF1： TTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGT(SEQ ID NO：7)；反向引物PolR1： TAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCT(SEQ ID NO：8)；探针PolP1： FAM-CCCCTGCACTGTACCCCCCAATC-BHQ1(SEQ ID NO：9)；
(4)针对Pol-2的正向引物PolF2： GAATATAGACATAATAGCAACAGACA(SEQ ID NO：10)；反向引物PolR2： ACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO：11)；探针PolP2： FAM-CGGGTTTATTACAGRGACAGCAGAGA-BHQ1(SEQ ID NO：12)；
第三套引物和探针包括以下针对Ltr-1和Ltr-2的引物和探针中的任意一种：
(5)针对Ltr-1的正向引物LtrF1：CCCTCAGATGCTGCATAWAAGCA (SEQ ID NO：13)；反向引物LtrR1：GTAGTGTGTGCCCGTCTGT(SEQ ID NO：14)；探针LtrP1：FAM-CCTGGGAGCTCTCTGGCTA-BHQ1(SEQ ID NO：15)；
(6)针对Ltr-2的正向引物LtrF2：ACAGACGGGCACACACTAC(SEQ ID NO：16)；反向引物LtrR2：CGGGCGCCACTGCTAGAGATTTTT(SEQ ID NO：17)；探针LtrP2： FAM-GTAGTGTGTGCCCGTCTGTGTGTGACTC-BHQ1(SEQ ID NO：18)。
在本公开的实施例中，第一套引物和探针包括正向引物GagF1、反向引物GagR1、探针GagP1，第二套引物和探针包括正向引物PolF2、反向引物 PolR2、探针PolP2，第三套引物和探针包括正向引物LtrF1、反向引物LtrR1、探针LtrP1。
在本公开的实施例中，第一套引物和探针包括正向引物GagF1、反向引物GagR1、探针GagP1，第二套引物和探针包括正向引物PolF1、反向引物 PolR1、探针PolP1，第三套引物和探针包括正向引物LtrF1、反向引物LtrR1、探针LtrP1。
在本公开的实施例中，第一套引物和探针包括正向引物GagF1、反向引物GagR1、探针GagP1，第二套引物和探针包括正向引物PolF1、反向引物 PolR1、探针PolP1，第三套引物和探针包括正向引物LtrF2、反向引物LtrR2、探针LtrP2。
在本公开的实施例中，所述引物的Tm值在55℃至65℃范围内。
在本公开的实施例中，所述探针的Tm值在66℃至75℃范围内。
在本公开的实施例中，所述试剂盒可以包括：PCR反应液、酶混合液、校准品、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标和阴性质控品。
在本公开的实施例中，所述PCR反应液可以包括：三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、氯化钾、dATP、dGTP，dCTP、dUTP、二硫苏糖醇、甜菜碱、二甲基亚砜、蔗糖以及三套引物和探针。
在本公开的实施例中，在所述试剂盒的反应体系中，所述三羟甲基氨基甲烷的工作浓度可以为0.05M至2M，所述氯化镁的工作浓度可以为0.002M 至0.004M，所述氯化钾的工作浓度可以为0.02M至0.05M，所述dATP的工作浓度可以为0.8mM至2mM，所述dGTP的工作浓度可以为0.8mM至2mM，所述dCTP的工作浓度为0.8mM至2mM，所述dUTP的工作浓度可以为0.8mM 至2mM，所述二硫苏糖醇的工作浓度可以为0.1mM至0.4mM，所述甜菜碱的工作浓度可以为3mM至10mM，所述二甲基亚砜的工作浓度可以为0.1％至0.8％，所述蔗糖的工作浓度可以为0.2％至0.8％，三套引物和探针中的三个正向引物的工作浓度可以均为0.05μM至0.2μM，三套引物和探针中的三个反向引物的工作浓度可以均为0.05μM至0.2μM，三套引物和探针中的三个探针的工作浓度可以均为0.025μM至0.1μM。
在本公开的实施例中，所述酶混合液可以包括：Taq酶、逆转录酶、牛血清白蛋白、海藻糖以及RNAse抑制剂。
在本公开的实施例中，在所述试剂盒的反应体系中，所述Taq酶的工作浓度可以为0.03U/μL至0.0625U/μL，所述逆转录酶的工作浓度可以为0.05 U/μL至0.1U/μL，所述牛血清白蛋白的工作浓度可以为0.0001％至0.00025％，所述海藻糖的工作浓度可以为0.05％至0.15％，所述RNAse抑制剂的工作浓度可以为0.05U/μL至0.112U/μL。
本公开实施例还提供如上所述的人类免疫缺陷病毒1型核酸测定试剂盒的操作方法，所述操作方法包括：
S1：提取待测样品、校准品、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标、阴性质控品的RNA；
S2：将所述PCR反应液与所述酶混合液混合并分装至检测管中，将步骤 S1提取到的RNA加入检测管中，离心；
S3：将经过步骤S2离心后的检测管放入荧光PCR仪中进行PCR反应和扩增；
S4：完成步骤S3的PCR反应后，设定基线和阈值，绘制标准曲线并对待测样本进行定量或定性分析；
S5：结果质量控制。
在本公开的实施例中，所述PCR反应和扩增包括逆转录过程、预变性过程、变性过程、退火延伸过程以及仪器冷却过程。
在本公开的实施例中，所述逆转录过程的温度可以为50℃至60℃，时间可以为10min至20min，循环数为1。
在本公开的实施例中，所述预变性过程的温度可以为93℃至96℃，时间可以为1min至5min，循环数为1。
在本公开的实施例中，所述变性过程的温度可以为93℃至96℃，时间可以为10s至20s，循环数为1；
所述退火延伸过程的温度可以为58℃至62℃，时间可以为20s至35s；
所述变性过程和所述退火延伸过程的循环数可以为42至45。
在本公开的实施例中，所述仪器冷却的温度可以为40℃，时间可以为5s 至15s，循环数为1。
在本公开的实施例中，所述结果质量控制可以包括：阴性质控品的FAM 通道无Ct值，阴性质控品的VIC通道Ct值≤38；强阳性质控品的浓度在1×104 IU/mL至1×105IU/mL范围内，弱阳性质控品检测为阳性；校准品1至4的扩增曲线呈典型“S”型，绘制标准曲线R2≥0.98。
在本公开的实施例中，所述操作方法还可以包括测定结果判断：
采用所述试剂盒分析得到的待测样品的浓度记为C，
若待测样品的VIC通道Ct值≤38且FAM通道无Ct值，则判定为阴性；
若1×102IU/mL≤C≤1×108IU/mL，直接报告定量结果；
若5×101IU/mL≤C＜1×102IU/mL，则判定为阳性，但定量结果仅供参考；
若C＜5×101U/mL且阴性质控品的VIC通道Ct值≤38，报告低于检测下限；
若待测样品的VIC通道Ct值＞38或无Ct值，则检测结果无效，须复测。
本公开实施例提供的人类免疫缺陷病毒1型核酸测定试剂盒，检测范围能够覆盖中国国内的主要基因型别01_AE、07_BC、08_BC、B、BC、C，可以避免HIV核酸检测中漏检现象的发生；试剂盒的检测灵敏度可达35IU/mL，高于目前中国国内和国外厂家生产的试剂盒。而且，试剂盒采用的探针用量较少，可以降低试剂盒的生产成本。
本公开的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本公开而了解。本公开的其他优点可通过在说明书中所描述的方案来实现和获得。
具体实施方式
为使本公开的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下文中将对本公开的实施例进行详细说明。需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
本文中的实施方式可以以多个不同形式来实施。所属技术领域的普通技术人员可以很容易地理解一个事实，就是实现方式和内容可以在不脱离本公开的宗旨及其范围的条件下被变换为各种各样的形式。因此，本公开不应该被解释为仅限定在下面的实施方式所记载的内容中。在不冲突的情况下，本公开中的实施例及实施例中的特征可以相互任意组合。
目前的商品化试剂盒已被广泛应用，在大型三甲医院中多选择进口检测试剂盒，如罗氏、雅培等，中国国内商品化试剂盒的市场占有率相对较低，其主要原因在于检测结果不稳定、自动化程度低。导致此类问题的核心原因在于引物探针的设计不够全面合理，以及配套扩增体系不够完善。由于HIV 基因组存在高度变异的现象，导致引物探针设计时扩增区域不够保守(引物探针序列含有部分突变位点)、覆盖基因组不够全面，最终导致检测结果出现漏检或一些基因型别无法检出。另外一点在于没有筛选到更优的引物探针组合，导致不同引物探针组合存再相互干扰抑制，扩增曲线形态不标准、扩增效率低下，即灵敏度低(目前大部分试剂盒灵敏度≥50IU/mL，部分≥ 100IU/mL)，在实际的检测中无法对低载量的病毒进行确定。同时部分试剂盒的校准质控品采用灭活病毒或质粒，导致试剂盒存在潜在生物安全和质控结果不准确的问题。
本公开实施例提供一种人类免疫缺陷病毒1型核酸测定试剂盒，所述试剂盒包括针对下述保守区的三套引物和探针：Gag区、Pol区和Ltr区；其中，第一套引物和探针包括以下针对Gag-1和Gag-2的引物和探针中的任意一种：
(1)针对Gag-1的正向引物GagF1：TCCCTCARTCACTCTTTGGCA(SEQ ID NO：1)；反向引物GagR1：CCTCCAATTCCYCCTATCATT(SEQ ID NO： 2)；探针GagP1：FAM-TTAGAYACAGGAGCAGATGATACAGT-BHQ1(SEQ ID NO：3)；
(2)针对Gag-2的正向引物GagF2：CTTTGGATGGGNATGAACTC(SEQ ID NO：4)；反向引物GagR2：GTATATCATTGACAGTCCAGCT(SEQ ID NO： 5)；探针GagP2：FAM-ATCCTGACAAATGGACAGTTCAGCCTAT-BHQ1 (SEQ ID NO：6)；
第二套引物和探针包括以下针对Pol-1和Pol-2的引物和探针中的任意一种：
(3)针对Pol-1的正向引物PolF1： TTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGT(SEQ ID NO：7)；反向引物PolR1： TAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCT(SEQ ID NO：8)；探针PolP1： FAM-CCCCTGCACTGTACCCCCCAATC-BHQ1(SEQ ID NO：9)；
(4)针对Pol-2的正向引物PolF2： GAATATAGACATAATAGCAACAGACA(SEQ ID NO：10)；反向引物PolR2： ACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO：11)；探针PolP2： FAM-CGGGTTTATTACAGRGACAGCAGAGA-BHQ1(SEQ ID NO：12)；
第三套引物和探针包括以下针对Ltr-1和Ltr-2的引物和探针中的任意一种：
(5)针对Ltr-1的正向引物LtrF1：CCCTCAGATGCTGCATAWAAGCA (SEQ ID NO：13)；反向引物LtrR1：GTAGTGTGTGCCCGTCTGT(SEQ ID NO：14)；探针LtrP1：FAM-CCTGGGAGCTCTCTGGCTA-BHQ1(SEQ ID NO：15)；
(6)针对Ltr-2的正向引物LtrF2：ACAGACGGGCACACACTAC(SEQ ID NO：16)；反向引物LtrR2：CGGGCGCCACTGCTAGAGATTTTT(SEQ ID NO：17)；探针LtrP2： FAM-GTAGTGTGTGCCCGTCTGTGTGTGACTC-BHQ1(SEQ ID NO：18)。
在本公开的描述中，碱基“R”、“Y”、“N”、“W”均为简并碱基，其中，“R”代表A/G，“Y”代表C/T，“N”代表A/T/C/G，“W”代表 A/T。该定义的依据为《核苷酸和或氨基酸序列表和序列表电子文件标准》- 局长令第15号。
本公开实施例提供的人类免疫缺陷病毒1型核酸测定试剂盒，检测范围能够覆盖中国国内的主要基因型别01_AE、07_BC、08_BC、B、BC、C，可以避免HIV核酸检测中漏检现象的发生；试剂盒的检测灵敏度可达35IU/mL，高于目前中国国内和国外厂家生产的试剂盒。而且，试剂盒采用的探针用量较少，可以降低试剂盒的生产成本。
在本公开的实施例中，第一套引物和探针包括正向引物GagF1、反向引物GagR1、探针GagP1，第二套引物和探针包括正向引物PolF2、反向引物 PolR2、探针PolP2，第三套引物和探针包括正向引物LtrF1、反向引物LtrR1、探针LtrP1。
在本公开的实施例中，第一套引物和探针包括正向引物GagF1、反向引物GagR1、探针GagP1，第二套引物和探针包括正向引物PolF1、反向引物 PolR1、探针PolP1，第三套引物和探针包括正向引物LtrF1、反向引物LtrR1、探针LtrP1。
在本公开的实施例中，第一套引物和探针包括正向引物GagF1、反向引物GagR1、探针GagP1，第二套引物和探针包括正向引物PolF1、反向引物 PolR1、探针PolP1，第三套引物和探针包括正向引物LtrF2、反向引物LtrR2、探针LtrP2。
在本公开的实施例中，所述引物的Tm值在55℃至65℃范围内。
在本公开的实施例中，所述探针的Tm值在66℃至75℃范围内。
本公开实施例的引物和探针的Tm值如表1所示。
表1
在本公开的实施例中，所述试剂盒可以包括：PCR反应液、酶混合液、校准品、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标和阴性质控品。其中，PCR反应液和酶混合液组成所述试剂盒的反应体系。
在本公开的实施例中，所述PCR反应液可以包括：三羟甲基氨基甲烷(Trometamol,Tris)、氯化镁、氯化钾、dATP、dGTP，dCTP、dUTP、二硫苏糖醇(DL-Dithiothreitol,DTT)、甜菜碱、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide, DMSO)、蔗糖以及三套引物和探针。
在本公开的实施例中，在所述试剂盒的反应体系中，所述三羟甲基氨基甲烷的工作浓度可以为0.05M至2M，所述氯化镁的工作浓度可以为0.002M 至0.004M，所述氯化钾的工作浓度可以为0.02M至0.05M，所述dATP的工作浓度可以为0.8mM至2mM，所述dGTP的工作浓度可以为0.8mM至2mM，所述dCTP的工作浓度为0.8mM至2mM，所述dUTP的工作浓度可以为0.8mM 至2mM，所述二硫苏糖醇的工作浓度可以为0.1mM至0.4mM，所述甜菜碱的工作浓度可以为3mM至10mM，所述二甲基亚砜的工作浓度可以为0.1％至0.8％，所述蔗糖的工作浓度可以为0.2％至0.8％，三套引物和探针中的三个正向引物的工作浓度可以均为0.05μM至0.2μM，三套引物和探针中的三个反向引物的工作浓度可以均为0.05μM至0.2μM，三套引物和探针中的三个探针的工作浓度可以均为0.025μM至0.1μM。
在本公开的实施例中，所述酶混合液可以包括：Taq酶、逆转录酶、牛血清白蛋白、海藻糖以及RNAse抑制剂。
在本公开的实施例中，在所述试剂盒的反应体系中，所述Taq酶的工作浓度可以为0.03U/μL至0.0625U/μL，所述逆转录酶的工作浓度可以为0.05 U/μL至0.1U/μL，所述牛血清白蛋白的工作浓度可以为0.0001％至0.00025％，所述海藻糖的工作浓度可以为0.05％至0.15％，所述RNAse抑制剂的工作浓度可以为0.05U/μL至0.112U/μL。
在本公开的描述中，以“％”表示的工作浓度指物料的质量与试剂盒的整个反应体系的体积之比，即质量体积比，其单位可以为g/mL。
在本公开的实施例中，所述校准品可以有4个。
本公开实施例提供的人类免疫缺陷病毒1型核酸测定试剂盒可以选择模拟假病毒颗粒作为配套使用校准品、质控品，不存在生物安全性问题且可稳定保存。
本公开实施例还提供如上所述的人类免疫缺陷病毒1型核酸测定试剂盒的操作方法，所述操作方法包括：
S1：提取待测样品、校准品、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标、阴性质控品的RNA；
S2：将所述PCR反应液与所述酶混合液混合并分装至检测管中，将步骤 S1提取到的RNA加入检测管中，离心；
S3：将经过步骤S2离心后的检测管放入荧光PCR仪中进行PCR反应和扩增；
S4：完成步骤S3的PCR反应后，设定基线和阈值，绘制标准曲线并对待测样本进行定量或定性分析；
S5：结果质量控制。
在本公开的实施例中，所述PCR反应和扩增包括逆转录过程、预变性过程、变性过程、退火延伸过程以及仪器冷却过程。
在本公开的实施例中，所述逆转录过程的温度可以为50℃至60℃，例如可以为50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、 60℃；时间可以为10min至20min，例如可以为10min、11min、12min、13min、 14min、15min、16min、17min、18min、19min、20min；循环数为1。
在本公开的实施例中，所述预变性过程的温度可以为93℃至96℃，例如可以为93℃、94℃、95℃、96℃；时间可以为1min至5min，例如可以为1min、 2min、3min、4min、5min；循环数为1。
在本公开的实施例中，所述变性过程的温度可以为93℃至96℃，例如可以为93℃、94℃、95℃、96℃；时间可以为10s至20s，例如可以为10s、11s、 12s、13s、14s、15s、16s、17s、18s、19s、20s；循环数为1；
所述退火延伸过程的温度可以为58℃至62℃，例如可以为58℃、59℃、 60℃、61℃、62℃；时间可以为20s至35s，例如可以为20s、21s、22s、23s、 24s、25s、26s、27s、28s、29s、30s、31s、32s、33s、34s、35s；
所述变性过程和所述退火延伸过程的循环数可以为42至45，例如可以为 42、43、44、45。
在本公开的实施例中，所述仪器冷却的温度可以为40℃；时间可以为5s 至15s，例如可以为5s、6s、7s、8s、9s、10s、11s、12s、13s、14s、15s；循环数为1。
在本公开的实施例中，所述结果质量控制可以包括：阴性质控品的FAM 通道无Ct值，阴性质控品的VIC通道Ct值≤38；强阳性质控品的浓度在1×104 IU/mL至1×105IU/mL范围内，弱阳性质控品检测为阳性；校准品1至4的扩增曲线呈典型“S”型，绘制标准曲线R2≥0.98。
在本公开的实施例中，所述操作方法还可以包括测定结果判断：
采用试剂盒分析得到的待测样品的浓度记为C，
若待测样品的VIC通道Ct值≤38且FAM通道无Ct值，则判定为阴性；
若1×102IU/mL≤C≤1×108IU/mL，直接报告定量结果；
若5×101IU/mL≤C＜1×102IU/mL，则判定为阳性，但定量结果仅供参考；
若C＜5×101U/mL且阴性质控品的VIC通道Ct值≤38，报告低于检测下限；
若待测样品的VIC通道Ct值＞38或无Ct值，则检测结果无效，须复测。
以下实施例中采用的荧光定量PCR仪购买自Thermofisher，型号为 ABI7500。
HIV国家标准品为来自中国食品药品检定研究院的人类免疫缺陷病毒1 型(HIV-1)RNA标准品，批号为220021-20160101。
1、校准品1至4、强阳性质控品和弱阳性质控品的制备过程：
基本原料为“含HIV基因片段的MS2假病毒颗粒(armored RNA)”、“阴性血浆”，利用阴性血浆将已标化的假病毒颗粒以10倍梯度进行梯度稀释，得到不同浓度的样本，即上述校准品1至4、强阳性质控品、弱阳性质控品，同时对上述校准品浓度溯源至国家标准品；
2、内标的制备过程：利用阴性血浆对含人GAPDH基因的MS2假病毒颗粒以10倍梯度进行梯度稀释获得；
3、阴性质控品的制备过程：为含有一定比例防腐剂的阴性血浆；
上述所用阴性血浆经抗-HCV、抗HIV1/2、HBsAg检测均为阴性，保证其生物安全性；
上述制备过程参照国家食品药品监督管理总局办法的《丙型肝炎病毒核糖核酸测定试剂技术审查指导原则》的相关规定进行。
实施例1
1、试剂盒的组成
本实施例的用于定量测定人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)载量的试剂盒，包含PCR反应液、酶混合液、校准品1至4、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标和阴性质控品；
其中，PCR反应液包括三羟甲基氨基甲烷Tris、氯化镁、氯化钾、dATP、 dGTP，dCTP、dUTP、二硫苏糖醇DTT、甜菜碱、二甲基亚砜DMSO、蔗糖、正向引物1至3、反向引物1至3以及探针1至3；
酶混合液包括：Taq酶、逆转录酶、牛血清白蛋白、海藻糖以及RNAse 抑制剂；
上述各物料在体系中的工作浓度如表2所示。
表2
2、试剂盒的操作方法包括：
采用已知的高浓度HIV国家标准品作为待测样品验证本公开实施例的试剂盒的性能；
S1：采用阴性血浆将HIV国家标准品依次稀释至1×104IU/mL、1×103 IU/mL、1×102IU/mL、50IU/mL、35IU/mL，利用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取上述稀释后的不同浓度的HIV国家标准品、校准品1至4、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标、阴性质控品的核酸RNA；
S2：量取18μL PCR反应液和2μL酶混合液混合在一起，将混合后的反应试剂分装至八联管内，并取20μL步骤S1提取到的核酸RNA加入相应八联管内，盖好盖子进行瞬时离心，接着将八联管放入荧光定量PCR仪内；
S3：设置荧光定量PCR仪的参数，包括设置PCR反应和扩增的条件为： 55℃逆转录15min，1个循环；95℃预变性3min，1个循环；95℃变性15s、 60℃退火延伸30s(收集荧光信号)，45个循环；40℃仪器冷却10s，1个循环；
S4：反应完成，自动完成基线和阈值的设定，绘制标准曲线并对待测样品进行定量/定性分析；
S5：结果质量控制：阴性质控品的FAM通道无Ct值，阴性质控品的VIC 通道Ct值≤38；强阳性质控品的浓度在1×104IU/mL至1×105IU/mL范围内，弱阳性质控品检测为阳性；校准品1至4的扩增曲线呈典型“S”型，绘制标准曲线R2≥0.98。
测定结果判断包括：
采用所述试剂盒分析得到的待测样品的浓度记为C，
若待测样品的VIC通道Ct值≤38且FAM通道无Ct值，则判定为阴性；
若1×102IU/mL≤C≤1×108IU/mL，直接报告定量结果；
若5×101IU/mL≤C＜1×102IU/mL，则判定为阳性，但定量结果仅供参考；
若C＜5×101U/mL且阴性质控品的VIC通道Ct值≤38，报告低于检测下限；
若待测样品的VIC通道Ct值＞38或无Ct值，则检测结果无效，须复测。
3、测定结果
本实施例的试剂盒的测定结果如表3所示。
表3
注：表格中的“/”表示无Ct值。
可以看出，质量控制符合上述要求，样本浓度为35IU/mL时就可以达到 100％的阳性检出率；而且在同一浓度下的多个样本的Ct值比较接近，说明本实施例的试剂盒的检测结果比较稳定。
另外，本实施例的试剂盒中的探针的浓度为引物的浓度的1/2，即探针的用量为引物用量的1/2，试剂盒的成本较低。
实施例2
1、试剂盒的组成
本实施例的用于定量测定人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)载量的试剂盒，包含PCR反应液、酶混合液、校准品1至4、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标和阴性质控品；
其中，PCR反应液包括三羟甲基氨基甲烷Tris、氯化镁、氯化钾、dATP、 dGTP，dCTP、dUTP、二硫苏糖醇DTT、甜菜碱、二甲基亚砜DMSO、蔗糖、正向引物1至3、反向引物1至3以及探针1至3；
酶混合液包括：Taq酶、逆转录酶、牛血清白蛋白、海藻糖以及RNAse 抑制剂；
上述各物料在体系中的工作浓度如表4所示。
表4
2、试剂盒的操作方法包括：
采用已知的高浓度HIV国家标准品作为待测样品验证本公开实施例的试剂盒的性能；
S1：采用阴性血浆将HIV国家标准品依次稀释至1×104IU/mL、1×103 IU/mL、1×102IU/mL、50IU/mL、35IU/mL，利用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取上述稀释后的不同浓度的HIV国家标准品、校准品1至4、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标、阴性质控品的核酸RNA；
S2：量取18μL PCR反应液和2μL酶混合液混合在一起，将混合后的反应试剂分装至八联管内，并取20μL步骤S1提取到的核酸RNA加入相应八联管内，盖好盖子进行瞬时离心，接着将八联管放入荧光定量PCR仪内；
S3：设置荧光定量PCR仪的参数，包括设置PCR反应和扩增的条件为： 55℃逆转录13min，1个循环；95℃预变性2min，1个循环；95℃变性10s、 58℃退火延伸35s(收集荧光信号)，45个循环；40℃仪器冷却10s，1个循环；
S4：反应完成，自动完成基线和阈值的设定，绘制标准曲线并对待测样品进行定量/定性分析；
S5：结果质量控制：阴性质控品的FAM通道无Ct值，阴性质控品的VIC 通道Ct值≤38；强阳性质控品的浓度在1×104IU/mL至1×105IU/mL范围内，弱阳性质控品检测为阳性；校准品1至4的扩增曲线呈典型“S”型，绘制标准曲线R2≥0.98。
测定结果判断包括：
采用所述试剂盒分析得到的待测样品的浓度记为C，
若待测样品的VIC通道Ct值≤38且FAM通道无Ct值，则判定为阴性；
若1×102IU/mL≤C≤1×108IU/mL，直接报告定量结果；
若5×101IU/mL≤C＜1×102IU/mL，则判定为阳性，但定量结果仅供参考；
若C＜5×101U/mL且阴性质控品的VIC通道Ct值≤38，报告低于检测下限；
若待测样品的VIC通道Ct值＞38或无Ct值，则检测结果无效，须复测。
3、测定结果
本实施例的试剂盒的测定结果如表5所示。
表5
注：表格中的“/”表示无Ct值。
可以看出，质量控制符合上述要求，样本浓度为35IU/mL时就可以达到 100％的阳性检出率；而且在同一浓度下的多个样本的Ct值比较接近，说明本实施例的试剂盒的检测结果比较稳定。另外，本实施例的试剂盒中的探针的浓度为引物的浓度的1/2，即探针的用量为引物用量的1/2，试剂盒的成本较低。
实施例3
1、试剂盒的组成
本实施例的用于定量测定人类免疫缺陷病毒I型(HIV-1)载量的试剂盒，包含PCR反应液、酶混合液、校准品1至4、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标和阴性质控品；
其中，PCR反应液包括三羟甲基氨基甲烷Tris、氯化镁、氯化钾、dATP、 dGTP，dCTP、dUTP、二硫苏糖醇DTT、甜菜碱、二甲基亚砜DMSO、蔗糖、正向引物1至3、反向引物1至3以及探针1至3；
酶混合液包括：Taq酶、逆转录酶、牛血清白蛋白、海藻糖以及RNAse 抑制剂；
上述各物料在体系中的工作浓度如表6所示。
表6
2、试剂盒的操作方法包括：
采用已知的高浓度HIV国家标准品作为待测样品验证本公开实施例的试剂盒的性能；
S1：采用阴性血浆将HIV国家标准品依次稀释至1×104IU/mL、1×103 IU/mL、1×102IU/mL、50IU/mL、35IU/mL，利用QIAamp Viral RNA Mini Kit 提取上述稀释后的不同浓度的HIV国家标准品、校准品1至4、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标、阴性质控品的核酸RNA；
S2：量取18μL PCR反应液和2μL酶混合液混合在一起，将混合后的反应试剂分装至八联管内，并取20μL步骤S1提取到的核酸RNA加入相应八联管内，盖好盖子进行瞬时离心，接着将八联管放入荧光定量PCR仪内；
S3：设置荧光定量PCR仪的参数，包括设置PCR反应和扩增的条件为： 55℃逆转录20min，1个循环；95℃预变性3min，1个循环；95℃变性10s、 60℃退火延伸35s(收集荧光信号)，45个循环；40℃仪器冷却10s，1个循环；
S4：反应完成，自动完成基线和阈值的设定，绘制标准曲线并对待测样品进行定量/定性分析；
S5：结果质量控制：阴性质控品的FAM通道无Ct值，阴性质控品的VIC 通道Ct值≤38；强阳性质控品的浓度在1×104IU/mL至1×105IU/mL范围内，弱阳性质控品检测为阳性；校准品1至4的扩增曲线呈典型“S”型，绘制标准曲线R2≥0.98。
测定结果判断包括：
采用所述试剂盒分析得到的待测样品的浓度记为C，
若待测样品的VIC通道Ct值≤38且FAM通道无Ct值，则判定为阴性；
若1×102IU/mL≤C≤1×108IU/mL，直接报告定量结果；
若5×101IU/mL≤C＜1×102IU/mL，则判定为阳性，但定量结果仅供参考；
若C＜5×101U/mL且阴性质控品的VIC通道Ct值≤38，报告低于检测下限；
若待测样品的VIC通道Ct值＞38或无Ct值，则检测结果无效，须复测。
3、测定结果
本实施例的试剂盒的测定结果如表7所示。
表7
注：表格中的“/”表示无Ct值。
可以看出，质量控制符合上述要求，样本浓度为35IU/mL时就可以达到 100％的阳性检出率；而且在同一浓度下的多个样本的Ct值比较接近，说明本实施例的试剂盒的检测结果比较稳定。另外，本实施例的试剂盒中的探针的浓度为引物的浓度的1/2，即探针的用量为引物用量的1/2，试剂盒的成本较低。
实施例4
本实施例采用实施例1的试剂盒和操作方法检测含有01_AE、07_BC、 08_BC、B、BC、C等型别的质粒DNA，包括：
S1：分别将01_AE、07_BC、08_BC、B、BC、C质粒DNA稀释至1000copies，等比例混合在一起；
S2：量取18μL实施例1的PCR反应液和2μL实施例1的酶混合液混合在一起，将混合后的反应试剂分装至八联管内，并取20μL步骤S1得到的质粒DNA混合物加入相应八联管内，盖好盖子进行瞬时离心，接着将八联管放入荧光定量PCR仪内；
后续步骤与实施例1的操作方法相同。
检测结果如表8所示。
表8
可以看出，根据本公开实施例的试剂盒的结果判定标准，含有01_AE、 07_BC、08_BC、B、BC、C型别的质粒DNA的检测结果均为阳性，即都可以检测出结果，说明本公开实施例的试剂盒的可检测范围覆盖中国国内主要的HIV型别01_AE、07_BC、08_BC、B、BC、C。
虽然本公开所揭露的实施方式如上，但所述的内容仅为便于理解本公开而采用的实施方式，并非用以限定本公开。任何所属领域内的技术人员，在不脱离本公开所揭露的精神和范围的前提下，可以在实施的形式及细节上进行任何的修改与变化，但本公开的专利保护范围，仍须以所附的权利要求书所界定的范围为准。
序列表
<110> 京东方科技集团股份有限公司
成都京东方光电科技有限公司
<120> 一种人类免疫缺陷病毒1型核酸测定试剂盒及其操作方法
<130> 012130215
<160> 18
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)
<223> r = g或a
<400> 1
tccctcartc actctttggc a 21
<210> 2
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> y = c或t
<400> 2
cctccaattc cycctatcat t 21
<210> 3
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)
<223> y = c或t
<400> 3
ttagayacag gagcagatga tacagt 26
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (12)
<223> n = a或t或c或g
<400> 4
ctttggatgg gnatgaactc 20
<210> 5
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
gtatatcatt gacagtccag ct 22
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
atcctgacaa atggacagtt cagcctat 28
<210> 7
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
ttaagacagc agtacaaatg gcagt 25
<210> 8
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
tagtttgtat gtctgttgct attatgtct 29
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
cccctgcact gtacccccca atc 23
<210> 10
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
gaatatagac ataatagcaa cagaca 26
<210> 11
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
actactgccc cttcaccttt cca 23
<210> 12
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)
<223> r = g或a
<400> 12
cgggtttatt acagrgacag cagaga 26
<210> 13
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)
<223> w = a或t
<400> 13
ccctcagatg ctgcatawaa gca 23
<210> 14
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
gtagtgtgtg cccgtctgt 19
<210> 15
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
cctgggagct ctctggcta 19
<210> 16
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
acagacgggc acacactac 19
<210> 17
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
cgggcgccac tgctagagat tttt 24
<210> 18
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
gtagtgtgtg cccgtctgtg tgtgactc 28
Claims (16)
1.一种人类免疫缺陷病毒1型核酸测定试剂盒，其特征在于，包括针对下述保守区的三套引物和探针：Gag区、Pol区和Ltr区；
其中，第一套引物和探针包括以下针对Gag-1和Gag-2的引物和探针中的任意一种：
(1)针对Gag-1的正向引物GagF1：TCCCTCARTCACTCTTTGGCA(SEQ ID NO：1)；反向引物GagR1：CCTCCAATTCCYCCTATCATT(SEQ ID NO：2)；探针GagP1：FAM-TTAGAYACAGGAGCAGATGATACAGT-BHQ1(SEQ ID NO：3)；
(2)针对Gag-2的正向引物GagF2：CTTTGGATGGGNATGAACTC(SEQ ID NO：4)；反向引物GagR2：GTATATCATTGACAGTCCAGCT(SEQ ID NO：5)；探针GagP2：FAM-ATCCTGACAAATGGACAGTTCAGCCTAT-BHQ1(SEQ ID NO：6)；
第二套引物和探针包括以下针对Pol-1和Pol-2的引物和探针中的任意一种：
(3)针对Pol-1的正向引物PolF1：TTAAGACAGCAGTACAAATGGCAGT(SEQ ID NO：7)；反向引物PolR1：TAGTTTGTATGTCTGTTGCTATTATGTCT(SEQ ID NO：8)；探针PolP1：FAM-CCCCTGCACTGTACCCCCCAATC-BHQ1(SEQ ID NO：9)；
(4)针对Pol-2的正向引物PolF2：GAATATAGACATAATAGCAACAGACA(SEQ ID NO：10)；反向引物PolR2：ACTACTGCCCCTTCACCTTTCCA(SEQ ID NO：11)；探针PolP2：FAM-CGGGTTTATTACAGRGACAGCAGAGA-BHQ1(SEQ ID NO：12)；
第三套引物和探针包括以下针对Ltr-1和Ltr-2的引物和探针中的任意一种：
(5)针对Ltr-1的正向引物LtrF1：CCCTCAGATGCTGCATAWAAGCA(SEQ ID NO：13)；反向引物LtrR1：GTAGTGTGTGCCCGTCTGT(SEQ ID NO：14)；探针LtrP1：FAM-CCTGGGAGCTCTCTGGCTA-BHQ1(SEQ ID NO：15)；
(6)针对Ltr-2的正向引物LtrF2：ACAGACGGGCACACACTAC(SEQ ID NO：16)；反向引物LtrR2：CGGGCGCCACTGCTAGAGATTTTT(SEQ ID NO：17)；探针LtrP2：FAM-GTAGTGTGTGCCCGTCTGTGTGTGACTC-BHQ1(SEQ ID NO：18)。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，第一套引物和探针包括正向引物GagF1、反向引物GagR1、探针GagP1，第二套引物和探针包括正向引物PolF2、反向引物PolR2、探针PolP2，第三套引物和探针包括正向引物LtrF1、反向引物LtrR1、探针LtrP1；或者，
第一套引物和探针包括正向引物GagF1、反向引物GagR1、探针GagP1，第二套引物和探针包括正向引物PolF1、反向引物PolR1、探针PolP1，第三套引物和探针包括正向引物LtrF1、反向引物LtrR1、探针LtrP1；或者，
第一套引物和探针包括正向引物GagF1、反向引物GagR1、探针GagP1，第二套引物和探针包括正向引物PolF1、反向引物PolR1、探针PolP1，第三套引物和探针包括正向引物LtrF2、反向引物LtrR2、探针LtrP2。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述引物的Tm值在55℃至65℃范围内。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述探针的Tm值在66℃至75℃范围内。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的试剂盒，其特征在于，包括：PCR反应液、酶混合液、校准品、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标和阴性质控品。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述PCR反应液包括：三羟甲基氨基甲烷、氯化镁、氯化钾、dATP、dGTP，dCTP、dUTP、二硫苏糖醇、甜菜碱、二甲基亚砜、蔗糖以及三套引物和探针。
7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒的反应体系中，所述三羟甲基氨基甲烷的工作浓度为0.05M至2M，所述氯化镁的工作浓度为0.002M至0.004M，所述氯化钾的工作浓度为0.02M至0.05M，所述dATP的工作浓度为0.8mM至2mM，所述dGTP的工作浓度为0.8mM至2mM，所述dCTP的工作浓度为0.8mM至2mM，所述dUTP的工作浓度为0.8mM至2mM，所述二硫苏糖醇的工作浓度为0.1mM至0.4mM，所述甜菜碱的工作浓度为3mM至10mM，所述二甲基亚砜的工作浓度为0.1％至0.8％，所述蔗糖的工作浓度为0.2％至0.8％，三套引物和探针中的三个正向引物的工作浓度均为0.05μM至0.2μM，三套引物和探针中的三个反向引物的工作浓度均为0.05μM至0.2μM，三套引物和探针中的三个探针的工作浓度均为0.025μM至0.1μM。
8.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述酶混合液包括：Taq酶、逆转录酶、牛血清白蛋白、海藻糖以及RNAse抑制剂。
9.根据权利要求8所述的试剂盒，其特征在于，在所述试剂盒的反应体系中，所述Taq酶的工作浓度为0.03U/μL至0.0625U/μL，所述逆转录酶的工作浓度为0.05U/μL至0.1U/μL，所述牛血清白蛋白的工作浓度为0.0001％至0.00025％，所述海藻糖的工作浓度为0.05％至0.15％，所述RNAse抑制剂的工作浓度为0.05U/μL至0.112U/μL。
10.根据权利要求5至9中任一项所述的试剂盒的操作方法，其特征在于，包括：
S1：提取待测样品、校准品、强阳性质控品、弱阳性质控品、内标、阴性质控品的RNA；
S2：将所述PCR反应液与所述酶混合液混合并分装至检测管中，将步骤S1提取到的RNA加入检测管中，离心；
S3：将经过步骤S2离心后的检测管放入荧光PCR仪中进行PCR反应和扩增；
S4：完成步骤S3的PCR反应后，设定基线和阈值，绘制标准曲线并对待测样本进行定量或定性分析；
S5：结果质量控制。
11.根据权利要求10所述的操作方法，其特征在于，所述PCR反应和扩增包括逆转录过程、预变性过程、变性过程、退火延伸过程以及仪器冷却过程；
其中，所述逆转录过程的温度为50℃至60℃，时间为10min至20min，循环数为1。
12.根据权利要求11所述的操作方法，其特征在于，所述预变性过程的温度为93℃至96℃，时间为1min至5min，循环数为1。
13.根据权利要求11所述的操作方法，其特征在于，所述变性过程的温度为93℃至96℃，时间为10s至20s；
所述退火延伸过程的温度为58℃至62℃，时间为20s至35s；
所述变性过程和所述退火延伸过程的循环数为42至45。
14.根据权利要求11所述的操作方法，其特征在于，所述仪器冷却过程的温度为40℃，时间为5s至15s，循环数为1。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的操作方法，其特征在于，所述结果质量控制包括：阴性质控品的FAM通道无Ct值，阴性质控品的VIC通道Ct值≤38；强阳性质控品的浓度在1×104IU/mL至1×105IU/mL范围内，弱阳性质控品检测为阳性；校准品1至4的扩增曲线呈典型“S”型，绘制标准曲线R2≥0.98。
16.根据权利要求15所述的操作方法，其特征在于，还可以包括测定结果判断：
采用所述试剂盒分析得到的待测样品的浓度记为C，
若待测样品的VIC通道Ct值≤38且FAM通道无Ct值，则判定为阴性；
若1×102IU/mL≤C≤1×108IU/mL，直接报告定量结果；
若5×101IU/mL≤C＜1×102IU/mL，则判定为阳性，但定量结果仅供参考；
若C＜5×101U/mL且阴性质控品的VIC通道Ct值≤38，报告低于检测下限；
若待测样品的VIC通道Ct值＞38或无Ct值，则检测结果无效，须复测。
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