CN104846116B - 检测人类免疫缺陷病毒1型的pcr引物组、探针及其试剂盒和检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法，该试剂盒含有高敏感度的引物组和探针，设计多重循环并提到引物退火温度，达到极高的灵敏度和特异性，最低检出限可达每个反应可检测2拷贝HIV‑1 DNA/百万细胞，比目前其它检测方法更加灵敏。而且本发明的检测方法且加入细胞定量体系，可在同一反应中同时对HIV‑1 DNA及细胞数进行定量。本发明的试剂盒中还加入制备简单、稳定，溯源可靠的定量标准品，可解决目前HIV DNA定量溯源性问题。本发明可应用于HIV感染早期检测，新生儿或高危人群HIV感染筛查，HIV‑1病毒储存库检测，抗病毒药物治疗疗效评估，病情复发控制及彻底治愈标准建立等，其方法操作简单，成本低，具有广泛的临床应用作用，有利于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于病毒检测领域，涉及一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR引物组、探针及其试剂盒和检测方法。
背景技术
艾滋病即获得性免疫缺陷综合征(acquired immunodeficiency syndrome,AIDS)，是一种慢性致死性传染病，由人类免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)引起，分为人类免疫缺陷病毒1型（HIV-1）和人类免疫缺陷病毒2型（HIV-2），HIV-1是目前全球包括中国在内流行的主要毒株， HIV-2型目前只在西非流行。HIV感染后导致人体免疫机能缺陷，从而发生机会性感染和肿瘤等一系列临床综合征，病死率几乎达100%。根据2011年数据，艾滋病已经波及全球200多个国家和地区,感染者总数已超过6000万，2000万人死于艾滋病。由于该病潜伏期长、隐蔽性强、传播途径多样化、病死率高，目前既无能治愈的药物也无有效的疫苗预防，给防治工作带来了严重困难。
我国目前处于HIV/AIDS广泛流行期，政府采取了一系列坚决的措施，已经有效地控制了非法采供血行为，用血安全性得到最大限度的保障，但是经静脉注射吸毒和经性传播HIV的势头并未得到很好的控制，尤其是性传播已成为主要传播方式，而且在一些地区已出现HIV感染者的第二代传播(母婴传播、家庭内性传播等)，对全国HIV/AIDS的流行蔓延无疑起到推波助澜之作用。按照国家2014年最新颁布的治疗标准，其中超过8成需要立即开展和持续终生高效抗逆转录病毒治疗(Highly active antiretroviral therapy，HAART)，在公卫、临床、立法、治安等多方面均形成严重挑战。扩大HIV检测和抗病毒治疗，早诊早治，降低新发数和病死率，是我国“十二五”以来艾滋病整体防控的战略目标。
目前国内外HIV检测主要存在以下问题：
（1）“窗口期”（指感染后到体内产生抗体、并达到检出水平之间这段时间，期间具有感染性但抗体检测为阴性，受不同检测方法和个体差异影响）及早期诊断。HIV 感染后确定感染的病毒标志物依次出现的顺序为：病毒核酸（RNA与前病毒DNA） 、病毒蛋白（如ｐ24抗原）、病毒抗体。目前，国内外HIV 常规检测主要还是抗体血清学检测（ELISA、WB）。此技术已建立20 余年，成熟可靠，然而一直受所谓“窗口期”问题的困扰，“窗口期”一般在40天以上。核酸检测方面，由于病毒标志物出现更早，在窗口期前移上具有抗体检测技术不可比拟的优势。但受灵敏度限制，目前外周血血清HIV RNA检测（目前国内外已上市的病毒载量检测试剂盒检出限在20~200拷贝/mL之间）仍有11天左右窗口期。
虽然HIV-1是逆转录病毒，具有传染力的病毒子是RNA，但是HIV进入人体后，会进入到CD4+ T细胞，靠自身的逆转录酶逆转录为DNA，也就是通常所说的前病毒，然后整合到细胞的基因组中，从而感染T细胞。目前国内已上市的HIV-1核酸检测试剂盒是通过检测血里面的HIV RNA浓度来诊断是否艾滋病感染。在早期感染或正在进行抗艾滋病治疗的患者中，游离病毒子很少，而且病毒RNA在提取过程中容易降解，这类试剂盒难以检测到。但是细胞中还是有整合的HIV病毒基因，一旦人的免疫能力下降或者未及时用药，这些整合的病毒子就会开始复制，使病情发展。
（2）病毒储存库检测。临床对HIV抗病毒治疗的结果评价分为“彻底治愈”和“功能性治愈”。前者要求实现长期不进行任何抗病毒治疗，体内仍检测不到HIV核酸；后者效果类似病毒精英控制者，体内仍可检测到低水平的HIV-1 RNA和/或DNA，但长期免于HIV相关疾患的损害。后续的研究发现，接受HAART治疗患者体内其实一直存在着另一种潜伏形式的HIV-1，即所谓病毒储存库。chun等1997年首次发现了整合在静止的记忆性CD4+T淋巴细胞中的病毒储存库，其中小部分含有整合的HIV DNA，可以在某种刺激下重新开始复制-组装病毒。这些潜伏的感染细胞十分稳定，因此病毒储存库已被广泛认为是HAART无法从患者体内清除HIV的主要原因和艾滋病治愈的最大障碍。
近年来病毒储存库相关主要检测技术包括：① QVOA（Quantitative viraloutgrowth assay），又名IUPM（Infectious Units Per Million)分析，由Siliciano和Siliciano 2005年建立。该方法对人员和设备要求较高，价格昂贵，样本需求量大（120-180mL血液），费时费力，且结果准确性影响因素众多，检出率偏低，也不适用于组织活检。②CD4+T淋巴细胞计数，多采用CD4/8/3流式仪检测，但没有证据表明能直接反映HIV病毒储存库的变化，有无一定相关性尚待进一步求证。③ RNA检测。如上述，由于HAART能够非常有效地控制患者血浆HIV-1 RNA含量，甚至将其降低至临床常规检测的低限（20-50拷贝/mL）以下，而且RNA检测对设备、人员及标本提取要求较高，因此其无法应用于病毒储存库检测。
（3）新生儿HIV感染的诊断。HIV感染的母亲其婴儿由于母体抗体的存在，用抗体检测法通常为阳性。但实际上只有20%～60%的婴儿可在母亲的子宫里、在分娩和引产或通过产后哺乳时从其母体感染HIV。新生儿血清阳性者并不能说明是HIV感染。因为母体HIV抗体可持续大约15个月之久，在一般情况下，婴儿并不表现出HIV感染的任何症状。病毒细胞培养法对婴儿并不是一种可靠实用的方法；HIV特异IgM抗体的检测在母体抗体存在下也是不可能的，在过量血清抗体存在下检出血清中的HIV抗原也十分困难。对这些婴儿用可靠的核酸方法进行HIV感染的早期诊断是十分重要的。另外，婴幼儿被HIV感染后病情发展较快，早期诊断对及时采取治疗措施，延缓阻止病情发展极为重要。
综上所述，传统的HIV检测方法，受限于“窗口期”、耗时、花费及标本要求高以及检测灵敏度低等特点，亟需开发一种高敏感的HIV DNA检测方法。目前国内外鲜见有HIV DNA检测试剂盒，有文章报道的HIV DNA PCR检测方法灵敏度均在每百万细胞检测到10拷贝HIVDNA或以上。
发明内容
为了解决上述问题，本发明通过大量实验研究筛选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，及特定的PCR反应程序和条件，构建了高敏感HIV-1 DNA PCR检测试剂盒及检测方法，最低检测限可达每个反应可检测2拷贝HIV-1 DNA/百万细胞。
本发明的目的在于提供检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR引物。
本发明的另一目的在于提供一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒。
本发明的再一目的在于提供一种检测检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测方法。
本发明所采取的技术方案是：
检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR引物组，该引物组为引物组1或引物组2或引物组3，其中，
引物组1由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6组成；
引物组2由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成；
引物组3由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14组成。
检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测探针，其序列为：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ IDNO:22；或者为该些序列的核苷酸互补序列。
进一步的，上述探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。
一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒，该试剂盒含有至少一组上述所述的引物组。
进一步的，上述试剂盒还含有检测探针；具体探针情况如下：
当试剂盒中含有引物组1时，该试剂盒就还含有探针SEQ ID NO:15或其核苷酸互补序列；
当试剂盒中含有引物组2时，该试剂盒中就还含有探针SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针；
当试剂盒中含有引物组3时，该试剂盒中就还含有探针SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针。
进一步的，上述试剂盒还含有细胞定量引物组和细胞定量探针，所述细胞定量引物组由SEQ ID NO:23 、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成；所述探针为含SEQ ID NO:27或者为其核苷酸互补序列；
细胞定量探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于上述检测目的基因探针的荧光基团。
进一步的，上述试剂盒还含有：强阳性对照品、弱阳性对照品、阴性对照品、阳性定量参考品和含有Taq酶与UNG酶的酶系。
进一步的，上述阳性定量参考品为8E5或Ach2细胞株基因组，用于同时对HIV DNA及细胞数定量。
一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）DNA提取：
取待测全血样本、阴性质控品、弱阳性质控品、强阳性质控品、阳性定量参考品各200μl，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取试剂盒，按说明书操作，分提取各组样品的DNA作为模板；
2）PCR反应体系：
PCR反应液 29.2μL；
酶系 0.8μL；
DNA模板 20μL；
3）PCR反应程序：
以ABI7500为例，第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃15 秒， 62~68 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 5~8 个循环；第四步： 95 ℃ 15 秒， 62~65 ℃ 15秒，72℃ 20秒， 5~8 个循环； 第五步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时采集荧光；
4）结果分析：
反应结束后自动保存结果，对HIV-1 DNA的扩增曲线和相应细胞扩增的曲线进行分别分析；点击Analyze进行分析，使Std Curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即Correlation数值介于-1.0~-0.98，然后到Plate窗口下记录定量结果；
细胞中HIV-1 DNA含量结果计算：
同一份标本中，用2条标准曲线定量的HIV-1 DNA定量值除以细胞定量值，得出标本中每个细胞中HIV-1 DNA含量。
进一步的，在上述整个检测过程中，需保证各样品满足以下质量要求：
① 阴性质控品：HIV-1 DNA扩增曲线无CT值显示；
② 弱阳性参考品：检测值介于0.00005~0.005copies/cell；
③ 强阳性参考品：检测值介于0. 05~0.5copies/cell；
④ 阳性定量参考品的结果均为阳性，Ct值＜30，且2条标准曲线线性相关系数0.98 ≤ r ≤ 1；
以上要求需要在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
本发明的有益效果是：
1）本发明的高敏感HIV-1 DNA PCR检测试剂盒最低检出限可达每个反应可检测2拷贝HIV-1 DNA/百万细胞；
2）本发明技术开发的高敏感HIV-1 DNA PCR检测试剂盒及其检测方法的检测方法可以同时对HIV-1 DNA及细胞数定量；
3）本发明技术开发的高敏感HIV-1 PCR检测试剂盒及其检测方法由于高敏感等特性，其临床应用广泛，可用于：①HIV-1感染早期检测；②新生儿或高危人群HIV感染筛查；③HIV-1病毒储存库检测；④抗病毒药物治疗疗效评估、病情复发控制及彻底治愈标准建立。
4）在本发明的方法中，对传统荧光探针PCR进行创新，通过加入3对PCR引物，采用多个循环，并提高引物退火温度，使本发明的HIV-1 DNA PCR检测方法达到极高的灵敏度及特异性，其中最低检出限可达每个PCR中检测2拷贝/百万细胞。同时，本发明还在PCR反应中加入细胞定量反应体系，即可在同一个PCR反应中同时对HIV-1 DNA及细胞数进行定量（常规方法需要另外对细胞量进行计数）。再者，本发明方法采用8E5或Ach2细胞株梯度浓度基因组作为定量标准品，由于每个8E5或Ach2细胞中均只整合了一个HIV-1 DNA，因此可通过OD值定量测定标准品中8E5或Ach2基因组细胞数，即可得到定量标准品对应HIV-1 DNA拷贝数，解决了HIV-1 DNA定量溯源性问题，而且制备方法稳定可靠。
附图说明
图1 为本发明试剂标准曲线扩增图；
图2 为实施例4的特异性实验图；
图3 为实施例5的灵敏度实验图；
图4 为实施例5的线性定量回归曲线图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此
实施例1：检测人类免疫缺陷病毒1型DNA的PCR引物组
本发明前期通过引物设计原则并结合实际情况，设计出大量检测人类免疫缺陷病毒1型DNA的PCR引物，然后通过大量实验研究筛选出高灵敏和高特异性的引物序列和检测探针，最终选取检测人类免疫缺陷病毒1型DNA效果最佳的PCR引物组，其中包括3组，其核苷酸序列分别如下所示：
引物组1：
SEQ ID NO:1:TCTGGCTAACTAGGGAACCCACTGCT ；
SEQ ID NO:2：TGCGCGCTTCAAGCCGAGTCCTGCGT；
SEQ ID NO:3：AGGGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCT；
SEQ ID NO:4：AGCAAGCCGAGTCCTGCGTCGAGA ；
SEQ ID NO:5：AGCCTCAATAAAGCTTGCCT ；
SEQ ID NO:6：CCGCCACTGCTAGAGATTTTCCA；
对应引物组1的检测探针为：SEQ ID NO:15：TCTGGTAACTAGAGATCCCT或者为该序列的核苷酸互补序列。
引物组2：
SEQ ID NO:2：TGCGCGCTTCAAGCCGAGTCCTGCGT；
SEQ ID NO:7：GGTTAGACCAGATCTGAGCCTGGGAGCT ；
SEQ ID NO:8：GGAACCCACTGCTTAAGCCTCAATAAAGCTTGC；
SEQ ID NO:9：TGTTCGGGCGCCACTGCTAGAGA；
SEQ ID NO:10：AAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA ；
SEQ ID NO:11：AGGGTCTGAGGGATCTCTAGTTACCAGAG；
对应引物组2的检测探针选自以下探针序列中的至少一种：
SEQ ID NO:16：TTCAAGTAGTGTGTGCCC ；
SEQ ID NO:17：AGTAGTGTGTGCCCGTCT；
SEQ ID NO:18：TAGTGTGTGCCCGTCTGT；
或者为该些序列的核苷酸互补序列；
引物组3：
SEQ ID NO:4：AGCAAGCCGAGTCCTGCGTCGAGA；
SEQ ID NO:6：CCGCCACTGCTAGAGATTTTCCA；
SEQ ID NO:10：AAGCCTCAATAAAGCTTGCCTTGA；
SEQ ID NO:12：ACCAGATCTGAGCCTGGGAGCT ；
SEQ ID NO:13：GCTAACTAGGGAACCCACTGCT；
SEQ ID NO:14：TTCGGGCGCCACTGCTA；
对应引物组3的检测探针选自以下探针序列中的至少一种：
SEQ ID NO:19：TGTTGTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGA ；
SEQ ID NO:20：TGTTGTGTGTGACTCTGGTAACTA；
SEQ ID NO:21：TGTGTGTGACTCTGGTAACTAGAGA；
SEQ ID NO:22：TGTTGTGTGTGACTCTGGTAACTAG；
或者为该些序列的核苷酸互补序列。
实施例2：检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒
检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒包括以下成份：
1）含有实施例1中所述的至少一组引物组；
2）含有检测探针：
当试剂盒中含有引物组1时，该试剂盒就还含有探针SEQ ID NO:15或其核苷酸互补序列；
当试剂盒中含有引物组2时，该试剂盒中就还含有探针SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针；
当试剂盒中含有引物组3时，该试剂盒中就还含有探针SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针。
探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中任意一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中任意一种。
3）细胞定量引物组和细胞定量探针，其序列分别为：
细胞定量引物组序列为：
SEQ ID NO:23：CGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG；
SEQ ID NO:24：GGTCACCCACACTGTGCCCATCTACG；
SEQ ID NO:25：CCACACTGTGCCCATCTACGA；
SEQ ID NO:26：GCGCTCGGTGAGGATCTT C；
细胞定量探针序列为：
SEQ ID NO:27：ATGCCCTCCCCCATGCCATCCT或者为其核苷酸互补序列；
细胞定量探针序列所标记的荧光基团可从FAM、HEX、VIC、CY5、TET选择，但不同于2）中所述探针的标记荧光基团。
4）PCR反应液：含有15~25mM Tris-HCl (pH8.0)，15~25mM KCl，2.5~5mM (NH4)SO4，2~5mM MgCl2，0.5~2mM dNTP/UTP Mix，200~600Nm HIV-1 DNA引物组，100~300nM HIV-1DNA探针，200~600nM细胞定量引物组，100~300nM细胞定量探针。
5）还含有酶系（Taq酶与UNG酶混合）、强阳性质控品、弱阳性质控品、阴性对照品和阳性定量参考品。其中，阴性质控品为生理盐水；强阳性质控品和弱阳性质控品为含HIV-1基因序列及含细胞定量扩增基因序列质粒，并且强阳性质控品和弱阳性质控品中HIV-1基因的浓度分别在0.05~0.5 copies/cell和0.0005~0.005 copies/cell之间。
实施例3：检测人类免疫缺陷病毒1型 PCR检测试剂盒的检测方法
利用实施例2建立的检测试剂盒，对待检测样品进行检测，步骤如下：
1）DNA提取：
取待测全血样本、阴性质控品、弱阳性质控品、强阳性质控品、阳性定量参考品各200μl，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取试剂盒，按照说明书中全血标本提取步骤操作，洗脱体积为100uL，分别提取获得各组样品中的DNA作为后续PCR模板；
2）PCR反应体系：
PCR反应液 29.2μL；
酶系 0.8μL；
DNA模板 20μL；
3）PCR反应程序：
以ABI7500为例，第一步：37℃ 5分钟；第二步： 95 ℃ 10 分钟；第三步： 95 ℃15 秒， 62~68 ℃ 15 秒，72℃ 20秒， 5~8 个循环；第四步： 95 ℃ 15 秒， 62~65 ℃ 15秒，72℃ 20秒， 5~8 个循环； 第五步：95℃ 15秒，60℃ 1分钟，40个循环；60 ℃时采集荧光；
4）结果分析：
反应结束后自动保存结果，对HIV-1 DNA的扩增曲线和相应细胞扩增的曲线进行分别分析。根据分析后图像调节Baseline 的Start值、End值以及Threshold的Value值（用户可根据实际情况自行调整，Start值可以在1-10，Stop值可以在5-20，调整阴性质控品的扩增曲线平直或低于阈值线），点击Analyze进行分析，使Std Curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即Correlation数值介于-1.0~-0.98。然后到Plate窗口下记录定量结果。
细胞中HIV-1 DNA含量结果计算：
同一份标本中，用2条标准曲线定量的HIV-1 DNA定量值（单位：copies/μL）除以细胞定量结果（单位：cells/μL），得出标本中每个细胞中HIV-1 DNA含量（单位：copies/cell）。
5）质量控制
在整个检测过程中，需保证各样品满足以下质量要求：
① 阴性质控品：HIV-1 DNA扩增曲线无CT值显示；
② 弱阳性参考品：检测值介于0.00005~0.005copies/cell；
③ 强阳性参考品：检测值介于0. 05~0.5copies/cell；
④ 阳性定量参考品（FAM通道和VIC通道）的结果均为阳性，Ct值＜30，且2条标准曲线线性相关系数0.98 ≤ r ≤ 1。
标准曲线扩增如图1所示。红色为HIV-1 DNA定量标准曲线扩增；绿色为细胞定量标准曲线扩增。
实施例4：特异性实验
对124例HIV-1阴性标本或健康人群标本进行检测，阴性标本包括为HBV、1型单纯疱疹病毒、2型单纯疱疹病毒、水痘-带状疱疹病毒、EB病毒、细胞巨化病毒、6型单纯疱疹病毒、甲型肝炎病毒、丙型肝炎病毒、黄热病病毒、人类T细胞白血病病毒1型和2型、柯萨奇病毒B3以及大肠杆菌提取的核酸进行检测，结果显示为阴性（100%）（如图2所示，红色为HIV-1DNA扩增，均为阴性；绿色为细胞定量扩增）。以上结果证明本发明方法具有很好的特异性。
实施例5：灵敏度及线性范围实验
（1）人类免疫缺陷病毒1型DNA的PCR检测试剂盒灵敏度分析
将HIV阴性细胞稀释8E5细胞（基因组中整合了1个拷贝HIV-1 DNA）至浓度为每1×106个细胞中含10个 8E5细胞（相当于每个PCR反应中检测2个拷贝HIV-1 DNA），采用实施例3的试剂盒及检测方法对HIV-1 DNA进行检测。检测结果如图3所示，通过多次重复检测，本发明的最低检出限（每个PCR反应中检测2个拷贝HIV-1 DNA/百万细胞）检出率可达96%。
（2）人类免疫缺陷病毒1型DNA的PCR检测试剂盒的线性范围
将HIV阴性细胞稀释8E5细胞（基因组中整合了1个拷贝HIV-1 DNA）至浓度为每百万个细胞中含1×106、1×105、1×104、1×103、1×102和10个8E5细胞，采用实施例3的试剂盒及检测方法对HIV-1 DNA进行检测，取其检测值及均值进行结果计算和判断。进行数据经可用性检查和多项回归分析，并经精密度检验后，确定在检测范围内，本试剂结果为线性。最终结果显示线性覆盖范围为0.00001~1 copies/cell，HIV-1定量标准曲线的线性回归曲线图如图4所示，R2=0.995。
（3）本发明检测方法与常规荧光 PCR的比较
利用实施例5（2）所述稀释方法，将8E5细胞稀释至每百万细胞中分别含200、100、20、10、5和2个8E5细胞，用实施例3所述检测方法，核酸提取后，分别进行本发明检测方法和常规荧光PCR方法检测。结果常规荧光PCR方法检测的阳性率分别为：100%、95%、50%、25%、10%和0%；本发明方法检测阳性率分别为：100%、100%、100%、95%、60%、20%。
实施例6：临床标本检测
本发明检测方法男同性恋人群中HIV筛查试验与Western Blot方法对比（准确性）
HIV Western Blot检测方法目前被作为HIV感染确诊方法。通过和深圳CDC艾滋病防制中心合作，用本发明的HIV-1 DNA 检测试剂盒与Western Blot检测方法同时对191例男同性恋全血标本进行检测，结果如表1：
由表1可看出本发明方法与WB检测方法一致性99.0%。其不符的2例标本（本发明检测均为阳性，WB检测均为阴性），经CD4+/CD8+细胞计数结果证实其为HIV-1阳性。该结果对比进一步证实了本发明在检测方法的灵敏度及准确性。
<110> 广州海力特生物科技有限公司
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<213> 人工引物
<400> 2
tgcgcgcttc aagccgagtc ctgcgt 26
<210> 3
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 3
agggaaccca ctgcttaagc ctcaataaag ct 32
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
agcaagccga gtcctgcgtc gaga 24
<210> 5
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 5
agcctcaata aagcttgcct 20
<210> 6
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
ccgccactgc tagagatttt cca 23
<210> 7
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 7
ggttagacca gatctgagcc tgggagct 28
<210> 8
<211> 33
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 8
ggaacccact gcttaagcct caataaagct tgc 33
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 9
tgttcgggcg ccactgctag aga 23
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 10
aagcctcaat aaagcttgcc ttga 24
<210> 11
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 11
agggtctgag ggatctctag ttaccagag 29
<210> 12
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 12
accagatctg agcctgggag ct 22
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 13
gctaactagg gaacccactg ct 22
<210> 14
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 14
ttcgggcgcc actgcta 17
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 15
tctggtaact agagatccct 20
<210> 16
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 16
ttcaagtagt gtgtgccc 18
<210> 17
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 17
agtagtgtgt gcccgtct 18
<210> 18
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 18
tagtgtgtgc ccgtctgt 18
<210> 19
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 19
tgttgtgtgt gactctggta actagaga 28
<210> 20
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 20
tgttgtgtgt gactctggta acta 24
<210> 21
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 21
tgtgtgtgac tctggtaact agaga 25
<210> 22
<211> 25
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 22
tgttgtgtgt gactctggta actag 25
<210> 23
<211> 29
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 23
cggggtcacc cacactgtgc ccatctacg 29
<210> 24
<211> 26
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 24
ggtcacccac actgtgccca tctacg 26
<210> 25
<211> 21
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 25
ccacactgtg cccatctacg a 21
<210> 26
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 26
gcgctcggtg aggatcttc 19
<210> 27
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工探针
<400> 27
atgccctccc ccatgccatc ct 22
Claims (8)
1.检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR引物组和探针，该引物组为引物组1或引物组2或引物组3，其中，
引物组1由SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6组成；
引物组2由SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11组成；
引物组3由SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14组成；
探针序列为：SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21和SEQ ID NO:22；或者为该些序列的核苷酸互补序列。
2.根据权利要求1所述的检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR引物组和探针，其特征在于：探针序列5’端标记的荧光基团为FAM、HEX、VIC、CY5、TET中一种，探针序列3’端标记的淬灭基团为TAMRA、MGB、BHQ中一种。
3.一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒含有至少一组权利要求1中所述的引物组；
该试剂盒还含有检测探针；具体探针情况如下：
当试剂盒中含有引物组1时，该试剂盒就还含有探针SEQ ID NO:15或其核苷酸互补序列；
当试剂盒中含有引物组2时，该试剂盒中就还含有探针SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针；
当试剂盒中含有引物组3时，该试剂盒中就还含有探针SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22或者该些序列的核苷酸互补序列中的至少一条探针。
4.根据权利要求3所述的一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有细胞定量引物组和细胞定量探针，所述细胞定量引物组由SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:26组成；所述细胞定量探针为SEQ ID NO:27或者为其核苷酸互补序列；
细胞定量探针序列所标记的荧光基团从FAM、HEX、VIC、CY5、TET中选择，但不同于权利要求3所述检测探针的荧光基团。
5.根据权利要求3所述的一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒还含有：强阳性对照品、弱阳性对照品、阴性对照品、阳性定量参考品和含有Taq酶与UNG酶的酶系。
6.根据权利要求5所述的一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测试剂盒，其特征在于：所述的阳性定量参考品为8E5或Ach2细胞株基因组，用于同时对HIV DNA及细胞数定量。
7.一种检测人类免疫缺陷病毒1型的PCR检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
1)DNA提取：
取待测全血样本、阴性质控品、弱阳性质控品、强阳性质控品、阳性定量参考品各200μl，使用QIAamp DNA Blood Mini Kit提取试剂盒，按说明书操作，分提取各组样品的DNA作为模板；
2)PCR反应体系：
PCR反应液 29.2μL；
酶系 0.8μL；
DNA模板 20μL；
3)PCR反应程序：
以ABI7500为例，第一步：37℃5分钟；第二步：95℃10分钟；第三步：95℃15秒，62～68℃15秒，72℃20秒，5～8个循环；第四步：95℃15秒，62～65℃15秒，72℃20秒，5～8个循环；第五步：95℃15秒，60℃1分钟，40个循环；60℃时采集荧光；
4)结果分析：
反应结束后自动保存结果，对HIV-1DNA的扩增曲线和相应细胞扩增的曲线进行分别分析；点击Analyze进行分析，使Std Curve窗口下的标准曲线图达到最佳，即Correlation数值介于-1.0～-0.98，然后到Plate窗口下记录定量结果；
细胞中HIV-1DNA含量结果计算：
同一份标本中，用2条标准曲线定量的HIV-1DNA定量值除以细胞定量值，得出标本中每个细胞中HIV-1DNA含量；
上述方法用于非疾病的诊断或治疗；
所述PCR反应液含有15～25mM Tris-HCl pH8.0，15～25mM KCl，2.5～5mM(NH4)2SO4，2～5mM MgCl2，0.5～2mM dNTP/UTP Mix，200～600Nm HIV-1DNA引物组，100～300nM HIV-1DNA探针，200～600nM细胞定量引物组，100～300nM细胞定量探针，所述引物组为权利要求1所述的引物组，所述探针为权利要求1所述的探针。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于：在整个检测过程中，需保证各样品满足以下质量要求：
①阴性质控品：HIV-1DNA扩增曲线无CT值显示；
②弱阳性参考品：检测值介于0.00005～0.005copies/cell；
③强阳性参考品：检测值介于0.05～0.5copies/cell；
④阳性定量参考品的结果均为阳性，Ct值＜30，且2条标准曲线线性相关系数0.98≤r≤1；
以上要求需要在同一次实验中同时满足，否则，本次实验无效，需重新进行。
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