CN103068849A - 抗Bv8抗体及其用途 - Google Patents

Abstract

本发明关注针对Bv8的抗体及其用途。

Description

抗Bv8抗体及其用途

相关申请

本申请是依据37 CFR 1.53（b）（1）提交的非临时申请，依据35 USC 119（e）要求2009年12月23日提交的临时申请No.61/284,743和2010年11月16日提交的临时申请No.61/414,052的优先权，通过述及将其内容收入本文。

发明领域

一般而言，本发明涉及分子生物学领域。更具体地，本发明关注抗Bv8抗体及其用途。

发明背景

现在完全确立了涉及自已有的内皮形成新血管的血管发生参与多种病症的发病机理。这些包括实体瘤和转移、动脉粥样硬化、晶状体后纤维组织增生、血管瘤、慢性炎症、眼内新血管综合征诸如增殖性视网膜病例如糖尿病性视网膜病、老年性黄斑变性(AMD)、新生血管性青光眼、移植角膜组织和其它组织的免疫排斥、类风湿性关节炎、和银屑病。Folkman et al.,J.Biol.Chem.,267:10931-10934(1992);Klagsbrun et al.,Annu.Rev.Physiol.,53:217-239(1991);及Garner A.,"Vascular diseases",In:Pathobiology of OcularDisease.A Dynamic Approach,Garner A.,Klintworth GK,eds.,2nd Edition(Marcel Dekker,NY，1994),pp 1625-1710。

在肿瘤生长的情况中，血管发生对于自增生至瘤形成的转换，及为肿瘤的生长和转移提供营养似乎是至关重要的。Folkman et al.,Nature,339:58(1989)。新血管形成(neovascularization)让肿瘤细胞获得了与正常细胞相比的生长优势和增殖自治。肿瘤通常开始于单个异常细胞，由于与可利用毛细管床的距离，该细胞只能增殖至几立方毫米的尺寸，而且它能在较长的一段时间里保持“休眠”状态而不进一步生长和传播。有些肿瘤细胞然后转向血管发生表型以激活内皮细胞，所述内皮细胞增殖并成熟成新的毛细血管。这些新形成的血管不仅让原发性肿瘤继续生长，而且让转移性肿瘤细胞传播并再建群(recolonization)。因而，在肿瘤切片中的微血管密度与乳腺癌及数种其它肿瘤的患者存活之间观察到了相关性。Weidner et al.,N.Engl.J.Med,324:1-6(1991);Horak et al.,Lancet,340:1120-1124(1992);Macchiarini et al.,Lancet,340:145-146(1992)。尚未完全了解控制血管发生转换的精确机制，但是认为肿瘤块的新血管形成源自众多血管发生刺激物与抑制物的净平衡(Folkman,1995,Nat Med 1(1):27-31)。

血管发育过程受到严密调节。迄今为止，多种分子，多为由周围细胞生成的分泌性因子，已显示出调节EC分化、增殖、迁移和接合成索样结构。例如，血管内皮生长因子(VEGF)已鉴定为涉及刺激血管发生和诱导血管通透性的关键因子。Ferrara et al.,Endocr.Rev.,18:4-25(1997)。甚至单个VEGF等位基因的遗失导致胚胎致死的发现指向此因子在血管系统的发育和分化中所发挥的不可代替的作用。此外，VEGF已显示为与肿瘤和眼内病症有关的新血管形成的关键介导物。Ferrara et al.,Endocr.Rev.,见上文。VEGF mRNA在多数所检查的人肿瘤中过表达。Berkman et al.,J.Clin.Invest.,91:153-159(1993);Brown et al.,Human Pathol.,26:86-91(1995);Brown et al.,Cancer Res.,53:4727-4735(1993);Mattern et al.,Brit.J.Cancer，73:931-934(1996);Dvoraket al.,Am.J.Pathol.,146:1029-1039(1995)。

已经显示了Bv8诱导肾上腺皮层毛细管内皮细胞的增殖、存活和迁移(LeCouter,J.et al.,Proc Natl Acad Sci USA 100,2685-2690(2003))。Bv8和EG-VEGF是两种高度相关的分泌蛋白，也称作prokineticin-1和-2，它们在结构上属于由五个二硫桥基序（称作共脂肪酶/辅脂肪酶折叠）限定的一个较大的肽类别(DeCouter,J.et al.,Nature 420,860-867(2002);LeCouter,J.et al.,Proc Natl Acad Sci USA 100,2685-2690(2003);Li,M.et al.,Mol Pharmacol 59,692-698(2001))。Bv8最初被鉴定为来自蛙Bombina variegate皮肤的分泌蛋白(Mollay,C.et al.,Eur J Pharmacol 374,189-196(1999))。Bv8的克隆和表达记载于2003年3月13日公布的WO 03/020892。Bv8和EG-VEGF结合两种高度相关的G蛋白偶联受体(GPCR)，EG-VEGF/PKR-1(R1)和EG-VEGF/PKR-2(R2)(Masuda,Y et al.,Biochem Biophys Res Commun 293,496-402(2002);Lin,D.C.et al.,J Biol Chem 277,19276-19280(2002))。EG-VEGF和Bv8被表征为对特定内皮细胞类型选择性的丝裂原(LeCouter,J.et al.,Nature412(6850):877-84(2001);LeCouter，J.et al.,Proc Natl Acad Sci USA 100,2685-2690(2003))。已经将其它活性归于这个家族，包括伤害感受(Mollay,C.et al.,见上文)、胃肠道运动(Li,M.et al.,见上文)、昼夜节律运动节律的调节(Cheng,M.Y.,et al.,Nature 417,405-410(2002))和嗅球神经发生(Matsumoto,S.,et al.,Proc Natl Acad Sci USA 103,4140-4145(2006))。另外，Bv8在体外刺激粒细胞和单核细胞集落的生成(LeCouter,J.et al.,(2003),见上文;Dorsch,M.et al.,J.Leukoc Biol 78(2),426-34(2005))。Bv8已经被表征为巨噬细胞的化学引诱物(LeCouter et al.,Proc Natl Acad Sci USA 101,16813-16919(2004))。

鉴于血管发生在许多疾病和病症中的作用，希望有降低或抑制一种或多种引起这些过程的生物学效应的手段。通过述及完整收录本文中引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物。

发明概述

本发明部分基于多种针对Bv8的抗体。Bv8作为一种重要且有利的治疗靶，而且本发明提供抗体，作为治疗剂和诊断剂，供靶向与Bv8表达和/或活性有关的病理状况中使用。因而，本发明提供涉及Bv8的方法、组合物、试剂盒和制品。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中所述抗体包含可变域，该可变域包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区（HVR）序列：

(i)包含KASQSX₁X₂YX₃X₄X₅SYMN的HVR-L1，其中X₁为L或V；X₂为D或I；X₃为D、F、G、S、W或Y；X₄为A、G、H或V；且X₅为D、E或Y；

(ii)包含AASX₁X₂EX₃的HVR-L2，其中X₁为N或Y；X₂为L或R；且X₃为S或T；

(iii)包含QQINEDPFT的HVR-L3；

(iv)包含GYX₁X₂X₃X₄YDMH的HVR-H1，其中X₁为S或T；X₂为F或L；X₃为F、M、P、T或V；X₄为D、E、H、I或N；

(v)包含YIX₁X₂YX₃GX₄TX₅YNQKFKG的HVR-H2，其中X₁为H、S或T；X₂为C、S或T；X₃为A、L、N、S或T；X₄为A、E或S；X₅为I、L、S或T；和

(vi)包含DX₁NYGEAYAMDY的HVR-H3，其中X₁为G或S。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体包含下述三种HVR序列：

(i)包含KASQSX₁X₂YX₃X₄X₅SYMN的HVR-L1，其中X₁为L或V；X₂为D或I；X₃为D、F、G、S、W或Y；X₄为A、G、H或V；且X₅为D、E或Y；

(ii)包含AASX₁X₂EX₃的HVR-L2，其中X₁为N或Y；X₂为L或R；且X₃为S或T；和

(iii)包含QQINEDPFT的HVR-L3；及

人VL卡帕亚组IV共有框架序列SEQ ID NO：240。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体包含下述三种HVR序列：

(i)包含GYX₁X₂X₃X₄YDMH的HVR-H1，其中X₁为S或T；X₂为F或L；X₃为F、M、P、T或V；X₄为D、E、H、I或N；

(ii)包含YIX₁X₂YX₃GX₄TX₅YNQKFKG的HVR-H2，其中X₁为H、S或T；X₂为C、S或T；X₃为A、L、N、S或T；X₄为A、E或S；X₅为I、L、S或T；和

(iii)包含DX₁NYGEAYAMDY的HVR-H3，其中X₁为G或S；及

人VH亚组I共有框架序列SEQ ID NO：241。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列：

(i)包含KASQSX₁X₂YX₃X₄X₅SYMN的HVR-L1，其中X₁为L或V；X₂为D或I；X₃为D、F、G、S、W或Y；X₄为A、G、H或V；且X₅为D、E或Y；

(ii)包含AASX₁X₂EX₃的HVR-L2，其中X₁为N或Y；X₂为L或R；且X₃为S或T；

(iii)包含QQINEDPFT的HVR-L3；

(iv)包含GYX₁X₂X₃X₄YDMH的HVR-H1，其中X₁为S或T；X₂为F或L；X₃为F、M、P、T或V；X₄为D、E、H、I或N；

(v)包含YIX₁X₂YX₃GX₄T X5YNQKFKG的HVR-H2，其中X₁为H、S或T；X₂为C、S或T；X₃为A、L、N、S或T；X₄为A、E或S；X₅为I、L、S或T；和

(vi)包含DX₁NYGEAYAMDY的HVR-H3，其中X₁为G或S。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比在VL位置28和29之一或二者处进一步包含突变。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比在VH位置52a处进一步包含突变。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比在VH位置54处进一步包含突变。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比在VH位置95和96之一或二者处进一步包含突变。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比(1)在VL位置28和29之一或二者处；和/或(2)在VH位置52a处；和/或(3)在VH位置54处；和/或(4)在VH位置95和96之一或二者处进一步包含突变。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体与鼠/嵌合抗Bv8抗体相比在VH位置96处进一步包含突变且在VH位置95处不含突变。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段为，其中HVR-L1包含选自SEQ ID NO：49、55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145和151的氨基酸序列，HVR-L2包含选自SEQID NO：50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146和152的氨基酸序列，HVR-L3包含选自SEQ ID NO：51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147和153的氨基酸序列，HVR-H1包含选自SEQ ID NO：52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148和154的氨基酸序列，HVR-H2包含选自SEQ ID NO：53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149和155的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQ ID NO：54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150和156的氨基酸序列。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列和人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，人VL卡帕亚组IV共有框架序列减去三个轻链HVR序列为SEQ ID NO：240。在某些实施方案中，VH亚组I共有框架序列减去三个重链HVR序列为SEQ ID NO：241。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含可变域，该可变域包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列：

(i)包含KASQSX₁X₂YX₃X₄X₅SYMN的HVR-L1，其中X₁为L或V；X₂为D或I；X₃为F、G、S、W或Y；X₄为A、G、H或V；且X₅为D、E或Y；

(ii)包含AASX₁X₂EX₃的HVR-L2，其中X₁为N或Y；X₂为L或R；且X₃为S或T；

(iii)包含QQINEDPFT的HVR-L3；

(iv)包含GYX₁X₂X₃X₄YDMH的HVR-H1，其中X₁为S或T；X₂为F或L；X₃为F、M、P、T或V；X₄为D、E、H、I或N；

(v)包含YIX₁X₂YX₃GX₄TX₅YNQKFKG的HVR-H2，其中X₁为H、S或T；X₂为S或T；X₃为A、L、S或T；X₄为A、E或S；X₅为I、L、S或T；和

(vi)包含DSNYGEAYAMDY的HVR-H3。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体包含下述三种HVR序列：

(i)包含KASQSX₁X₂YX₃X₄X₅SYMN的HVR-L1，其中X₁为L或V；X₂为D或I；X₃为F、G、S、W或Y；X₄为A、G、H或V；且X₅为D、E或Y；

(ii)包含AASX₁X₂EX₃的HVR-L2，其中X₁为N或Y；X₂为L或R；且X₃为S或T；

(iii)包含QQINEDPFT的HVR-L3；及

人VL卡帕亚组IV共有框架序列SEQ ID NO：240。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体包含下述三种HVR序列：

(i)包含GYX₁X₂X₃X₄YDMH的HVR-H1，其中X₁为S或T；X₂为F或L；X₃为F、M、P、T或V；X₄为D、E、H、I或N；

(ii)包含YIX₁X₂YX₃GX₄TX₅YNQKFKG的HVR-H2，其中X₁为H、S或T；X₂为S或T；X₃为A、L、S或T；X₄为A、E或S；X₅为I、L、S或T；和

(iii)包含DSNYGEAYAMDY的HVR-H3；及

人VH亚组I共有框架序列SEQ ID NO：241。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列：

(i)包含KASQSX₁X₂YX₃X₄X₅SYMN的HVR-L1，其中X₁为L或V；X₂为D或I；X₃为F、G、S、W或Y；X₄为A、G、H或V；且X₅为D、E或Y；

(ii)包含AASX₁X₂EX₃的HVR-L2，其中X₁为N或Y；X₂为L或R；且X₃为S或T；

(iii)包含QQINEDPFT的HVR-L3；

(iv)包含GYX₁X₂X₃X₄YDMH的HVR-H1，其中X₁为S或T；X₂为F或L；X₃为F、M、P、T或V；X₄为D、E、H、I或N；

(v)包含YIX₁X₂YX₃GX₄T X5YNQKFKG的HVR-H2，其中X₁为H、S或T；X₂为S或T；X₃为A、L、S或T；X₄为A、E或S；X₅为I、L、S或T；和

(vi)包含DSNYGEAYAMDY的HVR-H3。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中HVR-L1包含选自SEQ ID NO：55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145和151的氨基酸序列，HVR-L2包含选自SEQ ID NO：56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146和152的氨基酸序列，HVR-L3包含选自SEQ ID NO：57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147和153的氨基酸序列，HVR-H1包含选自SEQ ID NO：58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148和154的氨基酸序列，HVR-H2包含选自SEQ ID NO：59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149和155的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQ ID NO：60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150和156的氨基酸序列。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列和人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，人VL卡帕亚组IV共有框架序列减去三个轻链HVR序列为SEQ ID NO：240。在某些实施方案中，VH亚组I共有框架序列减去三个重链HVR序列为SEQ ID NO：241。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含：

(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：61的HVR-H1；

(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：62的HVR-H2；

(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO：63的HVR-H3；

(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO：64的HVR-L1；

(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO：65的HVR-L2；和

(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO：66的HVR-L3。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含：

(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：85的HVR-H1；

(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：86的HVR-H2；

(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO：87的HVR-H3；

(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO：88的HVR-L1；

(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO：89的HVR-L2；和

(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO：90的HVR-L3。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含：

(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：91的HVR-H1；

(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：92的HVR-H2；

(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO：93的HVR-H3；

(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO：94的HVR-L1；

(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO：95的HVR-L2；和

(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO：96的HVR-L3。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含：

(1)包含氨基酸序列SEQ ID NO：121的HVR-H1；

(2)包含氨基酸序列SEQ ID NO：122的HVR-H2；

(3)包含氨基酸序列SEQ ID NO：123的HVR-H3；

(4)包含氨基酸序列SEQ ID NO：124的HVR-L1；

(5)包含氨基酸序列SEQ ID NO：125的HVR-L2；和

(6)包含氨基酸序列SEQ ID NO：126的HVR-L3。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组IV共有框架序列和人VH亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，人VL卡帕亚组IV共有框架序列减去三个轻链HVR序列为SEQ ID NO：240。在某些实施方案中，VH亚组I共有框架序列减去三个重链HVR序列为SEQ ID NO：241。

在一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：7，该重链可变域包含SEQ ID NO：8。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：9，该重链可变域包含SEQ ID NO：10。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：11，该重链可变域包含SEQ ID NO：12。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：13，该重链可变域包含SEQ ID NO：14。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变域。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含选自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列。

在一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO：7。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO：9。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO：11。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域，该轻链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO：13。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重链可变域。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含重链可变域，该重链可变域包含选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。

在一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含重链可变域，该重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO：8。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含重链可变域，该重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO：10。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含重链可变域，该重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO：12。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含重链可变域，该重链可变域包含氨基酸序列SEQ ID NO：14。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含与选自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的轻链可变域和与选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列具有至少90%序列同一性的重链可变域。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含选自SEQ ID NO：3、5、7、9、11、13和15的氨基酸序列，该重链可变域包含选自SEQ ID NO：4、6、8、10、12、14和16的氨基酸序列。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗Bv8抗体以小于0.02nM的Kd值结合人Bv8。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗Bv8抗体以约0.01nM或更小的Kd值结合人Bv8。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗Bv8抗体结合人Bv8的紧密程度比嵌合2G9抗Bv8抗体高至少两倍。在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗Bv8抗体结合人Bv8的紧密程度比嵌合2G9抗Bv8抗体高至少五倍。

在某些实施方案中，Kd值是使用表面等离振子共振测定法测量的。在某些实施方案中，Kd值是使用全长抗Bv8抗体测量的。在某些实施方案中，Kd值是使用Fab形式的抗Bv8抗体测量的。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列：

(i)包含SASSX₁VFYMH的HVR-L1，其中X₁为P或S；

(ii)包含DTSX₁LAS的HVR-L2，其中X₁为K或N；

(iii)包含QQWSX₁X₂PX₃T的HVR-L3，其中X₁为F、S、W或Y；X₂为D或E；X₃为I、L或M；

(iv)包含GFX₁X₂STX₃GMGVS的HVR-H1，其中X₁为L或Y；X₂为I或L；X₃为P或S；

(v)包含HIYWDDDTRYNPSLKS的HVR-H2；和

(vi)包含RDHGYYWFX₁Y的HVR-H3，其中X₁为D或T。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列：

(i)包含SASSX₁VFYMH的HVR-L1，其中X₁为P或S；

(ii)包含DTSX₁LAS的HVR-L2，其中X₁为K或N；

(iii)包含QQWSX₁X₂PX₃T的HVR-L3，其中X₁为F、S、W或Y；X₂为D或E；X₃为I、L或M；

(iv)包含GFX₁X₂STX₃GMGVS的HVR-H1，其中X₁为L或Y；X₂为I或L；X₃为P或S；

(v)包含HIYWDDDTRYNPSLKS的HVR-H2；和

(vi)包含RDHGYYWFX₁Y的HVR-H3，其中X₁为D或T。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中HVR-L1包含选自SEQ ID NO：157、163、169、175、181、187和193的氨基酸序列，HVR-L2包含选自SEQ ID NO：158、164、170、176、182、188和194的氨基酸序列，HVR-L3包含选自SEQ ID NO：159、165、171、177、183、189和195的氨基酸序列，HVR-H1包含选自SEQ ID NO：160、166、172、178、184、190和196的氨基酸序列，HVR-H2包含选自SEQ ID NO：161、167、173、179、185、191和197的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQ ID NO：162、168、174、180、186、192和198的氨基酸序列。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组III共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列和人VH亚组III共有框架序列。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列：

(i)包含SASSX₁VFYMH的HVR-L1，其中X₁为P或S；

(ii)包含DTSX₁LAS的HVR-L2，其中X₁为K或N；

(iii)包含QQWSX₁X₂PX₃T的HVR-L3，其中X₁为F、S、W或Y；X₂为D或E；X₃为I、L或M；

(iv)包含GFX₁X₂STX₃GMGVS的HVR-H1，其中X₁为L或Y；X₂为I或L；X₃为P或S；

(v)包含HIYWDDDTRYNPSLKS的HVR-H2；和

(vi)包含RDHGYYWFDY的HVR-H3。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含下述六种HVR序列：

(i)包含SASSX₁VFYMH的HVR-L1，其中X₁为P或S；

(ii)包含DTSX₁LAS的HVR-L2，其中X₁为K或N；

(iii)包含QQWSX₁X₂PX₃T的HVR-L3，其中X₁为F、S、W或Y；X₂为D或E；X₃为I、L或M；

(iv)包含GFX₁X₂STX₃GMGVS的HVR-H1，其中X₁为L或Y；X₂为I或L；X₃为P或S；

(v)包含HIYWDDDTRYNPSLKS的HVR-H2；和

(vi)包含RDHGYYWFDY的HVR-H3。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，该HVR-L1包含选自SEQ ID NO：157、163、169、175、181、187和193的氨基酸序列，该HVR-L2包含选自SEQ ID NO：158、164、170、176、182、188和194的氨基酸序列，该HVR-L3包含选自SEQ ID NO：159、165、171、177、183、189和195的氨基酸序列，该HVR-H1包含选自SEQ ID NO：160、166、172、178、184、190和196的氨基酸序列，该HVR-H2包含选自SEQ ID NO：161、167、173、179、185、191和197的氨基酸序列，该HVR-H3包含选自EQ ID NO：174、180、186、192和198的氨基酸序列。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组III共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列和人VH亚组III共有框架序列。

在另一个实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：23，该重链可变域包含SEQ ID NO：24。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列：

(i)包含EASQSVDYDDDSYMN的HVR-L1；

(ii)包含ATSNLAS的HVR-L2；

(iii)包含QQSNEDPFT的HVR-L3；

(iv)包含GYTFTNSWMN的HVR-H1；

(v)包含RIDPSDSETHYNQKFKD的HVR-H2；和

(vi)包含DSSYDGFYAMDY的HVR-H3。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含下述六种HVR序列：

(i)包含EASQSVDYDDDSYMN的HVR-L1；

(ii)包含ATSNLAS的HVR-L2；

(iii)包含QQSNEDPFT的HVR-L3；

(iv)包含GYTFTNSWMN的HVR-H1；

(v)包含RIDPSDSETHYNQKFKD的HVR-H2；和

(vi)包含DSSYDGFYAMDY的HVR-H3。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，该HVR-L1包含选自SEQ ID NO：199和205的氨基酸序列，该HVR-L2包含选自SEQ IDNO：200和206的氨基酸序列，该HVR-L3包含选自SEQ ID NO：201和207的氨基酸序列，该HVR-H1包含选自SEQ ID NO：202和208的氨基酸序列，该HVR-H2包含选自SEQ ID NO：203和209的氨基酸序列，该HVR-H3包含选自SEQ ID NO：204和210的氨基酸序列。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组III共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列和人VH亚组III共有框架序列。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区(HVR)序列：

(i)包含KSSEYVSNALS的HVR-L1；

(ii)包含GTNKLED的HVR-L2；

(iii)包含QQGYDIPT的HVR-L3；

(iv)包含GFTFSDYFMG的HVR-H1；

(v)包含GIDTKSYNYATYYSGSVKG的HVR-H2；和

(vi)包含NYGNYGAFDS的HVR-H3。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含下述六种HVR序列：

(i)包含KSSEYVSNALS的HVR-L1；

(ii)包含GTNKLED的HVR-L2；

(iii)包含QQGYDIPT的HVR-L3；

(iv)包含GFTFSDYFMG的HVR-H1；

(v)包含GIDTKSYNYATYYSGSVKG的HVR-H2；和

(vi)包含NYGNYGAFDS的HVR-H3。

在某些实施方案中，提供了结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含HVR-L1、HVR-L2、HVR-L3、HVR-H1、HVR-H2和HVR-H3，该HVR-L1包含氨基酸序列SEQ ID NO：211，该HVR-L2包含氨基酸序列SEQ ID NO：212，该HVR-L3包含氨基酸序列SEQ ID NO：213，该HVR-H1包含氨基酸序列SEQ ID NO：214，该HVR-H2包含氨基酸序列SEQ ID NO：215，该HVR-H3包含氨基酸序列SEQ ID NO：216。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VH亚组III共有框架序列。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体进一步包含人VL卡帕亚组I共有框架序列和人VH亚组III共有框架序列。

在某些实施方案中，该抗Bv8抗体为单克隆抗体。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体为人源化的。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体为人的。在某些实施方案中，该抗Bv8抗体的至少部分框架序列为人共有框架序列。在一个实施方案中，该抗体为选自Fab、Fab’-SH、Fv、scFv或(Fab’)₂片段的抗体片段。

在某些实施方案中，提供了编码本文所述任何抗体的多核苷酸或核酸。在一个实施方案中，提供了包含该多核苷酸或核酸的载体。在一个实施方案中，该载体为表达载体。在一个实施方案中，提供了包含该载体的宿主细胞。在一个实施方案中，该宿主细胞为真核的。在一个实施方案中，该宿主细胞为原核的。在一个实施方案中，该宿主细胞为CHO细胞。在一个实施方案中，提供了制备抗Bv8抗体的方法，其中该方法包括在适合于编码抗体的多核苷酸表达的条件下培养该宿主细胞，并分离抗体。

在某些实施方案中，本发明还涉及包含上述任何抗Bv8抗体的组合物。在某些实施方案中，本发明涉及包含与药学可接受载体混合的上述任何抗Bv8抗体的药物组合物。

在某些实施方案中，本发明涉及一种药物组合物，其用于预防或治疗肿瘤转移，包含与药学可接受载体混合的有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。

在某些实施方案中，提供了检测生物学样品中Bv8的存在的方法，该方法包括在允许抗体结合Bv8的条件下使生物学样品与本发明的抗Bv8抗体接触，并检测抗体和Bv8之间是否形成复合物。

在某些实施方案中，提供了用于治疗肿瘤、癌症、或细胞增殖性病症的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。在某些实施方案中，该癌症选自下组：乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，肾癌，成胶质细胞瘤，食管癌，黑素瘤，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝细胞癌。在某些实施方案中，该癌症为乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、卵巢癌或成胶质细胞瘤。在本文中“定义”下提供了所涵盖的癌症的一个例示性和非限制性列表。

在某些实施方案中，提供了用于在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中降低或抑制血管发生的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。在某些实施方案中，该病理状况为新生物状况(neoplasticcondition)。在某些实施方案中，该病理状况为非新生物状况。在本文中“定义”下提供了所涵盖的非新生物状况的一个例示性和非限制性列表。在某些实施方案中，该非新生物状况选自下组：糖尿病性和其它增殖性视网膜病，早产儿视网膜病，新生血管性青光眼，老年性黄斑变性，糖尿病性黄斑水肿，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，视网膜/脉络膜新血管形成和类风湿性关节炎。

在某些实施方案中，提供了用于抑制内皮细胞增殖的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。在某些实施方案中，该内皮细胞为肾上腺皮层内皮细胞。

在某些实施方案中，提供了用于抑制嗜中性粒细胞迁移的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。

在某些实施方案中，提供了用于抑制肿瘤转移的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。在某些实施方案中，该转移在淋巴系统中。在某些实施方案中，该转移在远端器官中。

在某些实施方案中，提供了用于治疗、预防或减轻疼痛的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。在某些实施方案中，该疼痛为急性或慢性疼痛。在某些实施方案中，该疼痛为急性或慢性炎性疼痛。在某些实施方案中，提供了用于治疗类风湿性关节炎的方法，包括对受试者施用有效量的本文所述任何抗Bv8抗体。

在某些实施方案中，本文和上文所述方法和进一步包括对受试者施用有效量的第二药物，其中该抗Bv8抗体为第一药物。在某些实施方案中，该第二药物为另一种抗体、化疗剂、细胞毒剂、抗血管发生剂、免疫抑制剂、前药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放疗、皮质类固醇、止吐剂、癌症疫苗、止痛剂、或生长抑制剂。在某些实施方案中，该第二药物为抗血管发生剂。在某些实施方案中，该第二药物或抗血管发生剂为抗VEGF抗体。在某些实施方案中，该抗VEGF抗体为贝伐单抗(bevacizumab)。在某些实施方案中，该第二药物在施用抗Bv8抗体之前或之后施用。在某些实施方案中，该第二药物与抗Bv8抗体同时施用。在某些实施方案中，该方法进一步包括对受试者施用有效量的第三药物，其中该第三药物为化疗剂。

在本文中“定义”下提供了所涵盖的化疗剂的一个例示性和非限制性列表。在某些实施方案中，该化疗剂选自下组：帕利他赛(paclitaxel)，卡铂(carboplatin)，顺铂(cisplatin)，吉西他滨(gemcitabine)和培美曲赛(pemetrexed)。

在某些实施方案中，提供了用于在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中增强抗血管发生剂的功效的方法，该方法包括对受试者施用与抗血管发生剂组合的有效量的本文所述任何抗Bv8抗体，由此增强所述抗血管发生剂的抑制活性。在某些实施方案中，该与血管发生有关的病理状况为肿瘤、癌症或细胞增殖性病症。在某些实施方案中，该与血管发生有关的病理状况为非新生物状况。在某些实施方案中，该非新生物状况选自下组：糖尿病性和其它增殖性视网膜病，早产儿视网膜病，新生血管性青光眼，老年性黄斑变性，糖尿病性黄斑水肿，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，视网膜/脉络膜新血管形成和类风湿性关节炎。在某些实施方案中，该非新生物状况为类风湿性关节炎。

在某些实施方案中，该受试者为人患者。在某些实施方案中，该受试者为人癌症患者。在某些实施方案中，该受试者为可已经诊断有转移或可处于发生转移的风险的人癌症患者。在某些实施方案中，该受试者为自VEGF拮抗剂复发的或对VEGF拮抗剂不应的。在某些实施方案中，该VEGF拮抗剂为抗VEGF抗体。在某些实施方案中，该抗VEGF抗体为贝伐单抗。

在某些实施方案中，该抗血管发生剂在施用抗Bv8抗体之前或之后施用。在某些实施方案中，该抗血管发生剂与抗Bv8抗体同时施用。在某些实施方案中，该抗血管发生剂为抗VEGF剂。在某些实施方案中，该抗VEGF剂为抗VEGF抗体。在某些实施方案中，该抗VEGF抗体为贝伐单抗。

本文所述任何实施方案或其任何组合适用于本文所述发明任何和所有抗Bv8抗体和方法。

附图简述

图1A-F：抗Bv8抗体的轻链和重链HVR环序列。所述图显示了轻链HVR序列L1、L2、和L3及重链HVR序列H1、H2和H3。每种抗体的序列编号方式如下：嵌合2G9（HVR-H1为SEQ ID NO：49；HVR-H2为SEQ ID NO：50；HVR-H3为SEQ ID NO：51；HVR-L1为SEQ ID NO：52；HVR-L2为SEQ IDNO：53；HVR-L3为SEQ ID NO：54）；h2G9.K4G1.Polish（HVR-L1为SEQ IDNO：55；HVR-L2为SEQ ID NO：56；HVR-L3为SEQ ID NO：57；HVR-H1为SEQ ID NO：58；HVR-H2为SEQ ID NO：59；HVR-H3为SEQ ID NO：60）；h2G9.K4G1.v19（HVR-L1为SEQ ID NO：61；HVR-L2为SEQ ID NO：62；HVR-L3为SEQ ID NO：63；HVR-H1为SEQ ID NO：64；HVR-H2为SEQ IDNO：65；HVR-H3为SEQ ID NO：66）；h2G9.K4G1.v25（HVR-L1为SEQ IDNO：67；HVR-L2为SEQ ID NO：68；HVR-L3为SEQ ID NO：69；HVR-H1为SEQ ID NO：70；HVR-H2为SEQ ID NO：71；HVR-H3为SEQ ID NO：72）；h2G9.K4G1.v27（HVR-L1为SEQ ID NO：73；HVR-L2为SEQ ID NO：74；HVR-L3为SEQ ID NO：75；HVR-H1为SEQ ID NO：76；HVR-H2为SEQ IDNO：77；HVR-H3为SEQ ID NO：78）；h2G9.K4G1.v37（HVR-L1为SEQ IDNO：79；HVR-L2为SEQ ID NO：80；HVR-L3为SEQ ID NO：81；HVR-H1为SEQ ID NO：82；HVR-H2为SEQ ID NO：83；HVR-H3为SEQ ID NO：84）；h2G9.K4G1.v52（HVR-L1为SEQ ID NO：85；HVR-L2为SEQ ID NO：86；HVR-L3为SEQ ID NO：87；HVR-H1为SEQ ID NO：88；HVR-H2为SEQ IDNO：89；HVR-H3为SEQ ID NO：90）；h2G9.K4G1.v55（HVR-L1为SEQ IDNO：91；HVR-L2为SEQ ID NO：92；HVR-L3为SEQ ID NO：93；HVR-H1为SEQ ID NO：94；HVR-H2为SEQ ID NO：95；HVR-H3为SEQ ID NO：96）；h2G9.K4G1.v63（HVR-L1为SEQ ID NO：97；HVR-L2为SEQ ID NO：98；HVR-L3为SEQ ID NO：99；HVR-H1为SEQ ID NO：100；HVR-H2为SEQ IDNO：101；HVR-H3为SEQ ID NO：102）；h2G9.K4G1.v64（HVR-L1为SEQ IDNO：103；HVR-L2为SEQ ID NO：104；HVR-L3为SEQ ID NO：105；HVR-H1为SEQ ID NO：106；HVR-H2为SEQ ID NO：107；HVR-H3为SEQ ID NO：108）；h2G9.K4G1.v65（HVR-L1为SEQ ID NO：109；HVR-L2为SEQ ID NO：110；HVR-L3为SEQ ID NO：111；HVR-H1为SEQ ID NO：112；HVR-H2为SEQ ID NO：113；HVR-H3为SEQ ID NO：114）；h2G9.K4G1.v67（HVR-L1为SEQ ID NO：115；HVR-L2为SEQ ID NO：116；HVR-L3为SEQ ID NO：117；HVR-H1为SEQ ID NO：118；HVR-H2为SEQ ID NO：119；HVR-H3为SEQ ID NO：120）；h2G9.K4G1.v73（HVR-L1为SEQ ID NO：121；HVR-L2为SEQ ID NO：122；HVR-L3为SEQ ID NO：123；HVR-H1为SEQ ID NO：124；HVR-H2为SEQ ID NO：125；HVR-H3为SEQ ID NO：126）；h2G9.K4G1.v75（HVR-L1为SEQ ID NO：127；HVR-L2为SEQ ID NO：128；HVR-L3为SEQ ID NO：129；HVR-H1为SEQ ID NO：130；HVR-H2为SEQ IDNO：131；HVR-H3为SEQ ID NO：132）；h2G9.K4G1.v77（HVR-L1为SEQ IDNO：133；HVR-L2为SEQ ID NO：134；HVR-L3为SEQ ID NO：135；HVR-H1为SEQ ID NO：136；HVR-H2为SEQ ID NO：137；HVR-H3为SEQ ID NO：138）；h2G9.K4G1.v80（HVR-L1为SEQ ID NO：139；HVR-L2为SEQ ID NO：140；HVR-L3为SEQ ID NO：141；HVR-H1为SEQ ID NO：142；HVR-H2为SEQ ID NO：143；HVR-H3为SEQ ID NO：144）；h2G9.K4G1.v92（HVR-L1为SEQ ID NO：145；HVR-L2为SEQ ID NO：146；HVR-L3为SEQ ID NO：147；HVR-H1为SEQ ID NO：148；HVR-H2为SEQ ID NO：149；HVR-H3为SEQ ID NO：150）；h2G9.K4G1.v19H/v55L（HVR-L1为SEQ ID NO：151；HVR-L2为SEQ ID NO：152；HVR-L3为SEQ ID NO：153；HVR-H1为SEQ IDNO：154；HVR-H2为SEQ ID NO：155；HVR-H3为SEQ ID NO：156）；嵌合2B9（HVR-L1为SEQ ID NO：157；HVR-L2为SEQ ID NO：158；HVR-L3为SEQ ID NO：159；HVR-H1为SEQ ID NO：160；HVR-H2为SEQ ID NO：161；HVR-H3为SEQ ID NO：162）；h2B9.v1（HVR-L1为SEQ ID NO：163；HVR-L2为SEQ ID NO：164；HVR-L3为SEQ ID NO：165；HVR-H1为SEQ IDNO：166；HVR-H2为SEQ ID NO：167；HVR-H3为SEQ ID NO：168）；h2B9.v10（HVR-L1为SEQ ID NO：169；HVR-L2为SEQ ID NO：170；HVR-L3为SEQID NO：171；HVR-H1为SEQ ID NO：172；HVR-H2为SEQ ID NO：173；HVR-H3为SEQ ID NO：174）；h2B9.v23（HVR-L1为SEQ ID NO：175；HVR-L2为SEQ ID NO：176；HVR-L3为SEQ ID NO：177；HVR-H1为SEQ ID NO：178；HVR-H2为SEQ ID NO：179；HVR-H3为SEQ ID NO：180）；h2B9.v37（HVR-L1为SEQ ID NO：181；HVR-L2为SEQ ID NO：182；HVR-L3为SEQID NO：183；HVR-H1为SEQ ID NO：184；HVR-H2为SEQ ID NO：185；HVR-H3为SEQ ID NO：186）；h2B9.v56（HVR-L1为SEQ ID NO：187；HVR-L2为SEQ ID NO：188；HVR-L3为SEQ ID NO：189；HVR-H1为SEQ ID NO：190；HVR-H2为SEQ ID NO：191；HVR-H3为SEQ ID NO：192）；h2B9.v76（HVR-L1为SEQ ID NO：193；HVR-L2为SEQ ID NO：194；HVR-L3为SEQID NO：195；HVR-H1为SEQ ID NO：196；HVR-H2为SEQ ID NO：197；HVR-H3为SEQ ID NO：198）；嵌合3F1（HVR-L1为SEQ ID NO：199；HVR-L2为SEQ ID NO：200；HVR-L3为SEQ ID NO：201；HVR-H1为SEQ ID NO：202；HVR-H2为SEQ ID NO：203；HVR-H3为SEQ ID NO：204）；h3F1.v1(HVR-L1为SEQ ID NO：205；HVR-L2为SEQ ID NO：206；HVR-L3为SEQ ID NO：207；HVR-H1为SEQ ID NO：208；HVR-H2为SEQ ID NO：209；HVR-H3为SEQ ID NO：210）；和嵌合2D3（HVR-L1为SEQ ID NO：211；HVR-L2为SEQ ID NO：212；HVR-L3为SEQ ID NO：213；HVR-H1为SEQ IDNO：214；HVR-H2为SEQ ID NO：215；HVR-H3为SEQ ID NO：216）。

氨基酸位置依照下文所述Kabat编号系统来编号。

图1G。人VL卡帕（κ）亚组IV共有框架序列减去Kabat轻链HVR序列显示于SEQ ID NO：240。人VH亚组I共有框架序列减去Kabat重链HVR序列显示于SEQ ID NO：241。

图2A-B。抗Bv8抗体2G9变体的(A)轻链可变域和(B)重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。

图3A-B。抗Bv8抗体2B9变体的(A)轻链可变域和(B)重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。

图4A-B。抗Bv8抗体3F1变体的(A)轻链可变域和(B)重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。

图5A-B。抗Bv8抗体2D3变体的(A)轻链可变域和(B)重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。

图6A-B。人源化抗Bv8抗体2B9变体的(A)轻链可变域和(B)重链可变域的氨基酸序列。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。

图7。轻链可变域氨基酸序列，显示(1)小鼠2G9(m2G9)框架序列和人共有卡帕I框架序列及(2)m2G9框架序列和人共有卡帕IV框架序列之间的差异。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。

图8。重链可变域氨基酸序列，显示(1)小鼠2G9(m2G9)框架序列和人共有亚组I(G1)框架序列及(2)m2G9框架序列和人共有亚组III(G3)框架序列之间的差异。位置依照Kabat来编号且高变区以框示。

图9。抗Bv8抗体h2G9.K4G1.Polish、h2G9.K4G1.v27、h2G9.K4G1.v52、h2G9.K4G1.v55、h2G9.K4G1.v63、h2G9.K4G1.v64、h2G9.K4G1.v67、h2G9.K4G1.v77和h2G9.K4G1.v80的L1、L2和L3氨基酸序列。

图10。抗Bv8抗体h2G9.K4G1.Polish、h2G9.K4G1.v19、h2G9.K4G1.v25、h2G9.K4G1.v37、h2G9.K4G1.v65、h2G9.K4G1.v73、h2G9.K4G1.v75、h2G9.K4G1.v77、h2G9.K4G1.v92的H1、H2和H3氨基酸序列。

图11显示嵌合2D3抗体可具有与嵌合2B9以及嵌合3F1和嵌合2G9抗体不同的表位。ELISA竞争测定法显示嵌合3F1和嵌合2G9抗体与嵌合2B9竞争对人Bv8的结合。嵌合2D3仅仅部分地与嵌合2B9抗体竞争对人Bv8的结合。

图12显示小鼠2G9、嵌合2G9、小鼠2B9、嵌合2B9和嵌合3F1对人Bv8诱导的ACE细胞增殖的阻断。该测定法的结果显示嵌合2G9能够完全抑制人Bv8诱导的ACE细胞增殖。

图13显示嵌合2G9、h2G9.K4G1、h2G9.K4G3、h2G9.K1G1和h2G9.K1G3抗Bv8抗体对人Bv8诱导的ACE细胞增殖的阻断。该测定法的结果显示嵌合2G9抗Bv8抗体在20μg/mL抗体浓度具有最高阻断活性。

图14A-B描绘来自噬菌体竞争测定法的结果，证明h2G9.K4G1变体（L1：D28E、D28S、G29A、G29S，H2：C52aA、C52aS、N54A、N54S，H3：D95E、D95S、G96A和G96S）针对人Bv8的结合。

图15显示嵌合2G9和h2G9.K4G1.Polish抗Bv8抗体对人Bv8诱导的ACE细胞增殖的阻断。

图16描绘来自噬菌体竞争测定法的结果，证明亲和力改善的h2G9.K4G1.Polish变体（来自L1/L2软随机化文库的h2G9.K4G1.v27、v52、v55、v63、v64、v67、v77、v80）针对人Bv8的结合。

图17来自噬菌体竞争测定法的结果，证明亲和力改善的h2G9.K4G1.Polish变体（来自H1/H2软随机化文库的h2G9.K4G1.v19、v25、v37、v65、v73、v75、v77.v92）针对人Bv8的结合。

图18显示下述抗Bv8抗体（Fab）针对人Bv8的解离常数：h2G9.K4G1.Polish，h2G9.K4G1.v19，h2G9.K4G1.v52，h2G9.K4G1.v55和h2G9.K4G1.v73。

图19显示人源化抗Bv8抗体（Fab和IgG）h2G9.K4G1.v19和h2G9.K4G1.v55针对人Bv8和猕猴Bv8的解离常数。

图20显示于25°C在人Bv8固定化BIAcore芯片上注射50nM抗Bv8 Fab抗体的传感图，证明解离速率改善。

图21显示下述抗Bv8抗体（IgG）针对人Bv8和猕猴Bv8的解离常数：嵌合2G9，h2G9.K4G1.v19和h2G9.K4G1.v55。结果显示人源化抗Bv8抗体h2G9.K4G1.v19和h2G9.K4G1.v55的亲和力表现为比嵌合2G9抗Bv8抗体紧密至少两倍。

图22显示人源化抗Bv8抗体阻断人Bv8对小鼠2G9抗体的结合。五种亲和力成熟的人源化抗Bv8抗体（h2G9.K4G1.v19、h2G9.K4G1.v52、h2G9.K4G1.v55、h2G9.K4G1.v73和h2G9.K4G1.v19H/v55L）具有与亲本改进型K4G1分子相比强大约5-8倍的阻断能力。

图23显示嵌合2G9,h2G9K4G1.Polish,h2G9K4G1.v19,h2G9K4G1.v52,h2G9K4G1.v55和h2G9K4G1.v73抗Bv8抗体在指定浓度(μg/mL)对人Bv8诱导的ACE细胞增殖的阻断。人源化抗Bv8抗体h2G9K4G1.v19、h2G9K4G1.v52、h2G9K4G1.v55和h2G9K4G1.v73显示阻断人Bv8诱导的ACE增殖方面的显著改善。

图24显示h2G9K4G1.Polished、h2G9K4G1.v19、h2G9K4G1.v55和嵌合2D3抗Bv8抗体在指定浓度(μg/mL)对小鼠Bv8诱导的ACE细胞增殖的阻断。

图25。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗HM7人结肠癌中的功效研究。

图26。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗A673人横纹肌肉瘤癌症中的功效研究。

图27。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗HT55人结肠癌中的功效研究。

图28。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗Calu-6人肺癌中的功效研究。

图29。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗Colo-205人结肠癌中的功效研究。

图30。嵌合3F1、嵌合2B9、嵌合2D3和嵌合2G9抗Bv8抗体在治疗HPAC人胰腺癌中的功效研究。

图31。嵌合2G9,h2G9.K4G1.v19和h2G9.K4G1.v55抗Bv8抗体在治疗Calu-6人肺癌中的功效研究。

图32。嵌合2D3,h2G9.K4G1.Polish、h2G9.K4G1.v19和h2G9.K4G1.v55抗Bv8抗体在治疗HM7人结肠癌中的功效研究。

图33。嵌合2G9、h2G9.K4G1.v19和h2G9.K4G1.v55抗Bv8抗体在治疗A673人横纹肌肉瘤癌症中的功效研究。

图34。嵌合2G9、h2G9.K4G1.v19和h2G9.K4G1.v55抗Bv8抗体在治疗HT55人结肠癌中的功效研究。

图35。嵌合2G9、h2G9.K4G1.v19和h2G9.K4G1.v55抗Bv8抗体在治疗Colo-205人结肠癌中的功效研究。

图36。嵌合2G9、h2G9.K4G1.v19和h2G9.K4G1.v55抗Bv8抗体在治疗HPAC人胰腺癌中的功效研究。

图37。抗Bv8小鼠抗体（3F1和2B9）在有和无抗VEGF抗体下治疗LXFL529人肺非小细胞癌细胞中的功效研究。

图38显示Lewis肺癌(LLC)同种异体移植物响应作为单一药剂或与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的生长抑制。

图39显示HM7人结肠直肠癌异种移植物响应作为单一药剂或与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的生长抑制。

图40显示H460人非小细胞肺癌异种移植物响应与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的生长抑制。

图41显示携带H460人非小细胞肺癌异种移植物的小鼠响应与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的延长的存活。

图42显示HT29人结肠直肠癌异种移植物响应单独的与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的生长抑制。

图43显示携带HT29人结肠直肠癌异种移植物的小鼠响应单独的与抗VEGF抗体组合的抗Bv8抗体的延长的存活。

发明详述

本发明提供抗Bv8抗体的方法、组合物、试剂盒和制品。本文中提供这些方法、组合物、试剂盒和制品的详情。

通用技术

本文中描述或提到的技术和规程一般得到了本领域技术人员的充分理解，而且通常利用常规方法得以采用，诸如例如下列文献中记载的广泛应用的方法：Sambrook et al.,Molecular Cloning:A Laboratory Manual 3rd.edition(2001)Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(F.M.Ausubel,et al.eds.,(2003))；丛书METHODS IN ENZYMOLOGY(Academic Press,Inc.):PCR2:A PRACTICAL APPROACH(M.J.MacPherson,B.D.Hames and G.R.Taylor eds.(1995))；Harlow and Lane,eds.(1988)ANTIBODIES,ALABORATORY MANUAL；及ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney,ed.(1987))。

定义

术语“Bv8”、“Bv8同系物”、“起动蛋白原-2”（也称作“PK2”、“KAL4”、和“MIT1”）在本文中可互换使用，指全长多肽和/或全长多肽的活性片段。天然序列Bv8涵盖Bv8的天然存在前原(prepro)、原(pro)和成熟形式和截短形式，天然存在变体形式（例如可变剪接形式和天然存在等位变体。在某些实施方案中，天然Bv8氨基酸序列显示于SEQ ID NO：235至239。人和鼠Bv8序列也披露于例如Wechselberger et al.(FEBS Lett.462:177-181(1999))及Li etal.(Mol.Pharm.59:692-698(2001))。

“Bv8受体”指Bv8结合的和介导Bv8生物学特性的分子。因此，术语“Bv8受体”在其含义内包括PKR1/GPR73/EG-VEGF受体-1/PROKR1和PKR2/GPR73L1/EG-VEGF受体-2/PROKR2(LeCouter et al.,2003,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,100:2685-2690;Lin et al.,2002,J.Biol.Chem.,277:19276-19280;Masuda et al.,2002,Biochem.Biophys.Res.Commun.,293:396-402)。

术语“生物学活性”和“有生物学活性的”就多肽而言指分子特异性结合并调节细胞应答（例如增殖、迁移等）的能力。细胞应答还包括那些经由受体介导的，包括但不限于迁移和/或增殖。

关于Bv8，为了本文中的目的，“有活性的”或“活性”指保留天然的或天然发生的Bv8的生物学和/或免疫学活性的Bv8形式，其中“生物学”活性指天然的或天然发生的Bv8所拥有的，在诱导针对抗原性表位的抗体生成的能力以外，由天然的或天然发生的Bv8引起的生物学功能（或是抑制性或是刺激性的），而“免疫学”活性指天然的或天然发生的Bv8所拥有的，诱导针对抗原性表位的抗体生成的能力。在某些实施方案中，Bv8的生物学活性是调控髓样细胞动员、促进肿瘤血管发生和/或促进肿瘤转移的能力。

术语“抗Bv8抗体”或“结合Bv8的抗体”指能够以足够亲和力结合Bv8，使得该抗体可用作靶向Bv8的诊断剂和/或治疗剂的抗体。在某些实施方案中，结合Bv8的抗体具有≤1μM、≤100nM、≤10nM、≤1nM、≤0.1nM、或≤0.01nM的解离常数(Kd)。在某些实施方案中，抗Bv8抗体结合在来自不同物种的Bv8之间保守的Bv8表位。在某些实施方案中，抗Bv8抗体与选自下组的抗体结合人Bv8上相同表位：嵌合2G9，h2G9.K4G1.v19，h2G9.K4G1.v52，h2G9.K4G1.v55，h2G9.K4G1.v73和嵌合2D3。在某些实施方案中，抗Bv8抗体与选自下组的抗体竞争对人Bv8的结合：嵌合2G9，h2G9.K4G1.v19，h2G9.K4G1.v52，h2G9.K4G1.v55，h2G9.K4G1.v73和嵌合2D3。

“结合亲和力”通常指分子（例如抗体）的单一结合位点与其结合配偶体（例如抗原）之间全部非共价相互作用总和的强度。除非另有说明，在用于本文时，“结合亲和力”指反映结合对的成员（例如抗体与抗原）之间1:1相互作用的内在结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可用解离常数(Kd)来表述。亲和力可通过本领域知道的常用方法来测量，包括本文中所描述的。低亲和力抗体通常缓慢的结合抗原且趋于容易解离，而高亲和力抗体通常更快速的结合抗原且趋于保持更长时间的结合。本领域知道测量结合亲和力的多种方法，其中任一种都可用于本发明的目的。下文描述了具体的示例性实施方案。

在某些实施方案中，依照本发明的“Kd”或“Kd值”是通过如下测定法所述使用Fab型式的抗Bv8抗体及其抗原进行的放射性标记抗原结合测定法(RIA)来测量的：通过在存在未标记抗原的滴定系列的条件下，用最小浓度的¹²⁵I标记抗原平衡，然后用抗Fab抗体包被的平板捕捉结合的抗原来测量Fab对抗原的溶液结合亲和力(Chen,et al.,(1999)J.Mol Biol 293:865-881)。为了确定测定条件，用50mM碳酸钠(pH 9.6)中的5μg/ml捕捉用抗Fab抗体(CappelLabs)包被微量滴定板(Dynex)过夜，随后用PBS中的2%(w/v)牛血清清蛋白在室温（约23°C）封闭2-5小时。在非吸附平板(Nunc #269620)中，将100pM或26pM[¹²⁵I]-抗原与连续稀释的目的Fab混合（例如与Presta et al.,(1997)Cancer Res.57:4593-4599中抗VEGF抗体，Fab-12的评估一致）。然后将目的Fab保温过夜；不过，保温可持续更长时间（例如65个小时）以保证达到平衡。此后，将混合物转移至捕捉板以进行室温保温（例如1小时）。然后除去溶液，并用含0.1% Tween^TM-20的PBS洗板8次。平板干燥后，加入150μl/孔闪烁液(MicroScint^TM-20;Packard)，然后在TopCount伽马计数器(Packard)上对平板计数10分钟。选择各Fab给出小于或等于最大结合之20%的浓度用于竞争性结合测定法。依照另一实施方案，Kd或Kd值是通过表面等离振子共振测定法使用BIAcore^TM-2000或BIAcore^TM-3000(BIAcore,Inc.,Piscataway,NJ)在25°C使用固定化抗原CM5芯片在约10个响应单位(RU)测量的。简而言之，依照供应商的说明书用盐酸N-乙基-N’-(3-二甲基氨基丙基)-碳化二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活化羧甲基化右旋糖苷生物传感器芯片(CM5,BIAcore Inc.)。用10mM乙酸钠pH 4.8将抗原稀释至5μg/ml（约0.2μM），然后以5μl/分钟的流速注入至获得约10个响应单位(RU)的偶联蛋白质。注入抗原后，注入1M乙醇胺以封闭未反应基团。为了进行动力学测量，在25°C以约25μl/分钟的流速注入在含0.05% Tween^TM-20的PBS(PBST)中两倍连续稀释的Fab（0.78nM至500nM）。使用简单一对一朗格缪尔(Langmuir)结合模型(BIAcore^TM Evaluation Software version 3.2)通过同时拟合结合和解离传感图计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。平衡解离常数(Kd)以比率k_off/k_on计算。参见例如Chen,Y.,et al.,(1999)J.Mol.Biol.293:865-881。如果根据上文表面等离振子共振测定法，结合速率超过10⁶M^-1S^-1，那么结合速率可使用荧光淬灭技术来测定，即根据分光计诸如配备了断流装置的分光光度计(a stop-flowequipped spectrophometer)(Aviv Instruments)或8000系列SLM-Aminco分光光度计(ThermoSpectronic)中用搅拌比色杯的测量，在存在浓度渐增的抗原的条件下，测量PBS,pH 7.2中的20nM抗抗原抗体（Fab形式）在25°C的荧光发射强度（激发=295nm；发射=340nm，16nm带通）的升高或降低。

“分离的”核酸分子指已经鉴定且与抗体核酸的天然来源中通常与之关联的至少一种污染性核酸分子分开的核酸分子。分离的核酸分子不同于在自然界中发现它时的形式或背景。分离的核酸分子因此与存在于天然细胞中时的核酸分子有区别。然而，分离的核酸分子包括通常表达该抗体的细胞中所包含的核酸分子，例如当所述核酸分子在所述细胞中的染色体定位不同于它在天然细胞中的染色体定位时。

术语“载体”在用于本文时意指能够运输与其连接的其它核酸的核酸分子。一类载体是“质粒”，指其中可连接另外的DNA区段的环状双链DNA环。另一类载体是噬菌体载体。另一类载体是病毒载体，其中可将另外的DNA区段连接到病毒基因组中。某些载体能够在其所导入的宿主细胞中自主复制（例如具有细菌复制起点的细菌载体和附加型哺乳动物载体）。其它载体（例如非附加型哺乳动物载体）可在导入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，由此随着宿主基因组一起复制。此外，某些载体能够指导与其可操作连接的基因表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”（或简称为“重组载体”或“表达载体”）。通常，在重组DNA技术中有用的表达载体常常是质粒形式。在本说明书中，“质粒”和“载体”可互换使用。

“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互换使用，指任何长度的核苷酸聚合物，包括DNA和RNA。核苷酸可以是脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、经过修饰的核苷酸或碱基、和/或其类似物，或者是可通过DNA或RNA聚合酶或者通过合成反应掺入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含经过修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸及其类似物。如果有的话，对核苷酸结构的修饰可以在装配聚合物之前或之后进行。核苷酸序列可以由非核苷酸组分中断。多核苷酸可以在合成后进一步修饰，诸如通过与标记物偶联。其它类型的修饰包括例如“帽”，将一个或多个天然存在的核苷酸用类似物替代，核苷酸间修饰诸如例如具有不带电荷连接（例如膦酸甲酯、磷酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等）和具有带电荷连接（例如硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯等）的修饰，含有悬垂模块(pendant moiety)诸如例如蛋白质（例如核酸酶、毒素、抗体、信号肽、聚L-赖氨酸等）的修饰、具有嵌入剂（例如吖啶、补骨脂素等）的修饰、含有螯合剂（例如金属、放射性金属、硼、氧化性金属等）的修饰、含有烷化剂的修饰、具有经修饰连接（例如α端基异构核酸(anomeric nucleic acid)等）的修饰、以及未修饰形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖类中的任何羟基可以用例如膦酸(phosphonate)基团、磷酸(phosphate)基团替换，用标准保护基团保护，或活化以制备与别的核苷酸的别的连接，或者可偶联至固体和半固体支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20个碳原子的有机加帽基团模块取代。其它羟基也可衍生成标准保护基团。多核苷酸还可含有本领域普遍知道的核糖或脱氧核糖糖类的类似物形式，包括例如2'-氧-甲基、2'-氧-烯丙基、2'-氟-或2'-叠氮-核糖，碳环糖类似物，α-端基异构糖，差向异构糖诸如阿拉伯糖、木糖或来苏糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，无环类似物及脱碱基核苷类似物诸如甲基核糖核苷。可用备选连接基团替换一个或多个磷酸二酯连接。这些备选连接基团包括但不限于以下实施方案，其中磷酸酯用P(O)S（“硫代酸酯”(thioate)）、P(S)S（“二硫代酸酯”(dithioate)）、(O)NR₂（“酰胺酯”(amidate)）、P(O)R、P(O)OR'、CO或CH₂（“甲缩醛”(formacetal)）替代，其中R或R'各自独立为H或者取代或未取代的烷基（1-20个C），任选含有醚(-O-)连接、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸中的所有连接都必需是相同的。前述描述适用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和DNA。

“寡核苷酸”在用于本文时一般指短的多核苷酸，一般是单链，一般是合成的，长度一般但不是必需小于约200个核苷酸。术语“寡核苷酸”与“多核苷酸”并不互相排斥。上文关于多核苷酸的描述平等且完全适用于寡核苷酸。

术语“抗体”和“免疫球蛋白”以最广义互换使用，包括单克隆抗体（例如全长或完整单克隆抗体）、多克隆抗体、多价抗体、多特异性抗体（例如双特异性抗体，只要它们展现出期望的生物学活性），而且还可以包括某些抗体片段（如本文中更为详细描述的）。抗体可以是人的、人源化的和/或亲和力成熟的。

“分离的”抗体指已经鉴定且自其天然环境的一种成分分开和/或回收的抗体。其天然环境的污染性成分指将会干扰该抗体的诊断或治疗用途的物质，可包括酶、激素、和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选的实施方案中，将抗体纯化至(1)根据Lowry法的测定，抗体重量超过95%，最优选重量超过99%，(2)足以通过使用转杯式测序仪获得至少15个残基的N-末端或内部氨基酸序列的程度，或(3)根据还原性或非还原性条件下的SDS-PAGE及使用考马斯蓝或优选银染色，达到同质。既然抗体天然环境的至少一种成分不会存在，那么分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体。然而，分离的抗体通常将通过至少一个纯化步骤来制备。

“可变的”指可变域中的某些部分在抗体序列间差异广泛且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的实情。然而，变异性并非均匀分布于抗体的整个可变域。它集中于轻链和重链可变域中称作互补决定区或高变区（CDR或HVR，在本文中可互换使用）的三个区段。可变域中较保守的部分称作框架区(FR)。天然重链和轻链的可变域各自包含四个FR，它们大多采取β-折叠片构象，通过形成环状连接且在有些情况中形成β-折叠片结构一部分的三个HVR连接。每条链中的HVR通过FR非常接近的保持在一起，并与另一条链的HVR一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat et al.,序列ofProteins of Immunological Interest,第5版,National Institute of Health,Bethesda,MD.(1991))。恒定域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应器功能，诸如抗体依赖性细胞的（细胞）毒性中抗体的参与。

用木瓜蛋白酶消化抗体产生两个相同的抗原结合片段，称为“Fab”片段，各自具有一个抗原结合位点，及一个剩余的“Fc”片段，其名称反映了它易于结晶的能力。胃蛋白酶处理产生一个F(ab')₂片段，它具有两个抗原结合位点且仍能够交联抗原。

“Fv”是包含完整抗原识别和结合位点的最小抗体片段。在双链Fv种类中，此区由紧密、非共价结合的一个重链可变域和一个轻链可变域的二聚体组成。在单链Fv种类中，一个重链可变域和一个轻链可变域可以通过柔性肽接头共价相连，使得轻链和重链在与双链Fv种类类似的“二聚体”结构中相结合。正是在这种构造中，各可变域的三个HVR相互作用而在V_H-V_L二聚体表面上确定了抗原结合位点。六个HVR共同赋予抗体以抗原结合特异性。然而，即使是单个可变域（或只包含对抗原特异的三个HVR的半个Fv）也具有识别和结合抗原的能力，只是亲和力低于完整结合位点。

Fab片段还包含轻链的恒定域和重链的第一恒定域(CH1)。Fab'片段与Fab片段的不同之处在于重链CH1结构域的羧基末端增加了少数残基，包括来自抗体铰链区的一个或多个半胱氨酸。Fab'-SH是本文中对其中恒定域半胱氨酸残基携带游离硫醇基的Fab'的称谓。F(ab')₂抗体片段最初是作为在Fab'片段之间有铰链半胱氨酸的成对Fab'片段生成的。还知道抗体片段的其它化学偶联。

根据其恒定域的氨基酸序列，来自任何脊椎动物物种的抗体（免疫球蛋白）的“轻链”可归入两种截然不同的型中的一种，称作卡帕(κ)和拉姆达(λ)。

根据其重链恒定域的氨基酸序列，免疫球蛋白可归入不同的类。免疫球蛋白有五大类：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中有些可进一步分为亚类（同种型），例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。将与不同类的免疫球蛋白对应的重链恒定域分别称作α、δ、ε、γ和μ。不同类的免疫球蛋白的亚基结构和三维构造是众所周知的。

“抗体片段”只包含完整抗体的一部分，其中所述部分优选保留该部分存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项、优选大多数或所有功能。抗体片段的例子包括Fab、Fab'、F(ab′)₂和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子；及由抗体片段形成的多特异性抗体。在一个实施方案中，抗体片段包含完整抗体的抗原结合位点，如此保留结合抗原的能力。在另一个实施方案中，抗体片段，例如包含Fc区的抗体片段，保留通常与Fc区存在于完整抗体中时通常与之有关的至少一项生物学功能，诸如FcRn结合、抗体半衰期调控、ADCC功能和补体结合。在一个实施方案中，抗体片段是体内半衰期与完整抗体基本上相似的单价抗体。例如，这样的抗体片段可包含一个抗原结合臂且其与能够赋予该片段以体内稳定性的Fc序列相连。

术语“高变区”、“HVR”或“HV”在用于本文时指抗体可变域中序列上高度可变和/或形成结构上定义的环的区域。通常，抗体包含六个HVR：三个在VH中（H1、H2、H3），三个在VL中（L1、L2、L3）。在天然抗体中，H3和L3展示这六个HVR的最大多样性，而且认为特别是H3在赋予抗体以精密特异性中发挥独特作用。参见例如Xu et al.,Immunity 13:37-45(2000);Johnsonand Wu,in Methods in Molecular Biology 248:1-25(Lo,ed.,Human Press,Totowa,NJ,2003)。事实上，仅由重链组成的天然存在camelid抗体在缺乏轻链时是有功能的且稳定的。参见例如Hamers-Casterman et al.,Nature363:446-448(1993);Sheriff et al.,Nature Struct.Biol.3:733-736(1996)。

本文中使用且涵盖许多HVR的叙述。Kabat互补决定区(CDR)是以序列变异性为基础的，而且是最常用的(Kabat et al.,序列of Proteins ofImmunological Interest,5th Ed.Public Health Service,National Institutes ofHealth,Bethesda,MD.(1991))。Chothia改为指结构环的位置(Chothia and LeskJ.Mol.Biol.196:901-917(1987))。AbM HVR代表Kabat HVR与Chothia结构环之间的折衷，而且得到Oxford Molecular的AbM抗体建模软件的使用。“接触(contact)”HVR是以对可获得的复合物晶体结构的分析为基础的。下文记录了这些HVR中每一个的残基。

HVR可包括如下“延伸的HVR”：VL中的24-36或24-34(L1)、46-56或50-56(L2)和89-97或89-96(L3)及VH中的26-35(H1)、50-65或49-65(H2)和93-102、94-102或95-102(H3)。对于这些定义中的每一个，可变区残基是依照Kabat等,见上文编号的。

“框架”或“FR”残基指可变域中除本文中所定义的高变区残基外的那些残基。

非人（例如鼠）抗体的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的序列的嵌合抗体。在一个实施方案中，人源化抗体指人免疫球蛋白（受体抗体）中的HVR残基用具有期望特异性、亲和力和/或能力的非人物种（供体抗体）诸如小鼠、大鼠、兔或非人灵长类的HVR残基替换的免疫球蛋白。在有些情况中，将人免疫球蛋白的FR残基用相应的非人残基替换。此外，人源化抗体可包含在受体抗体或供体抗体中没有找到的残基。进行这些修饰可以是为了进一步改进抗体的性能。一般而言，人源化抗体将包含至少一个、通常两个基本上整个如下可变域，其中整个或基本上整个高变环对应于非人免疫球蛋白的高变环，且整个或基本上整个FR是人免疫球蛋白序列的FR。人源化抗体任选还将包含至少部分免疫球蛋白恒定区(Fc)，通常是人免疫球蛋白的恒定区。更多细节参见例如Jones et al.,Nature 321:522-525(1986);Riechmann et al.,Nature 332:323-329(1988);Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2:593-596(1992)。还可参见例如Vaswani and Hamilton,Ann.Allergy，Asthma &Immunol.1:105-115(1998);Harris,Biochem.Soc.Transactions 23:1035-1038(1995);Hurle and Gross,Curr.Op.Biotech.5:428-433(1994);及美国专利No.6,982,321和7,087,409。

“人抗体”指拥有与由人生成的抗体的氨基酸序列对应的氨基酸序列和/或使用本文所公开的用于生成人抗体的任何技术生成的抗体。人抗体的这种定义明确排除包含非人抗原结合残基的人源化抗体。人抗体可使用本领域已知的多种技术来生成，包括噬菌体展示文库(Hoogenboom and Winter,J.Mol.Biol.227:381(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581(1991))。还可用于制备人单克隆抗体的是以下文献中记载的方法：Cole et al.,Monoclonal Antibodiesand Cancer Therapy,Alan R.Liss,p.77(1985);Boerner et al.,J.Immunol.147(1):86-95(1991)。还可参见van Dijk and van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.,5:368-74(2001)。可通过给已经修饰以应答抗原性刺激而生成人抗体但其内源基因组已经失能的转基因动物例如经过免疫的异种小鼠(xenomice)施用抗原来制备人抗体(参见例如6,075,181和6,150,584，关于XENOMOUSE^TM技术)。还可参见例如Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103:3557-3562(2006)，关于经人B-细胞杂交瘤技术生成的人抗体。

术语“单克隆抗体”在用于本文时指从一群基本上同质的抗体获得的抗体，即构成群体的各个抗体是相同的，除了可以以极小量存在的可能突变（例如天然存在突变）外。如此，修饰语“单克隆”表明抗体不是不同抗体混合物的特征。在某些实施方案中，此类单克隆抗体典型的包括包含能结合靶物的多肽序列的抗体，其中靶物结合多肽序列是通过包括从众多多肽序列中选择单一靶物结合多肽序列在内的过程得到的。例如，选择过程可以是从众多克隆（诸如杂交瘤克隆、噬菌体克隆或重组DNA克隆的集合）中选择独特克隆。应当理解，所选择的靶物结合序列可进一步改变，例如为了提高对靶物的亲和力、将靶物结合序列人源化、提高其在细胞培养物中的产量、降低其在体内的免疫原性、创建多特异性抗体等，而且包含改变后的靶物结合序列的抗体也是本发明的单克隆抗体。与典型的包含针对不同决定簇（表位）的不同抗体的多克隆抗体制备物不同，单克隆抗体制备物的每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。在它们的特异性之外，单克隆抗体制备物的优点在于它们通常未受到其它免疫球蛋白的污染。

修饰语“单克隆”表明抗体从基本上同质的抗体群获得的特征，不应解释为要求通过任何特定方法来生产抗体。例如，将依照本发明使用的单克隆抗体可通过多种技术来生成，包括例如杂交瘤法(例如Kohler and Milstein,Nature 256:495-97(1975);Hongo et al.,Hybridoma,14(3):253-260(1995);Harlow et al.,Antibodies:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor LaboratoryPress,2nd ed.1988;Hammerling et al.,于:Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas,563-681,Elsevier,N.Y.,1981)、重组DNA法(参见例如美国专利No.4,816,567)、噬菌体展示技术(参见例如Clackson et al.,Nature 352:624-628(1991);Marks et al.,J.Mol.Biol.222:581-597(1992);Sidhu et al.,J.Mol.Biol.338(2):299-310(2004);Lee et al.,J.Mol.Biol.340(5):1073-1093(2004);Fellouse,Proc.Nat.Acad.Sci.USA 101(34):12467-12472(2004);及Lee et al.,J.Immunol.Methods 284(1-2):119-132(2004))、及用于在具有部分或整个人免疫球蛋白基因座或编码人免疫球蛋白序列的基因的动物中生成人或人样抗体的技术(参见例如WO 1998/24893;WO 1996/34096;WO 1996/33735;WO1991/10741;Jakobovits et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:2551(1993);Jakobovits et al.,Nature 362:255-258(1993);Bruggemann et al.,Year inImmuno.7:33(1993);美国专利No.5,545,807;5,545,806;5,569,825;5,625,126;5,633,425;5,661,016;Marks et al.,Bio/Technology 10:779-783(1992);Lonberget al.,Nature 368:856-859(1994);Morrison,Nature 368:812-813(1994);Fishwild et al.,Nature Biotechnol.14:845-851(1996);Neuberger,NatureBiotechnol.14:826(1996);及Lonberg and Huszar,Intern.Rev.Immunol.13:65-93(1995))。

单克隆抗体在本文中明确包括“嵌合”抗体，其中重链和/或轻链的一部分与衍生自特定物种或属于特定抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，而链的剩余部分与衍生自另一物种或属于另一抗体类别或亚类的抗体中的相应序列相同或同源，以及此类抗体的片段，只要它们展现出期望的生物学活性(参见例如美国专利No.4,816,567;Morrison et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81:6851-6855(1984))。嵌合抗体包括“灵长类化”抗体，其中抗体的抗原结合区衍生自通过例如用感兴趣抗原免疫猕猴而生成的抗体。

术语“多特异性抗体”以最广义使用，并且具体涵盖具有多表位特异性的抗体。此类多特异性抗体包括但不限于：包含重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)的抗体，其中V_HV_L单元具有多表位特异性；具有两个或更多个V_L和V_H域的抗体，其中每个V_HV_L单元结合不同表位；具有两个或更多个单一可变域的抗体，其中每个单一可变域结合不同表位；全长抗体；抗体片段，诸如Fab、Fv、dsFv、scFv、双抗体、双特异性双抗体和三抗体及共价或非共价连接的抗体片段。依照一个实施方案，多特异性抗体是以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM、或0.1μM至0.001pM的亲和力结合每个表位的IgG抗体。

“多表位特异性”指特异性结合相同或不同抗原上两种或更多种不同表位的能力。例如，如本文中使用的，“双特异性”指结合两种不同表位的能力。“单特异性”指只结合一种表位的能力。

表述“单域抗体”(sdAb)或“单一可变域(SVD)抗体”一般指如下的抗体，其中单一可变域（V_H或V_L）能赋予抗原结合。换言之，单一可变域不需要与另一可变域相互作用来识别靶抗原。单域抗体的例子包括那些自驼类动物(camelid)（美洲驼和骆驼）和软骨鱼（例如绞口鲨）衍生的及那些自重组方法自人和小鼠抗体衍生的(Nature(1989)341:544-546;Dev CompImmunol(2006)30:43-56;Trend Biochem Sci(2001)26:230-235;TrendsBiotechnol(2003):21:484-490;WO 2005/035572;WO 03/035694;Febs Lett(1994)339:285-290;WO00/29004;WO 02/051870)。

“单链Fv”或“scFv”抗体片段包含抗体的V_H和V_L结构域，其中这些结构域存在于一条多肽链上。一般地，scFv多肽在V_H与V_L结构域之间进一步包含多肽接头，其使得scFv能够形成结合抗原的期望结构。关于scFv的综述参见Pluckthun，于《The Pharmacology of Monoclonal Antibodies》，第113卷，Rosenburg和Moore编，Springer-Verlag，New York，第269-315页，1994。

“抗原”指抗体可选择性结合的预定抗原。靶抗原可以是多肽、碳水化合物、核酸、脂质、半抗原或其它天然存在的或合成的化合物。

术语“双抗体”指具有两个抗原结合位点的小抗体片段，该片段在同一条多肽链（V_H-V_L）中包含相连的重链可变域(V_H)和轻链可变域(V_L)。通过使用过短的接头使得同一条链上的两个结构域之间不能配对，迫使这些结构域与另一条链的互补结构域配对，从而产生两个抗原结合位点。双抗体更完整的记载于例如EP 404,097;WO 93/11161;及Hollinger et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:6444-6448(1993)。三抗体(Triabody)和四抗体(tetrabody)也记载于Hudson et al.,Nat.Med.9:129-134(2003)。

术语“依照Kabat的可变域残基编号”或“依照Kabat的氨基酸位置编号”及其变体指Kabat et al.,见上文中的抗体编辑用于重链可变域或轻链可变域的编号系统。使用此编号系统，实际的线性氨基酸序列可包含较少或另外的氨基酸，对应于可变域FR或HVR的缩短或插入。例如，重链可变域可包含H2残基52后的单一氨基酸插入（依照Kabat为残基52a）及重链FR残基82后的插入残基（例如依照Kabat为残基82a、82b和82c等）。给定抗体的Kabat残基编号可通过将抗体序列与“标准”Kabat编号序列对比同源区来确定。

Kabat编号系统一般在提及可变域中的残基（大约是轻链残基1-107和重链残基1-113）时使用(例如Kabat et al.,序列of Immunological Interest.5th Ed.Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。“EU编号系统”或“EU指数”一般在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用（例如Kabat et al.,见上文中报道的EU指数）。“Kabat中的EU指数”指人IgG1 EU抗体的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体可变域中的残基编号指根据Kabat编号系统的残基编号方式。除非本文中另有说明，提及抗体恒定域中的残基编号指根据EU编号系统的残基编号方式（例如参见美国临时申请60/640,323，关于EU编号方式的图）。

“阻断性”抗体或“拮抗性”抗体指抑制或降低其所结合的抗原的生物学活性的抗体。某些阻断性抗体或拮抗性抗体实质或完全抑制抗原的生物学活性。

短语“基本上相似”或“基本上相同”在用于本文时表示两个数值（例如一个涉及本发明的抗体而另一个涉及参照/比较抗体）之间足够高的相似程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值（例如Kd值）所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有很小的或没有生物学显著性。作为参照/比较值的函数，所述两个数值之间的差异例如小于约50%、小于约40%、小于约30%、小于约20%、和/或小于约10%。

短语“实质性降低”或“实质性不同”在用于本文时表示两个数值（通常一个与某分子有关而另一个与参照/比较分子有关）之间足够高的差异程度，以致本领域技术人员将认为在用所述数值（例如Kd值）所测量的生物学特性背景内两个数值之间的差异具有统计学显著性。作为参照/比较分子该数值的函数，所述两个数值之间的差异例如大于约10％，大于约20%，大于约30%，大于约40%，和/或大于约50%。

抗体“效应器功能”指那些可归于抗体Fc区（天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区）且随抗体同种型而变化的生物学活性。抗体效应器功能的例子包括：C1q结合和补体依赖性细胞毒性(CDC)；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体（例如B细胞受体）下调；和B细胞活化。

术语“Fc区”在本文中用于定义免疫球蛋白重链的C-末端区，包括天然序列Fc区和变体Fc区。虽然免疫球蛋白重链Fc区的边界可以变化，但是人IgG重链Fc区通常定义为自其Cys226或Pro230位置的氨基酸残基至羧基末端的区段。Fc区的C-末端赖氨酸（残基447，依照EU编号系统）可以消除，例如在生产或纯化抗体的过程中，或者通过对编码抗体重链的核酸进行重组工程。相应的，完整抗体组合物可包括消除了所有K447残基的抗体群、没有消除K447残基的抗体群、或者混合了有和没有K447残基的抗体的抗体群。

“功能性Fc区”拥有天然序列Fc区的“效应器功能”。例示性的“效应器功能”包括C1q结合、CDC、Fc受体结合、ADCC、吞噬作用、细胞表面受体（例如B细胞受体；BCR）下调等。此类效应器功能一般要求Fc区与结合域（例如抗体可变域）联合，而且可使用多种测定法来评估，例如本文定义中所公开的。

“天然序列Fc区”包含与自然界中找到的Fc区的氨基酸序列相同的氨基酸序列。天然序列人Fc区包括天然序列人IgG1 Fc区（非A和A同种异型）、天然序列人IgG2 Fc区、天然序列人IgG3 Fc区、及天然序列人IgG4Fc区，及其天然存在变体。

“变异Fc区”包含由于至少一处氨基酸修饰，优选一处或多处氨基酸替代而与天然序列Fc区有所不同的氨基酸序列。优选的是，变异Fc区具有与天然序列Fc区或与亲本多肽的Fc区相比至少一处氨基酸替代，例如在天然序列Fc区中或在亲本多肽的Fc区中具有约1处至约10处氨基酸替代，优选约1处至约5处氨基酸替代。变异Fc区在本文中将优选与天然序列Fc区和/或亲本多肽的Fc区拥有至少约80%的同源性，最优选与其至少约90%的同源性，更优选与其至少约95%的同源性。

“Fc受体”或“FcR”描述结合抗体Fc区的受体。优选的FcR是天然序列人FcR。此外，优选的FcR是结合IgG抗体的FcR（γ受体），包括FcγRI、FcγRII和FcγRIII亚类的受体，包括这些受体的等位变体和可变剪接形式。FcγRII受体包括FcγRIIA（“活化受体”）和FcγRIIB（“抑制受体”），它们具有相似的氨基酸序列，区别主要在其胞质结构域中。活化受体FcγRIIA在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的活化基序(ITAM)。抑制受体FcγRIIB在其胞质结构域中包含免疫受体基于酪氨酸的抑制基序(ITIM)(参见综述Daёron,Annu.Rev.Immunol.15:203-234(1997))。FcR的综述参见Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-492(1991);Capel et al.,Immunomethods 4:25-34(1994);de Haas et al.,J.Lab.Clin.Med.126:330-41(1995)。术语“FcR”在本文中还涵盖其它FcR，包括那些未来将会鉴定的。

术语“Fc受体”或“FcR”还包括新生儿受体，FcRn，它负责将母体IgG转移给胎儿(Guyer et al.,J.Immunol.117:587(1976)和Kim et al.,J.Immunol.24:249(1994))并调节免疫球蛋白的动态平衡。测量对FcRn的结合的方法是已知的(参见例如Ghetie and Ward,Immunol.Today 18:592-8(1997))；Ghetie et al.,Nature Biotechnology,15(7):637-640(1997);Hinton et al.,J.Biol.Chem.279(8):6213-6216(2004);WO 2004/92219(Hinton et al.)。

可测定人FcRn高亲和力结合多肽与人FcRn的体内结合和血清半衰期，例如在表达人FcRn的转基因小鼠或经转染的人细胞系中，或者在施用了Fc变体多肽的灵长类动物中。PCT申请WO 00/42072(Presta)和美国申请No.12/577,967(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见Shields et al.,J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。

“人效应细胞”指表达一种或多种FcR并行使效应器功能的白细胞。在某些实施方案中，该细胞至少表达FcγRIII并行使ADCC效应器功能。介导ADCC的人白细胞的例子包括外周血单个核细胞(PBMC)、天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞。效应细胞可以从其天然来源分离，例如血液。

“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”或“ADCC”指其中结合到某些细胞毒性细胞（例如NK细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞）上存在的Fc受体(FcR)上的分泌型Ig使得这些细胞毒性效应细胞能够特异性结合携带抗原的靶细胞，随后用细胞毒素杀死靶细胞的细胞毒性形式。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII、和FcγRIII。Ravetchand Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。为了评估目的分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定法，诸如美国专利No.5,500,362或5,821,337或美国专利No.6,737,056(Presta)中所记载的。可用于此类测定法的效应细胞包括PBMC和NK细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所披露的。

“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”指存在补体时对靶细胞的溶解。经典补体途径的激活是由补体系统第一组分(C1q)结合抗体（适宜亚类的）起始的，该抗体已结合至其关联抗原。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所记载的。具有更改的Fc区氨基酸序列（具有变异Fc区的多肽）及提高或降低的C1q结合能力的多肽变体记载于例如美国专利No.6,194,551 B1和WO1999/51642。还可参见例如Idusogie et al.,J.Immunol.164:4178-4184(2000)。

“含Fc区的抗体”指包含Fc区的抗体。Fc区的C-末端赖氨酸（依照EU编号系统的残基447）可以消除，例如在纯化抗体的过程中或者通过重组改造编码抗体的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的抗体的组合物可包含具有K447的抗体、消除了所有K447的抗体、或具有与没有K447残基的抗体的混合物。

就本文目的而言，“受体人框架”是包含衍生自人免疫球蛋白框架或人共有框架的VL或VH框架之氨基酸序列的框架。“衍生自”人免疫球蛋白框架或人共有框架的受体人框架可包含与之相同的氨基酸序列，或者可包含预先存在的氨基酸序列变化。当存在预先存在的氨基酸变化时，优选存在不超过5个，优选4个或更少，或者3个或更少预先存在的氨基酸变化。当VH中存在预先存在的氨基酸变化时，优选那些变化只位于71H、73H和78H中的三个、两个或一个位置；例如，位于那些位置的氨基酸残基可以是71A、73T和/或78A。在一个实施方案中，VL受体人框架在序列上与VL人免疫球蛋白框架序列或人共有框架序列相同。

“人共有框架”指代表人免疫球蛋白VL或VH框架序列选集中最常见的氨基酸残基的框架。通常，人免疫球蛋白VL或VH序列选集来自可变区序列亚组。通常，序列亚组是如Kabat等人的亚组。在一个实施方案中，对于VL，亚组是如Kabat等人的亚组κIV。在一个实施方案中，对于VH，亚组是如Kabat等人的亚组I。

“VH亚组I共有框架”包含从Kabat等人的可变重链亚组I中的氨基酸序列获得的共有序列。

“VH亚组III共有框架”包含从Kabat等人的可变重链亚组III中的氨基酸序列获得的共有序列。

“VL亚组IV共有框架”包含从Kabat等人的可变轻链κ亚组IV中的氨基酸序列获得的共有序列。

“VL亚组I共有框架”包含从Kabat等人的可变轻链κ亚组I中的氨基酸序列获得的共有序列。

“药物”或“药剂”指用于治疗所讨论的病症或其症状、或副作用的活性药物。

“病症”或“疾病”指任何会受益于本发明的物质/分子或方法的治疗的疾患。这包括慢性和急性病症或疾病，包括那些使哺乳动物倾向于所讨论病症的病理状况。本文中待治疗的病症的非限制性例子包括恶性和良性肿瘤；癌瘤、母细胞瘤和肉瘤。

疾病的“病理”包括所有危及患者康乐的现象。例如，这包括但不限于异常的或不可控的细胞生长、转移、对邻近细胞正常机能的干扰、细胞因子或其它分泌产物的异常水平释放、炎性或免疫学应答的抑制或恶化、等。

术语“细胞增殖性病症”和“增殖性病症”指与一定程度的异常细胞增殖有关的病症。在一个实施方案中，细胞增殖性病症指癌症。

“肿瘤”在用于本文时指所有肿瘤性细胞生长和增殖，无论是恶性的还是良性的，及所有癌前(pre-cancerous)和癌性细胞和组织。术语“癌症”、“癌性”、“细胞增殖性紊乱”、“增殖性紊乱”和“肿瘤”在本文中提到时并不互相排斥。

术语“癌症”和“癌性”指向或描述哺乳动物中特征通常为细胞生长/增殖不受调控的生理疾患。癌症的例子包括但不限于癌瘤、淋巴瘤、母细胞瘤、肉瘤和白血病。此类癌症的更具体例子包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、脑垂体癌、食管癌、星形细胞瘤、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、肺的腺癌、肺的鳞癌、腹膜癌、肝细胞癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝瘤(hepatoma)、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer,renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌(hepatic carcinoma)、脑癌、子宫内膜癌、睾丸癌、胆管癌、胆囊癌、胃癌、黑素瘤、及各种类型的头和颈癌。

血管发生失调可导致可通过本发明的组合物和方法来治疗的许多病症。这些病症包括非赘生性的和赘生性的疾患。赘生病包括但不限于上文所描述的那些。

适合用本发明的抗体和抗体片段治疗的非新生物状况包括但不限于例如不想要的或异常的肥大，良性前列腺肥大，疼痛（急性和慢性），包括炎性疼痛，关节炎，类风湿性关节炎(RA)，银屑病关节炎，神经变性性疾病（例如阿尔茨海默(Alzheimer)氏病，AIDS相关痴呆，帕金森(Parkinson)氏病，肌萎缩侧索硬化，视网膜色素变性，脊髓性肌萎缩和小脑变性），自身免疫性疾病，银屑病，银屑病斑块，结节病，动脉粥样硬化，动脉粥样硬化斑块，桥本(Hasimoto)氏甲状腺炎，血管发生性病症，眼的疾病诸如假定的眼组织胞浆菌病综合征(presumed ocular histoplasmosis syndrome)，视网膜血管形成，糖尿病性视网膜病和其它增殖性视网膜病包括早产儿视网膜病，糖尿病性肾病，晶状体后显微组织增生，新生血管性青光眼，老年性黄斑变性，糖尿病性黄斑水肿，角膜新血管形成，角膜移植片新血管形成，角膜移植片排斥，视网膜/脉络膜新血管形成，眼角的新血管形成（发红），眼新血管疾病，血管病，涉及血管上皮细胞异常增殖的状况，血管再狭窄，格-巴(Guillain-Barre)综合征，息肉诸如结肠息肉、家族性腺瘤息肉病、鼻息肉或胃肠息肉，胃肠溃疡，婴儿肥厚性幽门狭窄，泌尿阻塞综合征，门内特里埃(Menetrier)氏病，分泌型腺瘤或蛋白质流失综合征(protein loss syndrome)，纤维腺瘤，呼吸疾病，胆囊炎，神经纤维瘤病，动静脉畸形(AVM)，脑膜瘤，血管瘤，血管纤维瘤，甲状腺增生（包括格雷夫斯(Grave)氏病），角膜和其它组织移植，炎性疾病，慢性炎症，肺的炎症，急性肺损伤/ARDS，败血病/脓毒症，慢性阻塞性肺病，原发性肺动脉高压，恶性肺部积液，粥样斑，烧伤、外伤、辐射、中风、缺氧或缺血后的水肿，心肌梗死所致水肿，缺血损伤，脑缺血事件后的损伤，脑水肿（例如与急性中风/闭合性头部损伤/外伤有关的），由血小板聚集引起的血栓，纤维变性性或水肿性疾病诸如肝硬化，肺纤维化，carcoidosis，throiditis，系统性高粘滞综合征，滑膜炎症(synovialinflammation)，RA中的血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成，骨相关病理学，诸如骨关节炎(OA)、佝偻病和骨质疏松，顽固性腹水，骨或关节发炎，骨髓发育异常综合征(Myelodysplastic Syndrome)，再生障碍性贫血，肾或肝的；T细胞介导的超敏感性疾病，佩吉特(Paget)氏病，多囊性肾病，第三空间流体病(3rd spacing of fluid diseases)（胰腺炎、间隔综合征、烧伤、肠病）、慢性炎症诸如IBD（克莱恩(Crohn)氏病和溃疡性结肠炎），肾病症，肾同种异体移植物排斥，移植物抗宿主病或移植物排斥，炎性肠病，急性和慢性肾病（包括增殖性肾小球肾炎和糖尿病诱发的肾病），肾病综合征，不希望有的或异常的组织块生长（非癌症），肥胖，脂肪组织块生长，血友病性关节，肥厚性瘢痕，毛发生长的抑制，奥斯勒-韦伯-朗迪(Osler Weber-Rendu)综合征，脓性肉芽肿晶状体后纤维组织增生，硬皮病，沙眼，血管粘连，滑膜炎，皮肤的超敏反应，皮肤病症包括银屑病和皮炎，湿疹，光老化（例如由UV照射人皮肤引起的），肥厚性瘢痕形成，生殖疾患，诸如子宫内膜异位、卵巢过刺激综合征、多囊性卵巢病、先兆子痫、功能障碍性子宫出血、或月经频多，子宫类纤维瘤，早产，腹水，心包积液（诸如与心包炎有关的），胸腔积液，内毒素性休克和真菌感染，某些微生物感染，包括选自腺病毒、汉坦病毒(hantaviruses)、布氏疏螺旋体(Borrelia burgdorferi)、耶尔森氏菌属(Yersinia spp.)和百日咳博德特氏菌(Bordetella pertussis)的微生物病原体，和精神病学病症（例如精神分裂症、双相型抑郁、孤独症、和注意力缺陷障碍）。

术语“癌前”指典型地在癌之前或发展成癌的疾患或生长。“癌前”生长会具有以异常细胞周期调节、增殖、或分化为特征的细胞，这些可通过细胞周期调节、细胞增殖、或分化的标志物来测定。

“发育异常”指组织、器官、或细胞的任何异常生长或发育。在某些实施方案中，发育异常是高级的或癌前的。

“转移”指癌自其原发部位传播至身体中的其它位置。癌细胞能脱离原发性肿瘤，渗透入淋巴和血管，经由血流而循环和在身体中其它地方的正常组织中的远端病灶（转移）中生长。转移可以是局部的或远端的。转移是一个连续过程，视肿瘤细胞自原发性肿瘤脱落、经由血流或淋巴系统而传播、并在远端部位停止而定。在新的部位，该细胞建立血供且能生长至形成危及生命的团块。在某些实施方案中，术语转移性肿瘤指能够转移，但尚未转移至身体中别处的组织或器官的肿瘤。在某些实施方案中，术语转移性肿瘤指已经转移至身体中别处的组织或器官的肿瘤。

肿瘤细胞内的刺激性和抑制性分子途径调节这种行为，而且肿瘤细胞与远端部位中的宿主细胞之间的相互作用也是重要的。

“非转移的”指良性的或保留在原发部位且尚未渗透入淋巴或血管系统或渗透至原发部位以外的组织的癌症。一般而言，非转移性癌症指作为0期、I期、或II期癌症和偶尔的III期癌症的任何癌症。

如本文中使用的，“转移前器官(pre-metastatic organ)”或“转移前组织”指其中没有检测到来自原发性肿瘤或来自身体另一部分的癌细胞的器官或组织。在某些实施方案中，如本文中使用的，转移前器官或转移前组织指处于癌细胞从原发性肿瘤或从身体另一部分传播至此器官或组织发生之前的阶段的器官或组织。转移前器官或转移前组织的例子包括但不限于肺、肝、脑、卵巢、骨和骨髓。

“原发性肿瘤”或“原发性癌”指初始的癌症，而不是位于受试者身体中另一组织、器官、或位置中的转移病灶。

“转移器官”或“转移组织(metastatic organ)”以最广义使用，指其中来自原发性肿瘤的癌细胞或来自身体另一部分的癌细胞已经传播的器官或组织。转移器官和转移组织的例子包括但不限于肺、肝、脑、卵巢、骨和骨髓。

“癌症复发”在本文中指癌症在治疗后回来，而且包括癌症在原发性器官中的回来，以及远端复发，即癌症在原发性器官以外发生。

“肿瘤载荷”指身体中癌细胞的数目、肿瘤的尺寸、或癌的量。肿瘤载荷也称作肿瘤负荷。

“肿瘤数目”指肿瘤的数目。

在用于本文时，“治疗”或“处理”指试图改变所治疗个体或细胞的自然进程的临床干预，可以是为了预防或在临床病理学的进程中进行。治疗的期望效果包括预防疾病的发生或复发、缓解症状、削弱疾病的任何直接或间接病理学后果、减缓疾病进展的速率、改善或减轻疾病状态、及免除或改善预后。在有些实施方案中，本发明的抗体用于延迟疾病或病症的发生/发展。

术语“抗肿瘤组合物”指可用于治疗癌症的组合物，其包含至少一种活性治疗剂，例如“抗癌剂”。治疗剂（例如抗癌剂）的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它用于治疗癌症的药剂诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂（例如酪氨酸激酶抑制剂）、HER1/EGFR抑制剂（例如erlotinib (TARCEVA^TM)、血小板衍生生长因子抑制剂（例如Gleevec^TM(Imatinib Mesylate)）、COX-2抑制剂（例如塞来考昔(celecoxib)）、干扰素、细胞因子、能与ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体中的一种或多种靶物结合的拮抗剂（例如中和性抗体）、TRAIL/Apo2、及其它生物活性和有机化学剂等。本发明还包括它们的组合。

术语“抗癌疗法”或“癌症疗法”指在治疗癌症中有用的疗法。抗癌治疗剂的例子包括但不限于例如化疗剂、生长抑制剂、细胞毒剂、放射疗法中所使用的药剂、抗血管发生剂、凋亡剂、抗微管蛋白剂、和其它治疗癌症的药剂，诸如抗HER-2抗体、抗CD20抗体、表皮生长因子受体(EGFR)拮抗剂（例如酪氨酸激酶抑制剂）、HER1/EGFR抑制剂（例如erlotinib

）、血小板衍生生长因子抑制剂（例如

(Imatinib Mesylate)）、COX-2抑制剂（例如celecoxib）、

(cetuximab,Imclone)、干扰素、细胞因子、结合一种或多种以下靶物的拮抗剂（例如中和性抗体）（ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受体、TRAIL/Apo2）、和其它生物活性和有机化学剂，等。本发明还包括它们的组合。

“放射疗法”或“放疗”指使用定向伽马射线或贝塔射线来诱发对细胞的足够损伤，以限制细胞正常发挥功能的能力或全然破坏细胞。应当领会，本领域知道许多方式来确定治疗的剂量和持续时间。典型的治疗作为一次施用来给予，而典型的剂量范围为每天10-200个单位（戈瑞(Gray)）。

术语“VEGF”和“VEGF-A”在用于本文时指165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子及相关的121个、189个和206个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子，如Leung等(1989)Science 246:1306和Houck等(1991)Mol.Endocrin,5:1806所述，及其天然存在等位基因形式和加工形式。术语“VEGF”还指来自非人物种诸如小鼠、大鼠或灵长类动物的VEGF。有时，来自特定物种的VEGF表示如下，hVEGF表示人VEGF，mVEGF表示鼠VEGF，等等。术语“VEGF”还用于指包含165个氨基酸的人血管内皮细胞生长因子的氨基酸第8-109位或第1-109位的截短形式多肽。本申请中可能通过例如“VEGF(8-109)”、“VEGF(1-109)”、“VEGF-A₁₀₉”或“VEGF₁₆₅”来鉴别任何此类形式VEGF。“截短的”天然VEGF的氨基酸位置如天然VEGF序列中所示编号。例如，截短的天然VEGF中的第17位氨基酸（甲硫氨酸）也是天然VEGF中的第17位（甲硫氨酸）。截短的天然VEGF具有与天然VEGF相当的对KDR和Flt-1受体的结合亲和力。

“VEGF拮抗剂”指能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性（包括但不限于其与一种或多种VEGF受体的结合）的分子。VEGF拮抗剂包括但不限于抗VEGF抗体及其抗原结合片段、特异性结合VEGF由此使其隔绝与一种或多种受体结合的受体分子及衍生物、抗VEGF受体抗体、VEGF受体拮抗剂（诸如VEGFR酪氨酸激酶的小分子抑制剂）和结合VEGF的免疫粘附素诸如VEGF Trap。如本文中所使用的，术语“VEGF拮抗剂”明确包括结合VEGF且能够中和、阻断、抑制、消除、降低或干扰VEGF活性的分子。如此，术语“VEGF活性”明确包括VEGF介导的VEGF生物学活性。

关于VEGF多肽或“VEGF活性”的术语“生物学活性”和“有生物学活性的”指与全长和/或截短的VEGF有关的物理/化学特性和生物学功能。在某些实施方案中，VEGF活性为诱导和/或刺激和/或促进血管发生。在某些实施方案中，VEGF活性为诱导和/或刺激和/或促进新血管形成。在某些实施方案中，VEGF活性为诱导和/或调控血管通透性。在某些实施方案中，VEGF活性为诱导和/或刺激和/或促进内皮细胞迁移和/或内皮细胞增殖。

抗VEGF中和性抗体遏制多种人肿瘤细胞系在裸鼠中的生长(Kim et al.,Nature 362:841-844(1993);Warren et al.,J.Clin.Invest.95:1789-1797(1995);

et al.,Cancer Res.56:4032-4039(1996);Melnyk et al.,Cancer Res.56:921-924(1996))，而且还抑制缺血性视网膜病症的模型中的眼内血管发生(Adamis et al.,Arch.Ophthalmol.114:66-71(1996))。

术语“抗VEGF抗体”或“结合VEGF的抗体”指能够以足够亲和力和特异性结合VEGF的抗体，该抗体在靶向VEGF中可用作诊断剂和/或治疗剂。例如，本发明的抗VEGF抗体可在靶向和干预其中涉及VEGF活性的疾病或疾患中用作治疗剂。参见例如美国专利6,582,959,6,703,020;WO98/45332;WO96/30046;WO94/10202;WO2005/044853;EP 0666868B1;美国专利申请20030206899,20030190317,20030203409,20050112126,20050186208和20050112126;Popkov et al.,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004);及WO2005012359。所选择的抗体通常具有针对VEGF的足够强的结合亲和力。例如所述抗体可以以介于100nM-1pM之间的K_d值结合hVEGF。抗体亲和力可以通过例如基于表面等离振子共振的测定法（诸如BIAcore测定法，如PCT申请公开号WO2005/012359所记载的）；酶联免疫吸附测定法(ELISA)；和竞争测定法（例如RIA）来测定。所述抗体可以进行其它生物学活性测定法，例如为了评估其作为治疗剂的效力。此类测定法是本领域已知的，而且依赖于所述抗体的靶抗原和预期用途。例子包括HUVEC抑制测定法；肿瘤细胞生长抑制测定法（如例如WO 89/06692所记载的）；抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)和补体介导的细胞毒性(CDC)测定法（美国专利5,500,362）；及激动性活性或造血测定法（参见WO 95/27062）。抗VEGF抗体通常不会结合其它VEGF同源物，诸如VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D或VEGF-E，也不会结合其它生长因子，诸如PlGF、PDGF或bFGF。在一个实施方案中，抗VEGF抗体包括与杂交瘤ATCC HB 10709所生成的单克隆抗VEGF抗体A4.6.1结合相同表位的单克隆抗体；重组人源化抗VEGF单克隆抗体(参见Presta et al.(1997)Cancer Res.57:4593-4599)，包括但不限于称为贝伐单抗即“贝伐单抗(BV)”、也称为“rhuMAb VEGF”或“”的抗体。

是当前商品化的。贝伐单抗包含突变的人IgG1框架区和来自鼠抗体A.4.6.1（其阻断人VEGF结合其受体）的抗原结合互补决定区。贝伐单抗大约93%的氨基酸序列（包括大部分框架区）衍生自人IgG1，而大约7%的序列衍生自A4.6.1。贝伐单抗具有约149,000道尔顿的分子量，而且是糖基化的。贝伐单抗和其它人源化抗VEGF抗体进一步记载于2005年2月26日公告的美国专利No.6,884,879。别的抗VEGF抗体包括G6或B20系列抗体（例如G6-23、G6-31、B20-4.1），如PCT申请公开号WO2005/012359所记载的。别的优选的抗体参见美国专利No.7,060,269,6,582,959,6,703,020;6,054,297;WO98/45332;WO 96/30046;WO94/10202;EP 0666868B1;美国专利申请公开号2006009360,20050186208,20030206899,20030190317,20030203409和20050112126;及Popkov et al.,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004)。

如本文中使用的，术语“B20系列多肽”指包括结合VEGF的抗体的多肽。B20系列多肽包括但不限于自B20抗体的序列衍生的抗体或美国公开文本No.20060280747,美国公开文本No.20070141065和/或美国公开文本No.20070020267中记载的B20衍生抗体，通过述及明确将这些专利申请的内容收入本文。在一个实施方案中，B20系列多肽是美国公开文本No.20060280747,美国公开文本No.20070141065和/或美国公开文本No.20070020267中记载的B20-4.1。在另一个实施方案中，B20系列多肽是PCT公开文本No.WO2009/073160中记载的B20-4.1.1，通过述及将其完整公开内容收入本文。

如本文中使用的，术语“G6系列多肽”指包括结合VEGF的抗体的多肽。G6系列多肽包括但不限于自G6抗体的序列衍生的抗体或美国公开文本No.20060280747,美国公开文本No.20070141065和/或美国公开文本No.20070020267中记载的G6衍生抗体。美国公开文本No.20060280747,美国公开文本No.20070141065和/或美国公开文本No.20070020267中记载的G6系列多肽包括但不限于G6-8,G6-23和G6-31。

“血管发生因子”或“血管发生剂”指刺激血管发育，例如促进血管发生(angiogenesis)、内皮细胞生长、血管稳定性和/或血管生成(vasculogenesis)等的生长因子。例如，血管发生因子包括但不限于例如VEGF和VEGF家族的成员（VEGF-B、VEGF-C和VEGF-D）、PlGF、PDGF家族、成纤维细胞生长因子家族(FGF)、TIE配体（血管生成素）、ephrin、德尔塔样配体4(DLL4)、Del-1、酸性(aFGF)和碱性(bFGF)成纤维细胞生长因子、卵泡抑素(Follistatin)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、肝细胞生长因子(HGF)/散射因子(SF)、白介素-8(IL-8)、Leptin、Midkine、神经纤毛蛋白、胎盘生长因子、血小板衍生内皮细胞生长因子(PD-ECGF)、血小板衍生生长因子尤其是PDGF-BB或PDGFR-β、Pleiotrophin(PTN)、Progranulin、Proliferin、转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等。它还包括加速伤口愈合的因子，诸如生长激素、胰岛素样生长因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生长因子(EGF)、CTGF及其家族的成员、及TGF-α和TGF-β。参见例如Klagsbrun and D’Amore(1991)Annu.Rev.Physiol.53:217-39;Streit andDetmar(2003)Oncogene 22:3172-3179;Ferrara & Alitalo(1999)NatureMedicine 5(12):1359-1364;Tonini等(2003)Oncogene 22:6549-6556(例如列举已知血管发生因子的表1);Sato(2003)Int.J.Clin.Oncol.8:200-206。

“抗血管发生剂”或“血管发生抑制剂”指或直接或间接抑制血管发生(angiogenesis)、血管生成(vasculogenesis)、或不想要的血管通透性的小分子量物质、多核苷酸、多肽、分离的蛋白质、重组蛋白、抗体、或其偶联物或融合蛋白。例如，抗血管发生剂是上文定义的血管发生剂的抗体或其它拮抗剂，例如VEGF的抗体、VEGF受体的抗体、阻断VEGF受体信号传导的小分子（例如PTK787/ZK2284、SU6668、

(sunitinib malate)、AMG706）。抗血管发生剂还包括天然血管发生抑制剂，例如血管他丁(angiostatin)、内皮他丁(endostatin)等。参见例如Klagsbrun and D’Amore,Annu.Rev.Physiol.,53:217-39(1991);Streit and Detmar,Oncogene,22:3172-3179(2003)(例如列举恶性黑素瘤中抗血管发生疗法的表3);Ferrara & Alitalo,Nature Medicine 5(12):1359-1364(1999);Tonini et al.,Oncogene,22:6549-6556(2003)(例如列举抗血管发生因子的表2);Sato Int.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)(例如列举临床试验中所使用的抗血管发生剂的表1)。在某些实施方案中，抗血管发生剂是抗VEGF剂，诸如抗VEGF抗体（例如贝伐单抗）

术语“细胞毒剂”在用于本文时指抑制或防止细胞的功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语意图包括：放射性同位素，例如At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²和Lu的放射性同位素；化疗剂，例如甲氨蝶呤(methotrexate)、阿霉素(adriamycin)、长春花生物碱类(vinca alkaloids)（长春新碱(vincristine)、长春碱(vinblastine)、依托泊苷(etoposide)）、多柔比星(doxorubicin)、美法仑(melphalan)、丝裂霉素(mitomycin)C、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、柔红霉素(daunorubicin)或其它嵌入剂；酶及其片段，诸如溶核酶；抗生素；和毒素，诸如小分子毒素或者细菌、真菌、植物或动物起源的酶活毒素，包括其片段和/或变体；及下文披露的各种抗肿瘤药或抗癌药。下文记载了其它细胞毒剂。杀肿瘤药引起肿瘤细胞的破坏。

“毒素”指能够对细胞的生长或增殖产生有害效果的任何物质。

“化疗剂”指可用于治疗癌症的化学化合物。化疗剂的实例包括烷化剂类(alkylating agents)，诸如塞替派(thiotepa)和环磷酰胺(cyclophosphamide)

磺酸烷基酯类(alkyl sulfonates)，诸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)和哌泊舒凡(piposulfan)；氮丙啶类(aziridines)，诸如苯佐替派(benzodepa)、卡波醌(carboquone)、美妥替派(meturedepa)和乌瑞替派(uredepa)；乙撑亚胺类(ethylenimines)和甲基蜜胺类(methylamelamines)，包括六甲蜜胺(altretamine)、三乙撑蜜胺(triethylenemelamine)、三乙撑磷酰胺(triethylenephosphoramide)、三乙撑硫代磷酰胺(triethylenethiophosphoramide)和三羟甲蜜胺(trimethylolomelamine)；番荔枝内酯类(acetogenin)（尤其是布拉他辛(bullatacin)和布拉他辛酮(bullatacinone)）；δ-9-四氢大麻酚(tetrahydrocannabinol)（屈大麻酚(dronabinol)，

）；β-拉帕醌(lapachone)；拉帕醇(lapachol)；秋水仙素类(colchicines)；白桦脂酸(betulinicacid)；喜树碱(camptothecin)（包括合成类似物托泊替康(topotecan)

CPT-11（伊立替康(irinotecan)，

）、乙酰喜树碱、东莨菪亭(scopoletin)和9-氨基喜树碱）；苔藓抑素(bryostatin)；callystatin；CC-1065（包括其阿多来新(adozelesin)、卡折来新(carzelesin)和比折来新(bizelesin)合成类似物）；鬼臼毒素(podophyllotoxin)；鬼臼酸(podophyllinic acid)；替尼泊苷(teniposide)；隐藻素类(cryptophycins)（特别是隐藻素1和隐藻素8）；多拉司他汀(dolastatin)；duocarmycin（包括合成类似物，KW-2189和CB1-TM1）；艾榴塞洛素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵抑素(spongistatin)；氮芥类(nitrogen mustards)，诸如苯丁酸氮芥(chlorambucil)、萘氮芥(chlornaphazine)、胆磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀(estramustine)、异环磷酰胺(ifosfamide)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥(mechlorethamine oxide hydrochloride)、美法仑(melphalan)、新氮芥(novembichin)、苯芥胆甾醇(phenesterine)、泼尼莫司汀(prednimustine)、曲磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥(uracil mustard)；亚硝脲类(nitrosoureas)，诸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)和雷莫司汀(ranimustine)；抗生素类，诸如烯二炔类抗生素(enediyne)（如加利车霉素(calicheamicin)，尤其是加利车霉素γ1I和加利车霉素ωI1（参见例如Nicolaou et al.,Angew.ChemIntl.Ed.Engl.,33:183-186(1994)）；CDP323，一种口服α-4整联蛋白抑制剂；蒽环类抗生素(dynemicin)，包括dynemicin A；埃斯波霉素(esperamicin)；以及新制癌素(neocarzinostatin)发色团和相关色蛋白烯二炔类抗生素发色团）、阿克拉霉素(aclacinomycin)、放线菌素(actinomycin)、氨茴霉素(anthramycin)、偶氮丝氨酸(azaserine)、博来霉素(bleomycin)、放线菌素C(cactinomycin)、carabicin、洋红霉素(carminomycin)、嗜癌霉素(carzinophilin)、色霉素(chromomycin)、放线菌素D(dactinomycin)、柔红霉素(daunorubicin)、地托比星(detorubicin)、6-二氮-5-氧-L-正亮氨酸、多柔比星(doxorubicin)（包括

吗啉代多柔比星、氰基吗啉代多柔比星、2-吡咯代多柔比星、盐酸多柔比星脂质体注射剂脂质体多柔比星TLC D-99

PEG化脂质体多柔比星

和脱氧多柔比星）、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊达比星(idarubicin)、麻西罗霉素(marcellomycin)、丝裂霉素类(mitomycins)诸如丝裂霉素C、霉酚酸(mycophenolic acid)、诺拉霉素(nogalamycin)、橄榄霉素(olivomycin)、培洛霉素(peplomycin)、泊非霉素(potfiromycin)、嘌呤霉素(puromycin)、三铁阿霉素(quelamycin)、罗多比星(rodorubicin)、链黑菌素(streptonigrin)、链佐星(streptozocin)、杀结核菌素(tubercidin)、乌苯美司(ubenimex)、净司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代谢物类，诸如甲氨蝶呤、吉西他滨(gemcitabine)

培美曲塞(pemetrexed)

替加氟(tegafur)卡培他滨(capecitabine)

埃坡霉素(epothilone)和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，诸如二甲叶酸(denopterin)、甲氨蝶呤、蝶酰三谷氨酸(pteropterin)、三甲曲沙(trimetrexate)；嘌呤类似物，诸如氟达拉滨(fludarabine)、6-巯基嘌呤(mercaptopurine)、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鸟嘌呤(thioguanine)；嘧啶类似物，诸如安西他滨(ancitabine)、阿扎胞苷(azacitidine)、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷(cytarabine)、双脱氧尿苷(dideoxyuridine)、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依诺他滨(enocitabine)、氟尿苷(floxuridine)；雄激素类，诸如卡鲁睾酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、表硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睾内酯(testolactone)；抗肾上腺类，诸如氨鲁米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；叶酸补充剂，诸如亚叶酸(folinic acid)；醋葡醛内酯(aceglatone)；醛磷酰胺糖苷(aldophosphamide glycoside)；氨基乙酰丙酸(aminolevulinic acid)；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；bestrabucil；比生群(bisantrene)；依达曲沙(edatraxate)；地磷酰胺(defosfamide)；地美可辛(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；elfornithine；依利醋铵(elliptinium acetate)；epothilone；依托格鲁(etoglucid)；硝酸镓；羟脲(hydroxyurea)；香菇多糖(lentinan)；氯尼达明(lonidamine)；美登木素生物碱类(maytansinoids)，诸如美登素(maytansine)和安丝菌素(ansamitocin)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌达醇(mopidamol)；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁(pentostatin)；蛋氨氮芥(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；2-乙基酰肼(ethylhydrazide)；丙卡巴肼(procarbazine)；多糖复合物（JHS NaturalProducts,Eugene,OR）；雷佐生(razoxane)；根霉素(rhizoxin)；西索菲兰(sizofiran)；螺旋锗(spirogermanium)；细交链孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亚胺醌(triaziquone)；2,2',2″-三氯三乙胺；单端孢菌素类(trichothecenes)（尤其是T-2毒素、疣孢菌素(verrucarin)A、杆孢菌素(roridin)A和蛇行菌素(anguidin)）；乌拉坦(urethan)；长春地辛(vindesine)（

）；达卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥(mannomustine)；二溴甘露醇(mitobronitol)；二溴卫矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；gacytosine；阿糖胞苷(arabinoside)（“Ara-C”）；塞替派(thiotepa)；类紫杉醇(taxoids)，例如帕利他塞(paclitaxel)

清蛋白改造的纳米颗粒剂型帕利他塞（ABRAXANE^TM）和多西他塞(doxetaxel)

苯丁酸氮芥(chlorambucil)；6-硫鸟嘌呤(thioguanine)；巯基嘌呤(mercaptopurine)；甲氨蝶呤(methotrexate)；铂类似物，诸如顺铂(cisplatin)、奥沙利铂(oxaliplatin)(例如

)和卡铂(carboplatin)；长春药类(vincas)，其阻止微管蛋白聚合形成微管，包括长春碱(vinblastine)

长春新碱(vincristine)

长春地辛(vindesine)(

)、和长春瑞滨(vinorelbine)

依托泊苷(etoposide)（VP-16）；异环磷酰胺(ifosfamide)；米托蒽醌(mitoxantrone)；亚叶酸(leucovorin)；能灭瘤(novantrone)；依达曲沙(edatrexate)；道诺霉素(daunomycin)；氨基蝶呤(aminopterin)；伊本膦酸盐(ibandronate)；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类维A酸(retinoids)，诸如维A酸(retinoic acid)，包括贝沙罗汀(bexarotene)

二膦酸盐类(bisphosphonates)，诸如氯膦酸盐(clodronate)（例如

或

）、依替膦酸钠(etidronate)

NE-58095、唑来膦酸/唑来膦酸盐(zoledronicacid/zoledronate)

阿伦膦酸盐(alendronate)

帕米膦酸盐(pamidronate)

替鲁膦酸盐(tiludronate)

或利塞膦酸盐(risedronate)

以及曲沙他滨(troxacitabine)（1,3-二氧戊环核苷胞嘧啶类似物）；反义寡核苷酸，特别是抑制涉及异常细胞增殖的信号途经中的基因表达的反义寡核苷酸，诸如例如PKC-α、Raf、H-Ras和表皮生长因子受体(EGF-R)；疫苗，诸如

疫苗和基因疗法疫苗，例如

疫苗、

疫苗和

疫苗；拓扑异构酶1抑制剂（例如

）；rmRH（例如

）；BAY439006(sorafenib;Bayer)；SU-11248(sunitinib,Pfizer)；哌立福辛(perifosine)，COX-2抑制剂（如塞来考昔(celecoxib)或艾托考昔(etoricoxib)），蛋白体抑制剂（例如PS341）；bortezomib

CCI-779；tipifarnib（R11577）；orafenib，ABT510；Bcl-2抑制剂，诸如oblimersensodium

pixantrone；EGFR抑制剂（见下文定义）；酪氨酸激酶抑制剂（见下文定义）；丝氨酸-苏氨酸激酶抑制剂，诸如雷帕霉素(rapamycin)(sirolimus,

)；法尼基转移酶抑制剂，诸如lonafarnib(SCH 6636,SARASARTM)；及任何上述各项的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述各项的组合，诸如CHOP（环磷酰胺、多柔比星、长春新碱和泼尼松龙联合疗法的缩写）和FOLFOX（奥沙利铂（ELOXATIN^TM）联合5-FU和亚叶酸的治疗方案的缩写）。

本文中定义的化疗剂包括起调节、降低、阻断或抑制可促进癌生长的激素效果作用的“抗激素剂”或“内分泌治疗剂”类。它们自身可以是激素，包括但不限于：具有混合的激动剂/拮抗剂特性的抗雌激素类，包括他莫昔芬(tamoxifen)(NOLVADEX)、4-羟基他莫昔芬、托瑞米芬(toremifene)

艾多昔芬(idoxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、雷洛昔芬(raloxifene)曲沃昔芬(trioxifene)、那洛昔芬(keoxifene)，和选择性雌激素受体调节剂类(SERM)，诸如SERM3；没有激动剂特性的纯的抗雌激素类，诸如氟维司群(fulvestrant)

和EM800（此类药剂可阻断雌激素受体(ER)二聚化、抑制DNA结合、提高ER周转、和/或遏制ER水平）；芳香酶抑制剂类，包括类固醇芳香酶抑制剂类，诸如福美坦(formestane)和依西美坦(exemestane)和非类固醇芳香酶抑制剂类，诸如阿那曲唑(anastrozole)

来曲唑(letrozole)

和氨鲁米特(aminoglutethimide)，和其它芳香酶抑制剂类，包括伏氯唑(vorozole)

醋酸甲地孕酮(megestrol acetate)

法倔唑(fadrozole)和4(5)-咪唑；促黄体生成激素释放激素激动剂类，包括亮丙瑞林(leuprolide)(

和

)、戈舍瑞林(goserelin)、布舍瑞林(buserelin)和曲普瑞林(triptorelin)；性类固醇类(sex steroids)，包括妊娠素类(progestine)，诸如醋酸甲地孕酮和醋酸甲羟孕酮(medroxyprogesteroneacetate)，雌激素类，诸如二乙基己烯雌酚(diethylstilbestrol)和普雷马林(premarin)，和雄激素类/类视黄酸类，诸如氟甲睾酮(fluoxymesterone)、所有反式视黄酸(transretionic acid)和芬维A胺(fenretinide)；奥那司酮(onapristone)；抗孕酮类；雌激素受体下调剂类(ERD)；抗雄激素类，诸如氟他米特(flutamide)、尼鲁米特(nilutamide)和比卡米特(bicalutamide)；及任何上述物质的药学可接受盐、酸或衍生物；以及两种或更多种上述物质的组合。

“生长抑制剂”在用于本文时指在体外或在体内抑制细胞（诸如表达Bv8的细胞）生长的化合物或组合物。因此，生长抑制剂可以是显著降低处于S期的细胞（诸如表达Bv8的细胞）百分比的药剂。生长抑制剂的例子包括阻断细胞周期行进（处于S期以外的位置）的药剂，诸如诱导G1停滞和M期停滞的药剂。经典的M期阻断剂包括长春药类(vincas)（长春新碱(vincristine)和长春碱(vinblastine)）、紫杉烷类(taxanes)、和拓扑异构酶II抑制剂诸如多柔比星(doxorubicin)、表柔比星(epirubicin)、柔红霉素(daunorubicin)、依托泊苷(etoposide)和博来霉素(bleomycin)。那些阻滞G1的药剂也溢出进入S期停滞，例如DNA烷化剂类诸如他莫昔芬(tamoxifen)、泼尼松(prednisone)、达卡巴嗪(dacarbazine)、双氯乙基甲胺(mechlorethamine)、顺铂(cisplatin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil)和ara-C。更多信息可参见Mendelsohn和Israel编，《The Molecular Basis of Cancer》，第1章，题为“Cellcycle regulation,oncogenes,and antieioplastic drugs”，Murakaini等人，W.B.Saunders，Philadelphia，1995，例如第13页。紫杉烷类（紫杉醇(paclitaxel)和多西他赛(docetaxel)）是衍生自紫杉树的抗癌药。衍生自欧洲紫杉的多西他赛(

Rhone-Poulenc Rorer)是紫杉醇(

Bristol-MyersSquibb)的半合成类似物。紫杉醇和多西他赛促进由微管蛋白二聚体装配成微管并通过防止解聚使微管稳定，导致对细胞中有丝分裂的抑制。

“多柔比星(Doxorubicin)”是蒽环类抗生素。多柔比星的完整化学名是(8S-顺式)-10-[(3-氨基-2,3,6-三脱氧-α-L-来苏-吡喃己糖基)氧基]-7,8,9,10-四氢-6,8,11-三羟基-8-(羟基乙酰基)-1-甲氧基-5,12-萘二酮。

(8S-cis)-10-[(3-amino-2,3,6-trideoxy-α-L-lyxo-hexapyranosyl)oxy]-7,8,9,10-tetrahydro-6,8,11-trihydroxy-8-(hydroxyacetyl)-1-methoxy-5,12-naphthacenedione

含“Fc区多肽”指包含Fc区的多肽，诸如抗体或免疫粘附素（见下文定义）。Fc区的C-末端赖氨酸（依照EU编号系统的残基447）可以消除，例如在纯化多肽的过程中或者通过重组改造编码多肽的核酸。因此，依照本发明包含具有Fc区的多肽的组合物可包含具有K447的多肽、消除了所有K447的多肽、或具有与没有K447残基的多肽的混合物。

“个体”、“受试者”或“患者”指脊椎动物。在某些实施方案中，脊椎动物为哺乳动物。哺乳动物包括但不限于牲畜（诸如牛）、运动用动物、宠物（诸如猫、犬、和马）、灵长类动物、小鼠和大鼠。在某些实施方案中，哺乳动物为人。

“有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的治疗或预防效果的量。

本发明的物质/分子、拮抗剂或激动剂的“治疗有效量”可根据诸如个体的疾病状态、年龄、性别和体重及该物质/分子、激动剂或拮抗剂在个体中引发期望应答的能力等因素而变化。治疗有效量还指该物质/分子、激动剂或拮抗剂的治疗有益效果胜过任何有毒或有害后果的量。“预防有效量”指在必需的剂量和时间上有效实现期望的预防效果的量。通常而非必然，由于预防剂量是在疾病发作之前或在疾病的早期用于受试者的，因此预防有效量会低于治疗有效量。

“顽固性”或“不应性”指疾病或疾患对治疗有抗性或没有响应（例如，即使给予治疗，新生性浆细胞的数目仍增加）。在某些实施方案中，术语“顽固性”或“不应性”指对任何先前治疗（包括但不限于VEGF拮抗剂、抗血管发生剂和化疗治疗）有抗性或没有响应。在某些实施方案中，术语“顽固性”或“不应性”指疾病或疾患对任何先前治疗（包括VEGF拮抗剂、抗血管发生剂和/或化疗治疗）的内在不响应性。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。

“复发”指患者的病退行回到其从前的患病状态，尤其是在表观恢复(apparent recovery)或部分恢复(partial recovery)后症状的回复。在某些实施方案中，复发状态指回到先前治疗（包括但不限于VEGF拮抗剂、抗血管发生剂和/或化疗治疗）前的病的过程或回到先前治疗前的病。在某些实施方案中，复发状态指在对癌症疗法（包括VEGF拮抗剂、抗血管发生剂和/或化疗治疗）的初始强响应之后，回到病的过程或回到病。在某些实施方案中，VEGF拮抗剂是抗VEGF抗体。

术语“功效”在本文中以最广义使用，而且指免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白产生期望效果的能力。在某些实施方案中，功效指在饱和水平对免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白观察到的最大效果。在某些实施方案中，功效指免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白的EC₅₀。在某些实施方案中，功效指免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白的效力。在某些实施方案中，功效指免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白对疾病的过程或持续时间产生有益效果的能力，包括本文所述临床好处。

“EC₅₀”指免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白诱导介于基线和最大值之间半途的响应的浓度。在某些实施方案中，EC₅₀代表如下的免疫球蛋白、抗体或Fc融合蛋白浓度，此时观察到其最大效果的50%。在某些实施方案中，EC₅₀代表获得50%最大体内效果所需要的血浆或血清浓度。

在治疗癌症中的功效可通过检测本发明的抗体、融合蛋白、偶联分子、或组合物抑制或降低癌性细胞生长或转移或改善或减轻一种或多种与癌症有关的症状的能力来证明。若施用本发明的抗体、融合蛋白、偶联分子、或组合物后有例如癌性细胞生长或转移的降低、一种或多种与癌症有关的症状的改善、或死亡率和/或发病率的降低，则认为处理是治疗性的。还可在体外、离体、和体内测定法中对本发明的抗体、融合蛋白或组合物测试它们降低肿瘤形成的能力。对于癌症疗法，体内功效还可以例如通过评估存活的持续时间、距疾病进展的时间(TTP)、响应率(RR)、响应的持续时间、和/或生活质量来测量。

临床好处可以通过评估各种终点来测量，例如一定程度地抑制疾病进展，包括减缓和完全阻滞；减少疾病发作和/或症状的数目；缩小损害尺寸；抑制（即减轻、减缓或完全终止）疾病细胞浸润入临近周围器官和/或组织；抑制（即减轻、减缓或完全终止）疾病扩散；减轻自身免疫应答，其可以但非必然导致疾病损害的消退或消融；一定程度地减轻与病症有关的一种或多种症状；治疗后无疾病呈现（例如无进展存活）的长度延长；总体存活延长；响应率升高；和/或治疗后给定时间点的死亡率降低。

“维持疗法”意指为了降低疾病复发或进展的可能性而给予的治疗方案。维持疗法可提供任意长度的时间，包括长至受试者终身的延长的时段。维持疗法可在初始疗法之后或与初始或别的疗法联合提供。用于维持疗法的剂量可变化，而且可包括与其它类型的疗法使用的剂量相比降低的剂量。

“辅助疗法”在本文中指在手术之后给予的疗法，其中检测不到残余疾病的迹象，从而来降低疾病复发的风险。辅助疗法的目标是预防癌症复发，及因此降低癌症相关死亡的机会。

与一种或多种其它治疗剂“联合”施用包括同时（共同）施用和任何次序的序贯施用。

术语“同时”或“并行”在本文中用于指施用两种或更多种治疗剂，其中至少部分施用在时间上交叠。因而，并行施用包括如下的剂量给药方案，一种或多种药剂的施用中断后继续一种或多种其它药剂的施用。

“生物学样品”（可互换地称作“样品”或“组织或细胞样品”）涵盖自个体获得的且可用于诊断或监测测定法的多种样品类型。该定义涵盖血液和生物学起源的其它液体样品、固体组织样品诸如活检标本或组织培养物或自其衍生的细胞、及其后代。该定义还涵盖在获得它们后已经进行过操作的样品，诸如用试剂处理、增溶、或富集某些成分诸如蛋白质或多核苷酸、或为切片目的而埋藏在半固体或固体基质中。术语“生物学样品”涵盖临床样品，而且还包括培养中的细胞、细胞上清液、细胞溶胞物、血清、血浆、生物学流体、和组织样品。生物学样品的来源可以是实体组织，像来自新鲜的、冷冻的和/或保存的器官或组织样品或活检样品或穿刺样品；血液或任何血液组分；体液，诸如脑脊液、羊水、腹膜液、或间质液；来自妊娠或受试者发育中任何时间的细胞。在有些实施方案中，生物学样品是自原发性或转移性肿瘤获得的。生物学样品可含有在自然界中不与该组织天然混和的化合物，诸如防腐剂、抗凝剂、缓冲剂、固定剂、营养物、抗生素、诸如此类。

为本发明目的，组织样品的“切片”指一块或一片组织样品，例如从组织样品上切下来的一薄片组织或细胞。应当了解，可以制作多片组织样品切片并依照本发明进行分析。在有些实施方案中，将组织样品的同一切片用于形态学和分子两个水平的分析或者针对蛋白质和核酸二者进行分析的方法。

术语“药物配制剂”、“药物组合物”或“治疗性配制剂”指处于如下的形式，从而容许活性成分的生物学活性有效，而且不含对于会接受配制剂施用的受试者具有不可接受的毒性的别的组分的制剂。此类配制剂可以是无菌的。

“无菌”配制剂是无菌的或者不含所有活的微生物及其孢子。

术语“标记物”在用于本文时指与试剂诸如核酸探针或抗体直接或间接偶联或融合，以便于检测它所偶联或融合的试剂的化合物或组合物。标记物可以是自身可检测的（例如放射性同位素标记物或荧光标记物），或者在酶标记物的情况中，可催化可检测的底物化合物或组合物的化学改变。

“载体”在用于本文时包括药学可接受的载体、赋形剂或稳定剂，它们在所采用的剂量和浓度对暴露于其的细胞或哺乳动物是无毒的。通常，生理学可接受的载体是pH缓冲水溶液。生理学可接受载体的例子包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖醇，诸如甘露醇或山梨醇；成盐反荷离子，诸如钠；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、聚乙二醇(PEG)和PLURONICS^TM。

“脂质体”指由各种类型的脂质、磷脂和/或表面活性剂构成的，可用于对哺乳动物投递药物的小囊泡。脂质体的成分通常排列成双层形式，与生物膜的脂质排列相似。

组合物

本发明的抗Bv8抗体优选是单克隆的。本发明的范围还涵盖本文中所提供的抗Bv8抗体的Fab、Fab'、Fab'-SH和F(ab')₂片段。这些抗体片段可通过传统手段来制备，诸如酶促消化，或者可以通过重组技术来生成。此类抗体片段可以是嵌合的或人源化的。这些片段可用于下文所列的诊断和治疗目的。

单克隆抗体是由一群基本上同质的抗体获得的，即构成群体的各个抗体相同，除了可能以极小量存在的可能的天然存在突变。如此，修饰语“单克隆”指明抗体的特征，即不是不同抗体的混合物。

本发明的抗Bv8单克隆抗体可使用最初由Kohler等,Nature 256:495(1975)记载的杂交瘤方法来制备，或者可以通过重组DNA方法(美国专利No.4,816,567)来制备。

在杂交瘤方法中，免疫小鼠或其它适宜的宿主动物，诸如仓鼠，以引发生成或能够生成如下抗体的淋巴细胞，所述抗体会特异性结合用于免疫的蛋白质。Bv8的抗体可以通过在动物中多次皮下(sc)或腹膜内(ip)注射Bv8和佐剂来生成。Bv8可以使用本领域众所周知的方法来制备，其中有些方法在本文中有进一步描述。例如，人和小鼠Bv8的重组生产在下文中有描述。在一个实施方案中，将动物用融合至免疫球蛋白重链Fc部分的Bv8免疫。在一个优选的实施方案中，将动物用Bv8-IgG1融合蛋白免疫。通常将动物针对Bv8的免疫原性偶联物或衍生物和单磷酰脂质A(MPL)/二棒分枝菌酸海藻糖(trehalose dicrynomycolate,TDM)Ribi Immunochem.Research,Inc.,Hamilton,MT)进行免疫，将溶液皮内注射于多个部位。2周后，对动物进行加强免疫。7-14天后，对动物采血，并对血清测定抗Bv8滴度。对动物进行加强免疫，直到滴度达到平台(plateaus)。

或者，可以在体外免疫淋巴细胞。然后，使用合适的融合剂诸如聚乙二醇将淋巴细胞与骨髓瘤细胞融合，以形成杂交瘤细胞(Goding,MonoclonalAntibodies:Principles and Practice,pp.59-103,Academic Press,1986)。

将如此制备的杂交瘤细胞在合适的培养基中接种和培养，所述培养基优选含有抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的一种或多种物质。例如，若亲本骨髓瘤细胞缺乏酶次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HGPRT或HPRT)，则用于杂交瘤的培养基典型的将含有次黄嘌呤、氨基喋呤和胸苷（HAT培养基），这些物质阻止HGPRT缺陷细胞生长。

优选的骨髓瘤细胞是那些高效融合、支持所选抗体生成细胞稳定的高水平生成抗体、并对诸如HAT培养基的培养基敏感的。在这些细胞中，优选的骨髓瘤细胞系是鼠骨髓瘤系，诸如那些可从索尔克研究所细胞分配中心(SalkInstitute Cell Distribution Center,San Diego,California,USA)获得的MOPC-21和MPC-11小鼠肿瘤及可从美国典型培养物保藏中心(American Type CultureCollection,Rockville,Maryland,USA)获得的SP-2或X63-Ag8-653细胞所衍生的。人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系也已描述用于生成人单克隆抗体(Kozbor,J.Immunol.133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal AntibodyProduction Techniques and Applications,pp.51-63,Marcel Dekker,Inc.,NewYork,1987)。

可对杂交瘤细胞正在其中生长的培养液测定针对Bv8的单克隆抗体的生成。优选的是，通过免疫沉淀或通过体外结合测定法，诸如放射免疫测定法(RIA)或酶联免疫吸附测定法(ELISA)，测定由杂交瘤细胞生成的单克隆抗体的结合特异性。

单克隆抗体的结合亲和力可通过例如Munson等,Anal.Biochem.107:220(1980)的Scatchard分析来测定。

在鉴定得到生成具有期望特异性、亲和力和/或活性的抗体的杂交瘤细胞后，该克隆可通过有限稀释规程进行亚克隆并通过标准方法进行培养(Goding,Monoclonal Antibodies:Principles and Practice,pp.59-103,AcademicPress,1986)。适于这一目的的培养基包括例如D-MEM或RPMI-1640培养基。另外，杂交瘤细胞可在动物中作为腹水瘤进行体内培养。

可通过常规免疫球蛋白纯化规程，诸如例如蛋白A-Sepharose、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，将亚克隆分泌的单克隆抗体与培养液、腹水或血清适当分开。

本发明的抗Bv8抗体可以通过使用组合文库筛选具有期望活性的合成抗体克隆来制备。在原理上，通过筛选噬菌体文库来选择合成抗体克隆，所述噬菌体文库含有展示融合至噬菌体外壳蛋白的各种抗体可变区片段(Fv)的噬菌体。通过针对期望抗原的亲和层析淘选此类噬菌体文库。表达能够结合期望抗原的Fv片段的克隆被吸附至抗原，从而与文库中不结合的克隆分开。然后将结合的克隆从抗原上洗脱，而且可以通过额外的抗原吸附/洗脱循环进一步富集。本发明的任何抗Bv8抗体可以如下获得，即设计合适的抗原筛选规程来选择感兴趣的噬菌体克隆，接着使用来自感兴趣的噬菌体克隆的Fv序列和Kabat等,Sequences of Proteins of Immunological Interest,第5版,NIHPublication 91-3242,Bethesda MD(1991),卷1-3中记载的合适的恒定区(Fc)序列构建全长抗Bv8抗体克隆。

抗体的抗原结合域由两个约110个氨基酸的可变(V)区形成，分别来自重链(VL)和轻链(VH)，都呈现三个高变环或互补决定区(CDR)。可变域可以功能性的展示在噬菌体上，或是作为单链Fv(scFv)片段（其中VH和VL通过短的、柔性的肽共价相连），或者作为Fab片段（其中它们各自与恒定域融合且非共价相互作用），如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。在用于本文时，编码scFv的噬菌体克隆和编码Fab的噬菌体克隆统称为“Fv噬菌体克隆”或“Fv克隆”。

VH和VL基因的全集可以通过聚合酶链式反应(PCR)分开克隆，并在噬菌体文库中随机重组，然后可以搜索抗原结合克隆，如Winter等,Ann.Rev.Immunol.,12:433-455(1994)所述。来自经免疫来源的文库能提供对免疫原有高亲和力的抗体，无需构建杂交瘤。或者，可以克隆未免疫的全集，用于为广泛的非自身的及自身的抗原提供单一人抗体来源，无需任何免疫，如Griffiths等,EMBO J,12:725-734(1993)所述。最后，未免疫的文库还可以以合成方式来构建，即从干细胞克隆未重排的V基因片段，使用包含随机序列的PCR引物来编码高度可变的CDR3区并在体外实现重排，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。

通过与次要外壳蛋白pIII融合，使用丝状噬菌体来展示抗体片段。抗体片段可以展示为单链Fv片段，其中VH与VL结构域通过柔性多肽间隔物在同一多肽链上相连，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者展示为Fab片段，其中一条链与pIII融合，而另一条链分泌到细菌宿主细胞周质中，在此装配Fab-外壳蛋白结构，其通过取代一些野生型外壳蛋白而展示在噬菌体表面上，例如如Hoogenboom等,Nucl.Acids Res.,19:4133-4137(1991)所述。

一般而言，从收获自人或动物的免疫细胞获得编码抗体基因片段的核酸。如果希望文库偏向抗Bv8克隆，那么可以给个体免疫Bv8以产生抗体应答，并回收脾细胞和/或循环B细胞或其它外周血淋巴细胞(PBL)用于文库构建。在一个优选的实施方案中，如下得到了偏向抗Bv8克隆的人抗体基因片段文库，即在携带功能性人免疫球蛋白基因阵列（且缺乏功能性内源抗体生成系统）的转基因小鼠中产生抗Bv8抗体应答，使得Bv8免疫产生生成针对Bv8的人抗体的B细胞。生成人抗体的转基因小鼠的产生在下文中有描述。

可以如下获得抗Bv8反应性细胞群的进一步富集，即使用合适的筛选规程来分离表达Bv8特异性膜结合抗体的B细胞，例如通过用Bv8亲和层析或者细胞对荧光染料标记的Bv8的吸附及后续的流动激活细胞分选(FACS)进行的细胞分离。

或者，来自未免疫供体的脾细胞和/或B细胞或其它PBL的使用提供了可能的抗体全集的更佳展现，而且还容许使用Bv8在其中没有抗原性的任何动物（人或非人的）物种构建抗体文库。为了体外掺入抗体基因的文库构建，从个体收获干细胞以提供编码未重排抗体基因区段的核酸。可以从多种动物物种（诸如人、小鼠、大鼠、兔类、luprine、犬、猫、猪、牛、马、和鸟类等）获得感兴趣的免疫细胞。

从感兴趣的细胞回收编码抗体可变基因区段（包括VH和VL区段）的核酸并扩增。就重排的VH和VL基因文库而言，可以如下获得所需DNA，即从淋巴细胞分离基因组DNA或mRNA，接着用与重排的VH和VL基因的5'和3'末端匹配的引物进行聚合酶链式反应(PCR)，如Orlandi等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:3833-3837(1989)所述，由此构建多样性V基因全集供表达。可以从cDNA和基因组DNA扩增V基因，反向引物位于编码成熟V结构域的外显子的5'末端，正向引物基于J区段内部，如Orlandi等(1989)和Ward等,Nature,341:544-546(1989)所述。然而，为了从cDNA进行扩增，反向引物还可基于前导外显子(leader exon)内，如Jones等,Biotechnol.,9:88-89(1991)所述，正向引物基于恒定区内，如Sastry等,Proc.Natl.Acad.Sci.(USA),86:5728-5732(1989)所述。为了使互补性最大化，引物中可以掺入简并性，如Orlandi等(1989)或Sastry等(1989)所述。优选的是，如下将文库多样性最大化，即使用靶向每个V基因家族的PCR引物来扩增免疫细胞核酸样品中存在的所有可获得的VH和VL排列，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)或Orum等,Nucleic Acids Res.,21:4491-4498(1993)的方法所述。为了将所扩增的DNA克隆到表达载体中，可以在PCR引物的一端引入罕见的限制性位点作为标签，如Orlandi等(1989)所述，或者用带标签的引物进行进一步的PCR扩增，如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)所述。

人工合成的重排的V基因全集可以在体外从V基因区段衍生。大多数人VH基因区段已经克隆和测序(Tomlinson等,J.Mol.Biol.,227:776-798(1992))，并定位(Matsuda等,Nature Genet.,3:88-94(1993))；这些克隆的区段（包括H1和H2环的所有主要构型）可用于生成多样性VH基因全集，用到编码序列和长度多样性的H3环的PCR引物，如Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)所述。VH全集还可如下生成，所有序列多样性集中于单一长度的长H3环，如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4457-4461(1992)所述。人Vκ和Vλ区段已经克隆和测序(Williams和Winter,Eur.J.Immunol.,23:1456-1461(1993))，而且可用于生成合成的轻链全集。基于一系列VH和VL折叠及L3和H3长度的合成的V基因全集会编码具有可观结构多样性的抗体。扩增编码V基因的DNA后，依照Hoogenboom和Winter,J.Mol.Biol.,227:381-388(1992)的方法，可以在体外重排种系V基因区段。

抗体片段全集可以如下构建，即以数种方式将VH与VL基因全集联合在一起。可以在不同载体中创建各个全集，并在体外重组载体，例如如Hogrefe等,Gene,128:119-126(1993)所述，或者在体内通过组合感染来重组载体，例如Waterhouse等,Nucl.Acids Res.,21:2265-2266(1993)中记载的loxP系统。体内重组方法利用Fab片段的双链性质来克服因大肠杆菌转化效率施加的库容量限制。分别克隆未免疫的VH和VL全集，一个克隆入噬菌粒，另一个克隆入噬菌体载体。然后通过用噬菌体感染含噬菌粒的细菌使得每个细胞包含不同的组合来联合两种文库，库容量只受细胞存在数的限制（约10¹²个克隆）。两种载体都包含体内重组信号，使得VH与VL基因重组到单一复制子上，并共包装成噬菌体病毒粒。这些巨型文库提供了大量的具有优良亲和力(Kd^-1为约10^-8M)的多样性抗体。

或者，可以将全集依次克隆入同一载体，例如如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88:7978-7982(1991)所述，或者通过PCR装配到一起，然后克隆，如Clackson等,Nature,352:624-628(1991)所述。PCR装配还可用于将VH和VL DNA与编码柔性肽间隔物的DNA连接以形成单链Fv(scFv)全集。在另一种技术中，“细胞内PCR装配”用于通过PCR在淋巴细胞内联合VH与VL基因，然后克隆所连接基因的全集，如Embleton等,Nucl.Acids Res.,20:3831-3837(1992)所述。

未免疫文库(naive library)（天然的或合成的）生成的抗体可具有中等亲和力（Kd^-1为约10⁶-10⁷M^-1），但还可以如下在体外模拟亲和力成熟，即构建和再次选择次生文库，如Winter等(1994),见上文所述。例如，在Hawkins等,J.Mol.Biol.,226:889-896(1992)的方法或Gram等,Proc.Natl.Acad.SciUSA,89:3576-3580(1992)的方法中，使用易错聚合酶在体外随机引入突变(Leung等,Technique,1:11-15(1989))。另外，可以通过随机突变一个或多个CDR来进行亲和力成熟，例如在选定的个别Fv克隆中使用携带跨越感兴趣CDR的随机序列的引物进行PCR并筛选更高亲和力的克隆。WO 96/07754(公布于1996年3月14日)记载了用于在免疫球蛋白轻链的互补决定区中诱导诱变以创建轻链基因文库的方法。另一种高效方法是将通过噬菌体展示选出的VH或VL结构域与得自未免疫供体的天然存在V结构域变体组合，并在数轮链重新改组中筛选更高亲和力，如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述。此技术容许生成亲和力在10^-9M范围的抗体和抗体片段。

Bv8核酸和氨基酸序列是本领域已知的，例如见Wechselberger et al.(FEBS Lett.462:177-181(1999))及Li et al.(Mol.Pharm.59:692-698(2001))。

编码Bv8的核酸可以通过本领域已知的多种方法来制备。这些方法包括但不限于通过Engels等,Agnew.Chem.Int.Ed.Engl.,28:716-734(1989)中记载的任何方法，诸如三酯、亚磷酸酯、磷酰胺酯(phosphoramidite)和H-膦酸酯法进行的化学合成。在一个实施方案中，编码Bv8的DNA的设计中使用表达宿主细胞所优选的密码子。或者，编码Bv8的DNA可以从基因组或cDNA文库分离。

构建编码Bv8的DNA分子后，将该DNA分子与表达载体，诸如质粒中的表达控制序列可操作连接，其中所述控制序列受到该载体转化的宿主细胞的识别。一般而言，质粒载体包含复制和控制序列，其衍生自与宿主细胞相容的物种。载体通常携带复制位点，以及编码能够在转化细胞中提供表型选择的蛋白质的序列。适于在原核和真核宿主细胞中表达的载体是本领域已知的，有些在本文中有进一步描述。可以使用真核生物体，诸如酵母或衍生自多细胞生物体诸如哺乳动物的细胞。

任选的是，编码Bv8的DNA与分泌前导序列可操作连接，导致表达产物被宿主细胞分泌到培养基中。分泌前导序列的例子包括stII、ecotin、lamB、疱疹GD、lpp、碱性磷酸酶、转化酶、和α-因子。适用于此处的还有蛋白A的36个氨基酸的前导序列(Abrahmsen等,EMBO J.,4:3901(1985))。

宿主细胞用上文所述本发明的表达或克隆载体转染，优选转化，并在常规营养培养基中培养，培养基可以为了诱导启动子、选择转化子、或扩增编码期望序列的基因而适当修改。

转染指宿主细胞摄取表达载体，无论任何编码序列事实上是否表达。本领域普通技术人员知道许多转染方法，例如CaPO₄沉淀和电穿孔。若宿主细胞内存在此载体运转的任何指示，则认为转染成功。用于转染的方法是本领域众所周知的，有些在本文中有进一步描述。

转化指将DNA导入生物体，使得DNA可进行复制，或是作为染色体外元件，或是通过染色体整合。根据所用宿主细胞，使用适于所述细胞的标准技术进行转化。用于转化的方法是本领域众所周知的，有些在本文中有进一步描述。

用于生成Bv8的原核宿主细胞可以如Sambrook等,见上文一般所述进行培养。

用于生成Bv8的哺乳动物宿主细胞可以在多种培养基中培养，所述培养基是本领域众所周知的，有些在本文中有描述。

本发明公开的宿主细胞涵盖体外培养物中的细胞以及宿主动物体内的细胞。

Bv8的纯化可以使用本领域公认的方法来实现，本文描述了其中一些。

纯化的Bv8可以附着于合适的基质，诸如琼脂糖珠、丙烯酰胺珠、玻璃珠、纤维素、各种丙烯酸共聚物、羟基甲基丙烯酸酯凝胶、聚丙烯酸和聚甲基丙烯酸共聚物、尼龙、中性和离子载体、诸如此类，用于噬菌体展示克隆的亲和层析分离。Bv8蛋白对基质的附着可以通过Methods in Enzymology,卷44(1976)中记载的方法来实现。将蛋白质配体附着于多糖基质，例如琼脂糖、右旋糖苷或纤维素的常用技术涉及用卤化氰活化载体，随后将肽配体的脂肪族伯胺或芳香族伯胺偶联至活化后的基质。

或者，Bv8可用于包被吸附板的孔，在附着至吸附板的宿主细胞上表达，或用于细胞分选，或者偶联至生物素以用链霉亲合素包被的珠捕捉，或者用于本领域已知的用于淘选噬菌体展示库的任何其它方法。

在适于至少部分噬菌体颗粒结合吸附剂的条件下，使噬菌体文库样品接触固定化的Bv8。正常情况下，选择包括pH、离子强度、温度等等的条件来模拟生理条件。对结合至固相的噬菌体进行清洗，然后用酸洗脱，例如如Barbas等,Proc.Natl.Acad.Sci USA,88:7978-7982(1991)所述，或者用碱洗脱，例如如Marks等,J.Mol.Biol.,222:581-597(1991)所述，或者通过Bv8抗原竞争洗脱，例如在与Clackson等,Nature,352:624-628(1991)的抗原竞争法类似的规程中。噬菌体在单轮选择中可以富集20-1,000倍。此外，富集的噬菌体可以在细菌培养物中进行培养，并进行更多轮选择。

选择的效率取决于许多因素，包括清洗过程中解离的动力学，及单个噬菌体上的多个抗体片段是否能同时结合抗原。具有较快解离动力学（和弱结合亲和力）的抗体可以通过使用短时间的清洗、多价噬菌体展示、及固相中的高抗原包被密度来保留。高密度不仅通过多价相互作用而稳定了噬菌体，而且有利于已解离的噬菌体的再结合。具有较慢解离动力学（和强结合亲和力）的抗体的选择可以通过使用长时间的清洗和单价噬菌体展示（如Bass等,Proteins,8:309-314(1990)和WO 92/09690所述）及低抗原包被密度（如Marks等,Biotechnol.,10:779-783(1992)所述）来促进。

有可能在对Bv8具有不同亲和力的噬菌体抗体之间进行选择，甚至是亲和力略有差异的。然而，选定抗体的随机突变（例如如有些上文所述亲和力成熟技术进行）有可能产生许多突变体，多数结合抗原，少数具有更高的亲和力。通过限制Bv8，罕见的高亲和力噬菌体能竞争胜出。为了保留所有较高亲和力的突变体，可以将噬菌体与过量的生物素化Bv8一起温育，但是生物素化Bv8的摩尔浓度低于Bv8的目标摩尔亲和常数。然后用链霉亲合素包被的顺磁珠捕捉高亲和力的结合噬菌体。此类“平衡捕捉”容许依照结合亲和力来选择抗体，其灵敏性容许从大大过量的低亲和力噬菌体中分离出亲和力只有原值2倍的突变体克隆。还可以操作清洗结合至固相的噬菌体的条件来进行基于解离动力学的区分。

Bv8克隆可以进行活性选择。在一个实施方案中，本发明提供了阻断Bv8与其配体（例如Bv8受体PKR1和PKR2）之间结合的Bv8抗体。对应于此类Bv8抗体的Fv克隆可以如下选择：(1)如上所述自噬菌体文库分离Bv8克隆，并任选通过在合适的细菌宿主中培养所述群体来扩增所分离的噬菌体克隆群体；(2)对想要阻断活性的Bv8和想要不阻断活性的第二蛋白质进行选择；(3)将抗Bv8噬菌体克隆吸附至固定化的Bv8；(4)使用过量的所述第二蛋白质洗脱任何不想要的克隆，它们识别与所述第二蛋白质的结合决定簇交叠或共享的Bv8结合决定簇；并(5)洗脱在步骤(4)后保持吸附的克隆。任选地，具有期望的阻断/不阻断特性的克隆可通过一次或多次重复本文所述选择规程来进一步富集。

本发明的编码杂交瘤衍生单克隆抗体或噬菌体展示Fv克隆的DNA易于使用常规规程分离和测序（例如通过使用设计成自杂交瘤或噬菌体DNA模板特异性扩增感兴趣的重链和轻链编码区的寡核苷酸引物）。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将该表达载体转染到原本不生成免疫球蛋白蛋白质的宿主细胞中，诸如大肠杆菌细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，以在重组宿主细胞中获得期望单克隆抗体的合成。关于编码抗体的DNA在细菌中的重组表达的综述性论文包括Skerra等,Curr.Opinion in Immunol.,5:256(1993)及Pluckthun,Immunol.Rev.,130:151(1992)。

本发明的编码Fv克隆的DNA可以联合编码重链和/或轻链恒定区的已知DNA序列（例如适宜的DNA序列可得自Kabat等,见上文）以形成编码全长或部分重链和/或轻链的克隆。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。衍生自一种动物（诸如人）物种的可变域DNA，然后与另一动物物种的恒定区DNA融合以形成“杂合的”全长重链和/或轻链的编码序列的Fv克隆包括在本文所用“嵌合”和“杂合”抗体的定义中。在一个优选的实施方案中，衍生自人可变DNA的Fv克隆与人恒定区DNA融合以形成完全人的、全长或部分重链和/或轻链的编码序列。

还可以修饰本发明的编码衍生自杂交瘤的抗Bv8抗体的DNA，例如通过替代，即用人重链和轻链恒定域的编码序列代替衍生自杂交瘤克隆的同源鼠序列(例如如Morrison等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81:6851-6855(1984)中的方法)。通过共价接合免疫球蛋白编码序列与非免疫球蛋白多肽的整个或部分编码序列，可以进一步修饰编码杂交瘤或Fv克隆衍生抗体或片段的DNA。可以以该方式制备具有本发明的Fv克隆或杂交瘤克隆衍生抗体的结合特异性的“嵌合”或“杂合”抗体。

抗体片段

本发明涵盖抗体片段。抗体片段可以通过传统手段来生成，诸如酶促消化，或者通过重组技术来生成。在某些情况中，使用抗体片段，而不是完整抗体有优势。片段的较小尺寸容许快速清除，而且可导致更易于到达实体瘤。某些抗体片段的综述参见Hudson等(2003)Nat.Med.9:129-134。

已经开发了用于生成抗体片段的多种技术。传统上，通过蛋白水解消化完整抗体来衍生这些片段(参见例如Morimoto等,Journal of Biochemical andBiophysical Methods 24:107-117(1992);及Brennan等,Science 229:81(1985))。然而，现在可直接由重组宿主细胞生成这些片段。Fab、Fv和scFv抗体片段都可在大肠杆菌中表达和由大肠杆菌分泌，如此容许容易地生成大量的这些片段。可从上文讨论的噬菌体抗体库中分离抗体片段。或者，可直接从大肠杆菌回收Fab'-SH片段并化学偶联以形成F(ab′)₂片段(Carter等,Bio/Technology 10:163-167(1992))。依照另一种方法，可直接从重组宿主细胞培养物分离F(ab')₂片段。包含补救受体结合表位残基、具有延长的体内半衰期的Fab和F(ab')₂片段记载于美国专利No.5,869,046。用于生成抗体片段的其它技术对于熟练从业人员会是显而易见的。在某些实施方案中，抗体是单链Fv片段(scFv)。参见WO 93/16185;美国专利No.5,571,894;及5,587,458。Fv和scFv是具有完整结合位点、缺少恒定区的唯一类型；如此，它们可能适于在体内使用时降低非特异性结合。可构建scFv融合蛋白以生成效应器蛋白质在scFv的氨基或羧基末端的融合。参见Antibody Engineering,Borrebaeck编,见上文。抗体片段还可以是“线性抗体”，例如如美国专利No.5,641,870中所记载的。此类线性抗体可以是单特异性的或双特异性的。

人源化抗体

本发明涵盖人源化抗体。本领域知道用于人源化非人抗体的多种方法。例如，人源化抗体可具有一个或多个从非人来源引入的氨基酸残基。这些非人氨基酸残基常常称为“输入”残基，它们通常取自“输入”可变域。基本上可遵循Winter及其同事的方法进行人源化（Jones等(1986)Nature 321:522-525;Riechmann等(1988)Nature 332:323-327;Verhoeyen等(1988)Science 239:1534-1536），即用高变区序列替代人抗体的对应序列。因此，此类“人源化”抗体是嵌合抗体（美国专利No.4,816,567），其中显著少于完整的人可变域用非人物种的相应序列替代。在实践中，人源化抗体通常是如下人抗体，其中有些高变区残基和可能的有些FR残基用啮齿类抗体类似位点的残基替代。

用于制备人源化抗体的人轻链和重链二者可变域的选择对于降低抗原性可能是重要的。依照所谓的“最适(best-fit)”方法，用啮齿类抗体的可变域序列对已知人可变域序列的整个文库进行筛选。然后选择与啮齿类最接近的人序列作为人源化抗体的人框架（参见例如Sims等(1993)J.Immunol.151:2296;Chothia等(1987)J.Mol.Biol.196:901）。另一种方法使用由特定轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列衍生的特定框架。相同框架可用于数种不同的人源化抗体（参见例如Carter等(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:4285;Presta等(1993)J.Immunol.151:2623）。

一般还希望的是，抗体在人源化后保留对抗原的高亲和力和其它有利的生物学特性。为了达到此目的，依照一种方法，通过使用亲本序列和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的过程来制备人源化抗体。通常可获得免疫球蛋白三维模型，这是本领域技术人员所熟悉的。还可获得图解和显示所选候选免疫球蛋白序列的可能三维构象结构的计算机程序。通过检查这些显示图像容许分析残基在候选免疫球蛋白序列发挥功能中的可能作用，即分析影响候选免疫球蛋白结合其抗原的能力的残基。这样，可以从受体序列和输入序列中选出FR残基并组合，从而得到期望的抗体特征，诸如对靶抗原的亲和力升高。一般而言，高变区残基直接且最实质地涉及对抗原结合的影响。

人抗体

本发明的人抗体可以通过如上所述联合选自人衍生噬菌体展示库的Fv克隆可变域序列与已知的人恒定域序列来构建。或者，可以通过杂交瘤方法来生成本发明的人单克隆抗体。用于生成人单克隆抗体的人骨髓瘤和小鼠-人异源骨髓瘤细胞系已有记载，例如Kozbor,J.Immunol.,133:3001(1984);Brodeur等,Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications,pp.51-63(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987);及Boerner等,J.Immunol.,147:86(1991).

例如，现在有可能生成在缺乏内源免疫球蛋白生成的情况下能够在免疫后生成人抗体完整全集的转基因动物（例如小鼠）。例如，已经记载了嵌合和种系突变小鼠中抗体重链连接区(JH)基因的纯合删除导致内源抗体生成的完全抑制。在此类种系突变小鼠中转移大量人种系免疫球蛋白基因会导致在抗原攻击后生成人抗体。参见例如Jakobovits等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA90:2551(1993);Jakobovits等,Nature 362:255(1993);Bruggermann等,Year inImmunol.7:33(1993)。

基因改组也可用于自非人（例如啮齿类）抗体衍生人抗体，其中人抗体具有与起始非人抗体相似的亲和力和特异性。依照此方法，它也称为“表位印记”(epitope imprinting)，如本文所述通过噬菌体展示技术得到的非人抗体片段的重链或轻链可变域用人V结构域基因全集替换，产生非人链/人链scFv或Fab嵌合物群。用抗原进行的选择导致如下非人链/人链嵌合scFv或Fab的分离，其中人链在一级噬菌体展示克隆中消除相应的非人链后恢复了抗原结合位点，即表位决定（印记，imprint）人链配偶的选择。在重复该过程以替换剩余非人链时，得到人抗体（参见PCT WO 93/06213，公布于1993年4月1日）。与传统的通过HVR嫁接进行的非人抗体的人源化不同，此技术提供完全人的抗体，它们不含非人起源的FR或HVR残基。

多特异性抗体

本发明的多特异性抗体的一个例子包括结合Bv8和另一种抗原的抗体。在其它实施方案中，多特异性抗体可结合Bv8的两种不同表位。多特异性抗体还可用于将细胞毒剂定位于表达Bv8的细胞。这些抗体拥有Bv8结合臂和结合细胞毒剂（诸如例如肥皂草毒蛋白、抗干扰素-α、长春花生物碱类、蓖麻毒蛋白A链、甲氨蝶呤或放射性同位素半抗原）的臂。可将多特异性抗体制备成全长抗体或抗体片段（例如F(ab')₂双特异性抗体）。

本领域已经记载了用于构建双特异性抗体的多种方法。第一类方法之一涉及两对免疫球蛋白重链-轻链的共表达，其中两种重链具有不同的特异性(Millstein和Cuello,Nature 305:537(1983))。由于免疫球蛋白重链和轻链的随机分配，这些杂交瘤（四源杂交瘤(quadroma)）生成10种不同抗体分子的潜在混合物，其中只有一种具有正确的双特异性结构。通常通过亲和层析步骤进行的正确分子的纯化相当麻烦且产物产量低。类似的规程披露于WO93/08829,公布于1993年5月13日及Traunecker等,EMBO J.10:3655(1991)。

依照一种不同的方法，将抗体可变域与免疫球蛋白恒定域序列融合。例如，与包含至少部分铰链、CH2和CH3区的免疫球蛋白重链恒定域进行融合。在某些实施方案中，在至少一种融合物中存在第一重链恒定区(CH1)。将编码免疫球蛋白重链融合物和，在需要时，免疫球蛋白轻链的DNA插入分开的表达载体，并共转染入合适的宿主生物体。在用于构建的三种多肽链比例不等时提供最佳产量的实施方案中，这为调整三种多肽片段的相互比例提供了极大的灵活性。然而，在至少两种多肽链以相同比例表达导致高产量时或在该比例没有特别意义时，有可能将两种或所有三种多肽链的编码序列插入一个表达载体。

在该方法的一个实施方案中，双特异性抗体由一个臂上具有第一结合特异性的杂合免疫球蛋白重链，和另一个臂上的杂合免疫球蛋白重链-轻链对（提供第二结合特异性）构成。由于免疫球蛋白轻链仅在半个双特异性分子中的存在提供了便利的分离途径，因此发现这种不对称结构便于将期望的双特异性化合物与不想要的免疫球蛋白链组合分开。该方法披露于WO94/04690。关于生成双特异性抗体的进一步详情参见例如Suresh等,Methodsin Enzymology 121:210(1986)。

依照另一种方法，“结入穴”(knob-into-hole)或“KnH”技术指通过在两条多肽相互作用的界面，在一条多肽中引入隆起（结）并在另一条多肽链中引入空腔（穴），在体外或在体内指导这两条多肽配对到一起的技术。例如，已经在抗体的Fc:Fc结合界面、CL:CH1界面或VH/VL界面中引入KnH（例如US20007/0178552；WO 96/027011；WO 98/050431；及Zhu et al.(1997)ProteinScience 6:781-788）。这在多特异性抗体的制造期间驱使两条不同重链配对到一起中尤其有用。例如，在其Fc区中具有KnH的多特异性抗体可进一步包含单一可变域（其与每一个Fc区连接），或进一步包含不同重链可变域（其与相似或不同轻链可变域配对）。依照一个实施方案，将第一抗体分子界面的一个或多个小氨基酸侧链用较大侧链（例如酪氨酸或色氨酸）替换。通过将大氨基酸侧链用较小氨基酸侧链（例如丙氨酸或苏氨酸）替换，在第二抗体分子的界面上产生与大侧链相同或相似大小的补偿性“空腔”。这提供了较之其它不想要的终产物诸如同二聚体提高异二聚体产量的机制。

多特异性抗体包括交联或“异源偶联”抗体。例如，异源偶联物中的一种抗体可以与亲合素偶联，另一种抗体与生物素偶联。例如，此类抗体已经建议用于将免疫系统细胞靶向不想要的细胞(美国专利No.4,676,980)，及用于治疗HIV感染(WO 91/00360,WO 92/00373和EP 03089)。可使用任何便利的交联方法来制备异源偶联抗体。合适的交联剂和技术是已知的（例如美国专利No.4,676,980）。

文献中还记载了由抗体片段生成多特异性抗体的技术。例如，可使用化学连接来制备双特异性抗体。Brennan等,Science 229:81(1985)记载了通过蛋白水解切割完整抗体以生成F(ab')₂片段的规程。将这些片段在存在二硫醇络合剂亚砷酸钠的情况下（用以稳定邻近的二硫醇和防止分子间二硫键的形成）还原。然后将产生的Fab’片段转变为硫代硝基苯甲酸酯(TNB)衍生物。然后将Fab'-TNB衍生物之一通过巯基乙胺的还原重新恢复成Fab'-硫醇，并与等摩尔量的另一种Fab'-TNB衍生物混合，以形成双特异性抗体。产生的双特异性抗体可用作酶的选择性固定化试剂。

可以从大肠杆菌回收Fab'-SH片段，而且可以可化学偶联这些片段以形成双特异性抗体。Shalaby等,J.Exp.Med.175:217-225(1992)记载了完全人源化的双特异性抗体F(ab')₂分子的生成。由大肠杆菌分开分泌每种Fab'片段，并在体外进行定向化学偶联以形成双特异性抗体。如此形成的双特异性抗体能够结合过表达HER2受体的细胞和正常人T细胞，以及触发人细胞毒性淋巴细胞针对人乳房肿瘤靶物的溶解活性。

还记载了直接从重组细胞培养物生成和分离双特异性抗体片段的多种技术。例如，已使用亮氨酸拉链生成双特异性抗体。Kostelny等,J.Immunol.148(5):1547-1553(1992)。将来自Fos和Jun蛋白的亮氨酸拉链肽通过基因融合与两种不同抗体的Fab'部分连接。抗体同二聚体在铰链区还原以形成单体，然后重新氧化以形成抗体异二聚体。这种方法也可用于生成抗体同二聚体。Hollinger等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90:6444-6448(1993)记载的“双抗体”技术提供了构建双特异性抗体片段的替代机制。该片段包含通过接头相连的重链可变域(VH)和轻链可变域(VL)，所述接头太短使得同一条链上的两个结构域之间不能配对。因此，迫使一个片段上的VH和VL结构域与另一个片段上的互补VL和VH结构域配对，由此形成两个抗原结合位点。还报道了通过使用单链Fv(sFv)二聚体构建双特异性抗体片段的另一种策略。参见Gruber等,J.Immunol.152:5368(1994)。

涵盖具有超过两个效价的抗体。例如，可制备三特异性抗体。Tutt等,J.Immunol.147:60(1991)。

多价抗体

多价抗体可以比二价抗体更快的受到表达该抗体所结合抗原的细胞的内在化（和/或异化）。本发明的抗体可以是可容易地通过编码抗体多肽链的核酸的重组表达而生成的、具有三个或更多抗原结合位点（例如四价抗体）的多价抗体（IgM类别以外的）。多价抗体可包含二聚化结构域和三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，二聚化结构域包含（或由其组成）Fc区或铰链区。在这种情况中，抗体会包含Fc区及Fc区氨基末端的三个或更多抗原结合位点。在某些实施方案中，多价抗体包含（或由其组成）三个至大约八个抗原结合位点。在一个这样的实施方案中，多价抗体包含（或由其组成）四个抗原结合位点。多价抗体包含至少一条多肽链（例如两条多肽链），其中所述多肽链包含两个或更多可变域。例如，所述多肽链可包含VD1-(X1)n-VD2-(X2)n-Fc，其中VD1是第一可变域，VD2是第二可变域，Fc是Fc区的一条多肽链，X1和X2代表氨基酸或多肽，而n是0或1。例如，多肽链可包含：VH-CH1-柔性接头-VH-CH1-Fc区链；或VH-CH1-VH-CH1-Fc区链。本文中的多价抗体可进一步包含至少两条（例如四条）轻链可变域多肽。本文中的多价抗体可包含例如约两条至约八条轻链可变域多肽。本文所涵盖的轻链可变域多肽包含轻链可变域，且任选进一步包含CL结构域。

单域抗体

在某些实施方案中，本发明的抗Bv8抗体是单域抗体(single-domainantibody)。单域抗体是包含抗体的整个或部分重链可变域或者整个或部分轻链可变域的单一多肽链。在某些实施方案中，单域抗体是人单域抗体(Domantis,Inc.,Waltham,MA;参见例如美国专利No.6,248,516 B1)。在一个实施方案中，单域抗体由抗体的整个或部分重链可变域组成。

抗体变体

在有些实施方案中，涵盖本文所述抗Bv8抗体的氨基酸序列修饰。例如，可能希望改进抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。抗体的氨基酸序列变体可以是通过将适宜的变化引入编码抗体的核苷酸序列或通过肽合成制备的。此类修饰包括例如抗体氨基酸序列内的残基删除和/或插入和/或替代。可进行任何删除、插入和替代组合以获得最终的构建物，倘若最终的构建物具有期望的特征。可在制备序列时将氨基酸改变引入受试抗体的氨基酸序列。

可用于鉴定抗体中作为优选诱变位置的某些残基或区域的方法有“丙氨酸扫描诱变”，如Cunningham和Wells(1989)Science 244:1081-1085中所述。这里，鉴定一个残基或一组靶残基（例如带电荷的残基，诸如arg、asp、his、lys、和glu）并用中性或带负电荷的氨基酸（例如丙氨酸或多丙氨酸）替换，以影响氨基酸与抗原的相互作用。然后通过在或对替代位点引入更多或其它变体，推敲对替代展示功能敏感性的氨基酸位置。由此，尽管用于引入氨基酸序列变异的位点是预先决定的，然而突变本身的本质不必预先决定。例如，为了分析指定位点处突变的后果，在靶密码子或区域进行丙氨酸扫描或随机诱变，并对所表达的免疫球蛋白筛选期望的活性。

氨基酸序列插入包括氨基和/或羧基末端的融合，长度范围由一个残基至包含一百或更多残基的多肽，以及单个或多个氨基酸残基的序列内插入。末端插入的例子包括具有N端甲硫氨酰残基的抗体。抗体分子的其它插入变体包括将抗体的N或C端与酶（例如用于ADEPT）或延长抗体血清半衰期的多肽融合。

在某些实施方案中，本发明的抗体发生了改变以提高或降低抗体糖基化的程度。多肽的糖基化典型的或是N-连接的或是O-连接的。N-连接指碳水化合物模块附着于天冬酰胺残基的侧链。三肽序列天冬酰胺-X-丝氨酸和天冬酰胺-X-苏氨酸（其中X是除脯氨酸外的任何氨基酸）是将碳水化合物模块酶促附着于天冬酰胺侧链的识别序列。如此，多肽中这两种三肽序列任一的存在产生了潜在的糖基化位点。O-连接的糖基化指将糖类N-乙酰半乳糖胺、半乳糖或木糖之一附着于羟基氨基酸，最常见的是丝氨酸或苏氨酸，但也可使用5-羟脯氨酸或5-羟赖氨酸。

向抗体中添加或删除糖基化位点可通过改变氨基酸序列从而创建或消除一个或多个上述三肽序列而便利地完成（用于N-连接的糖基化位点）。所述改变还可通过向原始抗体的序列中添加、删除、或替代一个或多个丝氨酸或苏氨酸残基来进行（用于O-连接的糖基化位点）。

若抗体包含Fc区，则可改变附着其上的碳水化合物。由哺乳动物细胞生成的天然抗体典型地包含分支的、双触角的寡糖，其一般通过N-连接附着于Fc区CH2结构域的Asn297(参见例如Wright等(1997)TIBTECH 15:26-32)。寡糖可包括各种碳水化合物，例如甘露糖、N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)、半乳糖、和唾液酸，以及附着至双触角寡糖结构“主干”中GlcNAc的岩藻糖。在一些实施方案中，可以对本发明抗体中的寡糖进行修饰以创建具有某些改善特性的抗体变体。

例如，提供了有缺乏岩藻糖的碳水化合物结构（直接地或间接地）附着于Fc区的抗体变体。此类变体具有改善的ADCC功能(参见例如美国专利申请号US 2003/0157108(Presta,L.);US 2004/0093621(Kyowa Hakko Kogyo Co.,Ltd))。涉及“脱岩藻糖型”或“岩藻糖缺乏型”抗体变体的出版物的例子包括：US 2003/0157108;WO 2000/61739;WO 2001/29246;US 2003/0115614;US 2002/0164328;US 2004/0093621;US 2004/0132140;US 2004/0110704;US2004/0110282;US 2004/0109865;WO 2003/085119;WO 2003/084570;WO2005/035586;WO 2005/035778;WO2005/053742;WO2002/031140;Okazaki等,J.Mol.Biol.336:1239-1249(2004);Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004)。能够生成脱岩藻糖化抗体的细胞系的例子包括蛋白质岩藻糖化缺陷的Lec13 CHO细胞(Ripka等,Arch.Biochem.Biophys.249:533-545(1986);美国专利申请号US 2003/0157108 A1,Presta,L;及WO 2004/056312 A1,Adams等,尤其是实施例11)和敲除细胞系，诸如α-1,6-岩藻糖转移酶基因FUT8敲除的CHO细胞(参见例如Yamane-Ohnuki等,Biotech.Bioeng.87:614(2004);Kanda,Y.等,Biotechnol.Bioeng.,94(4):680-688(2006);及WO2003/085107)。

进一步提供了具有等分寡糖的抗体变体，例如其中附着于抗体Fc区的双触角寡糖被GlcNAc等分。此类抗体变体可具有降低的岩藻糖化和/或改善的ADCC功能。此类抗体变体的例子记载于例如WO 2003/011878(Jean-Mairet等);美国专利No.6,602,684(Umana等);及US 2005/0123546(Umana等)。还提供了在附着于Fc区的寡糖中有至少一个半乳糖残基的抗体变体。此类抗体变体可具有改善的CDC功能。此类抗体变体记载于例如WO 1997/30087(Patel等);WO 1998/58964(Raju,S.);及WO 1999/22764(Raju,S.)。

在某些实施方案中，抗体变体包含具有一处或多处进一步改善ADCC的氨基酸替代的Fc区，例如Fc区第298、333、和/或334位（EU残基编号方式）处的替代。此类替代可以与任何上文所述变异组合存在。

在某些实施方案中，本发明涵盖了如下抗体变体，其具有一些但非所有效应器功能，这使之成为其中抗体体内半衰期是重要的但某些效应器功能（诸如补体和ADCC）不是必需的或有害的许多应用的期望候选物。在某些实施方案中，测量抗体的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法来证实CDC和/或ADCC活性的降低/消除。例如，可以进行Fc受体(FcR)结合测定法来确认抗体缺乏FcγR结合（从此有可能缺乏ADCC活性），但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利No.5,500,362中记载了评估感兴趣分子的ADCC活性的体外测定法的非限制性实例(还可参见Hellstrom,I.,et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.USA83:7059-7063(1986);Hellstrom,I et al.,Proc.Nat’l Acad.Sci.USA82:1499-1502(1985);5,821,337;Bruggemann,M.et al.,J.Exp.Med.166:1351-1361(1987))。或者，可采用非放射性测定方法(参见例如ACTI^TM非放射性细胞毒性测定法，其用于流式细胞术(CellTechnology,Inc.MountainView,CA)；和CytoTox非放射性细胞毒性测定法(Promega,Madison,WI))。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单个核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可以在体内评估感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，诸如Clynes et al.Proc.Nat’l Acad.Sci.(USA)95:652-656(1998)中所披露的。还可以进行C1q结合测定法来证实抗体不能结合C1q及从此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法(参见例如Gazzano-Santoro et al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996);Cragg,M.S.et al.,Blood 101:1045-1052(2003);及Cragg,M.S.和M.J.Glennie,Blood103:2738-2743(2004))。还可以使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定(参见例如Petkova,S.B.et al.,Int’l.Immunol.18(12):1759-1769(2006))。

提供了另一类具有一处或多处氨基酸替代的抗体变体。进行替代诱变的感兴趣位点包括高变区，但是也涵盖FR改变。“氨基酸替代表”中“优选替代”栏显示了保守替代。表1中提供了称为“例示替代”的更实质变化，或如下文参照氨基酸分类进一步描述的。可以将氨基酸替代掺入感兴趣抗体，并筛选产物，例如筛选期望的活性，诸如改善的抗原结合、降低的免疫原性、改善的ADCC或CDC、等等。

表1

原始残基	例示替代	优选替代
			Ala(A)	Val;Leu;Ile	Val
Arg(R)	Lys;Gln;Asn	Lys
			Asn(N)	Gln;His;Asp,Lys;Arg	Gln
Asp(D)	Glu;Asn	Glu
			Cys(C)	Ser;Ala	Ser
Gln(Q)	Asn;Glu	Asn
			Glu(E)	Asp;Gln	Asp
Gly(G)	Ala	Ala
			His(H)	Asn;Gln;Lys;Arg	Arg
Ile(I)	Leu;Val;Met;Ala;Phe;正亮氨酸	Leu
			Leu(L)	正亮氨酸;Ile;Val;Met;Ala;Phe	Ile
Lys(K)	Arg;Gln;Asn	Arg
			Met(M)	Leu;Phe;Ile	Leu
Phe(F)	Trp;Leu;Val;Ile;Ala;Tyr	Tyr
			Pro(P)	Ala	Ala
Ser(S)	Thr	Thr
			Thr(T)	Val;Ser	Ser
Trp(W)	Tyr;Phe	Tyr
			Tyr(Y)	Trp;Phe;Thr;Ser	Phe
Val(V)	Ile;Leu;Met;Phe;Ala;正亮氨酸	Leu

对抗体生物学特性的修饰可通过选择对影响以下方面的替代来实现：(a)替代区域中多肽主链的结构，例如（折叠）片或螺旋构象，(b)靶位点处分子的电荷或疏水性，或(c)侧链的体积。根据其侧链特性的相似性，可将氨基酸如下分组(A.L.Lehninger,于Biochemistry,第2版,pp.73-75,WorthPublishers,New York(1975))：

(1)非极性的：Ala(A)、Val(V)、Leu(L)、Ile(I)、Pro(P)、Phe(F)、Trp(W)、Met(M)

(2)不带电荷的、极性的：Gly(G)、Ser(S)、Thr(T)、Cys(C)、Tyr(Y)、Asn(N)、Gln(Q)

(3)酸性的：Asp(D)、Glu(E)

(4)碱性的：Lys(K)、Arg(R)、His(H)

或者，根据共同的侧链特性，天然存在残基可如下分组：

(1)疏水性的：正亮氨酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；

(2)中性、亲水性的：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；

(3)酸性的：Asp、Glu；

(4)碱性的：His、Lys、Arg；

(5)影响链取向的残基：Gly、Pro；

(6)芳香族的：Trp、Tyr、Phe。

非保守替代需要用这些类别之一的成员替换另一个类别的。此类替代残基还可以导入保守替代位点，或导入剩余（非保守）位点。

一类替代变体涉及替代亲本抗体（例如人源化或人抗体）的一个或多个高变区残基。通常，选择用于进一步开发的所得变体相对于产生它们的亲本抗体会具有改变的（例如改进的）生物学特性。例示性的替代变体是亲和力成熟的抗体，其可使用基于噬菌体展示的亲和力成熟技术而便利地生成。简而言之，将数个高变区位点（例如6-7个位点）突变，在各个位点产生所有可能的氨基酸替代。如此生成的抗体展示在丝状噬菌体颗粒上，作为与各个颗粒内包装的噬菌体外壳蛋白（例如M13基因III产物）至少一部分的融合物。然后对噬菌体展示的变体筛选其生物学活性（例如结合亲和力）。为了鉴定用于修饰的候选高变区位点，可进行扫描诱变（例如丙氨酸扫描）以鉴定对抗原结合具有重要贡献的高变区残基。或者/另外，分析抗原-抗体复合物的晶体结构以鉴定抗体和抗原之间的接触点可能是有益的。此类接触残基及邻近残基是依照本领域已知的技术（包括本文详述的技术）进行替代的候选位点。一旦产生这样的变体，使用本领域已知的技术（包括本文所述的技术）对该组变体进行筛选，可选择在一种或多种相关测定法中具有优良特性的变体用于进一步的开发。

编码抗体氨基酸序列变体的核酸分子可通过本领域知道的多种方法来制备。这些方法包括但不限于从天然来源分离（在天然存在氨基酸序列变体的情况中），或者通过对较早制备的变体或非变体型式的抗体进行寡核苷酸介导的（或定点）诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

可能希望在本发明抗体的Fc区中引入一处或多处氨基酸修饰，由此生成Fc区变体。Fc区变体可包括在一个或多个氨基酸位置（包括铰链半胱氨酸的位置）包含氨基酸修饰（例如替代）的人Fc区序列（例如人IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc区）。

依照此描述和本领域的教导，涵盖在有些实施方案中，本发明的抗体与野生型对应抗体相比可包含一处或多处改变（在例如Fc区中）。与它们的野生型对应物相比，这些抗体仍会基本上保留治疗功效所需要的相同特性。例如，认为可以在Fc区中进行会导致C1q结合和/或补体依赖性细胞毒性（CDC）改变（即或是增强或是削弱）的某些改变，例如WO99/51642中所述。还可参见关注Fc区变体其它例子的Duncan和Winter,Nature 322:738-40(1988);美国专利No.5,648,260;美国专利No.5,624,821;及WO94/29351。WO00/42072(Presta)和WO 2004/056312(Lowman)记载了对FcR的结合提高或降低的抗体变体。还可参见Shields等J.Biol.Chem.9(2):6591-6604(2001)。半衰期延长且对新生儿Fc受体(FcRn)（它负责将母体IgG转移给胎儿）(Guyer等,J.Immunol.117:587(1976)及Kim等,J.Immunol.24:249(1994))的结合改良的抗体记载于US2005/0014934A1(Hinton等)。这些抗体包含具有一处或多处改进Fc区与FcRn结合的替代的Fc区。具有改变的Fc区氨基酸序列且C1q结合能力升高或降低的多肽变体记载于美国专利No.6,194,551B1,WO99/51642。还可参见Idusogie等J.Immunol.164:4178-4184(2000)。

另一方面，本发明提供了在构成Fc区的Fc多肽的界面中包含修饰的抗体，其中所述修饰便于和/或促进异二聚化。这些修饰包括在第一Fc多肽中导入隆起(protuberance)和在第二Fc多肽中导入空腔(cavity)，其中所述隆起可位于所述空腔中，从而促进第一与第二Fc多肽的复合。生成具有这些修饰的抗体的方法是本领域已知的，例如记载于美国专利No.5,731,168。

又一方面，可能期望创建半胱氨酸改造抗体，例如“thioMAb”，其中用半胱氨酸残基替代抗体的一个或多个残基。在具体的实施方案中，被替代的残基位于抗体的可及位点。通过用半胱氨酸替代那些残基，由此将反应性硫醇基团定位于抗体的可及位点，并可用于将抗体与其它模块（诸如药物模块或接头-药物模块）偶联，如本文中进一步描述的。在某些实施方案中，可以用半胱氨酸替代一个或多个以下残基：轻链的V205（Kabat编号方式）；重链的A118（EU编号方式）；和重链Fc区的S400（EU编号方式）。

抗体衍生物

可进一步修饰本发明的抗Bv8抗体以包含本领域知道的且易于获得的额外非蛋白质性质模块。优选的是，适于抗体衍生化的模块是水溶性聚合物。水溶性聚合物的非限制性例子包括但不限于聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纤维素、右旋糖苷、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、聚-1,3-二氧戊环、聚-1,3,6-三

烷、乙烯/马来酸酐共聚物、聚氨基酸（均聚物或随机共聚物）、右旋糖苷或聚(n-乙烯吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇（例如甘油）、聚乙烯醇、及其混合物。由于其在水中的稳定性，聚乙二醇丙醛在生产中可能具有优势。聚合物可以是任何分子量，而且可以是分支的或不分支的。附着于抗体的聚合物数目可以变化，而且如果附着了超过一个聚合物，那么它们可以是相同或不同的分子。一般而言，可根据下列考虑来确定用于衍生化的聚合物的数目和/或类型，包括但不限于待改进抗体的具体特性或功能、抗体衍生物是否将用于指定条件下的治疗等。

在另一个实施方案中，提供了抗体与可通过暴露于辐射而选择性加热的非蛋白质性质模块的偶联物。在一个实施方案中，该非蛋白质性质模块是碳纳米管(Kam等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102:11600-11605(2005))。辐射可以是任何波长的，包括但不限于对普通细胞无害但将非蛋白质性质模块加热至接近抗体-非蛋白质性质模块的细胞被杀死的温度的波长。

活性测定法

可通过本领域知道的多种测定法对本发明的抗体鉴定它们的物理/化学特性和生物学功能。

一方面，提供了用于鉴定具有生物学活性的抗Bv8抗体的测定法。生物学活性可以包括例如对Bv8相关效应的一个或多个方面（Bv8结合、Bv8介导的内皮细胞增殖、肿瘤转移）的调控。

在本发明的某些实施方案中，对本文在生成的免疫球蛋白分析它们的生物学活性。在有些实施方案中，对本发明的免疫球蛋白测试它们的抗原结合活性。本领域知道的且可用于本文的抗原结合测定法包括但不限于使用诸如Western印迹、放射免疫测定法、ELISA（酶联免疫吸附测定法）、“三明治”免疫测定法、免疫沉淀测定法、荧光免疫测定法和蛋白A免疫测定法等技术的任何直接或竞争性结合测定法。下文在实施例部分中提供了例示性的抗原结合测定法。

可通过一系列测定法进一步鉴定纯化的抗体，包括但不限于N端测序、氨基酸分析、非变性大小排阻高压液相层析(HPLC)、质谱、离子交换层析和木瓜蛋白酶消化。

在一些实施方案中，本发明设想了具有一些但非所有效应物功能的改良抗体，这使得它在抗体体内半衰期是重要的但某些效应物功能（诸如补体和ADCC）是不必要的或有害的许多应用中成为期望的候选物。在某些实施方案中，测量所生成免疫球蛋白的Fc活性以确保只保留了期望的特性。可进行体外和/或体内细胞毒性测定法以确认CDC和/或ADCC活性的降低/消减。例如，可进行Fc受体(FcR)结合测定法以确认抗体缺乏FcγR结合（因此有可能缺乏ADCC活性）但保留FcRn结合能力。介导ADCC的主要细胞，NK细胞，只表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。Ravetch and Kinet,Annu.Rev.Immunol.9:457-92(1991)第464页表3总结了造血细胞上的FcR表达。美国专利5,500,362或5,821,337中记载了用于评估目的分子的ADCC活性的体外测定法的实例。可用于此类测定法的效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者/另外，可在体内评估目的分子的ADCC活性，如在动物模型中，诸如Clynes et al.,PNAS(USA)95:652-656(1998)中所公开的。还可进行C1q结合测定法以确认抗体不能结合C1q且因此缺乏CDC活性。为了评估补体激活，可进行CDC测定法，例如如Gazzano-Santoroet al.,J.Immunol.Methods 202:163(1996)中所述。还可使用本领域知道的方法进行FcRn结合和体内清除/半衰期测定。

在有些实施方案中，本发明提供了具有提高的效应器功能和/或延长的半衰期的改良抗体。参见例如美国申请No.12/577,967。

载体、宿主细胞和重组方法

为了重组生产本发明的抗体，分离编码它的核酸，并将其插入可复制载体，用于进一步克隆（DNA扩增）或表达。可使用常规流程容易的分离编码抗体的DNA并测序（如使用能够与编码抗体重链和轻链的基因特异结合的寡核苷酸探针）。可利用许多载体。载体的选择部分取决于将要使用的宿主细胞。通常，优选的宿主细胞是原核或真核（通常是哺乳动物）起源的。应当领会，任何同种型的恒定区都可用于此目的，包括IgG、IgM、IgA、IgD和IgE恒定区，而且此类恒定区可以得自任何人或动物物种。

a.使用原核宿主细胞生成抗体：

i.载体构建

可使用标准重组技术来获得编码本发明抗体多肽构件的多核苷酸序列。可从抗体生成细胞诸如杂交瘤细胞分离期望的多核苷酸序列并测序。或者，可使用核苷酸合成仪或PCR技术合成多核苷酸。一旦得到，将编码多肽的序列插入能够在原核宿主中复制并表达异源多核苷酸的重组载体。为了本发明，可使用本领域可获得的且知道的许多载体。适宜载体的选择将主要取决于将要插入载体的核酸的大小和将要用载体转化的具体宿主细胞。根据其功能（扩增或表达异源多核苷酸，或二者兼之）及其与它在其中驻留的具体宿主细胞的相容性，每种载体含有多种构件。载体构件通常包括但不限于复制起点、选择标志基因、启动子、核糖体结合位点(RBS)、信号序列、异源核酸插入片段、和转录终止序列。

一般而言，与宿主细胞一起使用的质粒载体包含衍生自与这些宿主相容物种的复制子和控制序列。载体通常携带复制位点，以及能够在转化细胞中提供表型选择的标志序列。例如，通常用衍生自大肠杆菌物种的质粒pBR322转化大肠杆菌。pBR322包含编码氨苄青霉素(Amp)和四环素(Tet)抗性的基因，由此提供轻松鉴定转化细胞的手段。pBR322、其衍生物、或其它微生物质粒或噬菌体还可包含或经修饰而包含可被微生物生物体用于表达内源蛋白质的启动子。Carter等人，美国专利5,648,237中详细记载了用于表达特定抗体的pBR322衍生物的实例。

另外，可将包含与宿主微生物相容的复制子和控制序列的噬菌体载体用作这些宿主的转化载体。例如，可使用噬菌体诸如λGEM^TM-11来构建可用于转化易感宿主细胞诸如大肠杆菌LE392的重组载体。

本发明的表达载体可包含两种或多种启动子-顺反子对，它们编码每一种多肽构件。启动子是位于顺反子上游（5'）的非翻译调控序列，它调控顺反子的表达。原核启动子通常分成两类，诱导型和组成性。诱导型启动子指响应培养条件的变化（如营养物的存在与否或温度变化）而启动受其控制的顺反子的升高水平转录的启动子。

众所周知受到多种潜在宿主细胞识别的大量启动子。通过限制酶消化切下源DNA中的启动子并将分离的启动子序列插入本发明的载体，由此可将选择的启动子与编码轻链或重链的顺反子DNA可操作连接。天然启动子序列和许多异源启动子都可用于指导靶基因的扩增和/或表达。在有些实施方案中，使用异源启动子，因为与天然靶多肽启动子相比，它们通常容许所表达靶基因的更高转录和更高产量。

适用于原核宿主的启动子包括PhoA启动子、β-半乳糖苷酶和乳糖启动子系统、色氨酸(trp)启动子系统、和杂合启动子诸如tac或trc启动子。然而，在细菌中有功能的其它启动子（诸如其它已知的细菌或噬菌体启动子）也是合适的。它们的核苷酸序列已经发表，由此熟练工作人员能够使用提供任何所需限制位点的接头或衔接头将它们与编码靶轻链和重链的顺反子可操作连接（Siebenlist et al.,Cell 20:269(1980)）。

在本发明的一个方面，重组载体内的每个顺反子都包含指导所表达多肽穿膜转运的分泌信号序列构件。一般而言，信号序列可以是载体的构件，或者它可以是插入载体的靶多肽DNA的一部分。为了本发明而选择的信号序列应当是受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的信号序列。对于不识别并加工异源多肽的天然信号序列的原核宿主细胞，将信号序列用选自例如下组的原核信号序列替代：碱性磷酸酶、青霉素酶、Ipp、或热稳定的肠毒素II(STII)前导序列、LamB、PhoE、PelB、OmpA和MBP。在本发明的一个实施方案中，表达系统的两个顺反子中都使用的信号序列是STII信号序列或其变体。

在另一方面，依照本发明的免疫球蛋白的生成可在宿主细胞的细胞质中发生，因此不需要在每个顺反子内存在分泌信号序列。在那点上，免疫球蛋白轻链和重链在细胞质内表达、折叠和装配而形成功能性免疫球蛋白。某些宿主菌株（如大肠杆菌trxB^-菌株）提供有利于二硫键形成的细胞质条件，从而容许所表达蛋白质亚基的正确折叠和装配。Proba and Pluckthun,Gene 159:203(1995)）。

适于表达本发明抗体的原核宿主细胞包括古细菌（Archaebacteria）和真细菌（Eubacteria），诸如革兰氏阴性或革兰氏阳性生物体。有用细菌的实例包括埃希氏菌属（Escherichia）（如大肠埃希氏菌E.coli）、芽孢杆菌属（Bacillus）（如枯草芽孢杆菌B.subtilis）、肠杆菌属（Enterobacteria）、假单胞菌属（Pseudomonas）（如铜绿假单胞菌P.aeruginosa）物种、鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）、粘质沙雷氏菌（Serratia marcescans）、克雷伯氏菌属（Klebsiella）、变形菌属（Proteus）、志贺氏菌属（Shigella）、根瘤菌属（Rhizobium）、透明颤菌属（Vitreoscilla）、或副球菌属（Paracoccus）。在一个实施方案中，使用革兰氏阴性细胞。在一个实施方案中，使用大肠杆菌细胞作为本发明的宿主。大肠杆菌菌株的实例包括菌株W3110（Bachmann,Cellular and Molecular Biology，第2卷，Washington,D.C.，美国微生物学学会，1987，第1190-1219页；ATCC保藏号27,325）及其衍生物，包括具有基因型W3110ΔfhuA(ΔtonA)ptr3 lac Iq lacL8ΔompTΔ(nmpc-fepE)degP41 kan^R的菌株33D3（美国专利号5,639,635）。其它菌株及其衍生物，诸如大肠杆菌294（ATCC 31,446）、大肠杆菌B、大肠杆菌_λ1776（ATCC 31,537）和大肠杆菌RV308（ATCC 31,608）也是合适的。这些实例只是例示而非限制。本领域知道用于构建具有指定基因型的任何上述细菌衍生物的方法，参见例如Bass et al.,Proteins 8:309-314(1990)。通常必需考虑复制子在细菌细胞中的可复制性来选择适宜的细菌。例如，在使用众所周知的质粒诸如pBR322、pBR325、pACYC177或pKN410来提供复制子时，大肠杆菌、沙雷氏菌属、或沙门氏菌属物种可能适于用作宿主。通常，宿主细胞应当分泌最小量的蛋白水解酶，而且可能希望在细胞培养中掺入额外的蛋白酶抑制剂。

ii.抗体生成

用上述表达载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。

转化即将DNA导入原核宿主，使得DNA能够进行复制，或是作为染色体外元件或是通过染色体成分。根据所用宿主细胞，使用适于这些细胞的标准技术进行转化。采用氯化钙的钙处理通常用于具有坚固细胞壁屏障的细菌细胞。另一种转化方法采用聚乙二醇/DMSO。使用的还有一种技术是电穿孔。

在本领域知道的且适于培养选定宿主细胞的培养基中培养用于生成本发明多肽的原核细胞。合适培养基的实例包括添加了必需营养补充物的LB培养基(Luria broth)。在有些实施方案中，培养基还含有根据表达载体的构建而选择的选择剂，以选择性容许包含表达载体的原核细胞生长。例如，向用于培养表达氨苄青霉素抗性基因的细胞的培养基中添加氨苄青霉素。

除了碳、氮、和无机磷酸盐来源以外，还可含有适当浓度的任何必需补充物，或是单独加入或是作为与另一种补充物或培养基的混合物，诸如复合氮源。任选的是，培养基可含有一种或多种选自下组的还原剂：谷胱甘肽、半胱氨酸、胱胺、巯基乙酸盐/酯、二硫赤藓糖醇和二硫苏糖醇。

在合适的温度培养原核宿主细胞。例如，对于培养大肠杆菌，优选的温度范围是约20℃至约39℃，更优选约25℃至约37℃，甚至更优选约30℃。主要取决于宿主生物体，培养基的pH可以是范围为约5至约9的任何pH。对于大肠杆菌，pH优选约6.8至约7.4，更优选约7.0。

如果本发明的表达载体中使用诱导型启动子，那么在适于激活启动子的条件下诱导蛋白质表达。在本发明的一个方面，使用PhoA启动子来控制多肽的转录。因此，为了诱导，在磷酸盐限制培养基中培养经过转化的宿主细胞。优选的是，磷酸盐限制培养基是C.R.A.P培养基（参见例如Simmons et al.,J.Immunol.Methods 263:133-147(2002)）。根据所采用的载体构建物，可采用多种其它诱导物，正如本领域所知道的。

在一个实施方案中，所表达的本发明多肽分泌到宿主细胞的周质中并从中回收。蛋白质回收通常涉及破坏微生物，通常通过诸如渗压震扰(osmoticshock)、超声处理或裂解等手段。一旦细胞遭到破坏，可通过离心或过滤清除细胞碎片或整个细胞。可以通过例如亲和树脂层析进一步纯化蛋白质。或者，蛋白质可能转运到培养液中并从中分离。可从培养液清除细胞，并将培养物上清液过滤和浓缩，用于进一步纯化所生成蛋白质。可使用普遍知道的方法诸如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western印迹分析进一步分离和鉴定所表达蛋白质。

在本发明的一个方面，通过发酵过程大量进行抗体生产。多种大规模补料-分批发酵流程可用于生产重组蛋白。大规模发酵具有至少1000升的容量，优选约1,000至100,000升的容量。这些发酵罐使用搅拌器叶轮来分配氧和养分，尤其是葡萄糖（优选的碳源/能源）。小规模发酵通常指在体积容量不超过约100升的发酵罐中进行的发酵，范围可以是约1升至约100升。

在发酵过程中，通常在将细胞在合适条件下培养至期望密度（如OD₅₅₀约180-220，在此阶段细胞处于早期稳定期）后启动蛋白质表达的诱导。根据所采用的载体构建物，可使用多种诱导物，正如本领域知道的和上文描述的。可在诱导前将细胞培养更短的时间。通常将细胞诱导约12-50小时，但是可使用更长或更短的诱导时间。

为了提高本发明多肽的产量和质量，可修改多项发酵条件。例如，为了改善所分泌抗体多肽的正确装配和折叠，可使用过度表达伴侣蛋白诸如Dsb蛋白（DsbA、DsbB、DsbC、DsbD和/或DsbG）或FkpA（具有伴侣活性的一种肽基脯氨酰-顺式,反式-异构酶）的额外载体来共转化宿主原核细胞。已经证明伴侣蛋白促进在细菌宿主细胞中生成的异源蛋白质的正确折叠和溶解度。Chen et al.,J.Biol.Chem.274:19601-19605(1999);Georgiou等人，美国专利6,083,715;Georgiou等人，美国专利6,027,888;Bothmann and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17100-17105(2000);Ramm and Pluckthun,J.Biol.Chem.275:17106-17113(2000);Arie et al.,Mol.Microbiol.39:199-210(2001)）。

为了将所表达异源蛋白质（尤其是对蛋白水解敏感的异源蛋白质）的蛋白水解降至最低，可将蛋白水解酶缺陷的某些宿主菌株用于本发明。例如，可修饰宿主细胞菌株，在编码已知细菌蛋白酶的基因中进行遗传突变，诸如蛋白酶III、OmpT、DegP、Tsp、蛋白酶I、蛋白酶Mi、蛋白酶V、蛋白酶VI及其组合。可以获得有些大肠杆菌蛋白酶缺陷菌株，参见例如Joly et al.,(1998)见上文;Georgiou等人，美国专利5,264,365;Georgiou等人，美国专利5,508,192;Hara et al.,Microbial Drug Resistance 2:63-72(1996)。

在一个实施方案中，在本发明的表达系统中使用蛋白水解酶缺陷且经过过度表达一种或多种伴侣蛋白的质粒转化的大肠杆菌菌株作为宿主细胞。

iii.抗体纯化

可采用本领域知道的标准蛋白质纯化方法。下面的流程是合适纯化流程的例示：免疫亲和或离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土或阳离子交换树脂诸如DEAE上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE、硫酸铵沉淀、和使用例如

G-75的凝胶过滤。

在一个方面，将固定在固相上的蛋白A用于本发明全长抗体产物的免疫亲和纯化。蛋白A是来自金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureas）的41kD细胞壁蛋白质，它以高亲和力结合抗体Fc区。Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)）。蛋白A固定其上的固相优选具有玻璃或石英表面的柱子，更优选可控孔径玻璃柱或硅酸柱。在有些应用中，柱子以诸如甘油等试剂包被，试图防止污染物的非特异粘附。

作为纯化的第一步，将衍生自如上所述细胞培养物的制备物施加到蛋白A固定化固相上，使得目的抗体特异结合蛋白A。然后清洗固相以清除与固相非特异结合的污染物。最后通过洗脱从固相回收目的抗体。

b.使用真核宿主细胞生成抗体：

载体构件通常包括但不限于如下一种或多种：信号序列、复制起点、一种或多种标志基因、增强子元件、启动子、和转录终止序列。

(i)信号序列构件

在真核宿主细胞中使用的载体还可在目的成熟蛋白质或多肽的N端包含信号序列或具有特异切割位点的其它多肽。优选受到宿主细胞识别并加工（即被信号肽酶切除）的异源信号序列。在哺乳动物细胞表达中，可利用哺乳动物信号序列以及病毒分泌前导，例如单纯疱疹病毒gD信号。

将这些前体区的DNA连接到编码抗体的DNA的读码框中。

(ii)复制起点

通常，哺乳动物表达载体不需要复制起点构件。例如，SV40起点通常可能只因包含早期启动子才使用。

(iii)选择基因构件

表达和克隆载体可包含选择基因，也称为选择标志。典型的选择基因编码如下蛋白质：(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤或四环素；(b)补足相应的营养缺陷；或(c)提供不能从复合培养基获得的关键营养物。

选择方案的一个实例利用药物来阻滞宿主细胞的生长。经异源基因成功转化的那些细胞生成赋予药物抗性的蛋白质，因而幸免于选择方案。此类显性选择的实例使用药物新霉素、霉酚酸和潮霉素。

适于哺乳动物细胞的选择标志的另一个实例是能够鉴定有能力摄取抗体核酸的细胞的选择标志，诸如DHFR、胸苷激酶、金属硫蛋白I和II优选灵长类金属硫蛋白基因、腺苷脱氨酶、鸟氨酸脱羧酶等。

例如，首先通过将所有转化子在含有甲氨蝶呤（Mtx，DHFR的一种竞争性拮抗剂）的培养基中进行培养来鉴定经DHFR选择基因转化的细胞。在采用野生型DHFR时，适宜的宿主细胞是DHFR活性缺陷的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞系（如

CRL-9096）。

或者，可通过在含有针对选择标志的选择剂诸如氨基糖苷抗生素如卡那霉素、新霉素或G418的培养基中培养细胞来选择经编码抗体、野生型DHFR蛋白、和另一种选择标志诸如氨基糖苷3'-磷酸转移酶(APH)的DNA序列转化或共转化的宿主细胞（特别是包含内源DHFR的野生型宿主）。参见美国专利4,965,199。

(iv)启动子构件

表达和克隆载体通常包含受到宿主生物体识别的启动子，且与抗体多肽核酸可操作连接。已知真核细胞的启动子序列。事实上，所有真核基因都具有富含AT区，它位于起始转录的位点上游约25至30个碱基处。在许多基因的转录起点上游70至80个碱基处发现的另一种序列是CNCAAT(SEQ ID NO：206)区，其中N可以是任何核苷酸。在大多数真核基因的3'端是AATAAA(SEQID NO：207)序列，它可能是向编码序列的3'端添加聚腺苷酸(polyA)尾的信号。所有这些序列合适的插入真核表达载体中。

在哺乳动物宿主细胞中由载体转录抗体多肽受到例如从病毒（诸如多瘤病毒、禽痘病毒、腺病毒（诸如2型腺病毒）、牛乳头瘤病毒、禽类肉瘤病毒、巨细胞病毒、逆转录病毒、乙肝病毒、和猿猴病毒40(SV40)）基因组获得的、来自异源哺乳动物启动子（如肌动蛋白启动子或免疫球蛋白启动子）的、来自热休克启动子的启动子的控制，倘若这些启动子与宿主细胞系统相容的话。

方便的以SV40限制性片段的形式获得SV40病毒的早期和晚期启动子，该片段还包含SV40病毒复制起点。方便的以HindIII E限制性片段的形式获得人巨细胞病毒的立即早期启动子。美国专利4,419,446中公开了使用牛乳头瘤病毒作为载体在哺乳动物宿主中表达DNA的系统。美国专利4,601,978中记载了该系统的一种修改。或者，可使用劳氏肉瘤病毒长末端重复序列作为启动子。

(v)增强子元件构件

常常通过在载体中插入增强子序列来提高高等真核细胞对编码本发明抗体多肽的DNA的转录。现在知道来自哺乳动物基因（球蛋白、弹性蛋白酶、清蛋白、α-胎蛋白和胰岛素）的许多增强子序列。然而，通常使用来自真核细胞病毒的增强子。实例包括SV40复制起点晚期侧的增强子（bp 100-270）、巨细胞病毒早期启动子增强子、多瘤病毒复制起点晚期侧的增强子、和腺病毒增强子。关于激活真核启动子的增强元件还可参见Yaniv,Nature 297:17-18(1982)。增强子可剪接到载体中，位于抗体多肽编码序列的5'或3'位置，但是优选位于启动子的5'位点。

(vi)转录终止构件

在真核宿主细胞中使用的表达载体通常还包含终止转录和稳定mRNA所必需的序列。此类序列通常可从真核或病毒DNA或cDNA非翻译区的5'端和偶尔的3'端获得。这些区域包含在编码抗体的mRNA的非翻译区中转录成聚腺苷酸化片段的核苷酸区段。一种有用的转录终止构件是牛生长激素聚腺苷酸化区。参见WO94/11026及其中公开的表达载体。

(vii)宿主细胞的选择和转化

适于克隆或表达本文载体中的DNA的宿主细胞包括本文描述的高等真核细胞，包括脊椎动物宿主细胞。脊椎动物细胞在培养（组织培养）中的繁殖已经成为常规流程。有用哺乳动物宿主细胞系的实例有经SV40转化的猴肾CV1系（COS-7，CRL 1651）、人胚肾系（293细胞或为悬浮培养而亚克隆的293细胞，Graham et al.,J.Gen.Virol.36:59(1977)）、幼仓鼠肾细胞（BHK，

CCL 10）、中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR（CHO，Urlaub et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980)）、小鼠塞托利(Sertoli)细胞（TM4，Mather,Biol.Reprod.23:243-251(1980)）、猴肾细胞（CV1，CCL 70）、非洲绿猴肾细胞（VERO-76，

CRL 1587）、人宫颈癌细胞（HELA，

CCL 2）、犬肾细胞（MDCK，

CCL 34）、牛鼠(buffalo rat)肝细胞（BRL 3A，

CRL 1442）、人肺细胞（W138，CCL 75）、人肝细胞（Hep G2，HB 8065）、小鼠乳瘤（MMT 060562，

CCL 51）、TRI细胞（Mather et al.,Annals N.Y.Acad.Sci.383:44-68(1982)）、MRC 5细胞、FS4细胞和人肝细胞瘤(hepatoma)系（Hep G2）。

为了生成抗体，用上文所述表达或克隆载体转化宿主细胞，并在为了诱导启动子、选择转化子或扩增编码期望序列的基因而适当改动的常规营养培养基中进行培养。

(viii)宿主细胞的培养

可在多种培养基中培养用于生成本发明抗体的宿主细胞。商品化培养基诸如Ham氏F10（Sigma）、极限必需培养基（MEM，Sigma）、RPMI-1640（Sigma）、和Dulbecco氏修改Eagle氏培养基（DMEM，Sigma）适于培养宿主细胞。另外，可使用下列文献中记载的任何培养基作为宿主细胞的培养基：Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979);Barnes et al.,Anal.Biochem.102:255(1980);美国专利4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;5,122,469;WO90/03430;WO 87/00195;或美国专利复审30,985。任何这些培养基可根据需要补充激素和/或其它生长因子（诸如胰岛素、运铁蛋白或表皮生长因子）、盐（诸如氯化钠、钙、镁和磷酸盐）、缓冲剂（诸如HEPES）、核苷酸（诸如腺苷和胸苷）、抗生素（诸如GENTAMYCIN^TM药物）、痕量元素（定义为通常以微摩尔范围的终浓度存在的无机化合物）、和葡萄糖或等效能源。还可以适宜浓度含有本领域技术人员知道的任何其它必需补充物。培养条件诸如温度、pH等即为表达而选择的宿主细胞先前所用的，这对于普通技术人员是显然的。

(ix)抗体的纯化

在使用重组技术时，可在细胞内生成抗体，或者直接分泌到培养基中。如果在细胞内生成抗体，那么首先需要通过例如离心或超滤清除微粒碎片，或是宿主细胞或是裂解片段。如果抗体分泌到培养基中，那么通常首先使用商品化蛋白质浓缩滤器（例如Amicon或Millipore Pellicon超滤单元）浓缩来自这些表达系统的上清液。可在任何上述步骤中包括蛋白酶抑制剂诸如PMSF以抑制蛋白水解，而且可包括抗生素以防止外来污染物的生长。

可使用例如羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析（优选的纯化技术是亲和层析）来纯化从细胞制备的抗体组合物。蛋白A作为亲和配体的适宜性取决于抗体中存在的任何免疫球蛋白Fc结构域的种类和同种型。蛋白A可用于纯化基于人γ1、γ2、或γ4重链的抗体（Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983)）。蛋白G推荐用于所有小鼠同种型和人γ3（Guss et al.,EMBOJ.5:1567-1575(1986)）。亲和配体所附着的基质最常用的是琼脂糖，但是可使用其它基质。物理稳定的基质诸如可控孔径玻璃或聚(苯乙烯二乙烯)苯能获得比琼脂糖更快的流速和更短的加工时间。若抗体包含C_H3结构域，则可使用Bakerbond ABX^TM树脂（J.T.Baker，Phillipsburg，NJ）进行纯化。根据待回收的抗体，也可使用其它蛋白质纯化技术诸如离子交换柱上的分馏、乙醇沉淀、反相HPLC、硅土上的层析、肝素SEPHAROSE^TM上的层析、阴离子或阳离子交换树脂（诸如聚天冬氨酸柱）上的层析、层析聚焦、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。

在任何初步纯化步骤之后，可将含有目的抗体和污染物的混合物进行低pH疏水相互作用层析，使用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液，优选在低盐浓度（如约0-0.25M盐）进行。

免疫偶联物

本发明还提供包含偶联有一种或多种细胞毒剂的抗体的免疫偶联物（可互换的称为“抗体-药物偶联物”或“ADC”），所述细胞毒剂诸如化疗剂、药物、生长抑制剂、毒素（例如蛋白质毒素，细菌、真菌、植物或动物起源的酶活性毒素，或其片段）、或放射性同位素（即放射偶联物）。

免疫偶联物已经在癌症治疗中用于局部投递细胞毒剂（即杀死或抑制细胞生长或增殖的药物）（Lambert,J.(2005)Curr.Opinion in Pharmacology5:543-549;Wu等(2005)Nature Biotechnology 23(9):1137-1146;Payne,G.(2003)i 3:207-212;Syrigos和Epenetos(1999)Anticancer Research 19:605-614;Niculescu-Duvaz和Springer(1997)Adv.Drug Deliv.Rev.26:151-172;美国专利No.4,975,278）。免疫偶联物容许将药物模块靶向投递至肿瘤，并在那儿进行细胞内积累，而系统施用未经偶联的药物可能在试图消除的肿瘤细胞以外导致不可接受的对正常细胞的毒性水平（Baldwin等,Lancet(1986年3月15日)第603-05页;Thorpe，“Antibody Carriers Of Cytotoxic Agents In CancerTherapy：A Review”，在《Monoclonal Antibodies'84：Biological And ClinicalApplications》中，A.Pinchera等人编，第475-506页，1985）。多克隆抗体和单克隆抗体皆有报导可用于这些策略（Rowland等,Cancer Immunol.Immunother.21：183-87(1986)）。这些方法中所使用的药物包括道诺霉素(daunomycin)、多柔比星(doxorubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)和长春地辛(vindesine)（Rowland等,1986,见上文）。抗体-毒素偶联物中所使用的毒素包括细菌毒素诸如白喉毒素、植物毒素诸如蓖麻毒蛋白、小分子毒素诸如格尔德霉素(geldanamycin)（Mandler等,J.Nat.Cancer Inst.92(19)：1573-1581(2000);Mandler等,Bioorganic & Med.Chem.Letters 10：1025-1028(2000);Mandler等,Bioconjugate Chem.13：786-791(2002)）、美登木素生物碱类（EP1391213;Liu等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：8618-8623(1996)）、和加利车霉素（Lode等,Cancer Res.58：2928(1998);Hinman等,Cancer Res.53：3336-3342(1993)）。毒素可通过包括微管蛋白结合、DNA结合或拓扑异构酶抑制在内的机制发挥其细胞毒性效果。有些细胞毒药物在与大的抗体或蛋白质受体配体偶联时趋于失活或活性降低。

（ibritumomab tiuxetan，Biogen/Idec）是由针对在正常和恶性B淋巴细胞表面上发现的CD20抗原的鼠IgG1 κ单克隆抗体与通过硫脲接头-螯合剂所结合的111In或90Y放射性同位素构成的抗体-放射性同位素偶联物（Wiseman等,Eur.Jour.Nucl.Med.27(7)：766-77(2000)；Wiseman等,Blood99(12)：4336-42(2002);Witzig等,J.Clin.Oncol.20(10)：2453-63(2002);Witzig等,J.Clin.Oncol.20(15)：3262-69(2002)）。尽管ZEVALIN具有针对B细胞非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤(NHL)的活性，然而施药在大多数患者中导致严重且长时间的血细胞减少。MYLOTARG^TM（gemtuzumab ozogamicin，WyethPharmaceuticals），即由人CD33抗体与加利车霉素连接而构成的抗体-药物偶联物，在2000年批准用于经注射治疗急性骨髓性白血病（Drugs of the Future25(7)：686(2000);美国专利No.4970198;5079233;5585089;5606040;5693762;5739116;5767285;5773001）。Cantuzumab mertansine（ImmunogenInc.），即由huC242抗体经二硫化物接头SPP与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于治疗表达CanAg的癌症诸如结肠癌、胰腺癌、胃癌和其它癌的II期试验。MLN-2704（Millennium Pharm.,BZLBiologics,Immunogen Inc.），即由抗前列腺特异性膜抗原(PSMA)单克隆抗体与美登木素生物碱药物模块DM1连接而构成的抗体-药物偶联物，正在进行用于前列腺肿瘤潜在治疗的开发。将多拉司他汀(dolastatin)的合成类似物auristatin肽，auristatin E(AE)和单甲基auristatin(MMAE)与嵌合单克隆抗体cBR96（对癌瘤上的Lewis Y特异）和cAC10（对血液学恶性肿瘤上的CD30特异）偶联（Doronina等,Nature Biotechnol.21(7)：778-784(2003)），且正在进行治疗性开发。

在某些实施方案中，免疫偶联物包含抗体和化疗剂或其它毒素。本文（例如上文）描述了可用于生成免疫偶联物的化疗剂。可使用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolacaamericana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordica charantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。多种放射性核素可用于生成放射偶联抗体。例子包括²¹²Bi、¹³¹I、¹³¹In、⁹⁰Y和¹⁸⁶Re。抗体和细胞毒剂的偶联物可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)，亚氨基硫烷(IT)，亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta等,Science 238：1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO 94/11026。

本文还涵盖抗体与一种或多种小分子毒素诸如加利车霉素(calicheamicin)、美登木素生物碱类(maytansinoids)、多拉司他汀类(dolostatins)、aurostatins、单端孢霉素(trichothecene)和CC1065及这些毒素具有毒素活性的衍生物的偶联物。

美登素和美登木素生物碱类

在有些实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个美登木素生物碱分子的抗体（全长或片段）。

美登木素生物碱类是通过抑制微管蛋白多聚化来发挥作用的有丝分裂抑制剂。美登素最初从东非灌木齿叶美登木（Maytenus serrata）分离得到（美国专利3,896,111）。随后发现某些微生物也生成美登木素生物碱类，诸如美登醇和C-3美登醇酯（美国专利4,151,042）。例如下列美国专利公开了合成美登醇及其衍生物和类似物：4,137,230;4,248,870;4,256,746;4,260,608;4,265,814;4,294,757;4,307,016;4,308,268;4,308,269;4,309,428;4,313,946;4,315,929;4,317,821;4,322,348;4,331,598;4,361,650;4,364,866;4,424,219;4,450,254;4,362,663;及4,371,533。

美登木素生物碱类药物模块在抗体药物偶联物中是有吸引力的药物模块，因为它们：(i)相对易于通过发酵或发酵产物的化学修饰、衍生化来制备；(ii)易于用适于通过非二硫化物接头的偶联的官能基衍生化；(iii)在血浆中稳定；且(iv)有效针对多种肿瘤细胞系。

例如下列专利公开了包含美登木素生物碱类的免疫偶联物及其制备方法和治疗用途：美国专利5,208,020;5,416,064;及欧洲专利EP 0 425 235 B1。Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93:8618-8623(1996)记载了包含与针对人结肠直肠癌的单克隆抗体C242连接的称为DM1的美登木素生物碱的免疫偶联物。发现该偶联物具有针对培养的结肠癌细胞的高度细胞毒性，而且在体内肿瘤生长测定法中显示抗肿瘤活性。Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992)记载了其中美登木素生物碱经二硫化物接头与结合人结肠癌细胞系上抗原的鼠抗体A7或结合HER-2/neu癌基因的另一种鼠单克隆抗体TA.1偶联的免疫偶联物。在体外在人乳癌细胞系SK-BR-3上测试了TA.1-美登木素生物碱偶联物的细胞毒性，该细胞系每个细胞表达3x105个HER-2表面抗原。药物偶联物达到了与游离美登木素生物碱药物相似的一定程度的细胞毒性，这可通过增加每个抗体分子偶联的美登木素生物碱分子数目来提高。A7-美登木素生物碱偶联物在小鼠中显示低系统性细胞毒性。

抗体-美登木素生物碱偶联物通过将抗体与美登木素生物碱分子化学连接且不显著削弱抗体或美登木素生物碱分子的生物学活性来制备。参见例如美国专利No.5,208,020。每个抗体分子偶联平均3-4个美登木素生物碱分子在增强针对靶细胞的细胞毒性中显示功效，且对抗体的功能或溶解度没有负面影响，尽管预计甚至一个分子的毒素/抗体也将较之裸抗体的使用增强细胞毒性。美登木素生物碱类在本领域是众所周知的，而且可通过已知技术合成或从天然来源分离。例如美国专利5,208,020和上文提及的其它专利及非专利发表物中公开了合适的美登木素生物碱类。优选的美登木素生物碱类是美登醇和美登醇分子的芳香环或其它位置经过修饰的美登醇类似物，诸如各种美登醇酯。

本领域知道许多连接基团可用于制备抗体-美登木素生物碱偶联物，包括例如美国专利5,208,020或欧洲专利0 425 235 B1;Chari et al.,CancerResearch 52:127-131(1992);2004年10月9日提交的美国专利申请No.10/960,602中所公开的。包含接头构件SMCC的抗体-美登木素生物碱类偶联物可以如2004年10月8日提交的美国专利申请No.10/960,602中所披露的来制备。连接基团包括二硫化物基团、硫醚基团、酸不稳定基团、光不稳定基团、肽酶不稳定基团、或酯酶不稳定基团，正如上文所述专利中所公开的，优选二硫化物和硫醚基团。本文中描述和例示了别的连接基团。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和美登木素生物碱的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。特别优选的偶联剂包括N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)（Carlsson et al.,Biochem.J.173:723-737(1978)）和N-琥珀酰亚氨基-4-(2-吡啶基硫代)戊酸酯(SPP)，由此提供二硫键连接。

根据连接的类型，可将接头附着于美登木素生物碱分子的多个位置。例如，可使用常规偶联技术通过与羟基的反应来形成酯键。反应可发生在具有羟基的C-3位置、经羟甲基修饰的C-14位置、经羟基修饰的C-15位置、和具有羟基的C-20位置。在一个优选的实施方案中，在美登醇或美登醇类似物的C-3位置形成键连接。

Auristatin和多拉司他汀

在有些实施方案中，免疫偶联物包含与多拉司他汀类(dolastatins)或多拉司他汀肽类似物及衍生物、auristatin类偶联的抗体(美国专利No.5,635,483;5,780,588)。多拉司他汀类和auristatin类已经显示出干扰微管动力学、GTP水解、及核和细胞分裂(Woyke et al(2001)Antimicrob.Agents and Chemother.45(12):3580-3584)且具有抗癌(US 5,663,149)和抗真菌活性(Pettit et al(1998)Antimicrob.Agents Chemother.42:2961-2965)。多拉司他汀或auristatin药物模块可经由肽药物模块的N（氨基）末端或C（羧基）末端附着于抗体(WO02/088172)。

例示性的auristatin实施方案包括N-末端连接的单甲基auristatin药物模块DE和DF，披露于“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation toLigands”,2004年11月5日提交的美国流水号10/983,340。

典型的是，基于肽的药物模块可通过在两个或多个氨基酸和/或肽片段之间形成肽键来制备。此类肽键可依照例如肽化学领域众所周知的液相合成法来制备(参见E.

and K.Lübke,The Peptides,volume 1,pp 76-136,1965,Academic Press)。auristatin/多拉司他汀药物模块可依照以下文献中的方法来制备：US 5,635,483;US 5,780,588;Pettit et al(1989)J.Am.Chem.Soc.111:5463-5465;Pettit et al(1998)Anti-Cancer Drug Design 13:243-277;Pettit,G.R.,et al.Synthesis,1996,719-725;Pettit et al(1996)J.Chem.Soc.PerkinTrans.1 5:859-863;及Doronina(2003)Nat Biotechnol 21(7):778-784;“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”,美国流水号No.10/983,340,2004年11月5日提交（披露了例如制备诸如MMAE和MMAF偶联至接头的单甲基缬氨酸化合物的接头和方法）。

加利车霉素

在其它实施方案中，免疫偶联物包含偶联有一个或多个加利车霉素分子的抗体。加利车霉素抗生素家族能够在亚皮摩尔浓度生成双链DNA断裂。关于加利车霉素家族偶联物的制备参见美国专利5,712,374;5,714,586;5,739,116;5,767,285;5,770,701;5,770,710;5,773,001;5,877,296（都授予美国Cyanamid公司）。可用的加利车霉素结构类似物包括但不限于γ1^I、α2^I、α3^I、N-乙酰基-γ1^I、PSAG和θ^I1（Hinman et al.,Cancer Research 53:3336-3342(1993);Lode et al.,Cancer Research 58:2925-2928(1998);及上述授予美国Cyanamid公司的美国专利）。可与抗体偶联的另一种抗肿瘤药物是QFA，它是一种抗叶酸药物。加利车霉素和QFA都具有胞内作用位点，且不易穿过质膜。因此，这些试剂经由抗体介导的内在化的细胞摄取大大增强了它们的细胞毒效果。

其它细胞毒剂

可与抗体偶联的其它抗肿瘤剂包括BCNU、链佐星(streptozoicin)、长春新碱(vincristine)、5-氟尿嘧啶、美国专利5,053,394、5,770,710中记载的统称为LL-E33288复合物的试剂家族、及埃斯波霉素类(esperamicins)（美国专利5,877,296）。

可用的酶活性毒素及其片段包括白喉毒素A链、白喉毒素的非结合活性片段、外毒素A链（来自铜绿假单胞菌Pseudomonas aeruginosa）、蓖麻毒蛋白(ricin)A链、相思豆毒蛋白(abrin)A链、蒴莲根毒蛋白(modeccin)A链、α-帚曲霉素(sarcin)、油桐(Aleutites fordii)毒蛋白、香石竹(dianthin)毒蛋白、美洲商陆(Phytolaca americana)毒蛋白（PAPI、PAPII和PAP-S）、苦瓜(Momordicacharantia)抑制物、麻疯树毒蛋白(curcin)、巴豆毒蛋白(crotin)、肥皂草(sapaonaria officinalis)抑制物、白树毒蛋白(gelonin)、丝林霉素(mitogellin)、局限曲菌素(restrictocin)、酚霉素(phenomycin)、依诺霉素(enomycin)和单端孢菌素(trichothecenes)。参见例如1993年10月28日公布的WO 93/21232。

本发明还设想了抗体和具有核酸降解活性的化合物（如核糖核酸酶或DNA内切核酸酶，诸如脱氧核糖核酸酶；DNA酶）之间形成的免疫偶联物。

为了选择性破坏肿瘤，抗体可包含高度放射性原子。多种放射性同位素可用于生成放射偶联抗体。实例包括At²¹¹、I¹³¹、I¹²⁵、Y⁹⁰、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸、Sm¹⁵³、Bi²¹²、P³²、Pb²¹²和Lu的放射性同位素。在将偶联物用于检测时，可包含放射性原子用于闪烁照相研究，例如Tc^99m或I¹²³，或是包含自旋标记物用于核磁共振（NMR）成像（也称为磁共振成像，MRI），诸如碘-123、碘-131、铟-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、钆、锰或铁。

可以已知方式将放射性或其它标记物掺入偶联物。例如，可生物合成肽，或是通过化学氨基酸合成法合成肽，其中使用涉及例如氟-19代替氢的合适氨基酸前体。可经肽中的半胱氨酸残基来附着标记物，诸如Tc^99m或I¹²³、Re¹⁸⁶、Re¹⁸⁸和In¹¹¹。可以经赖氨酸残基来附着钇-90。IODOGEN法（Fraker et al.(1978)Biochem.Biophys.Res.Commun.80:49-57）可用于掺入碘-123。《MonoclonalAntibodies in Immunoscintigraphy》（Chatal,CRC Press,1989）详细记载了其它方法。

可使用多种双功能蛋白质偶联剂来制备抗体和细胞毒剂的偶联物，诸如N-琥珀酰亚氨基-3-(2-吡啶基二硫代)丙酸酯(SPDP)、琥珀酰亚氨基-4-(N-马来酰亚氨基甲基)环己烷-1-羧酸酯(SMCC)、亚氨基硫烷(IT)、亚氨酸酯（诸如盐酸己二酰亚氨酸二甲酯）、活性酯类（诸如辛二酸二琥珀酰亚氨基酯）、醛类（诸如戊二醛）、双叠氮化合物（诸如双(对-叠氮苯甲酰基)己二胺）、双重氮衍生物（诸如双(对-重氮苯甲酰基)-乙二胺）、二异硫氰酸酯（诸如甲苯2,6-二异氰酸酯）、和双活性氟化合物（诸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯）的双功能衍生物。例如，可如Vitetta et al.,Science 238:1098(1987)中所述制备蓖麻毒蛋白免疫毒素。碳-14标记的1-异硫氰酸苯甲基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)是用于将放射性核苷酸与抗体偶联的例示性螯合剂。参见WO94/11026。接头可以是便于在细胞中释放细胞毒药物的“可切割接头”。例如，可使用酸不稳定接头、肽酶敏感接头、光不稳定接头、二甲基接头、或含二硫化物接头（Chari et al.,Cancer Research 52:127-131(1992);美国专利5,208,020）。

化合物明确涵盖但不限于用下列交联剂制备的ADC：商品化（如购自Pierce Biotechnology Inc.,Rockford,IL,U.S.A.）的BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、sulfo-EMCS、sulfo-GMBS、sulfo-KMUS、sulfo-MBS、sulfo-SIAB、sulfo-SMCC和sulfo-SMPB、和SVSB（琥珀酰亚胺基-(4-乙烯基砜)苯甲酸酯）。见2003-2004年度应用手册和产品目录(Applications Handbook and Catalog)第467-498页。

抗体-药物偶联物的制备

在抗体-药物偶联物(ADC)中，将抗体(Ab)经接头(L)与一个或多个药物部分(D)偶联，例如每个抗体偶联约1个至约20个药物部分。可采用本领域技术人员知道的有机化学反应、条件和试剂通过数种路径来制备通式I的ADC，包括：(1)抗体的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成Ab-L，随后与药物部分D反应；和(2)药物部分的亲核基团经共价键与二价接头试剂反应，形成D-L，随后与抗体的亲核基团反应。本文中描述了用于制备ADC的别的方法。

Ab-(L-D)p    I

接头可以由一种或多种接头构件构成。例示性的接头构件包括6-马来酰亚胺己酰基("MC")、马来酰亚胺丙酰基("MP")、缬氨酸-瓜氨酸("val-cit")、丙氨酸-苯丙氨酸("ala-phe")、对氨基苄氧羰基("PAB")、4-(2-吡啶基硫代)戊酸N-琥珀酰亚氨基酯(″SPP")、4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1羧酸N-琥珀酰亚氨基酯(″SMCC')、和(4-碘-乙酰基)氨基苯甲酸N-琥珀酰亚氨基酯(″SIAB")。本领域知道别的接头构件，本文也描述了一些。还可参见“Monomethylvaline Compounds Capable of Conjugation to Ligands”,美国流水号No.10/983,340,2004年11月5日提交。

在有些实施方案中，接头可包含氨基酸残基。例示性的氨基酸接头构件包括二肽、三肽、四肽或五肽。例示性的二肽包括：缬氨酸-瓜氨酸（vc或val-cit）、丙氨酸-苯丙氨酸（af或ala-phe）。例示性三肽包括：甘氨酸-缬氨酸-瓜氨酸（gly-val-cit）和甘氨酸-甘氨酸-甘氨酸（gly-gly-gly）。构成氨基酸接头构件的氨基酸残基包括那些天然存在的氨基酸，以及次要的氨基酸和非天然存在的氨基酸类似物，诸如瓜氨酸。氨基酸接头构件可以在它们的特定酶（例如肿瘤相关蛋白酶，组织蛋白酶B、C和D，或纤溶酶蛋白酶）的酶促切割的选择性方面进行设计和优化。

抗体的亲核基团包括但不限于：(i)N末端氨基；(ii)侧链氨基，如赖氨酸；(iii)侧链巯基，如半胱氨酸；和(iv)糖基化抗体中糖的羟基或氨基。氨基、巯基、和羟基是亲核的，能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基和马来酰亚胺基团。某些抗体具有可还原的链间二硫键，即半胱氨酸桥。可通过还原剂诸如DTT（二硫苏糖醇）处理使抗体具有与接头试剂偶联的反应活性。每个半胱氨酸桥理论上将形成两个反应性硫醇亲核体。可经由赖氨酸与2-亚氨基硫烷（Traut氏试剂）的反应，导致胺转变为硫醇，从而将额外亲核基团引入抗体。可以通过导入一个、两个、三个、四个、或更多个半胱氨酸残基（例如制备包含一个或多个非天然半胱氨酸氨基酸残基的突变型抗体）而将反应性硫醇基导入抗体（或其片段）。

还可通过修饰抗体来生成抗体-药物偶联物，即引入可与接头试剂或药物上的亲核取代基反应的亲电子部分。可用例如高碘酸盐氧化剂氧化糖基化抗体的糖，从而形成可与接头试剂或药物部分的胺基团反应的醛或酮基团。所得亚胺Schiff碱基可形成稳定的键，或者可用例如硼氢化物试剂还原而形成稳定的胺连接。在一个实施方案中，糖基化抗体的碳水化合物部分与半乳糖氧化酶或偏高碘酸钠的反应可在蛋白质中生成羰（醛和酮）基团，它可与药物上的适宜基团反应（Hermanson，Bioconjugate Techniques）。在另一个实施方案中，包含N末端丝氨酸或苏氨酸残基的蛋白质可与偏高碘酸钠反应，导致在第一个氨基酸处生成醛（Geoghegan & Stroh,Bioconjugate Chem.3:138-146(1992);US 5362852）。此类醛可与药物部分或接头亲核体反应。

同样，药物部分上的亲核基团包括但不限于：胺、硫醇、羟基、酰肼、肟、肼、缩氨基硫脲、肼羧酸酯、和芳基酰肼基团，它们能够与接头部分上的亲电子基团反应而形成共价键，而接头试剂包括：(i)活性酯类，诸如NHS酯、HOBt酯、卤代甲酸酯、和酸性卤化物；(ii)烷基和苯甲基卤化物，诸如卤代乙酰胺；(iii)醛类、酮类、羧基、和马来酰亚胺基团。

或者，可通过例如重组技术或肽合成来制备包含抗体和细胞毒剂的融合蛋白。DNA的长度可包含各自编码偶联物两个部分的区域，或是彼此毗邻或是由编码接头肽的区域分开，该接头肽不破坏偶联物的期望特性。

在又一个实施方案中，可将抗体与“受体”（诸如链霉亲和素）偶联从而用于肿瘤预先靶向，其中对患者施用抗体-受体偶联物，接着使用清除剂由循环中清除未结合的偶联物，然后施用与细胞毒剂（如放射性核素）偶联的“配体”（如亲合素）。

本发明的组合物

本发明还涵盖组合物，包括药物组合物，其包含抗Bv8抗体，和包含编码抗Bv8抗体的序列的多核苷酸。如本文中使用的，组合物包含一种或多种结合Bv8的抗体，和/或包含编码一种或多种结合Bv8的抗体的序列的一种或多种多核苷酸。这些组合物可进一步包含合适的载体，诸如药学可接受赋形剂，包括缓冲剂，它们是本领域公知的。

可通过将具有期望纯度的抗体与任选的生理学可接受载体、赋形剂或稳定剂混合来制备包含本发明抗Bv8抗体的治疗用配制剂，以水溶液、冻干或其它干燥剂型的形式贮存（Remington:The Science and Practice of Pharmacy20th edition(2000)）。可接受的载体、赋形剂或稳定剂在所采用的剂量和浓度对接受者是无毒的，而且包括缓冲剂，诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸；抗氧化剂，包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂（诸如氯化十八烷基二甲基苄基铵；氯化己烷双胺；苯扎氯铵、苯索氯铵；酚、丁醇或苯甲醇；对羟基苯甲酸烷基酯，诸如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚）；低分子量（少于约10个残基）多肽；蛋白质，诸如血清清蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，诸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，诸如EDTA；糖类，诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐相反离子，诸如钠；金属复合物（如Zn-蛋白质复合物）；和/或非离子表面活性剂，诸如TWEEN^TM、PLURONICS^TM或聚乙二醇(PEG)。

本文中的配制剂还可含有超过一种所治疗具体适应症所必需的活性化合物，优选活性互补且彼此没有不利影响的。合适的是，此类分子以对于预定目的有效的量组合。

活性成分还可包载于例如通过凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中（例如分别是羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊）、在胶状药物传递系统中（例如脂质体、清蛋白微球体、微乳剂、纳米颗粒和纳米胶囊）、或在粗滴乳状液中。此类技术公开于例如Remington:The Scienceand Practice of Pharmacy 20th edition(2000)。

用于体内施用的配制剂必须是无菌的。这可容易的通过使用无菌滤膜过滤来实现。

可制备持续释放配制剂。持续释放配制剂的合适例子包括含有本发明免疫球蛋白的固体疏水性聚合物半透性基质，该基质以定型产品的形式存在，如薄膜或微胶囊。持续释放基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇)）、聚交酯（美国专利3,773,919）、L-谷氨酸和γ-乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯-乙酸乙烯共聚物、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物诸如LUPRON DEPOT^TM（由乳酸-乙醇酸共聚物和醋酸亮丙瑞林构成的可注射微球体）及聚-D-(-)-3-羟基丁酸。虽然诸如乙烯-乙酸乙烯和乳酸-乙醇酸等聚合物能够持续释放分子100天以上，但是某些水凝胶释放蛋白质的时间较短。当胶囊化抗体在体内长时间维持时，它们可能由于暴露于37℃的潮湿环境而变性或聚集，导致生物学活性损失和免疫原性可能改变。可根据相关机制来设计合理的稳定化策略。例如，如果发现聚集机制是经由硫醇-二硫化物互换而形成分子间S-S键，那么可通过修饰巯基残基、由酸性溶液冻干、控制湿度、采用适宜添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来实现稳定。

用途

本发明的抗体可用于例如体外、回体(ex vivo)和体内治疗方法。

本发明提供了可用于调控与Bv8的表达和/或活性（诸如升高的表达和/或活性或不想要的表达和/或活性）有关的疾病状态的方法和组合物，所述方法包括将有效剂量的抗Bv8抗体施用于需要此类治疗的个体。

一方面，本发明提供了有用治疗或预防肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症的方法，该方法包括将有效量的抗Bv8抗体施用于需要此类治疗的个体。

一方面，本发明提供了用于抑制血管发生的方法，该方法包括将有效量的抗Bv8抗体施用于需要此类治疗的个体。

一方面，本发明提供了用于抑制肿瘤转移的方法，该方法包括将有效量的抗Bv8抗体施用于需要此类治疗的个体。

一方面，本发明提供了用于抑制内皮细胞增殖的方法，该方法包括将有效量的抗Bv8抗体施用于需要此类治疗的个体。

一方面，本发明提供了用于增强另一种抗血管发生剂的功效的方法，该方法包括将有效量的抗Bv8抗体施用于需要此类治疗的个体。在一些实施方案中，个体具有肿瘤、癌症、和/或细胞增殖性病症。在一些实施方案中，另一种抗血管发生剂靶向VEGF，例如抗VEGF抗体。

要理解，治疗方法中可以使用任何合适抗Bv8抗体，包括单克隆和/或多克隆抗体、人抗体、嵌合抗体、亲和力成熟的抗体、人源化抗体、和/或抗体片段。在一些实施方案中，使用本文中描述的任何抗Bv8抗体进行治疗。

在本文中的任何方法中，可以与本文中的抗Bv8抗体一起对受试者或患者施用有效量的选定药物（其中本文中的抗Bv8抗体是第一药物），该选定药物是另一种能治疗需要治疗的受试者中的状况的活性剂。例如，本发明的抗体可以与另一种抗体、化疗剂（包括化疗剂鸡尾酒）、抗血管发生剂、免疫抑制剂、细胞因子、细胞因子拮抗剂、和/或生长抑制剂共施用。此类第二药物的类型取决于多个因素，包括病症的类型、疾病的严重程度、患者的状况和年龄、采用的第一药物的类型和剂量、等。

例如，在本发明的抗体抑制肿瘤生长的情况中，可能特别希望将它与一种或多种也抑制肿瘤生长的其它治疗剂组合。例如，可以在治疗方案中，例如在治疗本文所述任何疾病（包括结肠直肠癌、肺癌、肝细胞癌、乳腺癌和/或胰腺癌）时组合本发明的抗体与抗血管发生剂，诸如抗VEGF抗体（例如

）和/或抗ErbB抗体（例如

trastuzumab抗HER2抗体或EGFR抑制剂（例如erlotinib

）或结合HER2结构域II的抗HER2抗体，诸如OMNITARG^TM pertuzumab抗HER2抗体）。或者/另外，患者可以接受联合放疗（例如外线束辐照或使用放射性标记药剂诸如抗体的疗法）。上文所述此类联合疗法包括联合施用（其中在同一配制剂或分开的配制剂中包括两种或更多种药剂）和分开施用（在该情况中，本发明抗体的施用可发生于辅助疗法的施用之前和/或之后）。另外，与组合本发明的抗体与对细胞产生高度毒性的其它药剂中的化疗剂相比，组合该抗体与相对无细胞毒性的药剂诸如另一种生物学分子例如另一种抗体预期降低细胞毒性。

本文中抗体与一种或多种第二药物的组合治疗优选导致癌症体征或症状的改善。例如，相对于只用第二药物（例如化疗剂）治疗的患者，此类疗法可导致存活（总体存活和/或无进展存活）改善，和/或可导致客观响应（部分的或完全的）。此外，本文中抗体和一种或多种第二药物的组合治疗优选对患者产生叠加的，更优选协同的（或大于叠加的）治疗好处。在某些实施方案中，第二药物的至少一次施用和本文中抗体的至少一次施用之间的时间为约1个月或更短。在某些实施方案中，第二药物的至少一次施用和本文中抗体的至少一次施用之间的时间为约2周或更短。在某些实施方案中，本文中抗体和第二药物并行施用。

对于癌症的治疗，第二药物优选为另一种抗体、化疗剂（包括化疗剂鸡尾酒）、抗血管发生剂、免疫抑制剂、前药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放疗剂、皮质类固醇、止吐剂、癌症疫苗、止痛剂、抗血管剂、和/或生长抑制剂。细胞毒剂包括与DNA相互作用的药剂、抗代谢物、拓扑异构酶I或II抑制剂、或纺锤体抑制剂或稳定剂（例如优选长春花生物碱，更优选选自长春碱、脱氧长春碱、长春新碱、长春地辛、长春瑞滨、长春匹定、长春磷汀、长春利定和长春氟宁），或化疗中使用的任何药剂，诸如5-FU、紫杉烷、多柔比星、或地塞米松。

在一些实施方案中，第二药物是另一种用于治疗癌症的抗体，诸如那些针对HER2/neu受体的胞外域的（例如曲妥单抗），或其功能性片段之一，泛HER抑制剂，Src抑制剂，MEK抑制剂，或EGFR抑制剂（例如抗EGFR抗体（诸如抑制EGFR的酪氨酸激酶活性的）诸如西妥昔单抗(cetuximab)

二苯胺基酞酰亚胺，吡唑并或吡咯并吡啶并嘧啶，quinaziline，gefitinib，erlotinib，cetuximab，ABX-EFG，canertinib，EKB-569和PKI-166），或双重EGFR/HER-2抑制剂诸如lapatanib。别的第二药物包括alemtuzumab（CAMPATH^TM），FavID（IDKLH），糖基化改变的CD20抗体，诸如GA-101/GLYCART^TM，oblimersen（GENASENSE^TM），沙利度胺及其类似物，诸如lenalidomide（REVLIMID^TM），imatinib，sorafenib，ofatumumab（HUMAX-CD20^TM），抗CD40抗体，例如SGN-40，和抗CD-80抗体，例如galiximab。

止吐剂优选为盐酸昂丹司琼、盐酸格拉司琼、甲氧氯普胺(metroclopramide)、多潘立酮、氟哌啶醇、赛克力嗪、劳拉西泮、丙氯拉嗪、地塞米松、左美丙嗪、或托烷司琼。疫苗优选为基于GM-CSF DNA和细胞的疫苗、树突细胞疫苗、重组病毒疫苗、热休克蛋白（HSP）疫苗、同基因或自体肿瘤疫苗。止痛剂优选为布洛芬、萘普生、三水杨酸胆碱镁、或盐酸羟考酮。抗血管剂优选为贝伐单抗或rhuMAb-VEGF。别的第二药物包括抗增殖剂，诸如法呢基蛋白转移酶抑制剂、抗VEGF抑制剂、p53抑制剂、或PDGFR抑制剂。本文中的第二药物还包括生物学靶向疗法诸如抗体治疗以及小分子靶向疗法例如针对某些受体的。

本领域已经鉴定和知道许多抗血管发生剂，包括本文所列的那些，例如定义中所列的，还可参见例如Carmeliet和Jain,Nature 407:249-257(2000);Ferrara等,Nature Reviews:Drug Discovery,3:391-400(2004);Sato Int.J.Clin.Oncol.,8:200-206(2003)。还可参见美国专利申请US20030055006。在一个实施方案中，抗Bv8抗体与抗VEGF中和性抗体（或片段）和/或另一VEGF拮抗剂或VEGF受体拮抗剂（包括但不限于例如可溶性VEGF受体（例如VEGFR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、神经毡蛋白（例如NRP1、NRP2））片段）、能够阻断VEGF或VEGFR的适体、中和性抗VEGFR抗体、VEGFR酪氨酸激酶(RTK)的低分子量抑制剂、VEGF的反义策略、针对VEGF或VEGF受体的核酶、VEGF的拮抗性变体、及其任意组合联合使用。或者/另外，任选的是，可以在VEGF拮抗剂和其它药剂外对患者共施用两种或更多血管发生抑制剂。在某些实施方案中，可以与抗Bv8抗体、VEGF拮抗剂和抗血管发生剂联合施用一种或多种别的治疗剂，例如抗癌剂。

上文（例如“化疗剂”的定义中）描述了在本文中有用的化疗剂。

此类第二药剂可以在施用本文中抗体后48小时内，或者在所述药剂后24小时内、或12小时内、或3-12小时内施用，或者可以在预先选择的一段时间里施用，其优选是约1-2天。另外，此类药剂的剂量可以是亚治疗性的。

本文中的抗体可以与第二药剂同时、序贯、或交替施用，或者在无响应性时与其它疗法同时、序贯、或交替施用。如此，第二药剂的联合施用包括使用分开的配制剂或单一的药物配制剂的共施用（同时施用），及任一次序的序贯施用，其中优选有一段时间所有（两种或更多种）药剂同时发挥其生物学活性。所有这些第二药剂可以彼此组合或者单独与第一药剂一起使用，因此表述“第二药剂”在用于本文时不意味着它是第一药剂以外的唯一药剂。如此，第二药剂不必是一种药剂，而是可以包含超过一种此类药剂或由其组成。

本文所列的这些第二药剂通常以与第一药剂相同的剂量和施用途径或者第一药剂的剂量的大约1-99%使用。如果确实使用此类第二药剂，那么优选它们以低于不存在第一药剂时的量使用，尤其是在第一药剂的初始给药之后的后续给药中，以便消除或降低由此引起的副作用。

本发明还提供了用于抑制或预防顽固性肿瘤、复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法和组合物。在某些实施方案中，复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长用于描述正在接受一种或多种当前可用疗法（例如癌症疗法，诸如化疗、放疗、手术、激素疗法和/或生物学疗法/免疫疗法、抗VEGF抗体疗法，特别是特定癌症的标准治疗方案）或用一种或多种当前可用疗法治疗过的患者在临床上不足以治疗患者或患者不再由该疗法取得任何有益效果使得这些患者需要别的有效疗法的状况。在某些实施方案中，癌症是复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长，其中癌细胞数目没有显著的减少，或者增多了，或者肿瘤尺寸没有显著的缩小，或者增大了，或者癌细胞的尺寸或数目未能有任何进一步的缩小或减少。在某些实施方案中，具有复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的患者产生了对一种或多种当前可用疗法的抗性。在某些实施方案中，术语顽固性/不应性用于描述正在接受一种或多种当前可用疗法（例如癌症疗法，诸如化疗、放疗、手术、激素疗法和/或生物学疗法/免疫疗法、抗VEGF抗体疗法，特别是特定癌症的标准治疗方案）或用一种或多种当前可用疗法治疗过的患者在临床上不足以治疗患者的状况。在某些实施方案中，无响应/顽固性患者是对疗法有响应但遭受副作用、对疗法不响应、或对疗法的响应不令人满意等的患者。在某些实施方案中，癌症是无响应性/顽固性肿瘤，其中肿瘤对先前的治疗内在地有不响应性或抗性。在某些实施方案中，顽固性/不应性指疾病或状况对包含VEGF拮抗剂的疗法的内在不响应性。确定癌细胞是否是顽固性的、复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长可以在体内或在体外进行，通过本领域知道的用于测定治疗对癌细胞有效性的任何方法，在这样的语境中使用本领域公认的“复发性”或“顽固性”或“无响应”的含义。

本发明提供了在受试者中阻断或降低复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长的方法，其通过施用有效量的抗Bv8抗体以阻断或降低受试者中的复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长来实现。本发明提供了治疗对包含VEGF拮抗剂的疗法不应的患者的方法，其通过对患者施用有效量的抗Bv8抗体进行。在某些实施方案中，可以在其它癌症治疗剂之后施用抗Bv8抗体。在某些实施方案中，与癌症疗法同时施用抗Bv8抗体。或者/另外，抗Bv8抗体疗法与另一癌症疗法交替施行，这可以以任意次序进行。本发明还涵盖施用一种或多种抑制性抗体来预防癌症在有癌症素因的患者中发作或复发的方法。一般地，受试者当前正在接受癌症疗法。在一个实施方案中，癌症疗法是使用抗血管发生剂例如VEGF拮抗剂的治疗。抗血管发生剂包括本领域知道的那些和本文定义中所列的那些。在一个实施方案中，抗血管发生剂是抗VEGF中和性抗体或片段（例如人源化A4.6.1、

(Genentech,South SanFrancisco,CA)、Y0317、M4、G6、B20、2C3等）。参见例如美国专利6,582,959,6,884,879,6,703,020;WO98/45332;WO 96/30046;WO94/10202;EP0666868B1;美国专利申请20030206899,20030190317,20030203409,20050112126;Popkov等,Journal of Immunological Methods 288:149-164(2004);及WO2005012359。别的药剂可以与VEGF拮抗剂和抗Bv8抗体联合施用以治疗顽固性肿瘤、阻断或降低复发性肿瘤生长或复发性癌细胞生长。

本发明的抗Bv8抗体(以及附加的治疗剂)通过任何适合的方式给药，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内和鼻内给药，以及视局部治疗需要，损伤区给药。肠胃外输注包括肌内、静脉内、动脉内、腹膜内或皮下给药。此外，抗Bv8抗体适于通过脉冲式输注给药，特别是使用递减剂量的抗体。部分取决于给药是否是短期或长期的，可以是任何适合的途径如通过注射，例如静脉或皮下注射。

在制备及给予抗体中要考虑本发明的抗体的结合靶的位置。当结合靶为细胞内分子时，对于要被导入其中结合靶所处的细胞中的抗体或其抗原结合片段提供了本发明的某些实施方案。在一个实施方案中，本发明的抗Bv8抗体可以作为胞内抗体在细胞内表达。如本文中所使用的，术语“胞内抗体”指如例如Marasco,Gene Therapy 4:11-15(1997);Kontermann,Methods 34:163-170(2004);美国专利号6,004,940和6,329,173;美国专利申请公开号2003/0104402和PCT公开号WO2003/077945中所述的，一种在细胞内表达并且能与靶分子选择性结合的抗体或其抗原结合部分。还可参见例如1996年3月14日公布的WO96/07321，其关于使用基因疗法来产生胞内抗体。

胞内抗体的细胞内表达可以受将编码期望抗体或其抗原结合部分的核酸(缺少野生型前导序列和通常与编码抗体或抗原结合片段的基因相关的分泌信号)导入靶细胞中的影响。可将一种或多种编码本发明抗体的全部或部分的核酸递送给靶细胞，使得一种或多种胞内抗体(intrabody)得以表达，从而能与细胞内靶多肽结合并调节靶多肽的活性。可使用任何将核酸导入细胞中的标准方法，包括但不限于显微注射，弹道式注射(ballistic injection)，电穿孔，磷酸钙沉淀，脂质体以及使用携带有目的核酸的逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒和痘苗病毒载体进行转染。

在某些实施方案中，可以通过体内和回体(ex vivo)方法使核酸（任选包含在载体中）进入患者的细胞。在体内递送的一个例子中，例如在需要治疗性干预的部位将核酸直接注射到患者体内。在体内递送的又一个例子中，使用病毒载体（诸如腺病毒、I型单纯疱疹病毒、或腺伴随病毒）和基于脂质的系统（对于脂质介导的基因转移有用的脂质有例如DOTMA、DOPE和DC-Chol）的转染使核酸进入细胞。关于某些基因标记和基因疗法方案的综述参见Anderson et al.,Science 256:808-813(1992)和WO 93/25673及其中引用的参考文献。在回体治疗的一个例子中，自患者取出细胞，将核酸导入那些分离的细胞，并将经过修饰的细胞或是直接施用于患者，或是例如装入多孔膜内并植入患者体内（参见例如美国专利No.4,892,538和5,283,187）。常用于回体递送核酸的载体是逆转录病毒载体。

在另一个实施方案中，提供了内在化的抗体。抗体可具有某些增强将抗体递送入细胞中的特性，或可被修饰以具有上述特性。用于实现其的技术是本领域已知的。例如，已知抗体的阳离子化能促进其被细胞摄取(参见如美国专利号6,703,019)。脂质转染或脂质体也可用于将抗体递送入细胞中。在使用抗体片段的情况下，与靶蛋白特异性结合的最小抑制性片段可能是有利的。例如，基于抗体的可变区序列，可设计保留与靶蛋白序列结合能力的肽分子。上述肽可化学合成和/或通过重组DNA技术产生。参见如Marasco等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:7889-7893(1993)。

可通过本领域已知的其它方法增加抗体进入靶细胞。例如，某些序列如来源于HIV Tat或触角足(Antennapedia)同源结构域蛋白的那些序列能指导异源蛋白穿过细胞膜从而有效地摄入。参见如Chen等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1999),96:4325-4329。

当抗体结合的靶位于脑中时，某些本发明的实施方案提供了穿过血脑屏障的抗体。存在着一些用于转运分子穿过血脑屏障的本领域已知的方法，包括但不限于物理方法、基于脂质的方法、基于干细胞的方法、以及基于受体和通道的方法。

将抗体转运穿过血脑屏障的物理方法包括但不限于完全绕过血脑屏障或通过在血脑屏障中产生开口。绕过方法包括但不限于直接注射入脑中(参见如Papanastassiou等,Gene Therapy 9:398-406(2002))、间质输注/对流增强的递送(convection-enhanced delivery)(参见如Bobo等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 91:2076-2080(1994))和在脑中插入递送装置(参见如Gill等,NatureMed.9:589-595(2003)；和Gliadel Wafers^TM,Guildford Pharmaceutical)。在屏障中产生开口的方法包括但不限于超声波(参见如美国专利公开号2002/0038086)、渗透压(如通过给予高渗的甘露醇(Neuwelt,E.A.,Implicationof the Blood-Brain Barrier and its Manipulation,Vols 1 & 2,Plenum Press,N.Y.(1989)))、通过如缓激肽或透化剂A-7透化(参见如美国专利号5,112,596,5,268,164,5,506,206和5,686,416)和用含有编码抗体的基因的载体转染跨越血脑屏障的神经细胞(参见如美国专利公开号2003/0083299)。

基于脂质的将抗体转运穿过血脑屏障的方法包括但不限于将抗体包囊入连接有与血脑屏障的血管内皮上受体结合的抗体结合片段的脂质体中(参见如美国专利申请公开号20020025313)，以及将抗体包被在低密度脂蛋白颗粒(参见如美国专利申请公开号20040204354)或载脂蛋白E(参见如美国专利申请公开号20040131692)中。

运输抗体穿越血脑屏障的基于干细胞的方法需要遗传工程改造神经前体细胞(NPC)以表达感兴趣的抗体，然后将干细胞植入待治疗个体的脑中。参见Behrstock et al.(2005)Gene Ther.2005年12月15日提前在先公开（报告了经遗传工程改造而表达神经营养因子GDNF的NPC在植入啮齿类和灵长类模型的脑后降低了帕金森病的症状）。

基于受体和通道的将抗体转运穿过血脑屏障的方法包括但不限于使用糖皮质激素阻断剂来增加血脑屏障的透过性(参见如美国专利申请公开号2002/0065259,2003/0162695和2005/0124533)；激活钾通道(参见如美国专利申请公开号2005/0089473)，抑制ABC药物运载体(参见如美国专利申请公开号2003/0073713)；用转铁蛋白包被抗体并调节一种或多种转铁蛋白受体的活性(参见如美国专利申请公开号2003/0129186)，以及阳离子化抗体(参见如美国专利号5,004,697)。

本发明的抗Bv8抗体应当以一种符合良好的医学实践的方式配制、确定剂量及给药。关于这一点考虑的因素包括在治疗的特定病症、在治疗的特定哺乳动物、患者个体的临床状态、病因、药物递送部位、给药方法、服药日程以及其它为开业医生所知的因素。抗Bv8抗体无需但可任选地与一种或多种目前用于预防或治疗所述病症的药物一起配制。上述其它药物的有效量取决于配方中所存在的抗体的量、所治疗病症的类型、以及其它上述讨论的因素。这些药物通常以相同的剂量使用并具有本文中所描述的给药途径，或以约1-99%的本文所描述的剂量使用，或以任何剂量并通过任何途径使用，所述剂量和途径是凭经验确定的/经临床测定合适的。

为了预防或治疗疾病，本发明的抗体(当单独或与一种或多种其它别的治疗剂联合使用时)的合适剂量应取决于所要治疗的疾病的类型、抗体的种类、疾病的严重性和病程、所给予抗体的预防或治疗目的、之前的治疗、患者的临床史和对抗体的应答、以及主治医师的斟酌决定。抗体适合于在一次或一系列的治疗中给予患者。取决于疾病的类型和严重性，约1μg/kg-15mg/kg(例如0.1mg/kg-10mg/kg)的抗体可作为首次候选用量给予患者，无论是例如通过一次或多次单独的给药或通过连续输注。取决予上述提及的因素，一个典型的日剂量可在约1μg/kg-100mg/kg或更多的范围内。对于几天或更长时间的重复给药，取决于病情，治疗应通常持续直至出现病症得到期望的抑制为止。抗体的一个例证性的剂量应为约0.05mg/kg-约50mg/kg。因此，可将一个或多个约0.5mg/kg、2.0mg/kg、4.0mg/kg、10mg/kg、15mg/kg、20mg/kg或25mg/kg(或它们的任何组合)的剂量给予患者。上述剂量可间歇给予，如每周或每三周给予一次(如使得患者得到约2-约20个，或例如约6个剂量的抗体)。可给予初始较高的负荷剂量，接着给予一个或多个较低的剂量。一个例证性的给药方案包括给予约4mg/kg的初始负荷剂量，继之以约2mg/kg抗体的周维持剂量。然而，可使用其它给药方案。通过常规技术和测定方法易于监测该治疗的进展。

诊断方法和检测方法

本发明的抗Bv8抗体可用于检测特定细胞或组织中的Bv8表达的测定法（诸如诊断或预后测定法），其中所述抗体如下所述进行标记和/或固定化在不溶性基质上。

另一方面，本发明提供了用于检测Bv8的方法，该方法包括检测样品中的Bv8-抗Bv8抗体复合物。术语“检测”在用于本文时包括定性和/或定量检测（测量水平），有或无参照对照。

另一方面，本发明提供了本文所述任何抗Bv8抗体，其中所述抗Bv8抗体包含可检测的标记物。

另一方面，本发明提供了本文所述任何抗Bv8抗体与Bv8的复合物。在一些实施方案中，复合物是体内的或体外的。在一些实施方案中，所述复合物包含癌细胞。在一些实施方案中，所述抗Bv8抗体是可检测标记的。

抗Bv8抗体（例如本文所述任何Bv8抗体）可用于大量公知检测测定法中任一种的Bv8检测。

例如，可以如下对生物学样品测定Bv8，即从期望来源获得样品，将样品与抗Bv8抗体混合以允许抗体与混合物中存在的任何Bv8形成抗体/Bv8复合物，并检测混合物中存在的任何抗体/Bv8复合物。可以通过本领域已知的适于特定样品的方法制备生物学样品供测定法用。根据所使用的测定法的类型来选择混合样品与抗体的方法和检测抗体/Bv8复合物的方法。此类测定法包括免疫组织化学、竞争性和三明治/夹心式测定法、和空间阻抑测定法(stericinhibition assay)。对于样品制备，可以使用来自哺乳动物（典型的是人患者）的组织或细胞样品。样品的例子包括但不限于癌细胞，诸如结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、肺癌、胃癌、胰腺癌、淋巴瘤、和白血病癌细胞。也可以测量血清中的Bv8。可以通过本领域已知的多种规程来获得样品，包括但不限于手术切除、抽吸或活检。组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中，样品是固定和包埋在石蜡或类似物中的。可以通过常规方法来固定（即保存）组织样品(参见例如“Manual of Histological Staining Method of theArmed Forces Institute of Pathology,”3^rd edition(1960)Lee G.Luna,HT(ASCP)Editor,The Blakston Division McGraw-Hill Book Company,New York;TheArmed Forces Institute of Pathology Advanced Laboratory Methods in Histologyand Pathology(1994)Ulreka V.Mikel,Editor,Armed Forces Institute ofPathology,American Registry of Pathology,Washington,D.C.)。本领域普通技术人员将领会，固定剂的选择由样品是用于组织学染色还是其它分析的目的来决定。本领域普通技术人员还将领会，固定时长取决于组织样品的大小和所使用的固定剂。例如，可以使用中性缓冲的福尔马林、Bouin氏液或低聚甲醛来固定样品。一般而言，将样品首先固定，然后通过酒精递增系列脱水，用石蜡或其它切片介质渗透和包埋使得该组织样品可以切片。或者，可以将组织进行切片并将所得切片固定。例如，可以通过常规方法学将组织样品在石蜡中包埋和加工（参见例如“Manual of Histological Staining Method of theArmed Forces Institute of Pathology",见上文）。可以使用的石蜡的例子包括但不限于Paraplast、Broloid、和Tissuemay。一旦将组织样品包埋，就可以用切片机等等将样品切片（参见例如“Manual of Histological Staining Method of theArmed Forces Institute of Pathology”,见上文）。对于此规程，例如，切片的厚度范围可以是约3微米至约5微米。一旦切片，就可以通过数种标准方法将切片附着至载玻片。载玻片粘合剂的例子包括但不限于硅烷、明胶、聚L-赖氨酸等等。例如，可以将石蜡包埋的切片附着于带正电荷的载玻片和/或聚L-赖氨酸包被的载玻片。若使用石蜡作为包埋材料，则一般将组织切片脱石蜡和复水。可以通过数种常规标准方法学将组织切片脱石蜡。例如，可以使用二甲苯和酒精逐渐递减系列（参见例如“Manual of Histological StainingMethod of the Armed Forces Institute of Pathology”,见上文）。或者，可以使用商品化的脱石蜡用非有机试剂，诸如Hemo-De7(CMS,Houston,Texas)。

Bv8的分析方法均使用一种或多种以下试剂：经过标记的Bv8类似物、固定化的Bv8类似物、经过标记的抗Bv8抗体、固定化的抗Bv8抗体和空间偶联物。经过标记的试剂还称为“示踪剂”。

使用的标记物是不干扰Bv8与抗Bv8抗体结合的任何可检测官能团。许多标记物已知用于免疫测定法，例子包括可以直接检测的模块，诸如荧光染料、化学发光和放射性标记物，以及必须反应或衍生化才能检测的模块，诸如酶。

使用的标记物是不干扰Bv8与抗Bv8抗体结合的任何可检测官能团。许多标记物已知用于免疫测定法，例子包括可以直接检测的模块，诸如荧光染料、化学发光和放射性标记物，以及必须反应或衍生化才能检测的模块，诸如酶。此类标记物的例子包括放射性同位素³²P、¹⁴C、¹²⁵I、³H和¹³¹I，荧光团诸如稀土螯合物或荧光素及其衍生物，若丹明及其衍生物，丹酰，伞形酮，萤光素酶，例如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶(美国专利No.4,737,456)，萤光素，2,3-二氢酞嗪二酮，辣根过氧化物酶(HRP)，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶，葡糖淀粉酶，溶菌酶，糖类氧化酶例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶、和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶，杂环氧化酶诸如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶，偶联有使用过氧化氢来氧化染料前体的酶诸如HRP，乳过氧化物酶，或微过氧化物酶，生物素/亲合素，自旋标记物，噬菌体标记物，稳定自由基，等等。

已经有将这些标记物共价结合至蛋白质或多肽的常规方法。例如，偶联剂诸如二醛、碳二亚胺、双马来酰亚胺、双亚氨酸酯、双重氮化联苯胺等可用于给抗体标记上上述荧光、化学发光和酶标记物。参见例如美国专利No.3,940,475(荧光测定法)和3,645,090(酶);Hunter等,Nature,144:945(1962);David等,Biochemistry,13:1014-1021(1974);Pain等,J.Immunol.Methods,40:219-230(1981);及Nygren,J.Histochem.and Cytochem.,30:407-412(1982)。本文中优选的标记物是酶，诸如辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。将此类标记物（包括酶）与抗体偶联对于熟悉免疫测定技术的普通技术人员来说是一种标准操作规程。参见例如O'Sullivan等,"Methods for the Preparation ofEnzyme-antibody Conjugates for Use in Enzyme Immunoassay",于Methods inEnzymology,J.J.Langone和H.Van Vunakis编,卷73(Academic Press,NewYork,New York,1981),pp.147-166。

某些测定法需要试剂的固定化。固定化能够将抗Bv8抗体与仍然在溶液中游离的任何Bv8分开。为此，或是通过吸附至不溶于水的基质或表面(Bennich等,US 3,720,760)、通过共价偶联（例如利用戊二醛交联）在测定法规程前使抗Bv8抗体或Bv8类似物不溶解，或是例如通过免疫沉淀，在测定法规程之后使抗Bv8抗体或Bv8类似物不溶解。

可以利用免疫组织化学和染色方案来检查样品中的蛋白质表达。组织切片的免疫组织化学染色已经证明是一种评估或检测样品中蛋白质存在的可靠方法。免疫组织化学（“IHC”）技术利用抗体来探查和显现原位细胞抗原，通常通过显色或者荧光方法。对于样品制备，可以使用来自哺乳动物（典型的是人患者）的组织或细胞样品。可以通过本领域已知的多种规程来获得样品，包括但不限于手术切除、抽吸或活检。组织可以是新鲜的或冷冻的。在一个实施方案中，样品是固定和包埋在石蜡或类似物中的。可以通过常规方法来固定（即保存）组织样品。本领域普通技术人员将领会，固定剂的选择由样品是用于组织学染色还是其它分析的目的来决定。本领域普通技术人员还将领会，固定时长取决于组织样品的大小和所使用的固定剂。

IHC可以与别的技术诸如形态学染色和/或荧光原位杂交一起实施。现有两种常用的IHC方法：直接和间接测定法。根据第一种测定法，直接测定抗体与靶抗原（例如Bv8）的结合。这种直接测定法使用经过标记的试剂，诸如荧光标签或酶标记的第一抗体(primary antibody)，其不需要进一步的抗体相互作用就能显现。在一种典型的间接测定法中，未偶联的第一抗体结合至抗原，然后经过标记的第二抗体(secondary antibody)结合至第一抗体。若第二抗体偶联有酶标记物，则添加显色底物或荧光底物以提供抗原的显现。因为数个第二抗体可以与第一抗体上的不同表位反应，所以发生信号放大。

用于免疫组织化学的第一和/或第二抗体通常用可检测模块进行标记。现有多种标记物。

在上文讨论的样品制备规程外，可能还需要在IHC之前、期间或之后对组织切片进行进一步的处理。例如，可以实施表位修复法，诸如在柠檬酸盐缓冲液中对组织样品进行加热(参见例如Leong等Appl.Immunohistochem.4(3):201(1996))。

在任选的封闭步骤后，将组织切片在合适条件下暴露于第一抗体足够时间，使得第一抗体结合至组织样品中的靶蛋白抗原。实现这一目的的适宜条件可以通过常规实验来确定。抗体与样品的结合程度通过使用上文讨论的任一种可检测标记物来测定。优选地，标记物是酶标记物（例如HRPO），其催化显色底物诸如3,3'-二氨基联苯胺色原体的化学变化。优选的是，将酶标记物偶联至特异性结合第一抗体的抗体（例如第一抗体是家兔多克隆抗体，第二抗体是山羊抗家兔抗体）。

可以将如此制备的标本放置好并盖上盖玻片。然后进行载玻片评估，例如利用显微镜，并且可以采用本领域常规使用的染色强度标准。

称为竞争性或者夹心测定法的其它测定法已经明确建立并广泛用于商业诊断工业。

竞争分析法依赖于显迹物Bv8类似物与待测样品Bv8竞争有限量的抗Bv8抗体抗原结合位点的能力。竞争前后抗Bv8抗体通常是不溶解的，然后将结合抗Bv8抗体的显迹物和Bv8与未结合的显迹物和Bv8分离。通过轻轻倒出（其中结合伴侣是预先不溶解的）或者通过离心（其中结合伴侣在竞争反应后沉淀）实现这种分离。待测样品Bv8的量与结合的显迹物的量成反比，所述结合显迹物的量通过标记物质的量测定。绘制Bv8已知量的剂量应答曲线，与试验结果进行比较以定量确定待测样品中存在的Bv8的量。当使用酶作为可检测标记物时，这些测定法被称为ELISA系统。

称为“均相”测定法的另一种竞争分析法不需要相分离。此处，制备并使用酶与Bv8的偶联物，这样的话当抗Bv8抗体结合Bv8时，抗Bv8抗体的存在改变酶活性。在这种情况下，Bv8或其免疫活性片段与双功能有机桥偶联到酶例如过氧化物酶上。选择偶联物以与抗Bv8抗体一起使用以便抗Bv8抗体的结合抑制或者增强标记物的酶活性。该方法本身被广泛使用，称作EMIT。

空间偶联物用于均相测定法的位阻方法。通过将低分子量半抗原共价连接到小Bv8片段来合成这些偶联物，以便针对半抗原的抗体基本上不能与抗Bv8抗体同时结合偶联物。在此测定步骤下待测样品中存在的Bv8将结合抗Bv8抗体，从而允许抗半抗原结合所述偶联物，导致偶联物的半抗原特性的变化，例如，当半抗原是荧光基团时荧光的变化。

夹心测定法尤其可用于Bv8或抗Bv8抗体的测定。在顺次夹心测定法(sequential sandwich assays)中固定化的抗Bv8抗体用于吸附待测样品Bv8，通过洗涤去除待测样品，结合的Bv8用于吸附经过标记的第二抗Bv8抗体，然后从残余显迹物中分离结合的材料。结合显迹物的量与待测样品Bv8成正比。“平行”夹心测定法中在添加经过标记的抗Bv8前不分离待测样品。使用抗Bv8单克隆抗体作为一种抗体和多克隆抗Bv8抗体作为另一种抗体的顺次夹心测定法可用于检测样品中的Bv8。

上文仅仅是Bv8的示范性检测分析法。现在或者此后发展的使用抗Bv8抗体测定Bv8的其它方法均包括在本发明范围内，包括此处描述的生物测定法。

在一个方面，本发明提供了在来自个体（诸如人受试者）的生物学样品中检测多核苷酸（例如Bv8多核苷酸）（例如存在或缺失或者量）的方法。可采用多种用于检测多核苷酸的方法，包括例如RT-PCR、taqman、扩增法、多核苷酸微阵列、诸如此类。

用于检测多核苷酸（诸如mRNA）的方法是众所周知的，包括例如使用互补DNA探针的杂交测定法（诸如使用经标记Bv8 RNA探针的原位杂交、Northern印迹和相关技术）和各种核酸扩增测定法（诸如使用对Bv8特异性的互补引物的RT-PCR，及其它扩增型检测方法，诸如例如分支DNA、SPIA、Ribo-SPIA、SISBA、TMA等等）。

例如可以使用Northern、点印迹、或PCR分析对来自哺乳动物的生物学样品测定Bv8 mRNA。例如，RT-PCR测定法（诸如定量PCR测定法）是本领域众所周知的。在本发明的一个例示性实施方案中，用于检测生物学样品中的Bv8 mRNA的方法包括使用至少一种引物通过逆转录自样品生成cDNA；使用Bv8多核苷酸作为有义和反义引物扩增如此生成的cDNA以扩增其中的Bv8 cDNA；并检测所扩增Bv8 cDNA的存在或缺失。另外，此类方法可以包括一个或多个如下步骤，其容许测定生物学样品中Bv8 mRNA的量（水平）（例如通过同时检验“持家”基因诸如肌动蛋白家族成员的比较性对照mRNA序列的水平）。任选的是，可以测定所扩增Bv8 cDNA的序列。

探针和/或引物可以用可检测标记物标记，诸如例如放射性同位素、荧光化合物、生物发光化合物、化学发光化合物、金属螯合剂或酶。此类探针和引物可用于检测样品中Bv8多核苷酸的存在，及用作检测表达Bv8蛋白的细胞的手段。正如技术人员将会理解的，例如基于本文中所提供的序列，可以制备很多种不同引物和探针，并有效用于扩增、克隆和/或测定Bv8 mRNA的存在或缺失和/或量。

本发明的任选方法包括如下方案，其包含使用微阵列技术检测组织或细胞样品中的多核苷酸，诸如Bv8多核苷酸。例如，使用核酸微阵列，将来自测试和对照组织样品的测试和对照mRNA样品逆转录和标记以生成cDNA探针。然后将所述探针杂交至在固体支持物上的固定化的核酸阵列。所述该阵列配置成阵列的每个成员的序列和位置是已知的。例如，可以将有可能在某些疾病状态中表达的基因选集在固体支持物上形成阵列。经标记探针与特定阵列成员的杂交指示衍生该探针的样品表达该基因。疾病组织的差异基因表达分析可提供有价值的信息。微阵列技术利用核酸杂交技术和计算技术在单一实验中评估数以千计基因的mRNA表达序型(expression profile)（参见例如2001年10月11日公布的WO 01/75166；参见例如US 5,700,637、美国专利5,445,934、和美国专利5,807,522；Lockart,Nature Biotechnology,14:1675-1680(1996);Cheung,V.G.et al.,Nature Genetics 21(Suppl):15-19(1999)，关于阵列制作的讨论）。DNA微阵列是包含基因片段的微型阵列，所述基因片段或是在玻璃或其它基质上直接合成或是点到玻璃或其它基质上。单一阵列中通常呈现数以千计的基因。一个典型的微阵列实验涉及以下步骤：1.自分离自样品的RNA制备荧光标记的靶物；2.将经标记的靶物杂交至微阵列；3.清洗，染色，和扫描阵列；4.分析扫描图像；并5.生成基因表达序型。当前使用两种主要类型的DNA微阵列：包含自cDNA制备的PCR产物的基因表达阵列和寡核苷酸（通常25-70聚物）阵列。在形成阵列时，寡核苷酸可以是预制并点到表面上的，或者是直接在表面上合成的（原位）。

Affymetrix

系统是包含通过在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制作的阵列的商品化微阵列系统。探针/基因阵列：寡核苷酸（通常25聚物）通过组合基于半导体的光刻和固相化学合成技术直接合成到玻璃晶片上。每个阵列包含多至400,000种不同寡聚物，每种寡聚物以数以百万计拷贝存在。因为寡核苷酸探针是在阵列上已知位置合成的，所以杂交样式和信号强度可以通过Affymetrix Microarray Suite软件解读成基因身份和相对表达水平。每种基因通过一系列不同寡核苷酸探针呈现在阵列上。每个探针对由完全匹配寡核苷酸和错配寡核苷酸组成。完全匹配探针具有与特定基因精确互补的序列，因而测量该基因的表达。错配探针因中央碱基位置的单一碱基替代而不同于完全匹配探针，从而扰乱了靶基因转录物的结合。这有助于对促成对完全匹配寡聚物测得的信号的背景和非特异性杂交的测定。Microarray Suite软件将错配探针的杂交强度从完全匹配探针的杂交强度中扣除，以确定每个探针集的绝对或特异强度。探针的选择基于

和其它核苷酸库的当前信息。认为其序列识别基因3’末端的独特区域。使用

杂交炉（“电转烤炉”）来进行多至64个阵列的同时杂交。射流站实施探针阵列的清洗和染色。它是完全自动化的，包括四个模块，每个模块持有一个探针阵列。每个模块经由Microarray Suite软件使用预编程射流方案独立控制。扫描仪是共聚焦激光荧光扫描仪，其测量由结合至探针阵列的经标记cRNA发射的荧光强度。安装有Microarray Suite软件的计算机工作站控制射流站和扫描仪。Microarray Suite软件可以控制多至八个射流站，使用探针阵列的预编程的杂交、清洗、和染色方案。该软件还获取杂交强度数据并使用适宜的算法将其转变成每种基因的有/无呼叫(presence/absence call)。最后，该软件通过比较分析来检测各实验间基因表达的变化，并将输出格式化为.txt文件，其可以与其它软件程序一起用于进一步的数据分析。

在一些实施方案中，治疗选自下组的癌症：结肠直肠癌，肺癌，卵巢癌，垂体癌，胰腺癌，乳房纤维腺瘤，前列腺癌，头和颈鳞状细胞癌，软组织肉瘤，乳腺癌，成神经细胞瘤，黑素瘤，乳腺癌瘤，胃癌，结肠直肠癌(CRC)，上皮癌，脑癌，子宫内膜癌，睾丸癌，胆管癌，胆囊癌，和肝细胞癌瘤。

本文中（例如生物样品的定义中）描述了生物样品。

制品

在本发明的另一个方面，提供了包含可用于治疗、预防和/或诊断上文所述病症的物质的制品。制品包括容器和贴在所述容器上或与其相联的标签或包装插页。合适的容器包括例如瓶子、小管、注射器等。容器可用各种材料制成，诸如玻璃或塑料。容器中装有其自身或在联合其它组合物时有效治疗、预防和/或诊断疾患的组合物，而且可具有无菌存取口（例如容器可以是具有皮下注射针可刺穿的塞子的静脉内溶液袋或小管）。组合物中的至少一种活性剂是本发明的抗体。标签或包装插页指示该组合物用于治疗选择的疾患，诸如癌症。此外，制品可包括(a)其中装有组合物的第一容器，其中所述组合物包含本发明的抗体；和(b)其中装有组合物的第二容器。本发明此实施方案中的制品还可包括指示第一和第二抗体组合物可用于治疗特定疾患例如癌症的包装插页。或者/另外，制品还可包括第二（或第三）容器，其中装有药学可接受的缓冲剂，诸如注射用抑菌水(BWFI)、磷酸盐缓冲盐水、林格氏(Ringer)溶液和右旋糖溶液。它还可包括商业和用户立场上所需的其它物质，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。

下面是本发明方法和组合物的实施例。应当理解，根据上文提供的一般描述，可实施各种其它实施方案。

实施例

实施例中提到的商品化试剂依照制造商的指令使用，除非另有说明。

实施例1：抗Bv8抗体的生成

此实施例演示针对Bv8的鼠抗Bv8抗体的人源化。残基编号依照Kabat(Kabat et al.,Sequences of proteins of immunological interest,5th Ed.,PublicHealth Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。使用单字母氨基酸缩写。

生成杂交瘤衍生的抗Bv8抗体

通过用重组人Bv8胞外域多肽(PeproTech,Rock Hill,NJ)免疫小鼠或仓鼠生成了抗Bv8抗体。选择了自小鼠杂交瘤生成的，包含图2A、2B、3A、3B、4A和4B所示轻链可变域(VL)和重链可变域(VH)序列的克隆2G9、2B9、3F1。还选择了自仓鼠杂交瘤衍生的，包含图5A和5B所示VH和VL序列的克隆2D3。

克隆杂交瘤衍生的抗Bv8抗体和生成嵌合抗体

使用RNeasy迷你试剂盒(Catalog 74104;QIAGEN;Valencia,CA)自分别生成小鼠抗Bv8单克隆抗体2B9、3F1、和2G9以及仓鼠抗Bv8单克隆抗体2D3的杂交瘤细胞提取总RNA。用下述简并引物使用RT-PCR扩增轻链可变域（VL）和重链可变域（VH）：

2B9轻链(LC)正向：

5’GTCAGATATCGTKCTSACMCARTCTCCAGCAATMA 3’(SEQ IDNO:225)

2B9重链(HC)正向：

5’GATCGACGTACGCTCAGGTGACKCTGAARGAGTCWGG 3’(SEQID NO:226)

3F1轻链(LC)正向：

5’GTACGATATCGTKCTSACCCARTCTCC 3’(SEQ ID NO:227)

3F1重链(HC)正向：

5’GATCGACGTACGCTCAGGTGACKCTGAARGAGTCWGG 3’(SEQID NO:228)

2G9轻链(LC)正向：

5’GTACGATATCGTKCTSACCCARTCTCC 3’(SEQ ID NO:229)

2G9重链(HC)正向：

5’GATCGACGTACGCTGAGGTYCAGCTSCAGCAGTCTGG 3’(SEQID NO:230)

2D3轻链(LC)正向：

5’GATCGATATCCARATGACNCARACNCC 3’(SEQ ID NO:231)

2D3重链(HC)正向：

5’GATCGA CGTACGCTGARGTGCARYTGGTGGARTCTGG 3’(SEQID NO:232)

轻链反向：5’GCTGTAGGTGCTGTCTTTGCT3’(SEQ ID NO:233)

重链反向：5’CTGGWCAGGGMTCCAGAGTTCCA 3’(SEQ ID NO:234)

所示引物序列依照下述IUB代码：

IUB代码

G鸟嘌呤

A腺嘌呤

T胸腺嘧啶

C胞嘧啶

R(A或G)

Y(C或T)

M(A或C)

K(G或T)

S(C或G)

W(A或T)

H(A或C或T)

B(C或G或T)

V(A或C或G)

D(A或G或T)

N(A或C或G或T)

正向引物是对VL和VH区的N端氨基酸序列特异性的。分别地，轻链(LC)和重链(HC)反向引物设计成与轻链恒定域（CL）和重链恒定域1（CH1）中在物种间高度保守的区域退火。

随后将扩增的PCR产物与TA克隆载体(Invitrogen,Carlsbad,CA)连接并测序。然后将经过鉴定的VL DNA序列亚克隆入含有人卡帕恒定域的pRK哺乳动物细胞表达载体(Carter et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89,4285-4289(1992))。将VH DNA序列插编码全长人γ1恒定域的入pRK载体。

使用Fugene转染试剂(Roche,Mannheim,Germany)将LC和HC表达载体共转染入经腺病毒转化的人胚肾细胞系293。在无血清培养基中生成抗体并通过蛋白A层析来纯化抗体。

高变区直接嫁接到受体人共有框架上

用于此工作的噬菌粒是单价Fab-g3展示载体，而且由在单个phoA启动子控制下的2个可读框组成。第一个可读框由与受体轻链的VL和CH1域融合的stII信号序列组成，而第二个由与受体重链的VH和CH1域（接着是次要噬菌体外壳蛋白P3）融合的stII信号序列组成。

在生成抗Bv8抗体的CDR嫁接物变体之前，将小鼠抗体的轻链可变域(VL)和重链可变域(VH)与人共有序列进行序列比对。

对于克隆2B9和3F1，人共有轻链卡帕1(huKI)和人共有重链亚组III(huGIII)是最接近的人框架，并且分别将小鼠2B9(m2B9)和小鼠3F1(m3F1)轻链和重链序列的高变区嫁接入huKI和huGIII共有受体框架以生成直接CDR嫁接物变体，称作h2B9.v1（图6A和6B）和h3F1.v1（图4A和4B）。

有趣的是，对于克隆2G9，与小鼠2G9最接近的人框架是人共有轻链卡帕IV(huKIV)和人共有重链亚组I(huGI)。因此，首先分别将小鼠2G9(m2G9)轻链和重链的高变区嫁接入huKI和huGIII以及huKIV和huGI共有受体框架以生成四种不同CDR嫁接物变体，标示为h2G9.K1G1、h2G9.K1G3、h2G9.K4G1和h2G9.K4G3（图14和15）。人VL卡帕亚组IV共有框架序列减去Kabat轻链HVR序列显示于SEQ ID NO:240。人VH亚组I共有框架序列减去重链HVR序列显示于SEQ ID NO:241。见图1G。在VL域中，将下述区嫁接至人共有受体：L1中的位置24-34，L2中的位置50-56及L3中的位置89-97。在VH域中，嫁接H1中的位置26-35、H2中的位置49-65、71和73及H3中的位置95-102。

使用针对每个高变区的分开的寡核苷酸通过Kunkel诱变生成了直接CDR嫁接物变体（h2B9.v1、h3F1.v1、h2G9.K1G1、h2G9.K1G3、h2G9.K4G1、h2G9.K4G3），作为在噬菌体展示的Fab和作为IgG二者。通过DNA测序鉴定了正确的克隆。

选择和改进(polishing)人源化2G9.K4G1

如本文中所述使用BIAcore^TM-3000仪器通过Biacore测量了四种CDR嫁接物抗Bv8抗体变体h2G9.K1G1、h2G9.K1G3、h2G9.K4G1和h2G9.K4G3的结合亲和力。另外，如本文中所述实施了肾上腺皮层内皮细胞(ACE)增殖测定法以调查四种变体的Bv8中和活性。

BIAcore分析的结果显示了变体h2G9.K1G1和h2G9.K1G3在高浓度分析具有与h2G9.K4G1和h2G9.K4G3相比显著较快的解离速率。另外，ACE增殖测定法显示了在四种变体中，变体h2G9.K4G1具有最好的活性，因为它几乎完全阻断Bv8对ACE细胞的结合。然而，BIAcore分析和ACE增殖测定法指示h2G9.K4G1抗Bv8抗体的结合亲和力和中和活性仍然低于嵌合2G9抗Bv8抗体的。因此，选择抗Bv8抗体h2G9.K4G1进行亲和力成熟以进一步改进其结合亲和力。

在启动抗Bv8抗体h2G9.K4G1的亲和力成熟之前，对HVR序列分析潜在的稳定性问题，其涉及异构化、不配对的半胱氨酸和制造工艺期间的脱酰胺。在下述位点鉴定出潜在的问题：(i)轻链可变序列位置28和29附近的残基；(ii)重链可变序列位置52a；(iii)重链可变序列位置54；和(iv)重链可变序列位置95和96附近的残基。

生成了抗Bv8抗体h2G9.K4G1在上文所述残基位置具有单一氨基酸替代的变体，并将每种变体在噬菌体上展示为Fab。生成了总共12种具有下述单一氨基酸修饰的变体，并通过噬菌体竞争ELISA评估了它们的结合亲和力：CDR-L1-D28E，D28S，G29A，G29S；CDR-H2-C52aA，C52aS，N54A，N54S；CDR-H3-D95E，D95S，G96A，G96S。与h2G9.K4G1相比，12种变体的结合亲和力显示于图14A和14B。所述图显示了大多数变体保持相似的或略微改进的结合亲和力。令人惊讶地，具有CDR-H3中D95S替代的变体在1μM人Bv8完全丧失结合。另外，具有CDR-H3中D95E替代的变体显示与h2G9.K4G1相比100倍的显著结合亲和力下降。

通过组合所有下述四项氨基酸替代生成了标示为h2G9.K4G1.Polish的克隆：CDR-L1-D28S；CDR-H2-C52aS，N54S；CDR-H3-G96S。BIAcore分析显示嵌合2G9 Fab和h2G9.K4G1.Polish Fab具有相似的结合亲和力，而且嵌合2G9 IgG和h2G9.K4G1.Polish IgG二者显示完全阻断Bv8诱导的ACE细胞增殖（图21）。另外，CDR-L1-D28S；CDR-H2-C52aS，N54S；CDR-H3-G96S（抗Bv8抗体h2G9.K4G1.Polish）处的氨基酸替代出乎意料地恢复结合亲和力至接近于嵌合2G9抗Bv8抗体的结合亲和力。

高变区的软随机化

使用维持趋向鼠高变区序列的偏好性的软随机化策略将序列多样性引入每个高变区以进一步改进克隆h2G9.K4G1.Polish的亲和力。这使用最初由Gallop et al.,J.Med.Chem.37:1233-1251(1994)记载的污染寡核苷酸合成策略(poisoned oligonucleotide synthesis strategy)来实现。对于要突变的高变区内的给定位置，用70-10-10-10核苷酸混合物污染编码野生型氨基酸的密码子，导致每个位置平均50%的突变率。软随机化寡核苷酸模仿(pattern after)鼠高变区序列，并且涵盖由直接高变区嫁接物限定的相同区域。

生成噬菌体文库

将为每个高变区设计的随机化寡核苷酸集合分开在六个含有660ng寡核苷酸、50mM Tris pH 7.5、10mM MgCl₂、1mM ATP、20mM DTT、和5U多核苷酸激酶的20μl反应中于37°C磷酸化1小时。然后将六个磷酸化的寡核苷酸集合与50mM Tris pH 7.5、10mM MgCl₂中的20μg Kunkel模板组合，终体积500μl，得到寡核苷酸:模板比3。将混合物退火，90°C 4分钟，50°C 5分钟，然后在冰上冷却。用QIAquick PCR纯化试剂盒(Catalog 28106,QIAGENInc.,Valencia,CA)使用为防止退火的DNA过度变性而改良的方案除去过量的未退火的寡核苷酸。对500μl退火混合物添加150μl PB，并在2个硅土柱中间拆分混合物。用750μl PE清洗每个柱并额外旋转以干燥柱之后，用110μl10mM Tris、1mM EDTA pH 8洗脱每个柱。然后通过于室温添加1μl 100mMATP、10μl 25mM dNTP（dATP、dCTP、dGTP和dTTP各25mM）、15μl 100mMDTT、25μl 10X TM缓冲液（0.5M Tris pH 7.5、0.1M MgCl₂）、2400U T4连接酶、和30U T7聚合酶3小时来补平退火且清洁的模板(220μl)。

在Tris-乙酸盐-EDTA/琼脂糖凝胶上分析补平产物(Sidhu et al.,Methodsin Enzymology 328:333-363(2000))。通常可见三条带：底部的条带是正确补平和连接的产物，中间的条带是补平但未连接的，而顶部的条带是移位的(displaced)条带。顶部的条带是由T7聚合酶的内在副活性生成的，而且难以避免(Lechner et al.,J.Biol.Chem.258:11174-11184(1983))；然而，此条带转化效率比顶部的条带低30倍，而且通常对文库的贡献较小。中间的条带是由于最终连接反应所需5'磷酸根的缺失；此条带转化效率高，而且不幸的是，主要给出野生型序列。

然后将补平产物清洁，电穿孔入SS320细胞，并在M13/KO7辅助噬菌体存在下繁殖，如Sidhu et al.,Methods in Enzymology 328:333-363(2000)所述。库容量的范围为1–2x10⁹个独立克隆。对来自初始文库的随机克隆测序以评估库质量。

噬菌体选择

人Bv8(PeproTech)作为靶物用于噬菌体选择。在MaxiSorp微量滴定板(Nunc)上包被含10μg/ml人Bv8的PBS，供第1轮淘选用。对于第一轮选择，使用8个孔的靶物；对于后续轮次的选择，使用一个孔的靶物。将孔使用SuperBlocker(Pierce)封闭1小时。自培养物上清液收获噬菌体，并在含有1% BSA和0.05% Tween 20的PBS(PBST)中重悬浮。对孔结合2小时后，通过用含有0.05% Tween 20的PBS(PBT)彻底清洗来除去未结合的噬菌体。通过将孔与50mM HCl、0.5M KCl一起温育30分钟来洗脱结合的噬菌体。噬菌体使用XL1 blue细胞(Strategene)和M13/KO7辅助噬菌体(New England BioLabs)来繁殖和扩增，并在37°C在2YT、50μg/ml羧苄西林中培养过夜，供下一轮淘选用。将自靶物包被的孔洗脱的噬菌体的滴度与自非靶物包被的孔回收的噬菌体的滴度比较以评估富集情况。

从第2轮分选开始，使用溶液分选方法来分选噬菌体文库(Lee,C.V.,et al.(2004)J.Mol.Biol 340(5):1073-93)，其容许我们提高选择的严格性以分离亲和力改善的克隆。使用Sulfo-NHS-LC-生物素(b-Bv8,Pierce,Rockford,IL)将人Bv8生物素化。将微量滴定孔用含10μg/ml中性链霉素的PBS于4°C包被过夜，然后使用Super Blocker(Pierce)封闭1小时。对于第二轮选择，将200μl在PBST缓冲液中悬浮的噬菌体与5nM b-Bv8于室温(RT)混合2小时。结合至b-Bv8的噬菌体在中性亲合素包被的孔上于RT捕捉15分钟，并用PBT缓冲液洗掉未结合的噬菌体。噬菌体使用100mM HCl洗脱30分钟，中和，并繁殖，如上所述。后面轮次的选择与第2轮选择类似地实施，只是：在第3和4轮中，b-Bv8终浓度为0.1nM；在第5轮中，b-Bv8终浓度为0.05nM。开始第4和5轮时，在噬菌体结合b-Bv8之后，于RT分别将500和1000倍过量的未生物素化人Bv8添加至所述混合物-2小时以在中性亲合素上捕捉之前竞争掉解离速率较快的结合物。

通过噬菌体竞争ELISA来测定噬菌体IC50

将MAXISORP^TM微量滴定板用含2μg/ml重组人Bv8(PeproTech)的PBS包被过夜，然后用PBST缓冲液（含0.5% BSA和0.05% Tween 20的PBS）于室温(RT)封闭1小时。将来自培养物上清液的噬菌体与在PBST缓冲液中系列稀释的人Bv8一起在组织培养微量滴定板中于RT温育1小时，之后将80μl混合物转移至靶物包被的孔15分钟以捕捉未结合的噬菌体。用PBT缓冲液（含0.05% Tween 20的PBS）清洗板，并添加HRP偶联的抗M13(AmershamPharmacia Biotech)（PBST缓冲液中1:5000）40分钟。将板用PBT缓冲液清洗，并通过添加四甲基联苯胺底物(Kirkegaard and Perry Laboratories,Gaithersburg,MD)来显现。将450nm吸光度作为溶液中靶物浓度的函数绘图以确定噬菌体IC50。使用这作为在噬菌体表面上展示的Fab克隆的亲和力估值。图14A和14B描绘了来自噬菌体竞争测定法的结果，证明了改进型h2G9.K4G1变体（L1：D28E，D28S，G29A，G29S，H2：C52aA，C52aS，N54A，N54S，H3：D95E，D95S，G96A和G96S）针对人Bv8的结合。图16和17描绘了来自噬菌体竞争测定法的结果，证明了亲和力改进的h2G9.K4G1.Polish变体（来自L1/L2软随机化文库的h2G9.K4G1.v27、v52、v55、v63、v64、v67、v77、v80；来自H1/H2软随机化文库的h2G9.K4G1.v19、v25、v37、v65、v73、v75、v77.v92）针对人Bv8的结合。

通过BIAcore来测定抗体亲和力

对于抗Bv8抗体（Fab或IgG）的结合亲和力测定，使用BIAcore^TM-3000仪器进行表面等离振子共振(SRP)测量。简言之，依照供应商的用法说明用EDC和NHS试剂活化CM5生物传感器芯片，并偶联人Bv8(PeproTech)或猕猴(Genentech;PUR21590)以实现大约150个响应单位(RU)，然后用1M乙醇胺封闭未反应的基团。对于动力学测量，在25°C以30μl/min的流速注射抗Bv8 Fab（0.19nM至25nM）或IgG（0.019nM至10nM）在HBS-P缓冲液（0.01MHEPES pH 7.4、0.15M NaCl、0.005%表面活性剂P20）中的两倍系列稀释液。使用简单一对一Langmuir结合模型(BIAcore Evaluation Software version 3.2)来计算结合速率(k_on)和解离速率(k_off)。作为比k_off/k_on来计算平衡解离常数(Kd)。见图18-21。结果显示人源化抗Bv8抗体h2G9.K4G1.v19和h2G9.K4G1.v55结合人和猕猴Bv8的紧密程度比嵌合2G9抗Bv8抗体高至少两倍。

ACE增殖测定法

在生长培养基中在6孔板中以5000个细胞/孔的密度接种ACE细胞。对于抑制测定法，首先以指定浓度(μg/mL)添加抗Bv8抗体。0.5-1小时后，然后添加人Bv8(Peprotech)至终浓度10nM。6天后，通过对每个孔添加1ml 2x胰蛋白酶(GIBCO)来使细胞解离，并使用Z2 Coulter颗粒计数和尺寸分析仪(Beckman Coulter)对一式两份的孔计数。见图12、13、15、23和24。图23显示了人源化抗Bv8抗体h2G9K4G1.v19、h2G9K4G1.v52、h2G9K4G1.v55和h2G9K4G1.v73显示在阻断人Bv8诱导的ACE增殖中的显著改善。

通过竞争ELISA来定位Bv8抗体表位

将NUNC^TM 96孔Maxisorp免疫板(NUNC;Roskilde,Denmark)用含1μg/mL嵌合2B9 IgG的PBS包被过夜，然后用PBST缓冲液（含0.5%BSA和0.05% Tween 20的PBS）室温封闭1小时。以摩尔比1:4（HuBv8:生物素）使用EZ-link Sulfo-NHS-LC-生物素(Catalog 21335;Pierce;Rockford,IL)试剂进行人Bv8的生物素化。

为了确定竞争测定法中生物素化人Bv8的量，将100nM至0.04nM的三倍系列稀释的生物素化人Bv8添加至抗体包被的板15分钟。然后，用PBT缓冲液（PBS和0.05% Tween 20）清洗板。结合的生物素化使用链霉亲合素来检测，其偶联辣根过氧化物酶(Catalog 21126;Pierce;Rockford,IL)并在PBST缓冲液中1:2500稀释。温育45分钟后，清洗板，并对每个孔添加100μL四甲基联苯胺(R&D Systems)大约5分钟以诱导信号显现。当出现蓝色时，对每个孔添加100μL 1M磷酸以终止显现过程。通过分光光度法读取450nm光密度。

为了用嵌合2B9定位Bv8抗体表位，首先将IgG（嵌合2B9、嵌合3F1、嵌合2D3、嵌合2G9和对照IgG）的三倍系列稀释液与通过上文结合测定法确定的、PBST缓冲液中的2nM生物素化人Bv8一起于室温温育1-2小时，然后将它转移到抗体（嵌合2B9 IgG；1μg/mL）包被的板上15分钟。然后，用PBT缓冲液清洗板，并通过上文所述方案检测结合到板上嵌合2B9 IgG的生物素化人Bv8的量。

在竞争测定法中，嵌合3F1和嵌合2G9抗体与嵌合2B9竞争对人Bv8的结合，提示这两种抗体与嵌合2B9具有交叠表位。然而，嵌合2D3只显示部分地与嵌合2B9抗体竞争对人Bv8的结合，提示嵌合2D3抗体可具有与嵌合2B9以及嵌合3F1和嵌合2G9抗体不同的表位（图11）。

实施例2：体内功效研究

人HT-55、Colo-205（结肠直肠癌）、A673（横纹肌肉瘤）、HPAC（胰腺癌）和Calu-6（肺癌）细胞得自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)。人结肠直肠癌HM7细胞系是LS 174T的衍生物。Calu-6、A673、HPAC和HM7在Ham氏F12，低葡萄糖DMEM 1:1中培养。Colo-205和HT-55在RPMI 1640培养基中培养。这两种培养基都补充10% v/v FBS、1% v/v青霉素/链霉素(Invitrogen,Carlsbad,CA)、2mM L-谷氨酰胺(Invitrogen,Carlsbad,CA)和1μg/ml FUNGIZONE^TM(Invitrogen,Carlsbad,CA)。细胞于37°C在5% CO₂中培养直至汇合，收获，并以15x10⁶个细胞/ml重悬浮于无菌Matrigel中。通过每只小鼠背侧皮下(S.C.)注射1.5x10⁶个细胞在6-8周龄BALB/c裸小鼠(CharlesRiver;Hollister,CA)中接种异种移植物并容许其生长。在肿瘤细胞接种后24小时启动每周两次，10mg/kg剂量，抗Bv8抗体嵌合2D3、嵌合3F1、嵌合2B9和嵌合2G9；人源化2G9变体19、人源化2G9变体55和人源化2G9.K4G1.Polish的i.p.处理。作为对照，我们采用每周两次10mg/kg的抗GP-120单抗和每周两次5mg/kg的抗VEGF单抗G6.31或B20(Liang,W.C.,et al.,J Biol Chem 281,951-961(2006))。所有实验，每周两次使用测径器沿着最长的轴和垂直的轴测量移植的肿瘤。使用椭圆体体积公式（0.5x L x W x W）来计算肿瘤体积，并在图上显示来自所有处理中每个组的10只小鼠的肿瘤体积均值和标准误差。在与抗VEGF抗体组合使用时，抗Bv8抗体还在LXFL529人肺非小细胞癌中具有叠加效应。给米色裸小鼠(n=7~9)植入LXFL529人肺非小细胞癌细胞。然后在肿瘤接种后24小时内用对照抗豚草1428和抗Bv8小鼠抗体（3F1和2B9）处理小鼠。在肿瘤达到~400mm³后用抗VEGF抗体处理小鼠。结果显示作为单一药剂和与抗VEGF抗体组合的嵌合和人源化抗Bv8抗体的处理导致各种肿瘤中肿瘤生长的降低。见图25-37。

小鼠LLC（Lewis肺癌）、人H460（非小细胞肺癌）和HT29（结肠直肠癌）细胞得自美国典型培养物保藏中心(Manassas,VA)。LLC和HM7细胞在RPMI 1640培养基加1% L-谷氨酰胺及10%胎牛血清(Hyclone;Logan,UT)中培养。细胞于37°C在5% CO₂中培养，收获，离心，用Hanks氏平衡盐溶液(HBSS)清洗一次，并计数。LLC细胞重悬浮于50% HBSS和50% Matrigel(BDBiosciences;San Jose,CA)中，而HM7细胞重悬浮于HBSS(Invitrogen;Carlsbad,CA)中，二者浓度均为3.5x10⁷个细胞/mL，供注射入小鼠用。H460细胞在含有10%胎牛血清、100U/mL青霉素G、100μg/mL硫酸链霉素、1mM丙酮酸钠、2mM谷氨酰胺、10mM HEPES、0.075%碳酸氢钠、和25μg/mL庆大霉素的RPMI-1640培养基中培养。细胞在组织培养瓶中在增湿温箱中于37°C在5% CO₂和95%空气气氛中培养，然后收获，并以5x10⁷个细胞/mL的浓度重悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中，供注射入小鼠用。HT29细胞最初得自ATCC，并且所得异种移植物肿瘤随后通过无胸腺裸小鼠中的连续皮下移植作为体内系维持，之后为实验而植入。通过每只小鼠背侧皮下(S.C.)注射3.5x10⁶个细胞在8-9周龄雌性BALB/c裸小鼠(Charles River,Hollister,CA)中接种LLC细胞并容许其作为同种异体移植物生长。通过每只小鼠后腿S.C.注射3.5x10⁶个细胞在12周龄雌性无胸腺裸(nu/nu)小鼠(HarlanSprague Dawley,Inc;Frederick,MD)中接种HM7细胞，通过每只小鼠背侧S.C.注射1x10⁷个细胞在10-11周龄雌性无胸腺裸(nu/nu)小鼠(Harlan SpragueDawley,Inc;Federick,MD)中接种H460细胞，在11-12周龄雌性无胸腺裸(nu/nu)小鼠(Harlan Sprague Dawley,Inc;Federick,MD)的体侧中S.C.植入1mm³的HT29肿瘤碎块。抗Bv8抗体嵌合2D3、鼠3F1、和鼠2B9每周两次以10mg/kg i.p.给药，而人源化抗Bv8抗体2G9每周一次以30mg/kg i.p.给药。作为对照，我们施用抗豚草单抗，i.p.，30或100mg/kg，每周两次和抗VEGF单抗B20-4.1.1，i.p.，5mg/kg，每周两次。在细胞接种或肿瘤植入(HT29)后的下述时间长度时启动处理：LLC为7小时，HM7为8天，H460为11天，而HT29为36天。在研究期间至少每周两次测量肿瘤和体重并实施一般临床观察。使用椭圆体体积公式（0.5xLxWxW）来计算肿瘤体积。为了分析随时间来自相同动物的肿瘤体积重复测量，使用混合建模办法，并生成拟合的肿瘤体积数据(Pinheiro et al.nlme:linear and nonlinear mixed effects models;2009;Version R package version 3.1-96)。绘制了Kaplan-Meier图来显示留在研究中的动物的百分比，作为时间的函数。作为单一药剂和与抗VEGF抗体组合的鼠和人源化抗Bv8抗体的处理导致各种肿瘤中肿瘤生长的降低（见图38-40和42）和延长的存活（见图41和43）。

实施例3：测量人源化抗Bv8抗体阻断人Bv8结合小鼠2G9抗体的能力的 竞争性ELISA

将Maxisorp 384孔板用1μg/ml亲本小鼠2G9 IgG1抗体以25μl/孔在50mM碳酸钠缓冲液pH 9.6中于4°C包被过夜。将板用含有0.05%聚山梨酯的磷酸盐缓冲衍生(PBS)pH 7.4清洗，并用含有0.5% BSA、10ppm Proclin的PBSpH 7.4以80μl/孔封闭。于室温温育1小时后，清洗板。以25μl/孔添加在含有0.5% BSA、0.05%聚山梨酯20的PBS pH 7.4中系列稀释的人源化2G9抗体（0.11pM-180nM）和生物素化人Bv8（终浓度0.5ng/ml或57pM）的混合物。温育2小时后，清洗板，并添加辣根过氧化物酶偶联的链霉亲合素(GEHealthcare)。最终温育30分钟后，清洗板，并添加底物3,3',5,5'-四甲基联苯胺(Kirkegaard & Perry Laboratories)。通过添加1M磷酸来终止反应，并在Multiskan Ascent读数仪(Thermo Scientific,Hudson,NH)上读取450nm吸光度。对于数据分析，使用四参数非线性回归曲线拟合程序来拟合滴定曲线，并确定IC50浓度(KaleidaGraph,Synergy Software,Reading,PA)。

结果显示人源化抗Bv8抗体h2G9.K4G1.v19、h2G9.K4G1.v52、h2G9.K4G1.v55、h2G9.K4G1.v73和h2G9.K4G1.v19H/v55L具有与嵌合2G9和h2G9.K4G1.Polish抗Bv8抗体相比更大的阻断人Bv8结合小鼠2G9抗体的能力。见图22。

通过述及明确将贯穿本公开内容引用的所有参考文献完整收入本文。

尽管已经参照所谓的具体实施方案描述了本发明，但是应当理解，本发明不限于此类实施方案。与之相反，本发明意图覆盖所附权利要求的精神和范围内所包括的各种修改形式和等同形式。

贯穿本申请，包括权利要求书，术语“包含”用作包括的，开放式过渡措词，它不排除别的、未叙述的要素或方法步骤。

Claims (43)

1.一种抗Bv8抗体，其包含可变域，该可变域包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区（HVR）序列：

（i）包含KASQSX₁X₂YX₃X₄X₅SYMN的HVR-L1，其中X₁为L或V；X₂为D或I；X₃为D、F、G、S、W或Y；X₄为A、G、H或V；且X₅为D、E或Y；

（ii）包含AASX₁X₂EX₃的HVR-L2，其中X₁为N或Y；X₂为L或R；且X₃为S或T；

（iii）包含QQINEDPFT的HVR-L3；

（iv）包含GYX₁X₂X₃X₄YDMH的HVR-H1，其中X₁为S或T；X₂为F或L；X₃为F、M、P、T或V；且X₄为D、E、H、I或N；

（v）包含YIX₁X₂YX₃GX₄TX₅YNQKFKG的HVR-H2，其中X₁为H、S或T；X₂为C、S或T；X₃为A、L、N、S或T；X₄为A、E或S；X₅为I、L、S或T，和

（vi）包含DX₁NYGEAYAMDY的HVR-H3，其中X₁为G或S。

2.权利要求1的抗Bv8抗体，其包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列：

（i）包含KASQSX₁X₂YX₃X₄X₅SYMN的HVR-L1，其中X₁为L或V；X₂为D或I；X₃为D、F、G、S、W或Y；X₄为A、G、H或V；且X₅为D、E或Y；

（ii）包含AASX₁X₂EX₃的HVR-L2，其中X₁为N或Y；X₂为L或R；且X₃为S或T；

（iii）包含QQINEDPFT的HVR-L3；

（iv）包含GX₁X₂X₃X₄TYGX₅S的HVR-H1，其中X₁为S或T；X₂为F或L；X₃为F、M、P、T或V；且X₄为D、E、H、I或N；

（v）包含YIX₁X₂YX₃GX₄TX₅YNQKFKG的HVR-H2，其中X₁为H、S或T；X₂为C、S或T；X₃为A、L、N、S或T；X₄为A、E或S；X₅为I、L、S或T，和

（vi）包含DX₁NYGEAYAMDY的HVR-H3，其中X₁为G或S。

3.权利要求2的抗Bv8抗体，其中HVR-L1包含选自SEQ ID NO：49、55、 61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145和151的氨基酸序列，HVR-L2包含选自SEQ ID NO：50、56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146和152的氨基酸序列，HVR-L3包含选自SEQ ID NO：51、57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147和153的氨基酸序列，HVR-H1包含选自SEQ ID NO：52、58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148和154的氨基酸序列，HVR-H2包含选自SEQ ID NO：53、59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149和155的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQ ID NO：54、60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150和156的氨基酸序列。

4.权利要求1的抗Bv8抗体，其包含可变域，该可变域包含至少一种、两种、三种、四种、五种或六种选自下组的高变区（HVR）序列：

（i）包含KASQSX₁X₂YX₃X₄X₅SYMN的HVR-L1，其中X₁为L或V；X₂为D或I；X₃为F、G、S、W或Y；X₄为A、G、H或V；且X₅为D、E或Y；

（ii）包含AASX₁X₂EX₃的HVR-L2，其中X₁为N或Y；X₂为L或R；且X₃为S或T；

（iii）包含QQINEDPFT的HVR-L3；

（iv）包含GYX₁X₂X₃X₄YDMH的HVR-H1，其中X₁为S或T；X₂为F或L；X₃为F、M、P、T或V；且X₄为D、E、H、I或N；

（v）包含YIX₁X₂YX₃GX₄TX₅YNQKFKG的HVR-H2，其中X₁为H、S或T；X₂为S或T；X₃为A、L、S或T；X₄为A、E或S；X₅为I、L、S或T，和

（vi）包含DSNYGEAYAMDY的HVR-H3。

5.权利要求4的抗Bv8抗体，其包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列：

（i）包含KASQSX₁X₂YX₃X₄X₅SYMN的HVR-L1，其中X₁为L或V；X₂为D或I；X₃为F、G、S、W或Y；X₄为A、G、H或V；且X₅为D、E或Y； 

（ii）包含AASX₁X₂EX₃的HVR-L2，其中X₁为N或Y；X₂为L或R；且X₃为S或T；

（iii）包含QQINEDPFT的HVR-L3；

（iv）包含GYX₁X₂X₃X₄YDMH的HVR-H1，其中X₁为S或T；X₂为F或L；X₃为F、M、P、T或V；X₄为D、E、H、I,或N；

（v）包含YIX₁X₂YX₃GX₄TX₅YNQKFKG的HVR-H2，其中X₁为H、S或T；X₂为S或T；X₃为A、L、S或T；X₄为A、E或S；X₅为I、L、S或T，和

（vi）包含DSNYGEAYAMDY的HVR-H3。

6.权利要求5的抗Bv8抗体，其中HVR-L1包含选自SEQ ID NO：55、61、67、73、79、85、91、97、103、109、115、121、127、133、139、145和151的氨基酸序列，HVR-L2包含选自SEQ ID NO：56、62、68、74、80、86、92、98、104、110、116、122、128、134、140、146和152的氨基酸序列，HVR-L3包含选自SEQ ID NO：57、63、69、75、81、87、93、99、105、111、117、123、129、135、141、147和153的氨基酸序列，HVR-H1包含选自SEQ ID NO：58、64、70、76、82、88、94、100、106、112、118、124、130、136、142、148和154的氨基酸序列，HVR-H2包含选自SEQ ID NO：59、65、71、77、83、89、95、101、107、113、119、125、131、137、143、149和155的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQ ID NO：60、66、72、78、84、90、96、102、108、114、120、126、132、138、144、150和156的氨基酸序列。

7.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，其中该抗体包含：

（1）包含氨基酸序列SEQ ID NO：61的HVR-H1；

（2）包含氨基酸序列SEQ ID NO：62的HVR-H2；

（3）包含氨基酸序列SEQ ID NO：63的HVR-H3；

（4）包含氨基酸序列SEQ ID NO：64的HVR-L1；

（5）包含氨基酸序列SEQ ID NO：65的HVR-L2；和

（6）包含氨基酸序列SEQ ID NO：66的HVR-L3。

8.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，其中该抗体包含：

（1）包含氨基酸序列SEQ ID NO：85的HVR-H1；

（2）包含氨基酸序列SEQ ID NO：86的HVR-H2； 

（3）包含氨基酸序列SEQ ID NO：87的HVR-H3；

（4）包含氨基酸序列SEQ ID NO：88的HVR-L1；

（5）包含氨基酸序列SEQ ID NO：89的HVR-L2；和

（6）包含氨基酸序列SEQ ID NO：90的HVR-L3。

9.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，其中该抗体包含：

（1）包含氨基酸序列SEQ ID NO：91的HVR-H1；

（2）包含氨基酸序列SEQ ID NO：92的HVR-H2；

（3）包含氨基酸序列SEQ ID NO：93的HVR-H3；

（4）包含氨基酸序列SEQ ID NO：94的HVR-L1；

（5）包含氨基酸序列SEQ ID NO：95的HVR-L2；和

（6）包含氨基酸序列SEQ ID NO：96的HVR-L3。

10.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，其中该抗体包含：

（1）包含氨基酸序列SEQ ID NO：121的HVR-H1；

（2）包含氨基酸序列SEQ ID NO：122的HVR-H2；

（3）包含氨基酸序列SEQ ID NO：123的HVR-H3；

（4）包含氨基酸序列SEQ ID NO：124的HVR-L1；

（5）包含氨基酸序列SEQ ID NO：125的HVR-L2；和

（6）包含氨基酸序列SEQ ID NO：126的HVR-L3。

11.权利要求1-10任一项的抗Bv8抗体，进一步包含人VL κ亚组IV共有框架序列SEQ ID NO：240和人V0.0H亚组I共有框架序列SEQ ID NO：241。

12.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：7，该重链可变域包含SEQ ID NO：8。

13.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：9，该重链可变域包含SEQ ID NO：10。

14.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：11，该重链可变域包含SEQ ID NO：12。

15.权利要求1-6任一项的抗Bv8抗体，包含轻链可变域和重链可变域，该轻链可变域包含SEQ ID NO：13，该重链可变域包含SEQ ID NO：14。

16.权利要求1-15任一项的抗Bv8抗体，其中该抗Bv8抗体以小于约0.02nM的Kd值结合人Bv8。

17.权利要求1-15任一项的抗Bv8抗体，其中该抗Bv8抗体结合人Bv8的紧密 程度比嵌合2G9抗Bv8抗体高至少两倍。

18.一种结合Bv8的抗体或其片段，其中该抗体包含可变域，该可变域包含下述六种HVR序列：

（i）包含SASSX₁VFYMH的HVR-L1，其中X₁为P或S；

（ii）包含DTSX₁LAS的HVR-L2，其中X₁为K或N；

（iii）包含QQWSX₁X₂PX₃T的HVR-L3，其中X₁为F、S、W或Y；X₂为D或E；X₃为I、L或M；

（iv）包含GFX₁X₂STX₃GMGVS的HVR-H1，其中X₁为L或Y；X₂为I或L；X₃为P或S；

（v）包含HIYWDDDTRYNPSLKS的HVR-H2，和

（vi）包含RDHGYYWFDY的HVR-H3。

19.权利要求18的抗Bv8抗体，其中HVR-L1包含选自SEQ ID NO：169、175、181、187和193的氨基酸序列，HVR-L2包含选自SEQ ID NO：170、176、182、188和194的氨基酸序列，HVR-L3包含选自SEQ ID NO：171、177、183、189和195的氨基酸序列，HVR-H1包含选自SEQ ID NO：172、178、184、190和196的氨基酸序列，HVR-H2包含选自SEQ ID NO：173、179、185、191和197的氨基酸序列，且HVR-H3包含选自SEQ ID NO：174、180、186、192和198的氨基酸序列。

20.编码权利要求1-19任一项的抗体的核酸。

21.包含权利要求20的核酸的载体。

22.权利要求21的载体，其中该载体为表达载体。

23.包含权利要求21或22的载体的宿主细胞。

24.包含权利要求1-19任一项的抗体的组合物。

25.权利要求24的组合物，其中该组合物包含载体。

26.权利要求24或25的组合物，其为药物组合物。

27.一种用于制备抗Bv8抗体的方法，所述方法包括（a）在合适宿主细胞中表达权利要求21或22的载体，并（b）回收该抗体。

28.权利要求27的方法，其中该宿主细胞是原核的。

29.权利要求27的方法，其中该宿主细胞是真核的。

30.一种用于治疗肿瘤、癌症、或细胞增殖性病症的方法，该方法包括对受试者施用有效量的权利要求1-19任一项的抗Bv8抗体。 

31.权利要求30的方法，其中该癌症选自下组：乳腺癌，结肠直肠癌，肺癌，肾癌，成胶质细胞瘤，食管癌，黑素瘤，膀胱癌，卵巢癌，胰腺癌，和肝细胞癌。

32.权利要求31的方法，其中该癌症为乳腺癌、结肠直肠癌、肺癌、肾癌、卵巢癌或成胶质细胞瘤。

33.一种在具有与血管发生有关的病理状况的受试者中降低或抑制血管发生的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求1-19任一项的抗Bv8抗体，由此降低或抑制受试者中的血管发生。

34.权利要求33的方法，其中所述病理状况为新生物状况。

35.一种用于抑制内皮细胞增殖的方法，包括对受试者施用有效量的权利要求1-19任一项的抗体。

36.权利要求30-35任一项的方法，进一步包括对受试者施用有效量的第二药物，其中抗Bv8抗体为第一药物。

37.权利要求36的方法，其中该第二药物为另一种抗体、化疗剂、细胞毒剂、抗血管发生剂、免疫抑制剂、前药、细胞因子、细胞因子拮抗剂、细胞毒性放疗剂、皮质类固醇、止吐剂、癌症疫苗、止痛剂、或生长抑制剂。

38.权利要求37的方法，其中该第二药物为抗血管发生剂。

39.权利要求38的方法，其中该抗血管发生剂为抗VEGF抗体。

40.权利要求39的方法，其中该抗VEGF抗体为贝伐单抗(bevacizumab)。

41.权利要求36-40任一项的方法，其中该第二药物在施用抗Bv8抗体之前或之后施用。

42.权利要求36-40任一项的方法，其中该第二药物与抗Bv8抗体同时施用。

43.权利要求30-40任一项的方法，进一步包括对受试者施用有效量的化疗剂。 

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