CN102776268A - 恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒及方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒及方法。试剂盒主要由四条引物、DNA聚合酶、反应液、阳性对照、阴性对照组成，以上液体分别置于容器中；试剂盒还可以有显色剂。其检测方法是通过提取待检玉米品种的DNA、采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63-65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝，其鉴定采用加入SYBR Green I观察颜色变化或者利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化判断扩增与否，检测待检玉米品种是否含有或为转基因玉米Mon89034及其衍生品种。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果。

Description

恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒及方法

【技术领域】

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物产品的检测试剂盒及其检测方法，具体地说是一种基于环介导等温基因扩增技术快速检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒及其检测方法。 

【背景技术】

国际农业生物技术应用服务组织近期发表的《2010年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势》报告显示，由于转基因作物带来的巨大益处，过去15年内大约有1亿人次的农民做出种植决定。自转基因作物投入商业化种植15年来，全球转基因作物种植面积累计已经超过10亿公顷。2010年，全球29个国家的1540万农民种植了共1.48亿公顷的转基因作物。自1996年至2010年，全球转基因作物的种植面积增加了87倍。种植转基因作物排名前十位的国家种植面积首次均超过了100万公顷。这些国家按照作物种植面积的大小排列分别是：美国(6680万公顷)、巴西(2540万公顷)、阿根廷(2290万公顷)、印度(940万公顷)、加拿大(880万公顷)、中国(350万公顷)、巴拉圭(260万公顷)、巴基斯坦(240万公顷)、南非(220万公顷)和乌拉圭(110万公顷)。目前，世界各国已进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、番茄、马铃薯、甜椒、木瓜、甜菜、烟草、水稻等。 

转基因玉米作为目前世界上最主要的转基因作物之一，占全世界转基因作 物种植面积的30％以上，仅次于转基因大豆。.转基因玉米Mon89034是由美国孟山都公司研发的一种表达cry1A.105和cry2Ab2基因，对鳞翅类害虫具有抗性的转基因玉米品系，目前已被授权用于加拿大牲畜饲料，其代表性种子保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC)，保藏号为PTA-7455。2010年11月29日，一批从美国进口的5.4万吨的转基因玉米就曾因为被检出转基因成分MON89034，而被作出退货决定。 

从世界范围看，转基因玉米的推广已经带来了巨大的社会和经济效益。然而转基因玉米在带来巨大社会和经济效益的同时也存在许多问题，主要集中在转基因食品的安全性以及对生态环境的安全性方面，包括对人和动物健康的风险，对生态环境与农业的风险，对非目标生物的风险。针对第一种风险，1993年，联合国经济发展与合作组织(OECO)提出了食品安全性评估的“实质等同性”原则。如果准基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。最早提出对转基因食品进行标识管理的是欧盟，1998年，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1％的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9％。日本，澳大利亚，新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从1-5％不等。 

我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价，标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。 

为了能够对转基因作物及其产品做出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，建立有效的方法体系对转基因作物进行检测也很重要，这是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。 

转基因产品的检测要求方法要快速，准确，灵敏，并且还得考虑适应大样品量， 目标基因种类多等特点。因此，目前转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质(基因表达产物)和是否含有外源基因(DNA)。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶联免疫吸附法(ELISA)试纸条检测、Western杂交等方法检测，主要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用与目的蛋白(抗原)特异性结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号，但是这种方法要求高质量高稳定性的抗体，否则因准确性不够，只能作为辅助检测手段。转基因作物的核酸检测方法主要有两种：核酸分子杂交技术(Sourthernblot)，PCR检测技术。其中PCR检测方法是最主要，最准确地检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法，符合PCR方法，巢式PCR方法，竞争性定量PCR方法，荧光定量PCR方法等等。 

目前，国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的片段，使微量、特定目的DNA片段在几小时内迅速扩增到百万倍，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后很容易观察，因而具有快速灵敏等优点。然而，PCR方法反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；所需PCR仪价格在5万元左右，扩增时间2-3小时，扩增结果的电泳时间需要1小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测。所以，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的转基因作物检测方法。 

环介导等温基因扩增技术(Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法)是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将LAMP法应用于快速检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒。 

【发明内容】

本发明的目的在于提供一种恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍 生品种的试剂盒。 

本发明的另一个目的在于提供一种基于上述试剂盒的恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的检测方法。 

本发明的上述目的通过以下技术方案予以实现： 

本发明的恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒主要由四条引物、DNA聚合酶、反应液、阳性对照、阴性对照组成，以上液体分别置于容器中。 

本发明的恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒还可以有显色剂。 

其中：(1)、根据转基因玉米Mon89034的外源基因与内源基因结合处的序列设计了4条引物，应用上述四条引物，扩增靶序列的6个区域，四条引物是： 

外引物1：CTATGTAAGAGGTGTTTGAA，如SEQ ID No.1所示； 

外引物2：GTAAGATGTGAGTATGATCC，如SEQ ID No.2所示； 

内引物1：GTCCATCTATCAAATCAGCACCGTCTATCCACGGTCCGTGCGCACC，如SEQ IDNo.3所示； 

内引物2：GAACAACATCTCTGGAGTCGGTGAGTCCGGCGTACTGCGCCACC，如SEQ IDNo.4所示。 

上述引物可以通过高通量DNA合成仪按照操作说明书合成，并通过HPLC(高压液相法)纯化。 

引物混合液：将合成引物干粉分别配成浓度为100μM的母液，然后取外引物1、外引物2各1μl，内引物1、内引物2各8μl，充分混合。 

(2)一种具有链置换活性的DNA聚合酶，例如可采用Bst DNA聚合酶：浓度为7-9U/μl，优选8U/μl； 

(3)反应液：含有10mM dNTP(三磷酸脱氧核糖核苷)，10×ThermoPol反应缓冲液(耐热聚合酶反应缓冲液)反应缓冲液，150mM MgSO₄水溶液，三者的 体积比是7-9∶4-6∶2，优选10mM dNTP/10×ThermoPol反应缓冲液/150mM MgSO₄＝8/5/2； 

(4)阳性对照为浓度为5％的转基因玉米89034的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。 

含目的基因的大肠杆菌质粒DNA可采用本领域技术人员熟知的方法制备质粒并提取其DNA。 

本发明的恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒还可以有显色剂：荧光染料SYBR Green I。 

本发明采用上述试剂盒恒温基因扩增快速检测转基因玉米MON89034及其衍生品种的方法，包括以下步骤： 

(1)转基因玉米Mon89034及其衍生品的DNA提取过程：采用CTAB法(十六烷基三甲基溴化铵法)提取纯化样品DNA； 

(2)恒温基因扩增反应：在200ul PCR管配制反应体系：引物混合物1μl，反应液12.5μl，DNA聚合酶1μl，检测模板DNA 2-5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用浓度为5％的转基因玉米89034的DNA替代模板DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代模板DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63-65℃反应60-90min，并在80℃持续2min； 

(3)分析判断反应产物结果：将反应管放置在浊度仪中按(2)中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，如果出现沉淀则为阳性，无沉淀则为阴性。其原理是通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀的量来进行。其具有极高的特异性，可通过浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。 

在试剂盒中含有显色剂的情况下，在(2)中得到产物中加入1-2μl显色剂，混匀，紫外灯下或肉眼观察，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。 

其中常规CTAB法提取转基因玉米Mon89034DNA的方法为： 

(1)取转基因玉米Mon89034，约100mg，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3-4次，磨碎成粉末为止。 

(2)加入1.5ml预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，65℃保育30min，期间不停颠倒混匀； 

(3)约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中； 

(4)加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中； 

(5)加入2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清；加入350μl氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10min，转移上清至一新离心管； 

(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min，12000g离心15min。弃上清。加入500μl70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000g离心10min。弃上清； 

(7)干燥DNA沉淀，加100μlTE缓冲液溶解DNA。 

本发明基于环介导等温扩增技术(LAMP法)是根据靶基因设计的四条引物，特异性的识别靶基因序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎-环DNA混合物。采用4条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63-65℃对核酸进行扩增反应，反应需在恒温条件下进行，反应时间依据模板DNA质量变化，一般为90min或更少，在60-90min的短时间内扩增效率可以达到10⁹-10¹⁰个拷贝数。加入模板DNA，在63-65℃经60-90min反应后，在80℃持续2min后终止。这项技术的优点是不需要热循环，且由于扩增是在恒温条件下进行，因此不需要PCR仪等昂贵仪器。在反应中，在核酸大量合成时， 从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中Mg离子结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。 

本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果： 

(1)快速高效：整个扩增只用60-90min即可完成，扩增产量可达10⁹-10¹⁰个拷贝； 

(2)操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和； 

(3)高特异性：本发明根据转基因玉米Mon89034的外源基因序列设计了四条特异性引物： 

应用上述四条引物，扩增靶序列的6个区域，因此具有高度特异性； 

(4)高灵敏度：最低检测极限可达到10个拷贝； 

(5)鉴定简便：可通过观察观察加入SYBR Green I颜色变化或者是否存在焦磷酸镁沉淀来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。 

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。 

转基因玉米Mon89034及其衍生品种的模板DNA的提取方法采用常规CTAB法。 

【具体实施方式】

实施例1含显色剂的试剂盒及其检测方法： 

按下列配方制备恒温基因扩增快速检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒： 

(1)引物混合液：将合成引物干粉分别配成浓度为100μM的母液，然后 取外引物1、外引物2各1μl，内引物1、内引物2各8μl，充分混合，其中引物序列分别为： 

外引物1：CTATGTAAGAGGTGTTTGAA；如SEQ ID No.1所示； 

外引物2：GTAAGATGTGAGTATGATCC；如SEQ ID No.2所示； 

内引物1：GTCCATCTATCAAATCAGCACCGTCTATCCACGGTCCGTGCGCACC；如SEQ IDNo.3所示； 

内引物2：GAACAACATCTCTGGAGTCGGTGAGTCCGGCGTACTGCGCCACC；如SEQ IDNo.4所示； 

(2)DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl； 

(3)反应液：10mM dNTP/10×ThermoPol反应缓冲液/150mM MgSO₄＝8/5/2； 

(4)显色剂：荧光染料1×SYBR Green I； 

(5)阳性对照为浓度为5％的转基因玉米89034的DNA，或用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代模板DNA；阴性对照为不含目的基因的反应混合液。 

用上述试剂盒按以下方法对某玉米品种进行检测： 

(1)DNA模板准备过程：采用常规CTAB法，提取转基因玉米Mon89034及其衍生品种的模板DNA； 

(2)恒温基因扩增反应：在200ul PCR管配制反应体系：引物混合物1μl，反应液12.5μl，Bst DNA聚合酶，1μl，模板DNA 2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用浓度为5％的转基因玉米89034的DNA替代模板DNA，或用含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代模板DNA；设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代模板DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63℃反应60min，并在80℃持续2min； 

(3)分析判断反应产物结果：在(2)中得到产物中加入1μl显色剂，混匀，肉眼观察。无扩增反应的管子呈现黄色，有扩增反映的管子变成绿色。 

本实施例中，PCR管显绿色，表明待检玉米种子中含有或全部为转基因玉米Mon89034及其衍生品种，含有转基因玉米Mon89034成分。 

实施例2不含显色剂的试剂盒及其检测方法： 

试剂盒除缺少实施例1中的显色剂外，其余同实施例1. 

检测方法除分析判断反应产物结果步骤外，其余同实施例1，分析判断结果的方法为： 

将反应管放置在浊度仪中按(2)中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，如果出现沉淀则为阳性，无沉淀则为阴性。 

本实施例中，PCR管出现沉淀，表明待检玉米种子中含有或全部为转基因玉米Mon89034及其衍生品种，含有转基因玉米Mon89034成分。 

实施例3PCR反应与本发明检测方法灵敏度的比较： 

按下列配方制备恒温基因扩增快速检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒： 

(1)引物混合液：将合成引物干粉分别配成浓度为100μM的母液，然后取外引物1、外引物2各1μl，内引物1、内引物2各8μl，充分混合，其中引物序列分别为： 

外引物1：CTATGTAAGAGGTGTTTGAA；如SEQ ID No.1所示； 

外引物2：GTAAGATGTGAGTATGATCC；如SEQ ID No.2所示； 

内引物1：GTCCATCTATCAAATCAGCACCGTCTATCCACGGTCCGTGCGCACC；如SEQ IDNo.3所示； 

内引物2：GAACAACATCTCTGGAGTCGGTGAGTCCGGCGTACTGCGCCACC；如SEQ IDNo.4所示； 

(2)DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，也可采用其他DNA聚合酶，浓度为8U/μl； 

(3)反应液：10mM dNTP/10×ThermoPol反应缓冲液/150mM MgSO₄＝8/5/2； 

(4)显色剂：荧光染料1×SYBR Green I； 

(5)阳性对照为浓度为5％的转基因玉米89034的DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。 

用上述试剂盒按以下方法对转基因玉米Mon89034及其衍生品种进行检测： 

(1)DNA模板准备过程：采用CTAB法提取纯化含有转基因玉米Mon89034成分的DNA5％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.05％的样品的DNA； 

(2)恒温基因扩增反应：在200ul PCR管配制反应体系：引物混合物1μl，反应液12.5μl，DNA聚合酶1μl，模板DNA 5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用浓度为5％的转基因玉米89034的DNA替代模板DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代模板DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于65℃反应90min，并在80℃持续2min； 

(3)分析判断反应产物结果：将反应管放置在浊度仪中按(2)中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，如果出现沉淀则为阳性，无沉淀则为阴性。阳性对照、5％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％均出现沉淀显示为阳性结果，阴性对照无沉淀产生。也可以在(2)中得到产物中加入1μl显色剂，混匀，肉眼观察。无扩增反应的管子呈现黄色，有扩增反映的管子变成绿色。 

本实施例中，阳性对照、5％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％均出现沉淀显示为阳性结果，PCR管显绿色；阴性对照管子呈现黄色。 

(4)PCR反应引物采用本方法反应中的外引物1和外引物2。PCR反应为25μl体系，10×PCR Buffer(PCR反应缓冲液，Promega公司)2.5μl，10mM dNTPs(Promega公司)0.5μl，上、下游引物分别对应外引物1和外引物2，各0.5μl，Taq酶(5U/μl，Promega公司)0.5μl，DNA模板1μl，用灭菌去离子水补至25μl。反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸7min。PCR产物取10μl与2％琼脂糖凝胶电泳，100V电压下40min，通过凝胶成像分析仪观察结果，.对应条带分别为：M，DL600DNAMa rker(DNA分子量标准)；1，阳性对照；2，5％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7，0.005％；8，阴性对照。其中PCR方法的灵敏度为0.05％，而6，7显示为阴性结果。 

由两种方法比较可以看出，本发明的试剂盒的灵敏度的结果可以达到0.005％的浓度，而PCR方法的灵敏度为0.05％，而0.01％或以下显示为阴性结果；经比对，本发明的试剂盒及方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出更低含量的样品。 

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (6)

1.一种恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒，主要由四条引物、DNA聚合酶、反应液、阳性对照、阴性对照组成，以上液体分别置于容器中，其中：

(1)引物混合液：将合成引物干粉分别配成浓度为100μM的母液，然后取外引物1、外引物2各1μl，内引物1、内引物2各8μl，充分混合，四条引物为：

外引物1：CTATGTAAGAGGTGTTTGAA，如SEQ ID No.1所示；

外引物2：GTAAGATGTGAGTATGATCC，如SEQ ID No.2所示；

内引物1：GTCCATCTATCAAATCAGCACCGTCTATCCACGGTCCGTGCGCACC，如SEQ IDNo.3所示；

内引物2：GAACAACATCTCTGGAGTCGGTGAGTCCGGCGTACTGCGCCACC，如SEQ IDNo.4所示；

(2)DNA聚合酶：浓度为7-9U/μl；

(3)反应液：含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgS0₄水溶液，三者的体积比是7-9∶4-6∶2；

(4)阳性对照为浓度为5％的转基因玉米89034的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。

2.根据权利要求1所述的一种恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒，其特征在于：

(1)DNA聚合酶：为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；

(2)反应液：为10mM dNTP/10×ThermoPol反应缓冲液/150mM MgSO₄＝8/5/2体积比。

3.权利要求1所述的试剂盒检测转基因玉米MON89034及其衍生品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)转基因玉米Mon89034及其衍生品的DNA提取过程：采用CTAB法提取纯化样品DNA；

(2)恒温基因扩增反应：在200ul PCR管配制反应体系：引物混合物1μl，反应液12.5μl，DNA聚合酶1μl，模板DNA 2-5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用浓度为5％的转基因玉米89034的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代模板DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代模板DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63-65℃反应60-90min，并在80℃持续2min；

(3)分析判断反应产物结果：将反应管放置在浊度仪中按(2)中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，如果出现沉淀则为阳性，无沉淀则为阴性。

4.如权利要求1所述的一种恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒，还有显色剂：荧光染料SYBR Green I。

5.根据权利要求4所述的一种恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒，其特征在于：

(1)DNA聚合酶：为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；

(2)反应液：为10mM dNTP/10×ThermoPol反应缓冲液/150mM MgSO₄＝8/5/2体积比。

6.权利要求4所述的试剂盒检测转基因玉米MON89034及其衍生品种的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)转基因玉米Mon89034及其衍生品的DNA提取过程：采用CTAB法提取纯化样品DNA；

(2)恒温基因扩增反应：在200ul PCR管配制反应体系：引物混合物1μl，反应液12.5μl，DNA聚合酶1μl，模板DNA 2-5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用浓度为5％的转基因玉米89034的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代模板DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代模板DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63-65℃反应60-90min，并在80℃持续2min；

(3)分析判断反应产物结果：在(2)中得到产物中加入1-2μl显色剂，混匀，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。