CN101302565B

CN101302565B - 一种快速检测转基因玉米品系bt176的方法

Info

Publication number: CN101302565B
Application number: CN200810053700A
Authority: CN
Inventors: 王永; 兰青阔; 程奕; 赵新; 朱珠
Original assignee: Central Laboratory of Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Central Laboratory of Tianjin Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2008-06-30
Filing date: 2008-06-30
Publication date: 2012-09-05
Anticipated expiration: 2028-06-30
Also published as: CN101302565A

Abstract

本发明公开了一种转基因玉米BT176的快速检测方法及所用引物。其原理是采用5条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在64℃左右对样品模板DNA进行扩增，短时间扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝。其鉴定采用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过加入SYBR Green颜色变化判断扩增与否。本发明的检测方法具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点，为转基因作物的检测开辟了广阔的前景。

Description

一种快速检测转基因玉米品系BT176的方法

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因产品的检测方法，具体说是一种快速检测转基因玉米品系BT176的方法，通过肉眼观察反应管浊度或观察加入1000×SYBR Green后颜色变化或观察琼脂糖凝胶电泳来判断样品中是否含有转基因玉米品系BT176成分。

背景技术

自1993年第一个转基因作物转基因晚熟西红柿正式投放美国市场以来，转基因作物已由1996年的190万hm²增加到2007年的1.44亿hm²，市场产值从最初1995年的0.75亿美元增加到2007年的70亿美元，12年间增加约93倍。目前已有23个国家种植转基因作物，其中转基因大豆占全球种植面积的51％，玉米占31％，棉花占13％，油菜占5％。

Bt-176玉米是先正达公司开发的抗虫且耐草铵膦除草剂的转基因玉米品种。美国农业部(USDA)1994年受理该公司的申请，并于1995年批准在美国国内无限制种植。随后，日本(1996)、加拿大(1996)、阿根廷及欧盟各成员国(1997)也先后准许无限制种植，Bt-176玉米的种植面积不断扩大。同时，美国(1995)、加拿大(1995)、日本(1996)及英国、丹麦、荷兰、瑞士和阿根廷等国分别批准Bt-176玉米作为食物或饲料来源并可上市销售。

转基因作物发展迅速，世界很多组织对其安全性产生担忧。其安全性主要集中在转基因作物释放的环境安全性和由转基因作物生产出的食品的安全性上。包括对人和动物健康的风险、对生态环境与农业的风险、对非目标生物的风险。针对第一种风险，1993年，联合国经济发展与合作组织(OECO)提出了食品安全性评估的“实质等同性”原则。如果转基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。

最早提出对转基因食品进行标识管理的是欧盟，1998年，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1％的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9％。日本、澳大利亚、新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从1-5％不等。

我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价、标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。

为了能够对转基因作物及其产品做出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，建立有效的方法体系对转基因作物进行检测也很重要，这是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。

转基因产品的检测要求方法要快速、准确、灵敏，并且还得考虑适应大样品量、目标基因种类众多等特点。因此，目前转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质(基因表达产物)和是否含有外源基因(DNA)。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫学原理的酶联免疫吸附法(ELISA)、试纸条检测、Western杂交等方法检测，主要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用抗体与目的蛋白(抗原)特异结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号。转基因作物的核酸检测方法主要有两种：核酸分子杂交技术(Sourthernblot)，PCR检测技术。其中的PCR检测方法是最主要、最准确地检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法、复合PCR方法、巢式PCR方法、竞争性定量PCR方法、荧光定量PCR方法等等。

目前，国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的片段，使微量、特定目的DNA片段在几小时内迅速扩增到百万倍。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭染色后很容易观察，因而具有快速、灵敏等优点。

发明内容

本发明的目的在于公开一种快速检测转基因玉米品系BT176的方法及根据外源基因序列设计一套引物对其进行扩增，通过肉眼观察浊度或观察加入SYBR Green后颜色的变化或观察琼脂糖凝胶电泳结果判断扩增情况。

本发明的技术方案如下：

本发明基于转基因玉米BT176的基因序列信息，设计引物进行环状等温扩增从而提供检测转基因玉米BT176的方法。

用于检测转基因玉米BT176的特异性引物，其特征在于包括：

外引物正向序列：CGGGAACTGGCATGACGT，

外引物反向序列：GAGGGAGAGAGAGGGAGC；

内引物正向序列：TCTCGGTGACGGGCAGGACTTTTGGTTTCTGGCAGCTGGACTT，

反向序列：TCTCCTCCATTGATGCACGCCTTTTGGAAGGGAGAAACGGTCGG，

环引物：TCAATGGCCTTGAAGCCTTG。

本发明采用上述一套引物进行快速检测转基因玉米品系BT176的方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)采用权利要求1所述的5条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，使扩增达到10⁹-10¹⁰个拷贝；

其中的扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO₄ 0.25μL，引物混合溶液1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL，模板DNA 1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；

其中的引物序列表1如下：

(2)扩增反应结束，取体系液3-25μL，采用不同方法判断扩增与否，包括：直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，通过颜色变化观察有无扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来观察有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。例如可以通过肉眼观察反应管浊度判断结果，无色透明为阴性，白色混浊为阳性；或通过加入1-2μL 1000×SYBR Green判断结果，橙色为阴性，绿色为阳性；或通过琼脂糖凝胶电泳判断结果，无条带为阴性，有弥散及梯度条带为阳性。

本发明所述的引物混合溶液指的是将合成的引物干粉分别配制浓度为100μM的母液，然后取外引物F3、B3各8μL，内引物FIP、BIP各1μL，环引物2μL，充分混合，制得引物混合溶液。

本发明所述判断扩增方法中通过加入1-2μL 1000×SYBR Green判断结果。

本发明所述的模板DNA指的是样品采用CTAB法提取纯化得到的DNA。

为了能更加清楚的说明本发明的测定方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明。

1、原理

本方法应用新型的核酸扩增方法，其原理是采用5条特异引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min而终止，短时间扩增效率可达到10⁹-10¹⁰个拷贝。具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。

2、引物设计

该引物设计较复杂。需要4-6条引物，分别是正向内引物FIP、正向外引物F3、反向内引物BIP、反向外引物B3、正向环引物LF、反向环引物LB。内引物长度通常超过40个碱基，外引物短些，为25个碱基左右。除了引物的长度、碱基组成外，还要考虑引物与靶序列的结构因素，使引物能够更好的与模版目的基因序列结合并形成环状扩增结构。

本研究依据转基因玉米品系BT176外源基因与内源基因结合处序列设计了5条引物。引物由大连宝生物公司合成。

表1引物序列表如下：

3、反应条件

反应试剂需要链置换型DNA聚合酶、dNTPs、引物、BSA、MgSO4和反应缓冲液。反应在恒温条件下进行，反应时间依据引物的效率和模板DNA质量变化，一般为1h或更少。加入模板DNA，在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min而终止。这项技术的优点就是不需要热循环。由于扩增是在恒温条件下进行的，因此仅需要恒温水浴锅或金属加热块维持反应温度，不需要PCR仪等昂贵的仪器。

材料与方法：

(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；BT176品系特异性引物；BSA溶液；MgSO₄溶液；dNTPs；

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分及终浓度分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO4 0.25μL，引物混合液1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L BstDNA聚合酶大片段1-2μL，模板DNA 1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL。

(3)扩增反应过程：在63-65℃进行45-60min，并且在80℃持续2min，4℃，保存；

(4)扩增反应结束，取体系液3-25μL用不同的检测方法判断扩增与否。

4、扩增结果观察

有三种观察方法，适合不同情况下进行：

1)使用2％琼脂糖凝胶，加入EB染色剂，100V电泳50min，在紫外灯下观察。反应会产生各种片断长度的茎环结构的扩增产物，因此在电泳图谱中显示为从点样孔处开始的弥散和条带现象。由于EB是致癌剂，因此该方法应用不是很广范。结果见图1。

2)由于反应形成大量双链DNA产物，可以直接向扩增管中加入嵌入剂SYBR Green，紫外灯下或肉眼观察，无扩增反应的管子呈橙色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图2。

3)检测还可以通过评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物的量来进行。在反应中，在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg²⁺结合，产生副产物一焦磷酸镁沉淀。它有极高的特异性，可以用肉眼观察或浊度仪检测反应管中的沉淀浊度就能够判断扩增与否。

本发明用于转基因玉米品系BT176检测的扩增方法，具有许多迄今为止的扩增方法无法比拟的优点：

1)操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，只需一恒定温度就能反应，不需要预先进行双链DNA的变性。

2)高特异性：该技术由5条引物扩增靶序列的6个区段，因此具有高度特异性。

3)快速高效：本发明的检测方法快速、准确、灵敏，整个扩增不到1h即可完成，产量可达到10⁹-10¹⁰个拷贝；

4)灵敏度高：扩增模板可仅为10拷贝甚至更少。

5)鉴定简便：可以用肉眼直接观察反应管内沉淀的混浊度或者通过SYBR Green颜色变化判断扩增与否。

附图说明

图1为扩增产物的电泳分析图谱。自左向右依次为阳性对照、阳性样品、Marker、阴性样品、阴性对照。

图2为扩增产物加入SYBR Green结果图。从左边依次为阳性对照、阳性样品、阴性样品、阴性对照。

图3为扩增产物加入SYBR Green结果图。由左向右，阳性对照、待测样品1、待测样品2、阴性对照。

图4为扩增产物加入SYBR Green结果图。由左向右：阳性对照1、阳性对照2、待测样品1、待测样品2、阴性对照、空白对照。

图5为扩增产物的电泳分析图谱。由左向右：Marker，空白对照，阴性对照，待测样品1、待测样品2、阳性对照。

图6为实施例4本发明方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果，其中M，DL2000 DNA Marker；1，5％；2，1％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7，0.005％；8，0.001％；9，阴性对照。

图7为实施例4常规定性PCR方法扩增产物的琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果其中M，DL2000 DNA Marker；1，5％；2，1％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7，阴性对照。

为了能更加清楚的说明本发明的方法，下面对本发明的试验方法做以详细的说明，在此需加以说明的是：

(1)本发明所述的引物序列见表1。

(2)样品DNA模板的提取方法：常规CTAB法提取(见附件)

实施例1

(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；BT176特异性引物混合液；4M BSA溶液；0.2M MgSO₄溶液；DNA模板包括阳性对照、待测样品1、待测样品2、阴性对照。

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO₄ 0.25μL，引物混合液1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1μL，DNA模板1μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(3)扩增反应程序：在63℃进行60min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；

(4)扩增反应结束，取体系液15μL，向扩增管中加入嵌入剂1μL 1000×SYBR Green，振荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的管子呈橙黄色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图3。由左向右，阳性对照、待测样品1、待测样品2、阴性对照。有结果可知，待测样品1含有转基因玉米BT176成份，待测样品2不含有转基因玉米BT176成份。

实施例2

(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；BT176特异性引物混合液；4M BSA溶液；0.2M MgSO4溶液；DNA模板包括阳性对照1、阳性对照2、待测样品1、待测样品2、阴性对照。

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO4 0.25μL，引物混合液1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA 2μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(3)扩增反应程序：在65℃进行45min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；

(4)扩增反应结束，取体系液15μL，直接向扩增管中加入嵌入剂2μL 1000×SYBR Green，振荡混匀，肉眼观察结果。无扩增反应的管子呈橙黄色，有扩增反应的管子将变为绿色。结果见图4。由左向右：阳性对照1、阳性对照2、待测样品1、待测样品2、阴性对照、空白对照。有结果可知，待测样品1和待测样品2都含有转基因玉米BT176成份。

实施例3

(1)试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；BT176特异性引物混合液；4M BSA溶液；0.2M MgSO₄溶液；DNA模板包括阴性对照，待测样品1、待测样品2、阳性对照。

(2)扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO4 0.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(4)扩增反应结束，取体系液5μL，经2％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的管子无明显条带，有扩增反应的管子出现阶梯状条带。结果见图5。由左向右：Marker，空白对照，阴性对照，待测样品1、待测样品2、阳性对照。有结果可知，待测样品1不含有转基因玉米BT176成份，待测样品2含有转基因玉米BT176成份。

实施例4

对比实验：目前转基因玉米BT176的测定方法与本发明测定方法的对比

(1)本方法试剂：BioLabs(NEW ENGLAND)生产的Bst DNA聚合酶大片段和10倍Buffer溶液；BT176特异性引物混合液；4M BSA溶液；0.2M MgSO4溶液；DNA模板包括含有转基因玉米BT176成份5％、1％、0.5％、0.1％、0.05％、0.01％、0.005％、0.001％的样品。

(2)本方法扩增反应体系：扩增反应的总体积为25μL，其各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO4 0.25μL，混合引物1μL，10μM dNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段2μL，模板DNA 5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL，混合均匀后离心；

(3)本方法扩增反应程序：在63℃进行60min，并且在80℃保温2min，4℃，保存；

(4)本方法扩增反应结束，取体系液3μL，经2％琼脂糖凝胶电泳分析，紫外灯下观察结果。无扩增反应的管子无明显条带，有扩增反应的管子出现阶梯状条带。结果见图6：M，DL2000 DNA Marker；1，5％；2，1％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7，0.005％；8，0.001％；9，阴性对照。

(5)PCR反应引物采用本方法反应中一对外引物F3和B3。PCR反应为25μL体系，10×PCR buffer(Promega)2.5μL，10mM dNTPs(Promega)0.5μL，上游和下游引物(10mM)各0.5μL，Taq酶(5U/μL，Promega)0.5μL，DNA模板1μL，灭菌去离子水19.5μL。反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸7min。PCR产物取10μL于2％琼脂糖凝胶电泳，100V电压下40min，通过凝胶成像分析仪观察结果图7：M，DL2000 DNA Marker；1，5％；2，1％；3，0.5％；4，0.1％；5，0.05％；6，0.01％；7，阴性对照。

由两种方法比较可以看出，本发明的方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出BT176含量更低的样品。

附件：常规CTAB法提取转基因玉米BT176 DNA的方法

(1)取转基因玉米BT176约100mg，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎。液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止。

(2)加入1.5mL预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样(依试样不同，可适当增加缓冲液的用量)，65℃保育30min，期间不停颠倒混匀；

(3)约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；

(4)加入1倍体积的氯仿∶异戊醇(24∶1)，充分混合。约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；

(5)加入2倍体积CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清；加入350μL氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10min，转移上清至一新离心管。

(6)加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min。12000g离心15min。弃上清。加入500μL70％乙醇溶液，并颠倒离心管数次。12000g离心10min。弃上清。

(7)干燥DNA沉淀，加100μL水或TE缓冲液溶解DNA。

序列表

<110>天津市农业科学院中心实验室

<120>一种快速检测转基因玉米品系BT176的方法及所用引物

<160>5

<210>1

<211>18bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

cgggaactgg catgacgt 18

<210>2

<211>18bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

gagggagaga gagggagc 18

<210>3

<211>43bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

tctcggtgac gggcaggact tttggtttct ggcagctgga ctt 43

<210>4

<211>44bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

tctcctccat tgatgcacgc cttttggaag ggagaaacgg tcgg 44

<210>5

<211>20bp

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

tcaatggcct tgaagcct tg 20

Claims

1.一套用于检测转基因玉米BT176的特异性引物，其特征在于由以下引物组成：

外引物正向序列：CGGGAACTGGCATGACGT，反向序列：GAGGGAGAGAGAGGGAGC；内引物正向序列：TCTCGGTGACGGGCAGGACTTTTGGTTTCTGGCAGCTGGACTT，反向序列：TCTCCTCCATTGATGCACGCCTTTTGGAAGGGAGAAACGGTCGG，环引物：TCAATGGCCTTGAAGCCTTG。

2.一种采用权利要求1所述特异性引物快速检测转基因玉米BT176的方法，其特征在于：

其中扩增反应的总体积为25μL，各种成分分别为：10×Buffer 2.5μL，4M BSA 6.25μL，0.2M MgSO₄ 0.25μL，引物混合溶液1μL，10μMdNTPs 3.5μL，8000U/L Bst DNA聚合酶大片段1-2μL，模板DNA 1-5μL，用灭菌去离子水补齐到25μL；混合均匀后离心；

(2)扩增反应结束，取体系液3-25μL，采用不同方法判断扩增与否，包括：直接向扩增管中加入嵌入染色剂SYBR Green，通过颜色变化观察有无扩增反应；或评估扩增副产物焦磷酸镁的白色沉淀物来观察有无扩增反应；或通过观察琼脂糖凝胶电泳条带判断扩增结果。

3.如权利要求2所述的检测方法，其中所述的引物混合溶液指的是将合成引物干粉分别配制浓度为100μM的母液，然后取外引物各8μL，内引物各1μL，环引物2μL，充分混合，制得引物混合溶液。

4.如权利要求2所述的检测方法，其中通过加入1-2μL 1000×SYBRGreen判断结果。

5.如权利要求2所述的检测方法，其中的模板DNA指的样品采用CTAB法提取纯化得到的DNA，体积为1-5μL。