CN102634591B - 转基因水稻bt63及其衍生品种的lamp检测引物组、检测试剂盒及检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。检测引物组包括四条特异性引物；检测试剂盒包括引物液、反应液、DNA聚合酶和对照；试剂盒还可以有显色剂。其检测方法是通过提取待检水稻品种的DNA、采用四条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对样品DNA模板进行扩增，短时间扩增效率可达到109～1010个拷贝，其鉴定采用加入SYBRGreenI观察颜色变化或者利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化判断扩增与否，确定待检水稻品种是否含有或为转基因水稻BT63及其衍生品种。本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等优点，适于推广应用。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物品种的检测方法，具体涉及转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法。
背景技术
国际农业生物技术应用服务组织近期发表的《2010年全球生物技术/转基因作物商业化发展态势》报告显示，由于转基因作物带来的巨大益处，过去15年内大约有1亿人次的农民做出种植决定。自转基因作物投入商业化种植15年来，全球转基因作物种植面积累计已经超过10亿公顷。2010年，全球29个国家的1540万农民种植了共1.48亿公顷的转基因作物。自1996年至2010年，全球转基因作物的种植面积增加了87倍。种植转基因作物排名前十位的国家种植面积首次均超过了100万公顷。这些国家按照作物种植面积的大小排列分别是：美国（6680万公顷）、巴西（2540万公顷）、阿根廷（2290万公顷）、印度（940万公顷）、加拿大（880万公顷）、中国（350万公顷）、巴拉圭（260万公顷）、巴基斯坦（240万公顷）、南非（220万公顷）和乌拉圭（110万公顷）。目前，世界各国已进行田间试验的转基因作物超过5000种，批准商品化的转基因作物有160多种，包括玉米、大豆、油菜、番茄、马铃薯、甜椒、木瓜、甜菜、烟草、水稻等。
水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，全球约三分之一以上的人口以水稻为主食。 同时，水稻也是受害虫侵袭最为严重的粮食作物之一. 据不完全统计，全世界每年因虫害造成的损失占水稻总产量的5%以上，约为1×106 t 。特别是近年来，二化螟等蛀茎害虫的发生逐年加重，对水稻生产造成严重威胁。传统化学防治方法的长期使用，不但增加生产成本，造成环境污染，而且破坏了生态平衡，因此选育抗虫水稻是防治害虫最经济、有效的方法，随着植物细胞生物学和分子生物学的发展，利用基因工程将外源抗虫基因导入水稻，使水稻自身产生抗虫蛋白从而达到防治害虫的目的已成为现实。
目前，国内外已培育出多个高抗水稻螟虫（Cnapha locrocis medinalis）的转抗虫基因材料，如转Bt基因水稻。Bt基因是一种革兰氏阳性芽抱细菌苏云菌杆菌（Bacillus thuringiertsis Bt）杀虫晶体蛋白基因的简称，目前Bt基因已成为植物基因工程及转基因育种应用中最广泛的抗虫基因。但是由于转入的外源基因并非来自传统的基因库，转抗虫基因植物可能带来生态效应和环境风险问题已成为国际社会关注的焦点。
1993年，联合国经济发展与合作组织（OECO）提出了食品安全性评估的“实质等同性”原则。如果准基因作物生产的产品与传统产品具有实质等同性，则可以认为是安全的。最早提出对转基因食品进行标识管理的是欧盟，1998年，欧盟在世界上签署第一个法案，要求对转基因产品进行标签说明；1999年，要求出口到欧盟的非转基因产品不得含有1%的转基因产品污染；2002年，欧盟将标识的最低限量降低到0.9%。日本，澳大利亚，新西兰对转基因成分的最低含量做了不同规定，域值从1～5%不等。
我国于2001年5月9日公布并实施《农业转基因生物安全管理条例》，于2002年1月5日公布了农业转基因生物安全评价，标识和进口安全管理三个配套管理办法，确定了第一批实施标识管理的农业转基因生物目录，并于2002年3月20日起正式实施。
为了能够对转基因作物及其产品做出综合评价，除了需要各国政府和国际机构制定科学的安全评价体系以及严格的管理法规外，建立有效的方法体系对转基因作物进行检测也很重要，这是对转基因作物进行安全性评价和实施监管的基础，也是农产品国际贸易健康发展的重要保障。
转基因产品的检测要求方法要快速，准确，灵敏，并且还得考虑适应大样品量，目标基因种类多等特点。因此，目前转基因作物的检测主要是检测样品是否含有外源蛋白质（基因表达产物）和是否含有外源基因（DNA）。转基因作物中外源蛋白可以利用基于免疫原理的酶联免疫吸附法（ELISA）试纸条检测、Western杂交等方法检测，主要从待测样品中按照一定的程序抽提含有目的蛋白的基质，利用与目的蛋白（抗原）特异性结合的特性，通过偶联抗体与抗原抗体复合物的作用产生可检测的信号，但是这种方法要求高质量高稳定性的抗体，否则因准确性不够，只能作为辅助检测手段。转基因作物的核酸检测方法主要有两种：核酸分子杂交技术(Sourthernblot)，PCR检测技术。其中PCR检测方法是最主要，最准确地检测转基因作物的方法，包括定性PCR方法，符合PCR方法，巢式PCR方法，竞争性定量PCR方法，荧光定量PCR方法等等。
目前，国内外推广使用的是定性PCR和实时定量PCR检测方法：PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。通过聚合酶的作用，在体外快速特异地扩增目的片段，使微量、特定目的DNA片段在几小时内迅速扩增到百万倍，扩增产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后很容易观察，因而具有快速灵敏等优点。然而，PCR方法反应体系和操作过程比较复杂，需要专业人员；所需PCR仪价格在5万元左右，扩增时间2～3小时，扩增结果的电泳时间需要1小时左右；电泳常用染料EB为强致癌物质，有较强毒性，且难以实行现场检测。所以，在科学研究和生产实践中均需要一种快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠且适用于现场操作的转基因作物检测方法。
环介导等温基因扩增技术（Loop-Mediated Isothermal Amplification，以下简称LAMP法）是日本荣研化学株式会社于2000年前后开发出的基因扩增技术，其具有快速简便、操作准确、容易普及、安全可靠的优点，目前尚未有将LAMP法应用于快速检测转基因水稻BT63及其衍生品种的试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测引物组。
本发明的另目的在于提供一种转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于提供一种基于上述检测引物组及检测试剂盒的转基因水稻BT63及其衍生品种的恒温基因扩增检测方法。
本发明所采用的技术方案如下：
转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测引物组，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物1：TCTTGCCCGGCGTCAAT（SEQ ID No：1）；
外引物2：TTCGTAGCCCCACCACTAC（SEQ ID No：2）；
内引物1：TTGACTGGAGCGAGGCGATGGGATAATACCGCGCCACAT（SEQ ID No：3）；
内引物2：GACCGCTGTTATGCGGCCATTCCTCTAGAGTCGACCTGC（SEQ ID No：4）。
转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括以下成分：
（1）引物液：含有上述的检测引物组，浓度分别为4～6μM外引物1、4～6μM外引物2，32～48μM内引物1、32～48μM内引物2；
（2）反应液：含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是7～9：4～6：2；
（3）DNA聚合酶：浓度为7～9U/μl；
（4）对照：阳性对照为转基因水稻BT63的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
优选的，所述引物液中含有5μM外引物1、5μM外引物2，40μM内引物1、40μM内引物2。
优选的，所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl。
优选的，所述反应液中，10mM dNTP：10×ThermoPol反应缓冲液：150mM MgSO4＝8：5：2体积比。
本发明的转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为荧光染料SYBRGreen I。
利用以上所述的试剂盒检测转基因水稻BT63及其衍生品种的方法，包括如下步骤：
（1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化样品DNA；
（2）恒温基因扩增反应：在200ul PCR管配制反应体系：引物液1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 2～5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用转基因水稻BT63的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应60～90min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。
在试剂盒中含有显色剂的情况下，在（2）得到的产物中加入1～2μl显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。
其中，CTAB法提取转基因水稻BT63 DNA的方法为：
（1）取转基因水稻BT63约100mg，放入研钵中，加入少量液氮迅速磨碎，液氮反复加入3～4次，磨碎成粉末为止；
（2）加入1.5ml预热至65℃的CTAB提取缓冲液，充分混合、悬浮试样，65℃保育30min，期间不停颠倒混匀；
（3）约12000g离心10min。转移上清至一新离心管，加入1倍体积的苯酚：氯仿：异戊醇（25:24:1），充分混合，约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
（4）加入1倍体积的氯仿：异戊醇（24:1），充分混合，约12000g离心15min。转移上清至一新离心管中；
（5）加入2倍体积的CTAB沉淀缓冲液，室温静置保育60min；12000g离心15min，弃上清；加入350μl氯化钠溶液溶解沉淀；12000g离心10min，转移上清至一新离心管；
（6）加入0.6倍体积异丙醇，倒置离心管轻柔混合，室温放置20min，12000g离心15min，弃上清，加入500μl70%乙醇溶液，并颠倒离心管数次，12000g离心10min，弃上清；
（7）干燥DNA沉淀，加100μlTE缓冲液溶解DNA。
本发明基于环介导等温扩增技术（LAMP法），根据靶基因设计的四条引物能特异性识别靶基因序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎－环DNA混合物。采用4条特异性引物及一种具有链置换活性的DNA聚合酶，在63～65℃对核酸进行扩增反应，反应需在恒温条件下进行，反应时间依据模板DNA质量变化，一般为90min或更少，在60～90min的短时间内扩增效率可以达到109～1010个拷贝数。加入模板DNA，在63～65℃经60～90min反应后，在80℃持续2min后终止。这项技术的优点是不需要热循环，且由于扩增是在恒温条件下进行，因此不需要PCR仪等昂贵仪器。在反应中，在核酸大量合成时，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中Mg离子结合，产生副产物焦磷酸镁的白色沉淀。
本发明具有快速高效、操作简便、高特异性、高灵敏度、鉴定简便、适合现场检测等有益效果：
（1）快速高效：整个扩增只用60～90min即可完成，扩增产量可达109～1010个拷贝；
（2）操作简便：不需要复杂的仪器，不需要特殊试剂，不需要预先进行双链DNA的变性等繁琐步骤，只需要一部恒定温度仪就能反应和检测，条件比较温和；
（3）高特异性：本发明根据转基因水稻BT63的外源基因与内源基因结合处设计了四条特异性引物，应用上述四条引物，扩增靶序列的6个区域，具有很强的品系特异性，且非常稳定，形成引物二聚体概率低，保证了反应的顺利进行；
（4）高灵敏度：最低检测极限可达到10个拷贝；
（5）鉴定简便：可通过观察观察加入SYBR Green I颜色变化或者是否存在焦磷酸镁沉淀来判断扩增与否，无需电泳等其他任何分析步骤，适合现场检测。
附图说明
图1是实施例1的检测结果图（1-4：待检样品；5：阳性对照；6：阴性对照）；
图2是实施例2的检测结果图（1、2：待检样品；3：阴性对照，4：阳性对照）；
图3是实施例3的检测结果图（1-6依次为：5%、0.5%、0.1%、005%、0.01%、0.005%的样品DNA，7：阴性对照：8：阳性对照）；
图4是实施例4的检测结果图（1-20依次为：转基因水稻：BT63、LLRICE601、LLRICE62、科丰6号、克螟稻，转基因玉米BT176，转基因大豆MON89788，转基因土豆EH92-527-1，转基因油菜T45，转基因棉花GHB614，非转基因水稻：日本晴、珍汕97、明恢63、合江19、9311，非转基因玉米、小麦、油菜、棉花、烟草）。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明作进一步的说明，但并不局限于此。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
如无特殊说明，以下实施例中的“%”均指质量百分比。
实施例1 含显色剂的试剂盒及其检测方法：
转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测试剂盒，包括引物液、反应液、DNA聚合酶、对照和显色剂：
（1）引物液：含有5μM外引物1、5μM外引物2，40μM内引物1、40μM内引物2，四条引物为：
外引物1：TCTTGCCCGGCGTCAAT（SEQ ID No：1）
外引物2：TTCGTAGCCCCACCACTAC（SEQ ID No：2）
内引物1：TTGACTGGAGCGAGGCGATGGGATAATACCGCGCCACAT（SEQ ID No：3）
内引物2：GACCGCTGTTATGCGGCCATTCCTCTAGAGTCGACCTGC（SEQ ID No：4）
（2）反应液：含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2；
（3）DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；
（4）对照：阳性对照为浓度为5%的转基因水稻BT63的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
（5）显色剂：荧光染料 1×SYBR Green I。
用上述试剂盒按以下方法对待测水稻品种进行检测：
（1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；
（2）恒温基因扩增反应：在200ul PCR管配制反应体系：引物液1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用浓度为5%的转基因水稻BT63的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于65℃反应60min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：在上述反应管中加入2μl显色剂，混匀，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。
本实施例中，阴性对照显现橙色，阳性对照显现绿色，待检样品1、2的PCR管显绿色（图1中管1、2），表明待检水稻样品1、2中含有或全部为转基因水稻BT63及其衍生品种，含有转基因水稻BT63成分，待检样品3、4的PCR管显橙色（图1中管3、4），则表明待检样品3、4中不含转基因水稻BT63成分。
参照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed中检测BT63品系的引物T51F：GACTGCTGGAGTGATTATCGACAGA（SEQ ID No：5），T51R：AGCTCGGTACCTCGACTTATTCAG（SEQ ID No：6）和探针：FAM-TCGAGTTCATTCCAGTTACTGCAACACTCGAG-TAMRA（SEQ ID No：7）进行荧光定量PCR检验，检验结果与上述LAMP方法结果一致。
实施例2 不含显色剂的试剂盒及其检测方法：
试剂盒中除缺少实施例1中的显色剂外，其余同实施例1。
用上述试剂盒按以下方法对待测水稻品种进行检测：
（1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化待测样品DNA；
（2）恒温基因扩增反应：在200ul PCR管配制反应体系：引物液1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用浓度为5%的转基因水稻BT63的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于65℃反应60min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：将反应管放置在浊度仪中按（2）中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，如果出现沉淀则为阳性，无沉淀则为阴性。
本实施例中，阴性对照无沉淀，阳性对照产生沉淀，待检样品1的PCR管出现沉淀（图2管1），表明待检水稻样品1中含有或全部为转基因水稻BT63及其衍生品种，含有转基因水稻BT63成分。待检样品2的PCR管没有出现沉淀（图2管2），表明待检样品2中不含转基因水稻BT63成分。
参照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed中检测BT63品系的引物T51F：GACTGCTGGAGTGATTATCGACAGA（SEQ ID No：5），T51R：AGCTCGGTACCTCGACTTATTCAG（SEQ ID No：6）和探针：FAM-TCGAGTTCATTCCAGTT ACTGCAACACTCGAG-TAMRA（SEQ ID No：7）进行荧光定量PCR检验，检验结果与上述LAMP方法结果一致。
实施例3 PCR反应与本发明检测方法灵敏度的比较：
按下列配方制备转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测试剂盒：
（1）引物液：含有5μM外引物1、5μM外引物2，40μM内引物1、40μM内引物2，四条引物为：
外引物1：TCTTGCCCGGCGTCAAT（SEQ ID No.1）
外引物2：TTCGTAGCCCCACCACTAC（SEQ ID No.2）
内引物1：TTGACTGGAGCGAGGCGATGGGATAATACCGCGCCACAT（SEQ ID No.3）
内引物2：GACCGCTGTTATGCGGCCATTCCTCTAGAGTCGACCTGC（SEQ ID No.4）
（2）反应液：含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是8：5：2；
（3）DNA聚合酶：Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl；
（4）对照：阳性对照为浓度为5%的转基因水稻BT63的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液；
（5）显色剂：荧光染料 1×SYBR Green I。
用上述试剂盒按以下方法对转基因水稻BT63进行检测：
（1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化待测样品DNA，分别稀释成5%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%的样品DNA；
（2）恒温基因扩增反应：在200ul PCR管配制反应体系：引物液1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 2μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用浓度为5%的转基因水稻BT63的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于65℃反应60min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：将反应管放置在浊度仪中按（2）中步骤反应，观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，如果出现沉淀则有扩增，无沉淀则无扩增。也可以在（2）中得到产物中加入1μl显色剂，混匀，肉眼观察。无扩增反应的管子呈现黄色，有扩增反映的管子变成绿色。
本实施例中，阳性对照、5%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%均出现沉淀显示为有扩增，阴性对照无沉淀显示为无扩增；加入显色剂后，阳性对照、5%、0.5%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%的PCR管显绿色，阴性对照管子呈现黄色（见图3）。
PCR反应引物采用本方法反应中的外引物1和外引物2。PCR反应为25μl体系，10×PCR Buffer（PCR反应缓冲液，Promega公司）2.5μl，10mM dNTPs （Promega公司）0.5μl，上、下游引物分别对应外引物1和外引物2，各0.5μl，Taq酶（5U/μl ，Promega公司）0.5μl，DNA模板1μl，用灭菌去离子水补至25μl。反应程序为95℃预变性5min，95℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸30s，72℃延伸7min。PCR产物取10μl与2%琼脂糖凝胶电泳，100V电压下40min，通过凝胶成像分析仪观察结果，.对应条带分别为：M，DL600 DNA Marker（DNA分子量标准，最大DNA片段为600碱基对）； 1，阳性对照； 2，5%； 3，0.5%； 4，0.1%； 5，0.05%； 6，0.01%； 7，0.005%； 8，阴性对照。其中PCR方法的灵敏度为0.05%，而6，7显示为阴性结果。
由两种方法比较可以看出，本发明的试剂盒的灵敏度的结果可以达到0.005%的浓度，而PCR方法的灵敏度为0.05%，而0.01%或以下显示为阴性结果；经比对，本发明的试剂盒及方法灵敏度明显高于PCR方法的敏感度，能检测出更低含量的样品。
实施例4 特异性实验
用实施例1的鉴定方法分别对分离纯化的转基因水稻：BT63、LLRICE601、LLRICE62、科丰6号、克螟稻，转基因玉米BT176，转基因大豆MON89788，转基因土豆EH92-527-1，转基因油菜T45，转基因棉花GHB614，非转基因水稻：日本晴、珍汕97、明恢63、合江19、9311，非转基因玉米、小麦、油菜、棉花、烟草进行鉴定，同时参照EU Reference Laboratory for GM Food and Feed中检测BT63品系的引物T51F：GACTGCTGGAGTGATTATCGACAGA（SEQ ID No：5），T51R：AGCTCGGTACCTCGACTTATTCAG（SEQ ID No：6）和探针T51p：FAM-TCGAGTTCATTCCA GTTACTGCAACACTCGAG-TAMRA（SEQ ID No：7）进行荧光定量PCR检验。
鉴定结果显示：转基因水稻：LLRICE601、LLRICE62、科丰6号、克螟稻，转基因玉米BT176，转基因大豆MON89788，转基因土豆EH92-527-1，转基因油菜T45，转基因棉花GHB614，非转基因水稻：日本晴、珍汕97、明恢63、合江19、9311，非转基因玉米、小麦、油菜、棉花、烟草反应管均为橙色，即无扩增；转基因水稻BT63的反应管为绿色，即有扩增（见图4）。本结果与EU Reference Laboratory for GM Food and Feed中的荧光定量PCR结果相一致，显示出良好的特异性。
<110> 广州迪澳生物科技有限公司
<120> 转基因水稻BT63及其衍生品种的LAMP检测引物组、检测试剂盒及检测方法
<130>
<150> CN201210017348.2
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<160> 7
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 1
tcttgcccgg cgtcaat 17
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<212> DNA
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<212> DNA
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ttgactggag cgaggcgatg ggataatacc gcgccacat 39
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 4
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 6
agctcggtac ctcgacttat tcag 24
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<211> 32
<212> DNA
<213> 人工引物
<400> 7
tcgagttcat tccagttact gcaacactcg ag 32
Claims (8)
1.转基因水稻BT63的LAMP检测引物组，包括外引物1和外引物2、内引物1和内引物2，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物1：TCTTGCCCGGCGTCAAT（SEQ ID No：1）；
外引物2：TTCGTAGCCCCACCACTAC（SEQ ID No：2）；
内引物1：TTGACTGGAGCGAGGCGATGGGATAATACCGCGCCACAT（SEQ ID No：3）；
内引物2：GACCGCTGTTATGCGGCCATTCCTCTAGAGTCGACCTGC（SEQ ID No：4）。
2.转基因水稻BT63的LAMP检测试剂盒，包括以下成分：
（1）引物液：含有权利要求1所述的引物组，浓度分别为4～6μM外引物1、4～6μM外引物2，32～48μM内引物1、32～48μM内引物2；
（2）反应液：含有10mM dNTP、10×ThermoPol反应缓冲液、150mM MgSO4水溶液，三者的体积比是7～9：4～6：2；
（3）DNA聚合酶：浓度为7～9U/μl；
（4）对照：阳性对照为转基因水稻BT63的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA，阴性对照为不含目的基因的反应混合液。
3.根据权利要求2所述的转基因水稻BT63的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述引物液中含有5μM外引物1、5μM外引物2，40μM内引物1、40μM内引物2。
4.根据权利要求2所述的转基因水稻BT63的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8U/μl。
5.根据权利要求2所述的转基因水稻BT63的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述反应液中，10mM dNTP：10×ThermoPol反应缓冲液：150mM MgSO4水溶液＝8：5：2体积比。
6.利用权利要求2～5任一项所述的试剂盒检测转基因水稻BT63的方法，包括如下步骤：
（1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化样品DNA；
（2）恒温基因扩增反应：在200μl PCR管配制反应体系：引物液1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 2～5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用转基因水稻BT63的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应60～90min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：通过观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果。
7.根据权利要求2～5任一项所述的LAMP检测试剂盒，其特征在于：还含有显色剂, 所述显色剂为荧光染料SYBRGreen I。
8.利用权利要求7所述的试剂盒检测转基因水稻BT63的方法，包括如下步骤：
（1）待检样品DNA的提取：采用CTAB法提取纯化样品DNA；
（2）恒温基因扩增反应：在200μl PCR管配制反应体系：引物液1μl，反应液 12.5μl，DNA聚合酶1μl，待检DNA 2～5μl，用灭菌去离子水补齐到25μl；设置阳性对照反应时，用转基因水稻BT63的DNA或含目的基因的大肠杆菌质粒DNA替代待检DNA，设置阴性对照反应时，用不含目的基因的反应混合液替代待检DNA；将配制好的PCR管混匀后离心，并于63～65℃反应60～90min，并在80℃持续2min；
（3）结果判断：在反应管中加入1～2μl显色剂，混匀，根据显色结果来判断扩增结果。
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Free format text: CORRECT: INVENTOR; FROM: YE YUXIN LIU JIN GAO DONGWEI WU SHAOYUN XIAO YANWEN SHI LEI TO: YE YUXIN YI MINYING LIU JINGYU WU SHAOYUN XIAO YANWEN SHI LEI |
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