CN103924000B - 转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 - Google Patents
转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103924000B CN103924000B CN201410176842.2A CN201410176842A CN103924000B CN 103924000 B CN103924000 B CN 103924000B CN 201410176842 A CN201410176842 A CN 201410176842A CN 103924000 B CN103924000 B CN 103924000B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- primer
- dna
- detection
- μmol
- cry3a gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 101150102059 cry3Aa gene Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 38
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 16
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 91
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 53
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims abstract description 43
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 41
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 claims abstract description 11
- 238000006073 displacement reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 5
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims description 27
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims description 27
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 26
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 16
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 13
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 12
- 239000013642 negative control Substances 0.000 claims description 11
- 239000013641 positive control Substances 0.000 claims description 8
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N Betaine Natural products C[N+](C)(C)CC([O-])=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O N,N,N-trimethylglycinium Chemical compound C[N+](C)(C)CC(O)=O KWIUHFFTVRNATP-UHFFFAOYSA-O 0.000 claims description 6
- 229960003237 betaine Drugs 0.000 claims description 6
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 4
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 claims description 4
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 claims description 4
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 claims description 4
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 claims description 4
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 3
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 claims description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 abstract description 13
- 108700023863 Gene Components Proteins 0.000 abstract description 5
- 239000012916 chromogenic reagent Substances 0.000 abstract description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 abstract description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 16
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 16
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 15
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 14
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 14
- 108091040857 miR-604 stem-loop Proteins 0.000 description 10
- 235000003869 genetically modified organism Nutrition 0.000 description 6
- 101150065438 cry1Ab gene Proteins 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 239000010413 mother solution Substances 0.000 description 4
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 4
- 101100114760 Bacillus thuringiensis cry3Bb gene Proteins 0.000 description 3
- 101100497219 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki cry1Ac gene Proteins 0.000 description 3
- 101100275683 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki cry2Ab gene Proteins 0.000 description 3
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 3
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 3
- 238000007397 LAMP assay Methods 0.000 description 3
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 3
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 2
- 235000004977 Brassica sinapistrum Nutrition 0.000 description 2
- 241000219146 Gossypium Species 0.000 description 2
- 240000007594 Oryza sativa Species 0.000 description 2
- 235000007164 Oryza sativa Nutrition 0.000 description 2
- 108020005120 Plant DNA Proteins 0.000 description 2
- 235000016383 Zea mays subsp huehuetenangensis Nutrition 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000008676 import Effects 0.000 description 2
- 235000009973 maize Nutrition 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 235000009566 rice Nutrition 0.000 description 2
- LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M Cetrimonium bromide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C LZZYPRNAOMGNLH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004544 DNA amplification Effects 0.000 description 1
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 1
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 235000007688 Lycopersicon esculentum Nutrition 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 240000003768 Solanum lycopersicum Species 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 244000037671 genetically modified crops Species 0.000 description 1
- 239000004009 herbicide Substances 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000007859 qualitative PCR Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011895 specific detection Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开了一种转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法。引物组由5条特异性引物组成，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1~5所示。检测试剂盒包括检测引物溶液、环引物溶液、具有链置换活性的DNA聚合酶、10×反应缓冲液、dNTPs溶液、阳性DNA对照和阴性DNA对照，试剂盒还可以含有显色剂。检测方法是采用特异性引物及具有链置换活性的DNA聚合酶，在63~65℃对样品DNA模板进行扩增，并采用加入显色剂观察颜色变化或直接观察反应管内沉淀的浊度变化等方法，判断样品是否含有cry3A基因成分。本发明不需要特殊仪器，具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，适合现场检测。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学技术领域，涉及转基因植物及其产品的检测方法，具体涉及一种利用环介导等温扩增技术（LAMP）快速检测转基因植物中cry3A基因的引物组、试剂盒和检测方法。
背景技术
2013年全球转基因作物种植面积高达1.752亿公顷，比1996年商业化初期增长了100余倍。目前商业化种植的转基因作物主要有大豆、玉米、棉花、油菜，主要性状为抗虫、抗除草剂。在抗虫转基因植物中应用的目的基因有cry1Ab、cry1Ac、cry1A.105、cry1F、cry2Ab、cry3A、cry3Bb、vip3A、cry9C等，其中cry3A基因存在于转基因玉米MIR604中，已获准在美国、欧盟、澳大利亚、俄罗斯、韩国、南非等近20个国家和地区商业化种植或作为食品和饲料，我国也在2008年批准转基因玉米MIR604进口用作加工原料。
为加强转基因生物及其产品的安全管理，全球50多个国家和地区制订了转基因生物标识制度。我国于2001年相继颁布实施了《农业转基因生物安全管理条例》及安全评价、标识管理、进口安全、加工审批等一系列配套管理办法，对转基因生物进行全产业链监管，要求对转基因玉米、大豆、油菜、棉花、番茄等5类17种产品实施强制性标识管理制度。
转基因检测技术是转基因生物安全管理的重要技术支撑。目前转基因检测技术主要分为两大类：一类以外源DNA为检测对象，如PCR、基因芯片等，另一类以外源基因表达的蛋白质为检测对象，如ELISA、免疫试纸条等。在上述方法中，PCR方法应用最为广泛，但基于PCR技术的转基因检测方法需要PCR仪、凝胶成像系统等专业仪器设备，且扩增和产物检测时间较长（约3~4 h），难以实现现场快速检测，因此，在实际工作中需要一种更加便捷、准确、且适用于现场操作的转基因检测新技术。
LAMP技术是由日本荣研化学株式会社在2000年开发的一种新的基因扩增技术，该技术的基本特点是：①恒温扩增：整个扩增反应在恒温条件（60~65℃）进行，不需要特殊仪器设备；②快速高效：整个扩增和产物检测可在1 h内完成；③高特异性：针对靶标序列的6个区域设计4条检测引物，扩增特异性高；④高灵敏度：检测极限可低至10个拷贝或更低；⑤鉴定简便：扩增产物有多种鉴定方法，如肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化、加入染料观察颜色变化等。
LAMP方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等特点，不需要特殊仪器，适合现场快速检测，在转基因植物检测领域具有广阔的应用前景。目前尚未有利用LAMP方法检测转基因植物中cry3A基因的检测方法和试剂盒。
发明内容
本发明的一个目的在于公开一种转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组。
本发明的另一个目的在于公开一种转基因植物中cry3A基因的LAMP检测试剂盒。
本发明的另一个目的在于公开一种基于上述引物组和试剂盒检测转基因植物中cry3A基因的LAMP检测方法。
本发明所采用的技术方案如下：
根据cry3A基因的核苷酸序列，设计cry3A基因的LAMP检测引物组，其核苷酸序列如SEQ ID NO: 1~5；确定LAMP检测方法的技术参数，并对检测方法的特异性、灵敏度进行验证。
转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2、环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物1：AAGCCCCACCTGTTCGA（SEQ ID NO：1）；
外引物2：GGCTCGCTGCTCTTGTTG（SEQ ID NO：2）；
内引物1：AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC（SEQ ID NO：3）；
内引物2：GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA（SEQ ID NO：4）；
环引物：GGGCTGGAAACGCGTGT（SEQ ID NO：5）。
转基因植物中cry3A基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：
（1）检测引物溶液：由2条外引物和2条内引物配制的检测引物溶液，外引物1、外引物2、内引物1和内引物2的浓度依次为4~6 μmol/L、4~6 μmol/L、32~48 μmol/L和32~48 μmol/L；
（2）环引物溶液：环引物浓度为16~24 μmol/L；
（3）具有链置换活性的DNA聚合酶：浓度为7~9 U/μL；
（4）10×反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，40~100 mmol/L MgSO4，6~14 mol/L甜菜碱；
（5）dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
（6）阳性DNA对照样品，转cry3A基因植物的基因组DNA，或含有cry3A基因序列的大肠杆菌质粒DNA；
（7）阴性DNA对照样品：不含cry3A基因序列的DNA。
优选的，所述的检测引物溶液中含有5 μmol/L外引物1、5 μmol/L外引物2、40 μmol/L内引物1、40 μmol/L内引物2。
优选的，所述的环引物溶液中含有20 μmol/L环引物。
优选的，所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μL。
优选的，所述的10×反应缓冲液中MgSO4、甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L和8 mol/L。
本发明的cry3A基因的LAMP检测试剂盒中还可以含有显色剂，所述显色剂为SYBR GREEN I荧光染料。
利用以上所述的试剂盒检测cry3A基因的方法，包括如下步骤：
（1）提取待测样品的基因组DNA：按常规CTAB方法或植物基因组DNA提取试剂盒提取待测样品的基因组DNA；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200 μL PCR反应管内加入模板DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5 μL、环引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液3 μL，用灭菌去离子水补齐到25 μL；
（3）配制对照样品的LAMP检测反应体系：配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤（2）一致；
（4）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；
（5）LAMP扩增结果的鉴定：通过肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果，或取2~5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果。
在试剂盒中含有显色剂的情况下，在步骤（4）后获得的LAMP扩增产物中加入1~2 μL 显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。
通过实验证明，本发明提供的cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法具有快速高效、操作简便、特异性强、灵敏度高等优点。
附图说明
图1为实施例1的LAMP检测结果图，1为阳性对照样品，2为阴性对照样品，3、4为待测样品；
图2为实施例2的LAMP检测结果图，1为阳性对照样品，2为阴性对照样品，3、4为待测样品；
图3是实施例3中进行特异性检测的结果图，1~15依次为转基因玉米MON89034、MON810、Bt11、Bt176，转基因棉花MON531、MON15985，转基因水稻KF-6、TT51-1，转基因玉米MON863、MON88017、MIR604、TC1507、59122、非转基因玉米阴性对照、空白对照；
图4和图5是实施例4中进行灵敏度检测的结果图，1~7依次为转基因玉米MIR604质量分数分别为100%、10%、1%、0.1%、0.05%、0..02%、0.01%的测试样品，8为非转基因玉米样品，M为DNA分子量Marker。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
实施例1 不含显色剂的试剂盒及其检测方法：
按下列配方制备cry3A基因的LAMP检测试剂盒：
（1）检测引物溶液：合成外引物1、外引物2、内引物1和内引物2，将引物干粉用灭菌去离子水分别配成浓度为100 μmol/L的母液，然后取7.5 μL外引物1、7.5 μL外引物2、60 μL内引物1、60 μL内引物2、15 μL灭菌去离子水，充分混匀配成150 μL的cry3A基因的LAMP检测引物溶液，其中引物序列分别为：
外引物1：AAGCCCCACCTGTTCGA（SEQ ID NO：1）；
外引物2：GGCTCGCTGCTCTTGTTG（SEQ ID NO：2）；
内引物1：AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC（SEQ ID NO：3）；
内引物2：GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA（SEQ ID NO：4）；
（2）环引物溶液：合成环引物，将引物干粉用灭菌去离子水配成浓度为100 μmol/L的母液，然后取20 μL环引物、80 μL灭菌去离子水，充分混匀配成100 μL的cry3A基因的LAMP环引物溶液，其中引物序列为：
环引物：GGGCTGGAAACGCGTGT（SEQ ID NO：5）；
（3）Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μL；
（4）10×反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，80 mmol/L MgSO4，8 mol/L甜菜碱；
（5）dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
（6）阳性DNA对照样品，转cry3A基因植物的基因组DNA，或含有cry3A基因序列的大肠杆菌质粒DNA；
（7）阴性DNA对照样品：不含cry3A基因序列的DNA。
用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：
（1）提取待测样品的基因组DNA：采用北京天根公司生产的植物DNA提取试剂盒方法，提取待测样品的基因组DNA；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200 μL PCR反应管内加入模板DNA 2 μL、检测引物溶液1.5 μL、环引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液3 μL，用灭菌去离子水补齐到25 μL；
（3）配制对照样品的LAMP检测反应体系：配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤（2）一致；
（4）将反应管放置在浊度仪中，运行LAMP扩增反应：63℃孵育40min，80℃孵育5min终止反应；
（5）LAMP扩增结果的鉴定：利用实时浊度仪（日本荣研公司）观察反应管内沉淀的浊度变化（反映为实时扩增曲线）来判断扩增结果。
本实施例中，阳性对照有沉淀产生（出现典型扩增曲线），阴性对照无沉淀产生（无典型扩增曲线）；待测样品1的反应管出现沉淀，表明含有cry3A基因成分；待测样品2的反应管未出现沉淀，表明不含有cry3A基因成分。
实施例2 含显色剂的试剂盒及其检测方法
按下列配方制备cry3A基因的LAMP检测试剂盒：
（1）检测引物溶液：合成外引物1、外引物2、内引物1和内引物2，将引物干粉用灭菌去离子水分别配成浓度为100 μmol/L的母液，然后取7.5 μL外引物1、7.5 μL外引物2、60 μL内引物1、60 μL内引物2、15 μL灭菌去离子水，充分混匀配成150 μL的cry3A基因的LAMP检测引物溶液，其中引物序列分别为：
外引物1：AAGCCCCACCTGTTCGA（SEQ ID NO：1）；
外引物2：GGCTCGCTGCTCTTGTTG（SEQ ID NO：2）；
内引物1：AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC（SEQ ID NO：3）；
内引物2：GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA（SEQ ID NO：4）；
（2）环引物溶液：合成环引物，将引物干粉用灭菌去离子水配成浓度为100 μmol/L的母液，然后取20 μL环引物、80 μL灭菌去离子水，充分混匀配成100 μL的cry3A基因的LAMP环引物溶液，其中引物序列为：
环引物：GGGCTGGAAACGCGTGT（SEQ ID NO：5）；
（3）Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μL；
（4）10×反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl (pH 8.8)，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，80 mmol/L MgSO4，8 mol/L甜菜碱；
（5）dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
（6）阳性DNA对照样品，转cry3A基因植物的基因组DNA，或含有cry3A基因序列的大肠杆菌质粒DNA；
（7）阴性DNA对照样品：不含cry3A基因序列的DNA；
（8）显色剂：1000×SYBR GREEN I荧光染料。
用上述试剂盒按以下方法对待测样品进行检测：
（1）提取待测样品的基因组DNA：采用北京天根公司生产的植物DNA提取试剂盒方法，提取待测样品的基因组DNA；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200 μL PCR反应管内加入模板DNA 2 μL、检测引物溶液1.5 μL、环引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液3 μL，用灭菌去离子水补齐到25 μL；
（3）配制对照样品的LAMP检测反应体系：配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤（2）一致；
（4）将反应管放置在恒温水浴锅中，运行LAMP扩增反应：63℃孵育40min，80℃孵育5min终止反应；
（5）LAMP扩增结果的鉴定：在LAMP扩增产物中加入2 μL的显色剂，混匀，若反应管显现绿色则为阳性，若显现橙色则为阴性。
本实施例中，阳性对照显现绿色，阴性对照显现橙色；待测样品1的反应管显现绿色，表明含有cry3A基因成分；待测样品2的反应管显现橙色，表明不含有cry3A基因成分。
实施例3 试剂盒及检测方法的特异性实验
对实施例2所述的试剂盒及其检测方法的特异性进行实验，测试样品包括：转基因玉米MIR604（cry3A）、MON89034（cry1A.105、cry2Ab）、MON810（cry1Ab）、Bt11（cry1Ab）、Bt176（cry1Ab）、MON863（cry3Bb）、MON88017（cry3Bb）、TC1507（cry1F）、59122（cry34Ab、cry35Ab）、转基因棉花MON531（cry1Ac）、MON15985（cry1Ac、cry2Ab）、转基因水稻KF-6（cry1Ab）、TT51-1（cry1Ab/Ac）等13种抗虫转基因作物，以及非转基因玉米。
本实施例中，仅含有cry3A基因的转基因玉米MIR604样品反应管显现绿色，表明本发明所述的试剂盒及检测方法对cry3A基因具有很好的特异性。
实施例4 试剂盒及检测方法的灵敏度实验
对实施例2所述的试剂盒及其检测方法的灵敏度进行实验，测试样品由转基因玉米MIR604（含cry3A基因）与非转基因玉米按一定质量比混合制备而成，8份测试样品中的MIR604玉米的质量分数分别为100%、10%、1%、0.1%、0.05%、0.02%、0.01%、0。
本实施例中，MIR604玉米质量分数分别为100%、10%、1%、0.1%、0.05%、0.02%、0.01%的测试样品反应管中均显现绿色，而阴性对照显现橙色，表明本发明所述试剂盒及其检测方法的检测灵敏度可达0.01%。
以本发明所述的外引物1和外引物2，对上述测试样品进行定性PCR检测。
PCR检测反应体系为：1×PCR缓冲液（大连宝生物公司）、0.2 mmol/L dNTPs（大连宝生物公司）、0.2 μmol/L外引物1、0.2 μmol/L外引物2、1 U Taq DNA聚合酶（大连宝生物公司）、2 μL模板DNA，用灭菌去离子水补齐到25 μL。PCR反应程序为：94℃预变性5 min；95℃变性30 s、60℃退火30 s、72℃延伸30 s，35次循环；72℃延伸7 min。PCR结束后，取5 μL扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳检测。
本实施例中，MIR604玉米质量分数分别为100%、10%、1%、0.1%、0.05%的测试样品的PCR扩增产物出现典型电泳条带，而0.02%、0.01%、阴性对照均无典型电泳条带，表明PCR方法的检测灵敏度为0.05%。
两种方法的比较结果显示，本发明的试剂盒及其检测方法的检测灵敏度可以达到0.01%，而PCR方法的检测灵敏度为0.05%；经比对，本发明的试剂盒及检测方法的灵敏度明显高于PCR方法，可检测出更低含量的样品。
应当说明的是，上述实施例为本发明的具体实施例子，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
<110> 吉林省农业科学院
<120> 转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法
<130>
<160> 5
<210> 1
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cry3A基因的LAMP检测外引物1
<400> 1
aagccccacc tgttcga 17
<210> 2
<211> 18
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cry3A基因的LAMP检测外引物2
<400> 2
ggctcgctgc tcttgttg 18
<210> 3
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cry3A基因的LAMP检测内引物1
<400> 3
agttgaagct gtcgttgccg tacctgcacc gcatccagtt c 41
<210> 4
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cry3A基因的LAMP检测内引物2
<400> 4
ggagcggcaa ctacgtgagc agaaggggct ggtgatga 38
<210> 5
<211> 17
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> cry3A基因的LAMP检测环引物
<400> 5
gggctggaaa cgcgtgt 17
Claims (7)
1.转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组，包括外引物1、外引物2、内引物1、内引物2和环引物，其核苷酸序列分别如下所示：
外引物1：AAGCCCCACCTGTTCGA（SEQ ID NO：1）；
外引物2：GGCTCGCTGCTCTTGTTG（SEQ ID NO：2）；
内引物1：AGTTGAAGCTGTCGTTGCCGTACCTGCACCGCATCCAGTTC（SEQ ID NO：3）；
内引物2：GGAGCGGCAACTACGTGAGCAGAAGGGGCTGGTGATGA（SEQ ID NO：4）；
环引物：GGGCTGGAAACGCGTGT（SEQ ID NO：5）。
2.转基因植物中cry3A基因的LAMP检测试剂盒，包括以下组分：
（1）检测引物溶液：由权利要求1所述的2条外引物和2条内引物配制的检测引物溶液，外引物1、外引物2、内引物1和内引物2的浓度依次为4~6 μmol/L、4~6 μmol/L、32~48 μmol/L和32~48 μmol/L；
（2）环引物溶液：由权利要求1所述的环引物配制而成，环引物的浓度为16~24 μmol/L；
（3）具有链置换活性的DNA聚合酶：浓度为7~9 U/μL；
（4）10×反应缓冲液：200 mmol/L Tris-HCl、pH 8.8，100 mmol/L KCl，100 mmol/L (NH4)2SO4，40~100 mmol/L MgSO4，6~14 mol/L甜菜碱；
（5）dNTPs溶液，由浓度分别为10 mmol/L的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四种脱氧核糖核苷酸溶液等体积混合而成；
（6）阳性DNA对照样品，转cry3A基因植物的基因组DNA，或含有cry3A基因序列的大肠杆菌质粒DNA；
（7）阴性DNA对照样品：不含cry3A基因序列的DNA；
（8）显色剂：1000×SYBR GREEN I荧光染料。
3.根据权利要求2所述的cry3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的检测引物溶液中含有5 μmol/L外引物1、5 μmol/L外引物2、40 μmol/L内引物1、40 μmol/L内引物2。
4.根据权利要求2所述的cry3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的环引物溶液中含有20 μmol/L环引物。
5.根据权利要求2所述的cry3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的具有链置换活性的DNA聚合酶为Bst DNA聚合酶，浓度为8 U/μL。
6.根据权利要求2所述的cry3A基因的LAMP检测试剂盒，其特征在于：所述的10×反应缓冲液中MgSO4、甜菜碱的浓度分别为80 mmol/L、8 mol/L。
7.利用权利要求2~6任一项所述的试剂盒检测cry3A基因的方法，包括以下步骤：
（1）提取待测样品的基因组DNA；
（2）配制待测样品的LAMP检测反应体系：在200 μL PCR反应管内加入模板DNA 2~5 μL、检测引物溶液1.5 μL、环引物溶液1 μL、Bst DNA聚合酶1 μL、10×反应缓冲液2.5 μL、dNTPs溶液3 μL，用灭菌去离子水补齐到25 μL；
（3）配制对照样品的LAMP检测反应体系：配制阳性对照、阴性对照反应体系时，除将模板DNA分别换成阳性DNA对照样品、阴性DNA对照样品外，其他组分与步骤（2）一致；
（4）运行LAMP扩增反应：63~65℃孵育30~60min，80℃孵育5min终止反应；
（5）LAMP扩增结果的鉴定：通过肉眼观察或利用浊度仪观察反应管内沉淀的浊度变化来判断扩增结果；或取2~5 μL扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果；或在反应管中加入1~2μL显色剂，通过肉眼观察显色结果来判断扩增结果。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410176842.2A CN103924000B (zh) | 2014-04-29 | 2014-04-29 | 转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410176842.2A CN103924000B (zh) | 2014-04-29 | 2014-04-29 | 转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103924000A CN103924000A (zh) | 2014-07-16 |
| CN103924000B true CN103924000B (zh) | 2015-06-17 |
Family
ID=51142390
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410176842.2A Expired - Fee Related CN103924000B (zh) | 2014-04-29 | 2014-04-29 | 转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103924000B (zh) |
Families Citing this family (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN105483236A (zh) * | 2015-12-26 | 2016-04-13 | 吉林省农业科学院 | 转基因植物中cry1C基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN105483235A (zh) * | 2015-12-26 | 2016-04-13 | 吉林省农业科学院 | 转基因植物中cry1F基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN105483237A (zh) * | 2015-12-26 | 2016-04-13 | 吉林省农业科学院 | 转基因植物中aad1基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN105506081A (zh) * | 2015-12-26 | 2016-04-20 | 吉林省农业科学院 | 转基因植物中cry35Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN105483240A (zh) * | 2015-12-26 | 2016-04-13 | 吉林省农业科学院 | 转基因植物中cry34Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
| CN105483238A (zh) * | 2015-12-26 | 2016-04-13 | 吉林省农业科学院 | 转基因植物中vip3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1470648A (zh) * | 2002-07-26 | 2004-01-28 | 深圳市匹基生物工程股份有限公司 | 含有Cry3A基因转基因作物核酸扩增用引物序列 |
| CN103088161A (zh) * | 2013-01-14 | 2013-05-08 | 宁波检验检疫科学技术研究院 | 番茄环斑病毒的rt-lamp检测方法 |
-
2014
- 2014-04-29 CN CN201410176842.2A patent/CN103924000B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1470648A (zh) * | 2002-07-26 | 2004-01-28 | 深圳市匹基生物工程股份有限公司 | 含有Cry3A基因转基因作物核酸扩增用引物序列 |
| CN103088161A (zh) * | 2013-01-14 | 2013-05-08 | 宁波检验检疫科学技术研究院 | 番茄环斑病毒的rt-lamp检测方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Combining engineered(Bt-cry3A) and natural resisitance mechanisms in potato for control of Colorado potato beetle;Joseph J.Coombs等;《J.AMER.SOC.HORT.SCI》;20021231;第127卷(第1期);62-68 * |
| Development and Application of Loop-Mediated IsothermalAmplification Assays for Rapid Visual Detection of cry2Ab and cry3A Genes in Genetically-Modified Crops;Feiwu Li等;《Int. J. Mol. Sci.》;20140827;第15卷;15109-15121 * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103924000A (zh) | 2014-07-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103924000B (zh) | 转基因植物中cry3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN104450946A (zh) | 转基因大豆gts40-3-2及内外源基因的多重巢式荧光定量pcr检测引物组和方法 | |
| CN102212540A (zh) | 同时适于七个转基因油菜品系特异性检测的标准分子 | |
| CN103773867B (zh) | 转基因作物中cry2Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN102134602B (zh) | 转Xa21基因水稻或其制品检测用引物和探针、试剂盒及方法 | |
| CN101724698B (zh) | 检测待测水稻是否为转CpTI基因水稻的方法及其专用试剂盒 | |
| CN104513861A (zh) | 转基因大豆mon89788及其衍生品种的lamp检测引物组、检测试剂盒和检测方法 | |
| CN106755545A (zh) | 转基因作物中pat基因的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN105063207B (zh) | 转基因大豆mon87705的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN103060460A (zh) | 检测含有nos终止子的转基因水稻的引物、试剂盒和方法 | |
| CN103333960B (zh) | 转基因棉花t304-40的品系特异性检测方法及其试剂盒 | |
| CN102776268A (zh) | 恒温基因扩增检测转基因玉米Mon89034及其衍生品种的试剂盒及方法 | |
| CN102367485B (zh) | 用于pcr检测植物病害的内参基因的引物及其应用 | |
| CN105039556B (zh) | 转基因大豆mon87769的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN105039555B (zh) | 转基因大豆mon87701的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN105002291B (zh) | 转基因大豆mon87708的lamp检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN103397094B (zh) | 一种检测转基因水稻品系Bt63的方法及试剂盒 | |
| CN104388579A (zh) | 一种转基因大豆及其衍生品种的Arm-PCR检测方法 | |
| CN105483236A (zh) | 转基因植物中cry1C基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN110643734A (zh) | 一种转基因玉米das-40278-9的rpa引物与探针组合、试剂盒及检测方法 | |
| CN103060459A (zh) | 检测转基因水稻品系科丰8号的引物和探针、试剂盒和方法 | |
| CN105483238A (zh) | 转基因植物中vip3A基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN105506081A (zh) | 转基因植物中cry35Ab基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| CN105483235A (zh) | 转基因植物中cry1F基因的LAMP检测引物组、试剂盒及检测方法 | |
| KR20200063566A (ko) | Epsps 유전자가 도입된 유전자 변형 옥수수 검출용 프라이머 세트, 조성물, 키트 및 이를 이용한 검출 방법 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20150617 Termination date: 20200429 |