CN102770550A - 尸胺的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种尸胺的制备方法，其特征在于，培养向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物，该尸胺制备方法能够抑制副产物赖氨酸的产生，而且与传统的制备方法相比，尸胺对糖收率提高，并且可以降低在精制用作聚酰胺原料的尸胺时的精制工序中的负荷。
Description
技术领域
本发明涉及尸胺的制备方法。特别是，本发明涉及通过使微生物分泌产生赖氨酸脱羧酶从而有效制备尸胺的方法。
背景技术
聚酰胺（PA）是用作汽车行业、运动行业、生活时尚行业中所使用的一系列特殊塑料的原材料的重要聚合物组，二胺是所述聚酰胺的重要原材料单体成分。二胺和二羧酸缩合形成各种聚合物，此时，聚合物的特性由二胺和二羧酸的链长决定。
通常，二胺以化学方式经过二羧酸的中间阶段而由衍生自石油的材料来制备；或者通过氨基酸的化学脱羧反应来制备（非专利文献1）。考虑到石油价格的高涨，期望快速变化为下述方法：通过酶反应或微生物培养等生物技术方法从可再生资源中合成二胺。
于是，作为可以通过生物技术方法制备的二胺，尸胺受到广泛关注。尸胺别名为1,5-戊二胺，是可以用作聚酰胺的原材料单体的化合物。另外，尸胺是生物体内普遍存在的生物胺，其生物合成体系正逐步被阐明（参考非专利文献2），作为其生物合成途径的一部分，已知对从赖氨酸开始的尸胺脱羧反应进行催化的赖氨酸脱羧酶（LDC）。并且作为LDC基因，已知有衍生自大肠杆菌（Escherichiacoli）的LDC基因（参考非专利文献3）。
在传统的利用生物技术方法的尸胺制备方法中，大致分为利用以向微生物中导入LDC基因为基础、以赖氨酸为底物的酶反应的制备方法，或者利用微生物培养的尸胺制备方法。此外，作为利用微生物培养的尸胺制备方法，已知有：利用重组大肠杆菌的培养的制备方法（参考专利文献1）；在产赖氨酸的微生物的棒状杆菌中，进一步提高赖氨酸生产能力的方法（参考专利文献2）；切断尸胺降解体系的方法（参考专利文献3）；以及切断赖氨酸输送体系的方法（专利文献4）。但是，特别是在利用微生物培养的尸胺制备方法中需要解决的问题较多，例如有这样的问题：在对向产赖氨酸的微生物的棒状杆菌中导入了LDC基因的微生物进行培养时，会生成副产物赖氨酸（参考非专利文献4）。当生成副产物赖氨酸时，尽管可以制得前体，但尸胺的产率没有提高；另外，为了将尸胺用作聚酰胺的原材料，尸胺的高纯度化很重要，但是如果产生副产物赖氨酸，则对于尸胺精制而言负担会增加，从而造成经济上的问题。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2002-223770号公报
专利文献2：日本特开2004-222569号公报
专利文献3：日本特表2009-531042号公报
专利文献4：WO2008/092720号
非专利文献
非专利文献1：須山、金尾，「薬学雑誌」，1965年，第85卷，p.513-533
非专利文献2：セリアホワイトテ一バ一（Celia white tabor）、其他1人，「マイクロバイオロジカルレビユ一ズ（MicrobiologicalReviews）」，1985年，第49卷，p.81-99
非专利文献3：シユアンメング（Shi-yuanmeng）、其他1人，
「ジヤ一ナルオブバクテリオロジ一（Journal of Bacteriology）」，1992年，第174卷，p.2659-2669
非专利文献4：耳塚孝、其他4人、「バイオサイエンスバイオテクノロジ一アンドバイオケミストリ一（Bioscience,Biotechnology,and,Biochemistry）」，2007年，第71卷，p.2130-2135
发明内容
发明要解决的问题
本发明的课题在于提供一种利用微生物培养的尸胺制备方法，其中在微生物培养结束时，在微生物培养液中不残留作为尸胺前体的赖氨酸。
解决问题的手段
本发明人为了使在微生物培养结束时赖氨酸不残留在培养液中而进行了专心的研究，结果发现通过培养向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物，在微生物培养结束时，赖氨酸不会残留在培养液中，从而完成本发明。即，本发明由下列（1）至（6）构成。
（1）一种尸胺的制备方法，其特征在于，培养向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物。
（2）上述（1）所述的尸胺制备方法，其特征在于，向用于培养所述微生物的培养基中添加赖氨酸。
（3）上述（1）或（2）所述的尸胺制备方法，其特征在于，通过使在赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列的N末端侧添加有分泌信号肽的蛋白质在细胞内表达，所述微生物向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶。
（4）上述（3）所述的尸胺制备方法，其特征在于，所述微生物通过具有基因构建体，从而使在赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列的N末端侧添加有分泌信号肽的蛋白质在细胞内表达，其中所述基因构建体在核酸序列的5′到3′方向上包含在该微生物中起作用的启动子序列、编码分泌信号肽的核酸序列、以及编码赖氨酸脱羧酶的核酸序列。
（5）上述（3）或（4）所述的尸胺制备方法，其特征在于，所述分泌信号肽为由序列号13至43中的任一氨基酸序列所表示的肽。
（6）上述（1）至（5）中任意一项所述的尸胺制备方法，其特征在于，赖氨酸脱羧酶来源于大肠杆菌。
（7）上述（1）至（6）中任意一项所述的尸胺制备方法，其特征在于，所述微生物为棒状杆菌或大肠杆菌。
发明效果
根据本发明，在利用微生物培养的尸胺制备方法中，由于在微生物培养终止时在培养液中不残留赖氨酸，因此与传统的制备方法相比，尸胺对糖收率提高，并且在精制用作聚酰胺原材料的尸胺时的精制工序中的负荷也可以降低。
具体实施方式
本发明的方法为这样一种尸胺制备方法，其通过培养向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物来进行制备。需要指出的是，在本说明书中，赖氨酸脱羧酶被“分泌”到细胞外是指赖氨酸脱羧酶被运送到微生物外（细胞外），并且最终赖氨酸脱羧酶完全以游离状态存在于培养基或培养液中的情况。这里提到的分泌不包括仅赖氨酸脱羧酶的一部分存在于细胞外的情况，也不包括赖氨酸脱羧酶结合在微生物表层而存在的情况。
向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物迄今为止还未知，但是可以通过基因重组技术，使所期望的微生物向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶。具体而言，通过使在赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列的N末端侧添加有分泌信号肽的蛋白质在细胞内表达，从而能够向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶。
对本发明中所用的赖氨酸脱羧酶没有特别限定，但是优选L-赖氨酸脱羧酶。另外，关于赖氨酸脱羧酶的来源也没有特别限制，但是优选使用来源于（例如）耐盐芽孢杆菌（Bacillus halodurans）、枯草芽孢杆菌（bacillus subtilis）、大肠埃希氏菌（Escherichia coli；大肠杆菌）、反刍月形单胞菌（Selenomonas ruminamtium）、霍乱弧菌（Vibrio cholerae）、副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）、天蓝色链霉菌（Streptomyces coelicolor）、毛链霉菌（Streptomyces pilosus）、侵蚀艾肯菌（Eikenella corrodens）、噬氨基酸真杆菌（Eubacteriumacidaminophilum）、鼠伤寒沙门菌（Salmonella typhimurium）、蜂房哈夫尼菌（Hafnia Alvei）、脑膜炎奈瑟氏菌（Neisseria meningitidis）、嗜酸热原体（Thermoplasma acidophilum）、或者深海热球菌（Pyrococcus abyssi）的赖氨酸脱羧酶，更优选为来源于安全性得到确认的大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶。这些赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列登记在数据库（GenBank）中。
分泌信号肽原本是作为为了使分泌性蛋白质向细胞外分泌而发挥作用的信号肽序列被发现的。已知的是，分泌性蛋白质一般在被翻译为前肽或前肽原之后，形成成熟蛋白质，但是此时，在翻译为前肽或前肽原之后，伴随着向细胞外的分泌，由蛋白酶（一般也称为信号肽酶）切断分泌信号肽（“pre部分”），变为成熟肽或肽原，肽原被蛋白酶进一步切断其pro部分而变为成熟肽，然后分泌到细胞外。而且，已知的是，分泌信号肽具有下述功能：其不仅仅使分泌性蛋白质分泌到细胞外，还通过使非分泌性蛋白质和分泌信号肽融合，从而使非分泌性蛋白质分泌到细胞外，本发明中，通过使分泌信号肽与赖氨酸脱羧酶融合，能够有效地使赖氨酸脱羧酶分泌到细胞外。
本发明所使用的分泌信号肽可以来源于不同的微生物，也可以是所使用的微生物的分泌信号肽，但是优选来源于所使用的微生物的分泌性蛋白质。此外，可用于本发明目的的分泌信号肽也可以部分含有作为其来源的天然成熟蛋白质的N末端氨基酸序列。作为分泌信号肽的具体例子，可以列举：来源于大肠杆菌的TorA（三甲胺N-氧化物还原酶）、SufI（Suppressor of ftsI；ftsI抑制剂），来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）的PhoD（磷酸酯酶）、LipA（脂肪酶），来源于球形节杆菌（Arthrobacter globiformis）的异麦芽糖葡聚糖酶（IMD）等分泌信号肽（分别参照序列号13至17）；专利3711658号公报所记载的分泌信号肽（参照序列号18）；来源于Microbiology(2009),155,p.741-750中所记载的谷氨酸棒杆菌R的分泌信号肽CgR0079、CgR0120、CgR0124、CgR0900、CgR0949、CgR1023、CgR1448、CgR2137、CgR2677、CgR2926、CgR0040、CgR0789、CgR0865、CgR1522、CgR1819、CgR2213、CgR2386和CgR2535（分别参照序列号19至36）；日本特开平9-316095号公报所记载的分泌信号肽（参照序列号37）；Applied and Environmental Microbiology,(1995),61(4),p.1610-1613所记载的作为枯草杆菌蛋白酶的分泌信号肽的arpE信号肽（参照序列号38）；Applied and EnvironmentalMicrobiology,(2003),69(1),p.358-366所记载的分泌信号肽（参照序列号39）；以及Trends in Microbiology,(2005),13(4),p.175-180所记载的分泌信号肽（参照序列号40至43）。
需要说明的是，作为上述赖氨酸脱羧酶和分泌信号肽，在具有其功能的范围内，也包括分别在各氨基酸序列中，发生1个或多个氨基酸的置换、缺失、插入或添加而得到的蛋白质。这里，“多个”通常为1至7个的程度，优选1至5个，特别优选1至2个。另外，作为上述赖氨酸脱羧酶和分泌信号肽，在具有其功能的范围内，对于氨基酸序列的序列一致性，可以是具有通常为85%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上序列一致性的氨基酸序列的蛋白质。
上述这样的氨基酸序列的置换、缺失、插入或添加，优选保守性置换。作为置换原来的氨基酸并被视为保守性置换的氨基酸，可以举出：Ala向Ser或Thr的置换，Arg向Gln、His或Lys的置换，Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换，Asp向Asn、Glu或Gln的置换，Cys向Ser或Ala的置换，Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换，Glu向Asn、Gln、Lys或Asp的置换，Gly向Pro的置换，His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换，Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换，Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换，Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换，Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换，Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换，Ser向Thr或Ala的置换，Thr向Ser或Ala的置换，Trp向Phe或Tyr的置换，Tyr向His、Phe或Trp的置换，以及Val向Met、Ile或Leu的置换。
作为通过基因重组使在微生物中的赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列N末端侧添加有分泌信号肽的蛋白质在细胞内表达的方法，可以举出将基因构建体导入微生物的方法，其中所述基因构建体在核酸序列的5′到3′方向上包含在该微生物中起作用的启动子序列、编码分泌信号肽的核酸序列、以及编码赖氨酸脱羧酶的核酸序列。
对本发明所使用的启动子序列没有特别限定，只要是能够在所使用的微生物体内起作用的启动子序列即可，一般都能使用，还可以是来源于异种的启动子，但是作为优选的启动子的例子，可以列举出：各种氨基酸生物合成体系，例如谷氨酸生物合成体系的谷氨酸脱氢酶基因，谷氨酸合成体系的谷氨酸合成酶基因，赖氨酸生物合成体系的天冬氨酸激酶基因，苏氨酸生物合成体系的高丝氨酸脱氢酶基因，异亮氨酸和缬氨酸生物合成体系的乙酰羟基酸合成酶基因，亮氨酸生物合成体系的2-异丙基苹果酸合成酶基因，脯氨酸和精氨酸生物合成体系的谷氨酸激酶基因，组氨酸生物合成体系的磷酸核糖-ATP焦磷酸化酶基因，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸等芳香族氨基酸生物合成体系的3-脱氧-D-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸（DAHP）合成酶基因；肌苷酸和鸟苷酸这样的核酸生物合成体系，例如磷酸核糖焦磷酸（PRPP）氨基转移酶基因，肌苷酸脱氢酶基因和鸟苷酸合成酶基因的各个启动子；以及tac启动子等强启动子。这些启动子的序列登记在数据库（GenBank）中。
本发明所使用的编码分泌信号肽的核酸序列只要是能翻译上述分泌信号肽的核酸序列即可，并没有特别的限定，可以参考分泌信号肽的氨基酸序列的密码子（标准基因密码）来决定（参考ホ一トン生化学第3版東京化学同人，p.526），此时，可以利用对于本发明所使用的微生物而言常用的密码子来重新设计核酸序列。具体而言，可以列举出编码来源于大肠杆菌的TorA（三甲胺N-氧化物还原酶）、SufI（Suppressor of ftsI；ftsI抑制剂），编码来源于枯草芽孢杆菌（Bacillus Subtilis）的PhoD（磷酸酯酶）、LipA（脂肪酶），编码来源于球形节杆菌（Arthrobacter globiformis）的异麦芽糖葡聚糖酶（IMD）等分泌信号肽的核酸序列（分别参照序列号44至48）；编码日本专利3711658号公报所记载的分泌信号肽的核酸序列（参照序列号49）；编码来源于Microbiology(2009),155,p.741-750所记载的谷氨酸棒杆菌R的分泌信号肽CgR0079、CgR0120、CgR0124、CgR0900、CgR0949、CgR1023、CgR1448、CgR2137、CgR2677、CgR2926、CgR0040、CgR0789、CgR0865、CgR1522、CgR1819、CgR2213、CgR2386和CgR2535的核酸序列（分别参照序列号50至67）；编码日本特开平9-316095号公报所记载的分泌信号肽的核酸序列（参照序列号68）；编码Applied and Environmental Microbiology,(1995),61(4),p.1610-1613所记载的分泌信号肽的核酸序列（参照序列号69)；编码Applied and Environmental Microbiology,(2003),69(1),p.358-366所记载的分泌信号肽的核酸序列（参照序列号70）；以及编码Trends in Microbiology,(2005),13(4),p.175-180所记载的分泌信号肽的核酸序列（参照序列号71至74）。
关于本发明所使用的编码赖氨酸脱羧酶的核酸序列，作为具体例子，可以列举出编码来源于上述生物的赖氨酸脱羧酶的核酸序列，此时，可以根据所用微生物的密码子的使用频率，来重新设计核酸序列。需要说明的是，编码来源于上述生物的赖氨酸脱羧酶的核酸序列登记在数据库（GenBank）中。
作为上述启动子序列、编码分泌信号肽的核酸序列以及编码赖氨酸脱羧酶的核酸序列，在具有其功能的范围内，还包括在各核酸序列中，发生1个或多个碱基的置换、缺失、插入或添加的核酸序列。这里，“多个”通常为1至40个的程度，优选1至30个，更优选1至20个，特别优选1至10个，最优选1至5个。另外，作为上述启动子序列、编码分泌信号肽的核酸序列以及编码赖氨酸脱羧酶的核酸序列，在具有其功能的范围内，可以列举出与所述核酸序列或者其互补链的全体或一部分在严格条件下杂交的核酸序列。这里，“在严格条件下杂交的多核苷酸”是指将选自原来的碱基序列中任意至少20个、优选25个、更优选至少30个连续序列中的1个或多个核酸序列作为探针，并使用众所周知的杂交技术（Current Protocols I MolecularBiology edit.Ausbel等,(1987)Publish.John Wily&Sons Section6.3-6.4）等进行杂交的核酸序列。此处作为严格条件，例如在50%甲酰胺的存在下，在杂交温度为37℃、作为更加严格的条件为42℃、作为进一步严格的条件为65℃时，通过用0.1至2倍浓度的SSC溶液（1倍浓度的SSC溶液的组成：150mM氯化钠、15mM柠檬酸钠）洗涤，由此可实现杂交。另外，作为上述启动子序列、编码分泌信号肽的核酸序列以及编码赖氨酸脱羧酶的核酸序列，在具有其功能的范围内，也可以为序列一致性通常在85%以上、优选为90%以上、更优选为95%以上的序列一致性的核酸序列。这样的启动子序列、编码分泌信号肽的核酸序列以及编码赖氨酸脱羧酶的核酸序列，也可以从本来的宿主以外取得，还可以通过对从本来的宿主所得到的核酸序列进行本领域技术人员众所周知的体外突变处理、或者部位特异性突变处理而取得。
本发明所使用的基因构建体除了包含上述启动子序列、编码分泌信号肽的核酸序列以及编码赖氨酸脱羧酶的核酸序列之外，为了使它们起作用，还可以在适当的位置具有使赖氨酸脱羧酶在微生物细胞内表达所必需的控制序列（操纵子和终止子等）。对可以用于所述构建体的载体并没有特别限制，只要是在微生物中能够起作用的就可以，可以是像质粒那样在染色体外自主扩增的载体，也可以是整合到细菌染色体中的载体。另外，还可以使用人工转座子等。在使用转座子时通过同源重组或其自身的转移能力而将目的基因导入染色体中。需要说明的是，基因构建体的构建或其确认方法可通过本领域技术人员所熟知的分子生物学方法完成，例如可以参考Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Second Edition(1989)ColdSpring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York，DNACloning:A Practical Approach,Volumes I and II(D.N.Glovered.1985);F.M.Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(1994)John Willey&Sons,Inc.,PCR Technology:Principles and Applicationfor DNA Amplication,H.Erlich,ed.,Stockton Press，等。
对上述基因构建体向微生物中的导入方法没有特别限定，例如，可以通过原生质体法（Gene,(1985),39,p.281-286）、电穿孔法（Bio/Technology,(1989),7,1067-1070）等导入。
作为本发明中的向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物，优选通过基因重组能够导入上述基因构建体的微生物，作为具体例子，可以列举大肠杆菌（大肠埃希氏菌）、枯草杆菌、真菌、酵母、棒状杆菌等，但是优选大肠杆菌或棒状杆菌，它们是已知能够有效生产作为尸胺前体的赖氨酸的微生物。
作为大肠杆菌的具体例子，可以使用MC1061菌株、HB101菌株、JM105菌株、JM109菌株、DH5α菌株和JE5505菌株等。
另外，棒状杆菌为好氧性革兰氏阳性杆菌，传统上分类为短杆菌属，但是现在也被包括在统一为棒状杆菌属的细菌中（Int.J.Syst.Bacteriol.,(1981)41,p.225）。另外，包括与棒状杆菌属非常接近的短杆菌属细菌。作为这样的棒状杆菌的例子，可以列举出：嗜乙酰乙酸棒杆菌（Corynebacterium acetoacidophylum）、醋谷氨酸棒状杆菌（Corynebacterium acetoglutamicum）、解烷棒状杆菌（Corynebacterium alkanolyticum）、帚石南棒杆菌（Corynebacteriumcallunae）、谷氨酸棒杆菌（Corynebacterium glutamicum）、百合花棒杆菌（Corynebacterium lilium）、栖糖蜜棒杆菌（Corynebacteriummellassecola）、热产氨棒状杆菌（Corynebacteriumthermoaminogenes）、有效棒杆菌（Corynebacterium efficiens）、力士棒杆菌（Corynebacterium herculis）、乳发酵短杆菌（Brevibacteriumdivaricatum）、黄色短杆菌（Brevibacterium flavum）、ブレビバクテリウム·インマリオフィラム（Brevibacterium immariophilum）、乳糖发酵短杆菌（Brevibacterium lactofermentum）、玫瑰色短杆菌（Brevibacterium roseum）、解糖短杆菌（Brevibacteriumsaccharolyticum）、生硫短杆菌（Brevibacterium thiogenitalis）、产氨棒杆菌（Corynebacterium ammoniagenes）、白短杆菌（Brevibacteriumalbum）、ブレビバクテリウム·セリヌム（Brevibacterium cerinum）、嗜氨微杆菌（Microbacterium ammoniaphilum）。
另外，作为各棒状杆菌的具体菌株，可以举出：嗜乙酰乙酸棒杆菌ATCC13870，醋谷氨酸棒状杆菌ATCC15806，解烷棒状杆菌ATCC21511，帚石南棒杆菌ATCC15991，谷氨酸棒杆菌ATCC13020、ATCC13020、ATCC13060，百合花棒杆菌ATCC15990，栖糖蜜棒杆菌ATCC 17965，有效棒杆菌AJ12340（保藏编号：FERM BP-1539），力士棒杆菌ATCC13868，乳发酵短杆菌ATCC14020，黄色短杆菌ATCC13826、ATCC14067、AJ12418（保藏编号：FERM BP-2205），ブレビバクテリウム·インマリオフィラム ATCC 14068，乳糖发酵短杆菌ATCC 13869，ブレビバクテリウム·ロゼウム ATCC 13825，解糖短杆菌ATCC 14066，生硫短杆菌ATCC 19240，产氨短杆菌ATCC6871、ATCC6872，白短杆菌ATCC 15111，ブレビバクテリウム·セリヌム ATCC 15112，嗜氨微杆菌ATCC 15354。
上述棒状杆菌可以从（例如）美国典型培养物保藏中心处购买获得。也就是说，每个菌株都附带有对应的登记号，该登记号记载在美国典型培养物保藏中心的目录中，可以参考该登记号购买获得各菌株。
本发明中，优选使用上述棒状杆菌中的谷氨酸棒杆菌。另外，作为谷氨酸棒杆菌ATCC13869的抗链霉素突变株而分离的谷氨酸棒杆菌AJ12036（保藏编号：FERM BP-734）（昭和59年3月26日首次保藏，独立行政法人産業技術総合研究所特許生物寄託センタ一）与其亲代菌株（野生株）相比，预计在与蛋白质分泌相关的功能基因中存在突变，异种蛋白质的分泌生产能力在最佳培养条件下的蓄积量极高，大约为2至3倍，因此优选作为分泌赖氨酸脱羧酶的棒状杆菌（参考WO02/081694）。
作为向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的确认方法，培养微生物并进行离心分离，测定在使培养上清液和微生物分离而得到的培养上清液中的赖氨酸脱羧酶活性，确认其有无即可。另外，向细胞外分泌的赖氨酸脱羧酶的量可以由免疫印迹法或ELISA法等利用抗原-抗体反应的定量法来进行定量。
在培养向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物时，可以在培养液中生成并蓄积尸胺。
作为培养方法，可以使用分批培养、流加培养或连续培养。在连续培养时，优选进行例如日本特开2008-104453号公报所记载的连续培养。
作为培养用的培养基，可以使用含有碳源、氮源、无机盐类等普通的营养培养基。作为碳源，可以使用例如葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖、淀粉水解产物等糖类，乙醇等醇类，醋酸、乳酸、琥珀酸等有机酸类。作为氮源，可以使用氨水，氯化铵、硫酸铵、碳酸铵、醋酸铵等各种无机和有机铵盐类，尿素，其它含氮化合物，以及肉类提取物、酵母提取物、玉米浆、大豆水解产物等含氮有机物。作为无机盐，可以使用磷酸一氢钾、磷酸二氢钾、硫酸铵、氯化钠、硫酸镁、碳酸钙等。此外，根据需要，可以添加生物素、硫胺素、维生素B6等微量营养源。这些微量营养源也可以用肉类提取物、酵母提取物、玉米浆、酸水解酪素等培养基添加物来替代。
需要说明的是，在本发明中，向培养用的培养基中预先添加赖氨酸也是优选的方案之一。若向培养用的培养基中预先添加赖氨酸，则培养液中被分泌到细胞外的赖氨酸脱羧酶就以预先添加的赖氨酸为基质，将其转变为尸胺，因此能够提高尸胺的制备效率。向培养用的培养基中预先添加赖氨酸时，作为培养用的培养基中的赖氨酸的浓度，并没有特别的限制，但是优选不会对微生物的增殖造成恶劣影响，且不会对赖氨酸脱羧酶造成阻碍的浓度，具体而言优选为0.01至2M。
所添加的赖氨酸优选L-赖氨酸。另外，所添加的赖氨酸可以为游离体，也可以为赖氨酸盐，作为赖氨酸盐，优选赖氨酸盐酸盐或来源于下述二羧酸的赖氨酸·二羧酸盐。另外，作为赖氨酸·二羧酸盐的优选具体例子，可以举出赖氨酸·己二酸盐、赖氨酸·癸二酸盐、赖氨酸·1,12-十二烷双酸盐、赖氨酸·琥珀酸盐、赖氨酸·间苯二甲酸盐、赖氨酸·对苯二甲酸盐，作为更优选的具体例子，可以举出赖氨酸·己二酸盐。
对培养条件没有特别的限制，在振荡培养、深部通气搅拌培养等好氧条件下进行培养。培养温度一般为25℃至42℃，优选为28℃至38℃。培养时间通常为1天至6天。
培养pH的调节优选使用氨水、盐酸或二羧酸，更优选使用二羧酸。使用这些中和剂将培养pH调节到5至8，优选最好控制在pH6.5至7.5。此外，对中和剂的状态并没有限制，以气体、液体、固体或水溶液形式使用。特别优选水溶液。
对优选用作中和剂的二羧酸没有特别限定，但是优选的是，除了上述2个羧基以外，实质上不存在其它官能团的二羧酸。这里所说的官能团为在聚酰胺聚合反应（作为反应条件，例如，反应温度250至270℃，压力10至20kg/cm2，反应时间1至5小时）时，与氨基或羧基等反应，造成聚合物的分支、或使聚合物的结晶度下降（结晶度80%以下）的反应基团，例如，氨基或羧基就符合该官能团，另外，酸性基团（磺酸基、磷酸基、酚羟基等）、碱性基团（肼基等）、质子极性基（羟基等）、具有断裂性的基团（环氧基、过氧化基等）或者其它反应性高的基团（异氰酸根基）也符合该官能团。另一方面，卤素取代基、芳香性取代基、醚基、酯基、酰胺基等反应性低，不符合这里所说的官能团。
作为二羧酸，更优选的是由下列通式（1）、（2）或（3）所表示的二羧酸。
HOOC-(CH2)m-COOH （1）
（通式（1）中，m=0至16）。
[化学式1]
（通式（2）中，n、o=0至16）。
[化学式2]
（通式（3）中，p、q=0至16）。
另外，作为二羧酸，进一步优选己二酸、癸二酸、1,12-十二烷二羧酸、琥珀酸、间苯二甲酸、对苯二甲酸。
培养液中的尸胺以尸胺的游离体或尸胺盐的形式存在。作为收集培养液中的尸胺的方法，首先从培养液中除去微生物。作为分离方法，优选使用对微生物进行沉淀除去、离心分离、膜过滤分离等传统已知的方法。
作为从除去了微生物的含有尸胺的培养液中收集尸胺的方法，还可以如日本特开2009-207495号公报中所记载的那样，以尸胺·二羧酸盐的形式结晶析出并进行收集。另外，也可以如日本特开2009-29872号公报中所记载的那样，利用NF膜对尸胺的游离体进行精制并收集。另外，还可以如日本特开2009-28045号公报中记载的那样，利用极性有机溶剂提取并蒸馏，从而收集尸胺的游离体。
实施例
下面列举实施例和对比例对本发明进行详细说明。另外，除非另有说明，否则实施例和对比例中所用的全部培养基、琼脂培养基以及培养用培养基都进行一般的灭菌操作（例如121℃、30分钟的高压蒸汽灭菌，或0.45μm过滤器灭菌），以灭菌后的状态使用。
（尸胺和赖氨酸浓度的HPLC分析方法）
使用柱子：CAPCELL PAK C18（資生堂）
流动相：0.1%（w/w）磷酸水溶液:乙腈=4.5:5.5
检测：UV360nm
样品预处理：在25μl分析样品中添加25μl的1,4-丁二胺（0.03M）作为内标物，添加150μl碳酸氢钠（0.075M）以及2,4-二硝基氟苯（0.2M）的乙醇溶液加以混合，在37℃下保温1小时。将50μl上述反应溶液溶解在1ml乙腈中，然后以10,000rpm的转速进行5分钟离心，取10μl上清液进行HPLC分析。
参考例1（能够生产赖氨酸的谷氨酸棒杆菌的制作）
为了制作能够合成作为尸胺前体的赖氨酸的谷氨酸棒杆菌，通过向天冬氨酸激酶中导入有效突变来制作赖氨酸生产菌。通过Apppl.Microbiol.Biotechnol.,(2002),58,p.217-223中记载的方法，制作了谷氨酸棒杆菌AK-1菌株（以下简称AK-1菌株）。此菌株的天冬氨酸激酶能够解除赖氨酸和苏氨酸引起的反馈抑制。因此就能够通过培养来合成赖氨酸了。
接下来，通过对AK-1菌株进一步进行基因重组，制得向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的棒状杆菌（实施例1、2）、以及不向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的棒状杆菌（对比例1）。
实施例1（向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的谷氨酸棒杆菌的制作）（其1：利用Tat途径）
（1）HOM基因的克隆
作为导入赖氨酸脱羧酶基因的基因座，选择了高丝氨酸脱氢酶。对对应于HOM基因的从N末端开始的300个氨基酸区域的基因进行了克隆。参照数据库（GenBank）中登记的HOM基因（登记号：BA000036）的碱基序列，合成了寡核苷酸引物（序列号1和序列号2）。将来自谷氨酸棒杆菌ATCC13032的、根据常规方法配制的基因组DNA溶液作为扩增模板，各取0.2μl装入0.2ml的微量离心管中，添加各种试剂：各引物20pmol、pH8.0的Tris盐酸缓冲液（20mM）、氯化钾（2.5mM）、明胶（100μg/ml）、各dNTP（50μM）、LATaqDNA聚合酶（2单位）（宝酒造制），使总量为50μl。在DNA变性条件为94℃、30秒，引物的退火条件为55℃、30秒，DNA引物的伸长反应条件为72℃、3分钟的各条件下，使用BioRad公司的热循环仪，进行30个循环的聚合酶链式反应（下面简称为PCR法）。此外，在本实施例中，除非特别指明，PCR法都在此条件下进行。通过该PCR法所得到的产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有HOM基因的大约0.9kb的DNA片段，并且利用GeneClean Kit（BIO101公司制）进行精制。该片段用限制酶EcoRI和BamHI消化，将所得到的0.9kb的EcoRI-BamHI片段利用连接试剂盒ver.1（宝酒造公司制）插入到预先被EcoRI和BamHI消化过的pHSG298（宝酒造制）的EcoRI/BamHI间隙中，将所得质粒命名为pHOM1。
（2）LDC分泌表达盒的制作
作为用于使LDC在谷氨酸棒杆菌中组成性表达的启动子，选择了卡那霉素抗性基因的启动子；作为分泌信号，选择了通过Tat途径进行分泌的大肠杆菌的SufI；作为LDC基因，选择了大肠杆菌的cadA。
首先，进行卡那霉素抗性基因的启动子的克隆。参照数据库（GenBank）中登记的pHSG299（登记号：M19415）的碱基序列，合成寡核苷酸引物（序列号3和序列号4）。将通过以质粒pHSG299为扩增模板并以寡核苷酸（序列号：3）、（序列号：4）为引物组的PCR法所得到的产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有卡那霉素抗性基因的启动子区域的0.3kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制。利用连接试剂盒ver.1将该片段插入到在质粒载体pT7blue（Novagen公司制）的EcoRV切断部位的3′末端添加有T碱基的间隙中，在所得到的质粒中，在用限制酶HindIII和SacII进行消化时，将成为3.2kb的单一片断的质粒命名为pKMP 1。
接下来，进行LDC基因的克隆。参照数据库（GenBank）中登记的LDC基因（登记号：M76411）的碱基序列，合成寡核苷酸引物（序列号5和序列号6）。将通过PCR法（该PCR法以来源于大肠杆菌(大肠埃希氏菌ATCC10798)的用常规方法配制的基因组DNA溶液为扩增模板、以寡核苷酸（序列号5、6）为引物组）所得到的产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有LDC基因的2.1kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit来进行精制。利用连接试剂盒ver.1将所得片段插入到在质粒载体pT7blue的EcoRV切断部位的3′末端添加有T碱基的间隙中，在所得到的质粒中，在用HindIII和NcoI进行消化时，将成为4.0kb的单一片断的质粒命名为pCADA。
最后，合成了寡核苷酸引物（序列号7），该引物融合了LCD基因和作为分泌信号的与大肠杆菌的SufI的氨基酸序列对应的碱基序列。此寡核苷酸引物的3′侧设计有与LDC基因的5′侧重复的区域。将通过PCR法（该PCR法以pCADA为扩增模板、以寡核苷酸（序列号7、6）为引物组）所得到的产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有LDC基因的2.2kb的DNA片段，并利用GeneClean Kit来进行精制（LDC基因片段1）。同时，合成了寡核苷酸引物（序列号8），该引物融合了卡那霉素抗性基因启动子和作为分泌信号的与大肠杆菌的SufI的氨基酸序列对应的碱基序列。此寡核苷酸引物的5′侧设计有与卡那霉素抗性基因启动子的3′侧重复的区域。将通过PCR法（该PCR法以pKMP1为扩增模板、以寡核苷酸（序列号3、序列号8）为引物组）所得到的产物在1%的琼脂糖凝胶上进行电泳，从凝胶中切割出含有LDC基因的0.4kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制（卡那霉素抗性基因启动子片段1）。
将通过PCR法（该PCR法以所得到的LDC基因片段1和卡那霉素抗性基因启动子片段1作为扩增模板、以设计有限制酶BamHI序列的寡核苷酸引物（序列号9）和设计有限制酶SphI序列的寡核苷酸引物（序列号10）为引物组）所得到的产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有LDC分泌表达盒的2.6kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制。该片段用限制酶BamHI和SphI进行消化，将所得到的2.6kb的BamHI-SphI片段利用连接试剂盒ver.1（宝酒造公司制）插入到预先使用BamHI和SphI消化过的pHOM1的BamHI/SphI间隙中，所得质粒命名为pTM65。
（4）pTM65向染色体的整合
通过电穿孔法［FEMS Microbiology Letters,65,p.299(1989)］向AK-1菌株中导入质粒pTM65后，在含有卡那霉素（25μg/ml）的LB（胰蛋白胨（10g/l）（Bacto公司制）、酵母提取物（5g/l）（Bacto公司制）、氯化钠（10g/l））琼脂培养基上进行选取。从所选取的转化株中以常规方法配制基因组DNA溶液。以该基因组DNA为模板，以寡核苷酸（序列号：1）（序列号：6）为引物组进行PCR，将所得产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，此时观察到3.5kb的单一的带。由此能够确认，对于所选取的转化珠，LDC基因被插入到HOM基因座中。将该转化株命名为谷氨酸棒杆菌AK-1/pTM65（简称为AK-1/pTM65菌株）。
实施例2（向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的谷氨酸棒杆菌的制作）（其1：利用Sec途径）
（1）LDC分泌表达盒的制作
下面，作为用于使LDC在谷氨酸棒杆菌中组成性表达的启动子，选择了卡那霉素抗性基因的启动子；作为分泌信号，选择了通过Sec途径进行分泌的作为枯草杆菌蛋白酶信号的arpE；作为LDC基因，选择了大肠杆菌的cadA。和实施例1一样，合成了寡核苷酸引物（序列号11），该引物融合了LDC基因和作为分泌信号的与arpE的氨基酸序列对应的碱基序列。此寡核苷酸引物的3′侧设计有与LDC基因的5′侧重复的区域。将通过PCR法（该PCR法以pCADA为扩增模板，以寡核苷酸（序列号11、序列号6）为引物组）所得到的产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有LDC基因的2.2kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制（LDC基因片段2）。
同时，合成了寡核苷酸引物（序列号12），该引物融合了作为分泌信号的与arpE的氨基酸序列对应的碱基序列和卡那霉素抗性基因启动子。此寡核苷酸引物的5′侧设计有与卡那霉素抗性基因启动子的3′侧重复的区域。将通过PCR法（该PCR法以pKMP1为扩增模板、以寡核苷酸（序列号3、序列号12）为引物组）所得到的产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有LDC基因的0.4kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制（卡那霉素抗性基因启动子片段2）。
将通过PCR法（该PCR法以所得到的LDC基因片段2和卡那霉素抗性基因启动子片段2作为扩增模板、以寡核苷酸引物（序列号9）和（序列号10）为引物组）所得到的产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有LDC分泌表达盒的2.6kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制。将该片段用限制酶BamHI和SphI进行消化，将所得到的2.6kb的BamHI-SphI片段利用连接试剂盒ver.1（宝酒造公司制）插入到预先使用BamHI和SphI消化过的pHOM1的BamHI/SphI间隙中，所得质粒命名为pTM66。
（2）pTM66向染色体的整合
通过电穿孔法［FEMS Microbiology Letters,65,p.299(1989)］向AK-1菌株中导入质粒pTM66后，在含有卡那霉素（25μg/ml）的LB（胰蛋白胨（10g/l）（Bacto公司制）、酵母提取物（5g/l）（Bacto公司制）、氯化钠（10g/l））琼脂培养基上进行选取。从所选取的转化株中以常规方法配制基因组DNA溶液。以该基因组DNA为模板，以寡核苷酸（序列号1、序列号6）为引物组进行PCR，将所得产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，此时观察到3.5kb的单一的带。由此能够确认，对于所选取的转化株，LDC基因被插入到HOM基因座中。将该转化株命名为谷氨酸棒杆菌AK-1/pTM66（简称为AK-1/pTM66菌株）。
对比例1（不向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的谷氨酸棒杆菌的制作）
用HindIII和NcoI对pKMP 1进行消化，将所得产物用1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有卡那霉素抗性基因启动子区域的0.3kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制。将所得到的HindIII-NcoI片段利用连接试剂盒ver.1插入到预先使用HindIII和NcoI消化过的pCADA的HindIII/NcoI间隙中，所得质粒命名为pTM100。
接下来，用SacII对pTM100进行消化，将产物用1.0%的琼脂糖凝胶进行电泳，从凝胶中切割出含有LDC表达盒的2.4kb的DNA片段，并利用Gene Clean Kit进行精制。将所得SacII片段利用连接试剂盒ver.1插入到预先使用SacII消化过的pHOM1的SacII间隙中，所得质粒命名为pTM101。
通过电穿孔法［FEMS Microbiology Letters,65,p.299(1989)］向AK-1菌株中导入质粒pTM101后，在含有卡那霉素（25μg/ml）的LB（胰蛋白胨（10g/l）（Bacto公司制）、酵母提取物（5g/l）（Bacto公司制）、氯化钠（10g/l））琼脂培养基上进行选取。
从所选取的转化株中以常规方法配制基因组DNA溶液。以该基因组DNA为模板，以寡核苷酸（序列号：5）（序列号：6）为引物组进行PCR，将所得产物用1.0%琼脂糖凝胶进行电泳，此时观察到2.1kb的单一的带。由此能够确认，关于所选择的转化株，LDC基因被插入到HOM基因座中。将该转化株命名为谷氨酸棒杆菌AK-1/pTM101（以下简称为AK-1/pTM101菌株）。
实施例3（向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶活性的确认）
将AK-1/pTM65菌株、AK-1/pTM66菌株和AK-1/pTM101菌株用BY培养基（参考J.Bacteriol.,159,p.306-311(1984)）进行培养后，通过离心分离，分为微生物和培养上清液。使用常规方法破碎微生物，配制微生物破碎液。测定所得培养上清液和微生物破碎液中的赖氨酸脱羧酶活性（参考Biosci.Biotechnol.Biochem.,71,p.2130-2135,(2007)）。关于酶活性，将1分钟内1nmol的L-赖氨酸向尸胺的转换作为1U，将结果以每蛋白质重量的比活性示于表1中。
[表1]
AK-1/pTM65菌株和AK-1/pTM66菌株在细胞外的培养上清液中具有赖氨酸脱羧酶活性，能够确认赖氨酸脱羧酶被分泌到了细胞外。另外，能够确认在微生物破碎液中所有菌株都具有赖氨酸脱羧酶活性。
实施例4、5，对比例2、3（微生物培养：微生物为棒状杆菌时）
分别对AK-1/pTM65菌株（实施例4）、AK-1/pTM66菌株（实施例5）、AK-1/pTM101菌株（对比例2）和AK-1/pTM101菌株+20mg精制赖氨酸脱羧酶（以日本特开2004-000114号公报所记载的方法进行配制）（对比例3）进行培养，比较尸胺的生产性。
向灭过菌的5mL BY培养基中接种1白金环的各菌株，在30℃下振荡24小时，进行初步预培养。将此初步预培养液全部接种到50ml的与初步预培养相同的培养基中，在30℃、振幅30cm、120rpm的条件下培养24小时以进行预培养。接下来，将预培养液全部接种到表2所示的950ml的MMP培养基（培养用培养基）中，将灭过菌的空气以0.07vvm的流速进行通气，同时在30℃、搅拌桨转速800rpm、pH被调节为6.7的条件下进行50小时的培养。中和剂使用硫酸水溶液（3M）和氨水（3M）。对于对比例3，在培养开始时添加20mg精制赖氨酸脱羧酶。
[表2]
| 培养基成分 | 最终浓度[g/L] |
| 葡萄糖 | 50 |
| (NH4)2SO4 | 20 |
| Bacto蛋白胨 | 5 |
| KH2PO4 | 2.5 |
| K2HPO4 | 2.75 |
| NaCl | 0.5 |
| MgSO4·7H2O | 0.75 |
| CaCl2·2H2O | 0.05 |
| FeSO4·7H2O | 0.01 |
| MnSO4·4-6H2O | 0.001 |
| 生物素 | 0.0005 |
| 硫胺素·HCl | 0.007 |
| L-高丝氨酸 | 0.5 |
培养结束后，在4℃、8,000rpm下离心分离10分钟，除去微生物，回收培养上清液。利用HPLC对所得培养上清液中的尸胺和赖氨酸进行分析。另外，葡萄糖浓度测定使用了“Glucose C Test Wako”(注册商标)（和光純薬社制）。计算尸胺对糖收率（产生的尸胺重量/消耗的葡萄糖重量）×100(%)，结果如表3所示。
[表3]
结果，在对比例2和3中出现了通过在细胞外添加赖氨酸脱羧酶，可以降低副产物赖氨酸的产生这样的预想效果。另一方面，将对比例2与实施例4、5进行比较，显示出通过向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶，可以显著降低副产物赖氨酸的产生。另外，据认为由于副产物赖氨酸的减少而导致的尸胺蓄积浓度提高以及对糖收率提高，在对比例3和实施例4、5中没有差别，但是令人惊奇的是，当对向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物进行培养时，与向培养液中添加赖氨酸脱羧酶的情况相比，能够确认到尸胺的蓄积浓度及对糖收率的提高。
参考例2（赖氨酸脱羧酶活性缺失的大肠杆菌的制作）
（1）大肠杆菌的赖氨酸脱羧酶（LDC）基因的去除
已知在大肠杆菌中作为LDC基因，存在有cadA基因和ldcC基因。根据Datsenko和Wanner开发的被称为“Red-driven integration”的方法（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640-6645），如下所述去除大肠杆菌W3110菌株的cadA和ldcC基因。根据“Red-drivenintegration”法，使用通过将下述合成寡核苷酸作为引物而得到的PCR产物，可以在一个阶段中构建基因破坏株，其中所述合成寡核苷酸在合成寡核苷酸的5′侧设计有目的基因的一部分、而在3′侧设计有抗生素抗性基因的一部分。此外，通过来源于酵母的FLP重组酶，能够除去被整合到基因破坏株中的抗生素抗性基因。
（1-1）cadA基因的去除
作为PCR的模板，使用了质粒pKD3（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640-6645）。pKD3为在pMW118（タカラバイオ社制）中插入了FLP-重组酶的识别序列FRT（FLP重组酶识别靶）以及抗生素抗性基因cat基因的质粒，按照FRT-cat-FRT的顺序插入。FRT如序列号75所示。
将在序列号76、77中所示的合成寡核苷酸用作引物来进行PCR，该引物在3′末端具有与上述FRT两端所对应的序列，在5′末端具有与被去除基因cadA基因的开放阅读框（ORF）邻接的50个碱基。
将扩增的PCR产物用琼脂糖凝胶来进行精制，并通过电穿孔法导入到含有质粒pKD46的大肠杆菌W3110菌株中，所述质粒pKD46具有温度敏感性复制能力。质粒pKD46（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640-6645）含有λ噬菌体的共计2154个碱基的DNA片段（GenBank/EMBL登记号：J02459，第31088个至第33241个），所述λ噬菌体含有对受阿拉伯糖诱导性ParaB启动子控制的λRed同源重组系统的Red重组酶进行编码的基因（γ、β、exo基因）。
如下所述制备电穿孔用的感受态细胞。即，用含有氨苄青霉素和L-阿拉伯糖的SOB培养基将在含有氨苄青霉素的LB培养基中于30℃下培养了一晚上的大肠杆菌W3110菌株稀释100倍。将得到的稀释物于30℃下进行通气，同时使其生长直至OD600为约0.6，然后用10%的甘油洗涤3次，由此可以用于电穿孔。
向电穿孔后的细胞添加1mL的SOC培养基，在37℃下培养2.5小时后，于37℃下在含有氯霉素的LB琼脂培养基上进行平板培养，选择氯霉素抗性重组体。接着，为了除去pKD46质粒，在含有氯霉素的LB琼脂培养基上于42℃下进行2次继代培养，对所得菌群的氨苄青霉素抗性进行试验，获得了pKD46脱落了的氨苄青霉素敏感性菌株。
通过PCR对可由氯霉素抗性基因识别的突变体的cadA基因的缺失进行了确认。将所获得的cadA缺失株命名为W3110 cadA：：FRT-cat-FRT菌株。
接着，为了除去导入到cadA基因中的FRT-cat-FRT基因，使用了辅助质粒pCP20。pCP20（Proc.Natl.Acad.Sci.USA,2000,vol.97,No.12,p6640-6645）为携带有酵母的FLP重组酶、并且具有温度敏感性复制能力的质粒。通过导入pCP20，能对染色体上存在的两处FRT进行识别，引起重组，从而将FRT之间的基因切除，形成在染色体上仅残留有FRT的结构。
利用常规方法制作上述所得到的W3110 cadA：：FRT-cat-FRT菌株的感受态细胞，用辅助质粒pCP20对其进行转化，在30℃下用含有50mg/L氨苄青霉素的LB琼脂培养基进行平板培养，选择氨苄青霉素抗性菌株。接着，为了除去pCP20，在LB琼脂培养基上于42℃下进行2次继代培养，对所得菌群的氨苄青霉素抗性和氯霉素抗性进行试验，获得了cat基因和pCP20脱落了的氯霉素、氨苄青霉素敏感性菌株。将该菌株命名为W3110ΔcadA。
（1-2）ldcC基因的去除
大肠杆菌W3110ΔcadA菌株中的ldcC基因的去除按照上述（1-1）的方法来进行，作为ldcC破坏用引物，使用了序列号78、79的引物。由此获得cadA和ldcC基因被去除了的菌株。将所构建的菌株命名为W3110ΔLDC。
实施例6、7，对比例4（向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌（利用Sec途径和利用Tat途径）的制作以及不向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的大肠杆菌的制作）
通过常规方法，使用质粒pTM101、pTM65和pTM66对W3110ΔLDC菌株进行了转化。将所得到的基因重组大肠杆菌分别命名为W3110ΔLDC/pTM101菌株（不向细胞外分泌的菌株）（对比例4）、W3110ΔLDC/pTM65菌株（向细胞外分泌的菌株：利用Tat途径）（实施例6）和W3110ΔLDC/pTM66菌株（向细胞外分泌的菌株：利用Sec途径）（实施例7）。
实施例8（向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的确认）
将W3110ΔLDC/pTM101菌株、W3110ΔLDC/pTM65菌株和W3110ΔLDC/pTM66菌株在含有卡那霉素的LB培养基上进行培养后，通过离心分离，分为微生物和培养上清液。使用常规方法破碎微生物，配制微生物破碎液。测定所得培养上清液和微生物破碎液中的赖氨酸脱羧酶活性。关于酶活性，将1分钟内1nmol的L-赖氨酸向尸胺的转换作为1U，其结果以每蛋白质重量的比活性表示在表4中。
[表4]
W3110ΔLDC/pTM101菌株、W3110ΔLDC/pTM65菌株在细胞外的培养上清液中具有赖氨酸脱羧酶活性，从而能够确认赖氨酸脱羧酶被分泌到了细胞外。另外，能够确认在微生物破碎液中所有菌株都具有赖氨酸脱羧酶活性。
实施例9、10，对比例5（微生物培养：微生物为大肠杆菌时）
分别对W3110ΔLDC/pTM65菌株（实施例9）、W3110ΔLDC/pTM66菌株（实施例10）和W3110ΔLDC/pTM101菌株+20mg精制赖氨酸脱羧酶（以日本特开2004-000114号公报所记载的方法进行配制）（对比例5）进行培养，比较尸胺的生产性。
向5mL含有卡那霉素的LB培养基中接种1白金环的各种菌株，在30℃下振荡24小时以进行初步预培养。将该初步预培养液全部接种到50ml的与初步预培养相同的培养基中，在30℃、振幅30cm、120rpm的条件下培养24小时来进行预培养。接下来，将预培养液全部接种到950ml的表5所示的MS培养基（培养用培养基）中，将灭过菌的空气以0.20vvm的流速进行通气，同时在37℃、搅拌桨转速800rpm、pH被调节为7.0的条件下进行50小时的培养。中和剂使用硫酸水溶液（3M）和氨水（3M）。对于对比例6，在培养开始时添加20mg精制赖氨酸脱羧酶。
[表5]
| 培养基成分 | 最终浓度[g/L] |
| 葡萄糖 | 40 |
| (NH4)2SO4 | 16 |
| 多聚蛋白胨S | 10 |
| KH2PO4 | 1 |
| MgSO4·7H2O | 1 |
| FeSO4·7H2O | 0.01 |
| MnSO4·5H2O | 0.01 |
培养结束后，在4℃、8,000rpm下离心分离10分钟，除去微生物，回收培养上清液。利用HPLC对所得培养上清液中的尸胺和赖氨酸进行分析。另外，葡萄糖浓度的测定使用了“Glucose C TestWako”(注册商标)（和光純薬社制）。计算尸胺对糖收率（产生的尸胺重量/消耗的葡萄糖重量）×100(%)，结果如表6所示。
[表6]
将对比例5和实施例9、10进行比较，令人惊奇的是，当对向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物进行培养时，与向培养液中添加赖氨酸脱羧酶的情况相比，能够确认尸胺的蓄积浓度以及对糖收率提高。
实施例11、12，对比例6、7（微生物培养：赖氨酸添加的效果比较）
分别对W3110ΔLDC/pTM65菌株（实施例11）、W3110ΔLDC/pTM66菌株（实施例12）、W3110ΔLDC/pTM101菌株（对比例6）和W3110ΔLDC/pTM101菌株+20mg精制赖氨酸脱羧酶（以日本特开2004-000114号公报所记载的方法进行配制）（对比例7）的赖氨酸向尸胺的转换能力进行了比较。按照与实施例9、10相同的试验对各个微生物进行培养，只是在向MS培养基（培养用培养基）中添加62.5g/L的L-赖氨酸盐酸盐这一点上有所改变。50小时之后，在4℃、8,000rpm下离心分离10分钟，除去微生物，回收培养上清液。利用HPLC对该培养上清液中的尸胺和赖氨酸进行分析。结果如表7所示。
[表7]
将对比例6、7和实施例11、12进行比较，能够确认向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物具有显著优异的尸胺生产效率（生产速度）。由此表明，在对向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物进行培养时，通过添加赖氨酸，能够提高尸胺的生产效率。
实施例13、14，对比例8（微生物培养：与微生物表层结合有赖氨酸脱羧酶的微生物的比较）
分别对向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物（下面称为LDC分泌微生物）、以及作为微生物表层结合有赖氨酸脱羧酶的微生物（以下称为LDC细胞表层展示微生物）的在日本特开2004-298033号公报中所记载的JM109/pTM16菌株进行培养，比较尸胺的生产性。
对于W3110ΔLDC/pTM65菌株（实施例13）、W3110ΔLDC/pTM66菌株（实施例14）和JCM109/pTM16菌株（对比例8），向5mL的含有卡那霉素的LB培养基(对于JCM109/pTM16菌株，为含有氨苄青霉素的LB培养基)中，接种1白金环的各菌株，在30℃下振荡24小时，进行初步预培养。将该初步预培养液全部接种到50ml的与初步预培养相同的培养基中，在30℃、振幅30cm、120rpm的条件下培养24小时以进行预培养。接下来，将预培养液全部接种到950ml的添加了最终浓度为1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷的MS培养基（培养用培养基）中，将灭过菌的空气以0.20vvm的流速进行通气，同时在37℃、搅拌桨转速800rpm、pH被调节为7.0的条件下进行50小时的培养。中和剂使用硫酸水溶液（3M）和氨水（3M）。
培养结束后，在4℃、8,000rpm下离心分离10分钟，除去微生物，回收培养上清液。利用HPLC对所得培养上清液中的尸胺和赖氨酸进行分析。另外，葡萄糖浓度的测定使用了“Glucose C TestWako”(注册商标)（和光純薬社制）。计算尸胺对糖收率（产生的尸胺重量/消耗的葡萄糖重量）×100(%)，结果如表8所示。
[表8]
将对比例8和实施例13、14进行比较，令人惊奇的是，在对LDC分泌微生物进行培养时，与对LDC细胞表层展示微生物进行培养时的情况相比，能够确认尸胺的蓄积浓度以及对糖收率提高。
工业实用性
本发明能够合适地用于尸胺的制备。
Claims (7)
1.一种尸胺的制备方法，其特征在于，培养向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶的微生物。
2.权利要求1所述的尸胺的制备方法，其特征在于，向用于培养所述微生物的培养基中添加赖氨酸。
3.权利要求1或2所述的尸胺的制备方法，其特征在于，通过使在赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列的N末端侧添加有分泌信号肽的蛋白质在细胞内表达，所述微生物向细胞外分泌赖氨酸脱羧酶。
4.权利要求3所述的尸胺的制备方法，其特征在于，所述微生物通过具有基因构建体，使得在赖氨酸脱羧酶的氨基酸序列的N末端侧添加有分泌信号肽的蛋白质在细胞内表达，其中所述基因构建体在核酸序列的5′到3′方向上包含在该微生物中起作用的启动子序列、编码分泌信号肽的核酸序列、以及编码赖氨酸脱羧酶的核酸序列。
5.权利要求3或4所述的尸胺的制备方法，其特征在于，所述分泌信号肽为序列号13至43中的任一氨基酸序列所表示的肽。
6.权利要求1至5中任意一项所述的尸胺的制备方法，其特征在于，赖氨酸脱羧酶来源于大肠杆菌。
7.权利要求1至6中任意一项所述的尸胺的制备方法，其特征在于，所述微生物为棒状杆菌或大肠杆菌。
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