CN102634499A

CN102634499A - 新型变体红褐肉座菌cbh2纤维素酶

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Publication number: CN102634499A
Application number: CN2012100325273A
Authority: CN
Inventors: W·埃勒; R·M·考德威尔; L·丹克梅椰尔; F·格德盖布; B·R·凯莱门; C·米奇森; P·内菲; P·特尼塞恩
Original assignee: Genencor International Inc
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 2004-12-30
Filing date: 2005-12-22
Publication date: 2012-08-15
Anticipated expiration: 2025-12-22
Also published as: WO2006074005A2; WO2006074005A3; EP2292747B1; JP5148288B2; JP2012050456A; CA2592550C; CN102634499B; EP2292747A1; CN101094917B; DK2292747T3; DK2292746T3; EP1838849A2; EP2292746B1; US8715997B2; JP5848306B2; EP2302049A1; US20060205042A1; BRPI0519456A2; US8008056B2; DK2302049T3

Abstract

本发明描述了红褐肉座菌(H.jecorina)CBH2——Cel6A酶的变体。本发明提供了具有改变的热稳定性的新型纤维二糖水解酶。

Description

新型变体红褐肉座菌CBH2纤维素酶

本申请为2005年12月22日提交的，发明名称为“新型变体红褐肉座菌CBH2纤维素酶”的PCT申请PCT/US2005/047266的分案申请，所述PCT申请进入中国国家阶段的日期为2007年6月29日，申请号为200580045497.8。

相关申请的交叉参考

本申请要求下列美国临时申请的优先权：2004年12月30日提交的、题为Novel Variant Hyprocrea jecorina CBHII Cellulases的美国临时专利申请第60/640,398号(律师案卷编号GC864P)，和2005年2月25日提交的、题为Novel Variant Hyprocrea jecorina CBHII Cellulases的美国临时专利申请第60/656,863号(律师案卷编号GC864-P2)。

关于对在联邦政府资助的研究和开发项目中做出的发明的权利的声明

本工作的一部分由与美国国家再生能源实验室签定的分包合同ZCO-0-30017-01资助进行，而该分包合同隶属于与美国能源部签定的主合同DE-AC36-99GO10337。因此，美国政府可以拥有本发明的某些权利。

技术领域

本发明涉及变体纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)和编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽的分离的核酸序列。本发明也涉及核酸构建物、载体和包含所述核酸序列的宿主细胞，以及用于生产重组变体CBH多肽的方法。

参考文献

1.Sheehan and Himmel Biotechnology Progress 15，pp 817-827(1999)

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7.PDB reference 1DYS Structure and function of Humlcola insolens family 6cellulases：structure of the endoglucanase，Cel6B，at 1.6 A resolution.，Davies GJ，Brzozowski AM，Dauter M，Varrot A，Schulein M，Biochem J 2000 May15；348 Pt 1：201-7.

背景技术

纤维素(Cellulose)和半纤维素(hemicellulose)是由光合作用生成的最丰富的植物材料。它们可以被许多微生物降解并用作能量来源，这包括细菌、酵母和真菌，它们产生能够将多聚型底物水解为单体型糖的胞外酶(Aro et al.，J.Biol.Chem.，vol.276，no.26，pp.24309-24314，June 29，2001)。由于不可再生资源途径的限制，纤维素成为主要的可再生能源的潜力是巨大的(Krishna et al.，Bioresource Tech.77：193-196，2001)。通过生物学方法有效利用纤维素，是解决食品、饲料和燃料短缺的一个途径(Ohmiya et al.，Biotechnol.Gen.Engineer.Rev.vol.14，pp.365-414，1997)。

纤维素酶(Cellulases)是水解纤维素(β-1，4葡聚糖或者βD-糖苷键)导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖(cellooligosaccharides)和类似物质的酶。纤维素酶在传统上已被分为三个主要类型：内切葡聚糖酶(endoglucanases)(EC3.2.1.4)(″EG″)，外切葡聚糖酶(exoglucanases)或者纤维二糖水解酶(cellobiohydrolase)(EC 3.2.1.91)(″CBH″)和β-葡萄糖苷酶([β]-D-glucoside glucohydrolase；EC 3.2.1.21)(″BG″)。(Knowles et al.，TIBTECH 5，255-261，1987；Shülein，Methods Enzymol.，160，25，pp.234-243，1988)。内切葡聚糖酶主要作用于纤维素纤维的非晶体部分，而纤维二糖水解酶也可以降解晶体纤维素(Nevalainen and Penttila，

Mycota 303-319，1995)。因此，纤维二糖水解酶在纤维素酶体系中的存在对于晶体纤维素的有效溶解是必需的(Suurnakki，et al.Cellulose7：189-209，2000)。β-葡萄糖苷酶的作用是从纤维二糖、纤维寡糖和其它糖苷释放出D-葡萄糖单位(Freer，J.Biol.Chem.vol.268，no.13，pp.9337-9342，1993)。

已知纤维素酶是由众多的细菌、酵母和真菌产生的。一些真菌产生能够降解晶体形式的纤维素的完整纤维素酶系统，这样，纤维素酶很容易地通过发酵而大量生成。由于许多酵母，如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)缺乏水解纤维素的能力，丝状真菌起了特殊的作用。参见，例如，Aro et al.，2001；Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，eds.Aubert，J.P. et al.，Academic Press，1988；Wood et al.，Methods in Enzymology，vol.160，no.9，pp.87-116，1988，和Coughlan，et al.

″Comparative Biochemistry of Fungal and Bacterial Cellulolytic Enzyme Systems″Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，pp.11-301988。

真菌纤维素酶的CBH、EG和BG分类可以被进一步扩大，在每种类别中包括多种成分。例如，多种CBHs、EGs和BGs已经从各种真菌来源分离出来，包括里氏木霉(Trichoderma reesei)(也称为红褐肉座菌(Hypocrea jecorina))，其含有下列已知基因：2个CBHs，即CBHI(“CBH1”)和CBH II(“CBH2”)，至少8个EGs，即EG I、EG II、EG III、EG IV、EG V、EG VI、EGVII和EGVIII，和至少5个BGs，即BG1、BG2、BG3、BG4和BG5。EGIV、EGVI和EGVIII也具有木葡聚糖酶活性。

为了有效地将晶体纤维素转变为葡萄糖，完整的纤维素酶系统是必需的，其包括来自CBH、EG和BG类别中每一类的成分，而孤立的成分在水解晶体纤维素方面的有效性较小(Filho et al.，Can.J.Microbiol.42：1-5，1996)。已经观察到，在不同类别的纤维素成分之间存在协同关系。特别地，EG-型纤维素酶和CBH-型纤维素酶协同地相互作用，以更加有效地降解纤维素。参见，例如，Wood，Biochemical Society Transactions，611^th Meeting，Galway，vol.13，pp.407-410，1985。

在本领域已知，纤维素酶在织物的处理方面是有用的，可用于增强洗涤剂组合物清洁能力、用作软化剂、用于改善棉织物的手感和外观，和类似方面(Kumar et al.，Textile Chemist and Colorist，29：37-42，1997)。

已经描述了，具有改进的清洁特性的含纤维素酶的洗涤剂组合物(美国专利4,435,307号；英国申请2,095,275号和2,094,826号)，以及用于织物处理以改善织物的手感和外观的含纤维素酶的洗涤剂组分(美国专利5,648,263、5,691,178和5,776,757号；英国申请1,358,599号；The Shizuoka Prefectural Hammamatsu Textile Industrial Research Institute Report，Vol.24，pp.54-61，1986)。

因此，真菌和细菌中产生的纤维素酶受到了重大关注。特别地，已经表明，木霉属某些种(Trichoderma spp.)(例如，长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)或者里氏木霉(Trichoderma reesei))发酵生成能够降解晶体形式纤维素的完整纤维素酶系统。

尽管纤维素组合物在之前已被描述过，但仍存在着对新的和改进的纤维素组合物的需求，它们将用于家用洗涤剂、石洗组合物或者洗衣洗涤剂，等等。显示出改进性能的纤维素酶是特别令人感兴趣的。

发明概述

本发明提供了分离的纤维素酶蛋白，其在本文中被称为变体CBH2，和编码变体CBH2的核酸。

在一个实施方式中，本发明涉及变体CBH2纤维素酶，其中所述变体包含在对应于下列残基中的一个或多个的位置处的取代或者缺失：来自红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的CBH2(SEQ ID NO：2)中的残基V94、P98、G118、M120、M134、T142、L144、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、S210、I212、T214、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S386、F411、S413、A416、Q426和/或A429。在第一方面，本发明包括变体CBH2纤维素酶，其中所述变体包含在对应于下列残基中的一个或多个的位置处的取代或者缺失：来自红褐肉座菌的CBH2(SEQ IDNO：2)中的残基V94E、P98L、G118P、M120L、M134G/L/V、T142V、L144G/R/S、M145L、T148Y、T154A、L179A、Q204E、V206L、S210L/R、I212V、T214M/Y、L215I、G231N、T232V、V250I、Q276L、N285Q、S291G、G308A、T312S、S316P、V323L/N/Y、N325D、I333L、G334A、S343P、T349L/V、G360R、S380T、A381T、S386P、F411Y、S413Y、A416G、Q426E和/或A429T。

在第二个实施方式中，本发明涉及CBH2纤维素酶变体，其中所述变体包含在对应于下列残基中的一个或多个的位置处的取代或者缺失：来自红褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO：2)中的残基V94、P98、G118、M120、M134、T142、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、I212、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S386、F411、S413、A416、Q426和/或A429。在第一方面，本发明包括CBH2纤维素酶变体，其中所述变体包含在对应于下列残基中的一个或多个的位置处的取代或者缺失：来自红褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO：2)中的残基V94E、P98L、G118P、M120L、M134V、T142V、M145L、T148Y、T154A、L179A、Q204E、V206L、I212V、L215I、G231N、T232V、V250I、Q276L、N285Q、S291G、G308A、T312S、S316P、V323N、N325D、I333L、G334A、S343P、T349L、G360R、S380T、A381T、S386P、F411Y、S413Y、A416G、Q426E和/或A429T。

在第三个实施方式中，本发明包括CBH2纤维素酶变体，其中所述变体包含在对应于下列残基中的一个或多个的位置处的取代或者缺失：来自红褐肉座菌CBH2(SEQ ID NO：2)中的残基P98、M134、V206、I212、T312、S316、F411和/或S413。在第一方面，本发明包括CBH2纤维素酶变体，其中所述变体包含在对应于下列残基中的一个或多个的位置处的取代或者缺失：来自红褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO：2)中的残基P98L、M134G/L/V、V206L、I212V、T312S、S316P、F411Y和/或S413Y。

在第四个实施方式中，本发明包括CBH2纤维素酶变体，其中所述变体包含在部分区域中对应于一个或多个残基的位置处的取代或者缺失：所述部分区域选自红褐肉座菌CBH2(SEQ ID NO：2)中的(210，214)、(253，255，257，258)、(411，413，415)、(412，414，416)、(312，313)、323、(212，149，152)、(134，144)和98。在第一方面，本发明包括CBH2纤维素酶变体，其中所述变体选自来自红褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO：2)中的S316P/V323L、S316P/V323Y、V206L/S210R/S316P、V206L/S316P、V206L/S210L/T214M/S316P、V206L/S210R/T214Y/S316P、M134G/L144G/S316P、M134L/L144R/S316P和M134L/L144S/S316P。

在第五个实施方式中，本发明包括CBH2纤维素酶变体，其中所述变体包含在对应于下列残基中的一个或多个的位置处的取代或者缺失：来自红褐肉座菌CBH2(SEQ ID NO：2)中的残基P98、M134、V206、S210、T214、S316、V323和/或S413。在第一方面，本发明包括CBH2纤维素酶变体，其中所述变体包含在对应于下列残基中的一个或多个的位置处的取代或者缺失：来自红褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO：2)中的残基P98L、M134L/V、L144R、V206L、S210L/R、T214Y、S316P、V323Y和/或S413Y。在第二方面中，本发明包括CBH2纤维素酶变体，其中所述变体选自来自红褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO：2)中的98L/134V/206L/210R/214Y/316P/413Y、98L/134L/144R/316P/413Y、98L/134L/144R/206L/210R/214Y/316P/413Y、98L/134V/316P/323Y/413Y、98L/134V/206L/210R/214Y/316P/323Y/413Y、98L/134L/144R/316P/323Y/413Y、98L/134L/144R/206L/210R/214Y/316P/323Y/413Y、98L/134L/144R/210R/214Y/316P/323Y/413Y和98L/134L/144R/210L/214Y/316P/323Y/413Y。

在第六个实施方式中，本发明包括分离的核酸，其编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽。

在第一方面中，本发明包括分离的核酸，其编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽，该多肽是糖基水解酶家族6的变体，并且其中所述核酸编码在所述核酸编码的多肽中对温度压力敏感的残基上的缺失，其中所述纤维二糖水解酶变体源生于红褐肉座菌纤维二糖水解酶。在第二方面，本发明包括分离的核酸，其编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽，该多肽是糖基水解酶家族6的变体，并且其中所述核酸编码在所述核酸编码的多肽中实现酶可加工性的残基上的取代，其中所述纤维二糖水解酶变体源于红褐肉座菌纤维二糖水解酶。在第三方面，本发明包括分离的核酸，其编码具有纤维二糖水解酶活性的多肽，该多肽是糖基水解酶家族6的变体，并且其中所述核酸编码在所述核酸编码的多肽中实现产物抑制的残基上的取代，其中所述纤维二糖水解酶变体源于红褐肉座菌纤维二糖水解酶。

在另一方面，本发明涉及编码CBH2纤维素酶变体的分离的核酸，其中所述变体包含在对应于下列残基中的一个或多个的位置处的取代：来自红褐肉座菌CBH2(SEQ ID NO：2)中的残基V94、P98、G118、M120、M134、T142、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、I212、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、 S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S390、F411、S413、A416、Q426和/或A429。

在第七个实施方式中，本发明涉及表达盒，其包含编码CBH2变体的核酸。在一方面，存在这样的构建物，其包含可操纵性连接到调节序列的编码CBH2变体的核酸。

在第八个实施方式中，本发明涉及载体，其包含编码CBH2变体的核酸。在一方面，存在这样的构建物，其包含可操纵性连接到调节序列的编码CBH2变体的核酸。

在第九个实施方式中，本发明涉及宿主细胞，其用包含编码CBH2变体的核酸的载体转化。

在第十个实施方式中，本发明涉及产生CBH2变体的方法，包括步骤：

(a)在合适的条件下，在合适的培养基中，培养用包含编码CBH2变体的核酸的载体转化的宿主细胞，以产生CBH2变体；

(b)获得所述产生的CBH2变体。

在第十一个实施方式中，本发明涉及含有表面活性剂和CBH2变体的洗涤剂组合物。在本实施方式的一个方面，该洗涤剂是洗衣洗涤剂。在本实施方式的第二方面，该洗涤剂是盘碟洗涤剂。在本实施方式的第三方面，所述CBH2变体被用于含有纤维素的织物的处理，特别地，用于石洗或者靛青染色的粗斜棉布。

在第十二个实施方式中，本发明涉及含有CBH2变体的饲料添加剂。

在第十三个实施方式中，本发明涉及处理木浆的方法，包括将所述木浆和CBH2变体接触。

在第十四个实施方式中，本发明涉及将生物物质(biomass)转化为糖的方法，包括使所述生物物质和CBH2变体接触。

在一个实施方式中，所述纤维素酶来源于真菌、细菌或放线菌。在一个方面，所述纤维素酶来源于真菌。在另一方面，真菌是丝状真菌。优选的是，所述丝状真菌属于真子囊菌(Euascomycete)，具体而言，属于曲霉属某些种(Aspergillus spp.)、粘帚霉属某些种(Gliocladium spp.)、镰刀霉属某些种(Fusarium spp.)、支顶孢属某些种(Acremonium spp.)、Myceliophtora spp、轮生菌属某些种(Verticillium spp.)、漆斑菌属某些种(Myrothecium spp.)或青霉属某些种(Penicillium spp.)。在本实施方式的进一步的方面，纤维素酶是纤维二糖水解酶。

通过下面的详细描述，本发明的其它目标、特征和优势将变得明显。然而，应当理解，该详细描述和具体实施例，尽管指出本发明的优选实施方式，但是仍仅以举例说明的方式给出，因为通过本详细描述，在本发明的范围和精神内各种变化和改变对于本领域的普通技术人员将是显然的。

附图简述

图1是来自红褐肉座菌的野生型Cel6A(CBH2)的氨基酸(SEQ ID NO：2)序列，即图1示出了红褐肉座菌(图3中的P07987)CBH2氨基酸序列。

图2是野生型红褐肉座菌CBH2的核酸序列(SEQ ID NO：1)，即图2示出了CBH2(M16190)的cDNA序列。

图3A-C显示了具有可获得的晶体结构的Cel6家族成员的氨基酸序列比对。所述序列是：异常腐质霉(Humicola insolens)CBH2、支顶孢属CBH2、伞菌属(Agaricus)CBH2、尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)CBH2、康宁肉座菌(Hypocrea koningii)CBH2、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)CBH2、Talaromyces emersonii CBH2、里氏木霉(T.reesei)即红褐肉座菌CBH2、和共有序列。采用Vector NTI Suite软件程序，通过空位罚分为10的Clustal W，进行比对，即图3比对了红褐肉座菌CBH2与来源于异常腐质霉(Humicola insolens)(Q9C1S9)、Acremonium cellulotyticus(093837)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)(P49075)、康宁肉座菌(Hypocrea koningii)(AF315681)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)(S76141)、Talaromyces emersonii(Q8N1B5)、香菇(Lentinula edodes)(AF411251)、红褐肉座菌(P07987)的分子。

图4是pRAX1载体。该载体是以质粒pGAPT2为基础，不同的是构巢曲霉(Aspergillus nidulans)基因组DNA片段AMA1序列的5259bp的HindIII片段(Aleksenko and Clutterbuck，Molecular Microbiology 1996 19：565-574)被插入。碱基1-1134包含黑曲霉葡糖淀粉酶基因启动子。碱基3098至3356和4950至4971包含黑曲霉葡糖淀粉酶终止子。构巢曲霉pyrG基因被插入到3357至4949，作为真菌转化的标记(marker)。存在可以插入基因的多克隆位点(multiple cloning site(MCS))。

图5是pRAXdes2载体骨架，即图5示出了在黑曲霉中表达的目标载体pRAXdes2。此载体是基于质粒载体pRAX1。Gateway序列盒(Gateway cassette)已被插入pRAX1载体(用环状质粒内的箭头表示)。此序列盒含有重组序列attR1和attR2和选择性标记物(marker)catH和ccdB。该载体是根据Gateway^TM Cloning Technology第一版34-38页中的指南被制备，并且仅可以在Invitrogen的大肠杆菌DB3.1中复制；在其它大肠杆菌宿主中，ccdB基因是致命的。首先，用含有attB1/2重组序列的引物获得PCR片段。将此片段与pDONR201(可以从Invitrogen公司购得)重组；此载体含有attP1/2重组序列，catH和ccdB位于重组位点之间。应用Invitrogen的BP clonase酶，将该PCR片段重组到被称为ENTRY的载体中，带有插入的PCR片段的克隆可以用50μg/ml卡那霉素选择出来，原因是表达ccdB的克隆不存活。现在，att序列被改变，并且被称为attL1和attL2。第二个步骤是，用pRAXdes2载体(在重组位点之间含有attR1和attR2catH和ccdB)重组此克隆。应用Invitrogen的LP clonase酶，将来自ENTRY载体的插入片段重组到目标载体(destination vsctor)中。应用100μg/ml氨苄青霉素，仅pRAXCBH1载体被选择出来，原因是ccdB是致命的，而且ENTRY载体对氨苄青霉素敏感。通过这种方法，现在，表达载体得以制备并且可以用于转化黑曲霉。

图6提供了对pRAXdes2cbh2载体的说明，该载体被用于在曲霉菌中表达编码CBH2变异体的核酸。通过att序列的同源重组，编码CBH2酶同源物或者变异体的核酸被克隆入该载体，即图6显示了在葡糖淀粉酶启动子的调控下，CBH2基因的复制表达pRAXdes CBH2载体(在该图中以CBH2示出的CBH2基因是attB1-CBH2-attB2基因构建物)。

图7提供了pENTRY-CBH2载体的说明，即图7示出了用于通过Gateway技术制备表达载体pRAXdes CBH2的pENTRY-CBH2，并作为Quikchange多定点突变的模板。

图8是不同变体从磷酸膨胀的纤维素剂量依赖性释放糖的图。所述变体展示出对该底物宽范围的活性。

图9是由变体产生的(平均)总糖与由野生型CBH2产生的(平均)总糖之间比率的柱状图，如对PASC所测量的。

图10是显示了通过改变酶量所释放的糖量的图。野生型酶被表示为FCA500.3(空心菱形)，而所述变体是FCA543(P98L/M134V/T154A/I212V/S316P/S413Y)(空心正方形)。来自CBH2缺失株的培养基作为对照。

图11是由变体产生的(平均)总糖与由野生型CBH2产生的(平均)总糖之间比率的柱状图，如对预处理玉米秸秆所测量的。y轴的最小刻度值为0.6，表示由CBH2缺失株产生的(平均)总糖除以由野生型CBH2联合CBH2缺失株产生的(平均)总糖的值。值1表示与野生型相似的活性水平。

图12是时程试验(time course experiment)的图。在53℃下，通过CBH2分子，随时间从PASC释放的总糖被示出。变体以实心三角形(▲)表示；野生型以空心正方形(□)表示。

图13是时程试验的图。在65℃下，通过CBH2分子，随时间从PASC释放的总糖被示出。变体以实心三角形(▲)表示；野生型以空心正方形(□)表示。

图14是时程试验的图。在75℃下，通过CBH2分子，随时间从PASC释放的总糖被示出。变体以实心三角形(▲)表示；野生型以空心正方形(□)表示。

图15是描绘在38℃下纤维素酶混合物的具体性能的图。该混合物含有嗜酸耐热菌(Acidothermus cellulolyticus)E1催化核心以及或者野生型或者变体纤维二糖水解酶。野生型被标明为301、500，其表示野生型CBH1(即301)和野生型CBH2(即500)被使用。变体被标明为469、543，其表示变体CBH1(即469)和变体CBH2(即543)被使用。

图16是描绘在65℃下纤维素酶混合物的具体性能的图。该混合物含有嗜酸耐热菌(Acidothermus cellulolyticus)E1催化核心以及或者野生型或者变体纤维二糖水解酶。野生型被标明为301、500，其表示野生型CBH1(即301)和野生型CBH2(即500)被使用。变体被标明为469、543，其表示变体CBH1(即469)和变体CBH2(即543)被使用。

图17是在上面图16中所述的变体纤维素酶混合物在不同温度下的小规模糖化转化试验的图。

发明详述

现在，将通过参考下面的定义和实施例来详细描述本发明。此处提及的所有的专利和出版物，包括在这些专利和出版物中公开的序列，都特意地以引用方式并入。

除非本文另有定义，此处应用的所有技术术语和科学术语，皆具有本发明所属领域的普通技术人员所普遍理解的含义。Singleton，et al.，DICTIONARY OF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY，2D ED.，John Wiley and Sons，New York(1994)和Hale & Marham，THE HARPER COLLINS DICTIONARY OF BIOLOGY，Harper Perennial，NY(1991)向技术人员提供了本发明中应用的许多术语的一般性解释。尽管与此处描述的方法和材料相似或者等价的任意方法和材料可以被用于本发明的实践或者试验中，但仍描述了优选的方法和材料。数字范围包括用于限定该范围的端值。除非另有指明，核酸以5’-3’的方向从左至右书写；氨基酸序列以氨基末端向羧基末端的方向从左至右书写。关于本领域的定义和术语，实践者可以特别地参考Sambrook et al.，MOLECULAR CLONING：A LABORATORY MANUAL(Second Edition)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.，1989和Ausubel FM et al.，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，New York，NY，1993。应该理解，本发明不限于所描述的具体的方法学、方案和试剂，因为它们可以变化。

本文提出的标题不是对本发明各个方面或者各种实施方案的限制，可以通过参考整个说明书来考虑它们。因此，通过将说明书作为一个整体来参考，下面即将被定义的术语可以被更加全面地定义。

本文引用的所有出版物均特意地通过引用方式并入本文，以用于描述和揭示可能与本发明联系使用的组合物和方法学。

1.定义

如此处所使用，术语“多肽”(“polypeptide”)是指通过肽键连接的单链氨基酸残基。如此处所使用，术语“蛋白质”(“protein”)可以与术语“多肽”同义。

“变体”(“variant”)是指衍生于前体蛋白质(例如，天然蛋白质)的蛋白质，其通过向C末端和N末端的任一端或两端添加一个或多个氨基酸、在氨基酸序列的一个位点或者许多不同位点处一个或者多个氨基酸的取代、或在蛋白质的一端或两端或者在氨基酸序列的一个或者多个位点上一个或多个氨基酸的缺失而生产。通过修饰编码天然蛋白质的DNA序列，将该修饰的DNA序列转化到合适的宿主，并表达该修饰的DNA序列以形成酶变异体，酶变体的制备得以优选地完成。本发明的CBH2酶变体包括这样的肽，与前体酶氨基酸序列相比，其含有改变的氨基酸序列，其中该变体CBH2酶保留了前体酶的特征性的纤维水解性质，但是在一些特定方面可以具有改变的性质。例如，变体CBH2酶可以具有增加的最适pH，或者具有增加的温度或氧化稳定性，但仍保持其特征性的纤维水解活性。预期根据本发明的变体可以来源于编码纤维素变体CBH2酶的DNA片段，其中所表达的纤维素酶变体的功能性活性被保留。例如，编码纤维素酶的DNA片段还可以包括编码在5′或3′端连接于纤维素酶DNA序列的铰链或连接体的DNA序列或其部分，其中所编码的纤维素酶结构域的功能性活性被保留。术语变体和衍生物在本文中可以互换使用。

“等价残基(equivalent residues)”也可以被定义，通过在前体纤维素酶的三级结构水平上确定同源性，所述前体纤维素酶的三级结构已经通过X射线晶体学确定。等价残基被定义为这样的残基，对于它们来说，纤维素酶和红褐肉座菌CBH在联配(alignment)之后，特定氨基酸残基的主链原子(N对N，CA对CA，C对C和O对O)中的2个或者更多个的原子坐标是在0.13nm内，优选地在0.1nm内。在讨论红褐肉座菌CBH2时，联配是在最佳模型已经被定向和定位从而得到纤维素酶的非氢蛋白原子的原子坐标的最大重叠之后实现的。所述的最佳模式是在可利用的最高分辨率下对于衍射实验数据给出最低R因子的晶体学模型。

在功能上类似于红褐肉座菌CBH2特定残基的等价残基被定义为纤维素酶的那些氨基酸，其可以采用一种构象，以致于它们以限定或影响红褐肉座菌CBH2特定残基的方式，改变、修饰或者影响蛋白质的结构、底物结合或者催化作用。进一步地，它们是纤维素酶(其三级结构已经通过X射线晶体学获得)的那些残基，其占据相似的位置，所述的相似达到了这样的程度，虽然给定残基的主链原子可能不满足基于占据同源位置的等价标准，但是残基的侧链原子中的至少2个的原子坐标位于红褐肉座菌CBH2的对应侧链原子的0.13nm内。红褐肉座菌CBH2的晶体结构在Zou et al.(1999)(见上参考文献5)中被示出。

术语“核酸分子”包括RNA、DNA和cDNA分子。可以理解的是，由于遗传密码的简并性，编码一种给定蛋白如CBH2和/或其变体的多个核苷酸序列可以产生。本发明涵盖了每一种可能的变异体核苷酸序列，其编码变体CBH2，所有的序列都可能被赋予遗传密码的简并性。

“异源的”核酸构建物或序列具有与表达它的细胞不存在天然联系的序列的一部分。有关于调控序列的异源序列，是指调节基因的表达的控制序列(即，启动子或者增强子)，但是在自然界它并不调节现在它所调节的基因的表达。通常地，异源核酸序列对于其所存在的细胞或者基因组部分不是内源性的，而是通过感染、转染、转化、微注射、电穿孔或者类似方法被加入该细胞。“异源的”核酸构建物可以含有调控序列/DNA编码序列组合，该组合可以与天然细胞中发现的调控序列/DNA编码序列组合相同或者不同。

如此处所应用，术语“载体”是指设计用于在不同宿主细胞之间转移的核酸构建物。“表达载体”是指具有整合异源DNA片段和在外源细胞中表达异源DNA片段的能力的载体。许多原核细胞和真核细胞表达载体是商业上可得到的。对合适载体的选择在本领域技术人员的知识范围内。

因此，“表达序列盒”或者“表达载体”是重组产生或者合成产生的核酸构建物，其带有允许特定核酸在靶细胞中转录的一系列特定核酸元件。重组表达序列盒可以被并入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或者核酸片段。典型地，其他序列之外，表达载体的重组表达序列盒部分包括将被转录的核酸序列和启动子。

如此处所应用，术语“质粒”是指环状双链(ds)DNA构建物，其用作克隆载体，并且在许多细菌和一些真核细胞中形成染色体外的自我复制遗传元件。

如此处所应用，术语“编码选择性标记物的核苷酸序列”是指能够在细胞中表达的核酸序列，并且选择性标记物的表达使含有该被表达的基因的细胞能够在存在相应的选择试剂的条件下或者在相应的选择生长条件下生长。

如此处所应用，术语“启动子”是指核酸序列，其功能是指导下游基因的转录。启动子通常适用于表达靶基因的宿主细胞。启动子连同其它转录调节核酸序列和翻译调节核酸序列(也被称为“调控序列”)，对表达特定的基因是必需的。通常地，转录调节序列和翻译调节序列包括但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始序列和转录终止序列、翻译起始序列和翻译终止序列，以及增强子或者激活子序列。

如此处所定义，“嵌合基因”或者“异源核酸构建物”是指非天然的基因(即，已被导入到宿主中的基因)，其可以由不同的基因部分组成，包括调控元件。典型地，用于转化宿主细胞的嵌合基因构建物包括转录调控区域(启动子)，其可操作性地连接于异源蛋白编码序列，或者，在选择性标记物嵌合基因的情形中，其可操作性地连接于选择性标记物基因，该基因编码使转化细胞具有例如抗生素抗性的蛋白。本发明的用于转化入宿主细胞的典型嵌合基因包括，组成型或者诱导型转录调控区、蛋白编码序列和终止子序列。如果需要分泌靶蛋白，嵌合基因构建物也可以包括编码信号肽的另一个DNA序列。

当一个核酸被置于与另一个核酸序列的功能联系中时，该核酸便是“可操纵性连接的(operably linked)”。例如，如果多肽是以参与该多肽的分泌的前蛋白形式被表达，那么编码分泌型前导序列的DNA便与该多肽的DNA是可操纵性连接的；如果启动子或增强子可影响编码序列的转录，那么该启动子或增强子便是可操纵性连接于该序列；或者，如果核糖体结合位点被定位以致于可协助翻译，那么该核糖体结合位点便是可操纵性连接于编码序列。通常地，“可操纵性连接”意味着被连接的DNA序列是相邻的，而且在促分泌前导序列的情形中，是相邻的和处于正确的阅读框架中的。然而，增强子不一定是相邻的。连接可以通过在方便的限制性位点进行连接而完成。如果这样的位点不存在，可以按照常规的实践，应用合成的寡核苷酸接头、连接子或PCR引物。

如此处所应用，术语“基因”是指参与生成多肽链的DNA片段，可以包括或者不包括编码区之前的区域和之后的区域，例如，5’非翻译区(5’UTR)或者“前导”序列和3’UTR或者“尾部”序列，也可以包括或者不包括各个编码片段(外显子)之间的间插序列(内含子)。

一般来说，在中度至高度严紧(stringency)的条件下，编码变异体CBH2的核酸分子会和本文提供为SEQ ID NO：1的野生型序列杂交。然而，在一些情形下，应用的是具有基本上不同的密码子使用的编码CBH2的核苷酸序列，而由该编码CBH2的核苷酸序列编码的蛋白质具有和天然蛋白质相同的或者大体上相同的氨基酸序列。例如，根据特定密码子被宿主应用的频率，编码序列可以被修饰以有利于CBH2在特定原核细胞或者真核细胞表达系统中更快地表达。例如，Te′o，et al.(FEMS Microbiology Letters 190：13-19，2000)描述了在丝状真菌中表达基因的最优化方式。

如果两个序列在中度至高度严紧的杂交和洗脱条件下彼此特异地杂交，那么便认为其中一个核酸序列对于另一个参照核酸序列，是“可选择性地杂交”的。杂交条件基于核酸结合复合物或者探针的解链温度(Tm)。例如“最大的严紧性”典型地发生在大约Tm-5℃(低于探针的Tm 5℃)；“高严紧性”发生在低于Tm大约5-10℃；“中度”或者“中间严紧性”发生在低于探针的Tm大约10-20℃；“低严紧性”发生在低于Tm大约20-25℃。从功能上来说，最大严紧条件可以被用来鉴定与杂交探针具有严格同一性或者接近严格的同一性的序列；而高严紧条件被用来鉴定与探针具有大约80％或者更多的序列同一性的序列。

中度严紧和高度严紧的杂交条件在本领域是公知的(参见，例如，Sambrook，et al，1989，Chapters 9and 11，以及Ausubel，F.M.，et al.，1993，在此特意地并入作为参考)。高度严紧条件的例子包括，在大约42℃，在50％甲酰胺、5×SSC、5×Denhardt′s溶液、0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中杂交，随后，用2×SSC和0.5％SDS室温洗涤2次，用0.1×SSC和0.5％SDS在42℃再洗涤2次。

如此处所使用，术语“重组体”，当用于细胞或者载体时，表示该细胞或者载体已经通过异源性核酸序列的导入而被修饰，或者该细胞衍生于如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞表达在该细胞的天然(非重组)形式中未发现的相同形式的基因，或者由于精细的人为干预，表达的是天然基因，但是该天然基因在其它情况下是异常地表达、表达不足或者根本不表达。

如本文所应用，当用于描述细胞时，术语“转化的”、“稳定转化的”或者“转基因的”是指该细胞具有非天然的(异源的)核酸序列，其被整合入细胞的基因组中或者作为附加体质粒，经过多代之后依然被维持。

如本文所应用，术语“表达”是指根据基因的核酸序列产生多肽的过程。此过程既包括转录又包括翻译。

在谈及将核酸序列插入到细胞中时，术语“导入”是指“转染”或者“转化”或者“转导”，包括将核酸序列整合到真核细胞或者原核细胞中，其中所述核酸序列可以被并入到细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或者线粒体DNA)，转变为自主复制子，或者短暂地表达(例如，转染的mRNA)。

接下来，术语“CBH2表达”是指cbh2基因或其变体的转录和翻译，其产物包括前体RNA、mRNA、多肽、翻译后加工的多肽、以及它们的衍生物，包括来自相关种例如康宁木霉(Trichoderma koningii)、红褐肉座菌(也称为长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉、绿色木霉(Trichoderma viride))和施韦尼兹肉座菌(Hypocrea schweinitzii)的CBH2。作为例子，对CBH2表达的分析包括CBH2蛋白的蛋白质印迹(Western blot)、cbh2mRNA的RNA印迹(Northern blot)分析和反转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)分析，以及磷酸膨胀纤维素和PAHBAH测定(Phosphoric Acid Swollen Cellulose and PAHBAH assays)，如在(a)PASC：(Karlsson，J.et al.(2001)，Eur.J.Biochem，268，6498-6507，Wood，T.(1988)inMethods in Enzymology，Vol.160.Biomass Part a Cellulose and Hemicellulose(Wood，W.& Kellog，S.Eds.)，pp.19-25，Academic Press，San Diego，CA，USA)和(b)PAHBAH：(Lever，M.(1972)Analytical Biochemistry，47，273，Blakeney，A.B. & Mutton，L.L.(1980)Journal of Science of Food and Agriculture，31，889，Henry，R.J.(1984)Journal of the Institute of Brewing，90，37)中所描述。

术语“选择性剪接”是指由单一的基因产生多个多肽异构体的过程，其涉及将不连续的外显子通过剪接方式连在一起，这发生在一些但不是所有的基因转录物的加工过程中。因此特定的外显子可以与数个可供选择的外显子中的任意一个相连，以形成信使RNA。选择性剪接的mRNA生成多肽(“剪接变异体”)，其中一些部分是共同的，而其它部分是不同的。

术语“信号序列”是指蛋白质N端部分的氨基酸序列，其帮助成熟形式的蛋白质分泌出细胞。成熟形式的胞外蛋白缺乏信号序列，其在分泌过程中被切割。

术语“宿主细胞”是指含有载体并支持表达构建物的复制和/或转录或者转录和翻译(表达)的细胞。用于本发明的宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌，或者真核细胞，如酵母、植物、昆虫、两栖动物或者哺乳动物细胞。通常地，宿主细胞是丝状真菌。

术语“丝状真菌”是指本领域普通技术人员所认识的任何和所有丝状真菌。优选的真菌选自曲霉属(Aspergillus)、木霉属(Trichoderma)、镰孢菌属(Fusarium)、金孢菌属(Chrysosoporium)、青霉属(Penicillium)、腐质霉属(Humicola)、脉孢菌属(Neurospora)、或可选地，它们的有性形式例如肉座菌属(Emericella)、肉座菌属(Hypocrea)。现已证明无性工业真菌里氏木霉(Trichoderma reesei)是真子囊菌红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的克隆衍生物。参见Kuhls et al.，PNAS(1996)93：7755-7760。

术语“纤维寡糖(cellooligosaccharide)”是指含有2-8个葡萄糖单元并具有β-1，4键的寡糖组，例如纤维二糖。

术语“纤维素酶”是指酶的一个种类，其能够将纤维素多聚物水解为较短的纤维寡糖寡聚物、纤维二糖和/或葡萄糖。纤维素酶的许多例子，如外切葡聚糖酶、外切纤维二糖水解酶、内切葡聚糖酶和葡糖苷酶已经从可水解纤维素的生物体中获得，特别地，包括真菌、植物和细菌。

来自红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的CBH2是糖基水解酶家族6(因此称为Cel6)的一个成员，特别地，是该家族(Cel6)在红褐肉座菌中鉴定的第一个成员。糖基水解酶家族6既含有内切葡聚糖酶又含有纤维二糖水解酶/外切葡聚糖酶，CBH2是后者。因此，短语CBH2、CBH2-型蛋白和Cel6纤维二糖水解酶在此可以互换地应用。

如此处所应用，术语“纤维素结合结构域(cellulose binding domain)”是指纤维素酶的部分氨基酸序列，或者该酶的一个区域，其参与纤维素酶或其衍生物的纤维素结合活性。纤维素结合结构域通常通过将该纤维素酶非共价地结合于纤维素、纤维素衍生物或者它们的其它多糖等价物而起作用。纤维素结合结构域允许或有助于通过结构上不同的催化核心区域进行纤维素纤维的水解，并且，典型地，它们独立于催化核心而起作用。因此，纤维素结合结构域不具有显著的水解活性，水解活性可归因于催化核心。换言之，纤维素结合结构域是纤维素酶蛋白三级结构中不同于具有催化活性的结构元件的结构元件。纤维素结合结构域和纤维素结合组件(cellulose binding module)在本文中可以互换使用。

如本文中所使用的，术语“表面活性剂”是指在本领域通常被认为具有表面活性性质的任何化合物。因此，例如，表面活性剂包括阴离子、阳离子表面活性剂和非离子型表面活性剂，如通常发现于洗涤剂中的那些表面活性剂。阴离子表面活性剂包括线性的或者分支的烷基苯磺酸盐；具有线性或分支烷基基团或者烯基基团的烷基或烯基醚硫酸盐；烷基或烯基硫酸盐；烯烃磺酸盐和烷基磺酸盐。兼性表面活性剂(两性表面活性剂)包括季铵磺酸盐和甜菜碱型兼性表面活性剂。这样的兼性表面活性剂在同一分子中既有正电荷基团又有负电荷基团。非离子型表面活性剂可以包括聚乙二醇，以及更高级的脂肪酸链烷醇酰胺或者其氧化烯加合物、脂肪酸甘油单酯和类似物。

如本文所应用，术语“含纤维素的织物(cellulose containing fabric)”是指任何缝制或者非缝制的织物、纱或者纤维，由含棉或者不含棉的纤维素制成，或者由含棉或者不含棉的纤维素混合物制成，包括天然纤维素和人造纤维素(如黄麻、亚麻、苎麻、人造丝和莱赛尔纤维(lyocell))。

如本文中所使用的，术语“含棉织物(cotton-containing fabric)”指缝制或者非缝制的织物、纱或纤维，其由纯棉或棉混合物制成，棉混合物包括棉织物(cotton woven fabrics)、棉编织物(cotton knits)、斜纹粗棉布(cotton denims)、棉纱(cotton yarns)、原棉和类似物。

如本文中所应用，术语“石洗组合物(stonewashing composition)”是指用于石洗含纤维素的织物的制剂。石洗组合物被用于在出售之前，即，在生产过程中修饰含纤维素的织物。与之不同，洗涤剂组合物主要用于清洁污染的衣服，而不是用在生产过程中。

如本文中所应用，术语“洗涤剂组合物(detergent composition)”是指打算应用于洗涤介质中用于洗涤污染的含纤维素织物的混合物。就本发明来说，除了纤维素酶和表面活性剂，这样的组合物还可以包括另外的水解酶、增洁剂、漂白剂、漂白催化剂、蓝色漂白剂(bluing agents)和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂(masking agents)、纤维素酶激活剂、抗氧化剂和增溶剂。

如本文中所应用，术语“cbh2基因表达的降低或者消除”是指cbh2基因已经从基因组中剔除，因此不能被重组宿主微生物表达，或者cbh2基因已经被修饰以致于有功能的CBH2酶不能被宿主微生物产生。

术语“变异体cbh2基因”，或者“变异体CBH2”分别指，来自红褐肉座菌的cbh2基因的核酸序列已经通过去除、增加和/或操纵编码序列而被改变，或者被表达的蛋白的氨基酸序列已经被修饰，与本文所描述的发明一致。

如本文中所应用，术语“纯化”通常是指使含转基因核酸或蛋白的细胞经受生化纯化和/或柱层析。

如本文中所应用，术语“活性的”或者“生物活性的”是指与特定蛋白相关联的生物活性，它们在此可以互换应用。例如，与蛋白酶相关联的酶活性是蛋白水解，因此，活性蛋白酶具有蛋白水解活性。这样，特定蛋白的生物活性是指本领域技术人员通常认为该蛋白具有的任何生物活性。

如本文所使用，术语“富集的(enriched)”是指CBH2的浓度大于在野生型或天然存在的真菌纤维素酶组合物中发现的CBH2浓度。术语富集的、升高的(elevated)、增强的(enhanced)在本文中可以互换使用。

野生型真菌纤维素酶组合物是由天然存在的真菌来源产生的组合物并且其包含一种或多种BGL、CBH、EG成分，其中这些成分的每一种以所述真菌来源产生的比率被发现。因此，富集的CBH组合物将具有改变的比率的CBH，其中CBH与其它纤维素酶(即，EGs、β葡糖苷酶和其它内切葡聚糖酶)的比率被升高。该比率可以通过由本领域已知的任何方式增加CBH或降低(或消除)至少一种其它成分而被增加。

如此处所使用，术语“分离的”或“纯化的”是指核酸或氨基酸从与其天然相关的至少一种成分移出。

因此，为了举例说明，通过文献中充分公开的公认的分离技术，包括在合适的pH下的离子交换层析、亲合层析、大小排阻和类似技术，天然存在的纤维素酶系统可以被纯化成基本上纯的成分。例如，在离子交换层析(通常为阴离子交换层析)中，通过用pH梯度、盐梯度、或同时用pH和盐梯度洗脱，分离纤维素酶成分是可能的。然后，纯化的CBH可以被加到酶促溶液，得到富集的CBH溶液。采用分子遗传方法以过表达编码CBH的基因，增加微生物产生的CBH的量是可能的，这可能与缺失一种或多种编码其它纤维素酶的基因相结合。

真菌纤维素酶可以含有一种以上CBH成分。不同的成分通常具有不同的等电点，这使得可以通过离子交换层析和类似方法分离它们。单个CBH成分或CBH 成分的组合可以被用在酶促溶液中。

当应用于酶溶液时，同源或者变异CBH2成分通常被加入的量足以允许可溶性糖以最大速度从生物物质中释放出来。加入的CBH2同源物或者变异体的量取决于要被糖化的生物物质的类型，这可以被技术人员容易地确定。当被应用时，在纤维素组合物中存在的CBH2同源物或者变异体成分的重量百分比优选地在1和100之间，示例性例子为大约1、优选地大约5、优选地大约10、优选地大约15或者优选地大约20的重量百分比至优选地大约25、优选地大约30、优选地大约35、优选地大约40、优选地大约45或者优选地大约50的重量百分比。进一步地，优选的范围可以是，大约0.5至大约15的重量百分比、大约0.5至大约20的重量百分比、从大约1至大约10的重量百分比、从大约1至大约15的重量百分比、从大约1至大约20的重量百分比、从大约1至大约25的重量百分比、从大约5至大约20的重量百分比、从大约5至大约25的重量百分比、从大约5至大约30的重量百分比、从大约5至大约35的重量百分比、从大约5至大约40的重量百分比、从大约5至大约45的重量百分比、从大约5至大约50的重量百分比、从大约10至大约20的重量百分比、从大约10至大约25的重量百分比、从大约10至大约30的重量百分比、从大约10至大约35的重量百分比、从大约10至大约40的重量百分比、从大约10至大约45的重量百分比、从大约10至大约50的重量百分比、从大约15至大约60的重量百分比、从大约15至大约65的重量百分比、从大约15至大约70的重量百分比、从大约15至大约75的重量百分比、从大约15至大约80的重量百分比、从大约15至大约85的重量百分比、从大约15至大约95的重量百分比。然而，当被应用时，CBH2同源物或者变异体成分相对于纤维素酶组合物中存在的EG类型成分的重量百分比是从优选地大约1、优选地大约5、优选地大约10、优选地大约15或者优选地大约20的重量百分比至优选地大约25、优选地大约30、优选地大约35、优选地大约40、优选地大约45或者优选地大约50的重量百分比。进一步地，优选的范围可以是，大约0.5至大约15的重量百分比、大约0.5至大约20的重量百分比、从大约1至大约10的重量百分比、从大约1至大约15的重量百分比、从大约1至大约20的重量百分比、从大约1至大约25的重量百分比、从大约5至大约20的重量百分比、从大约5至大约25的重量百分比、从大约5至大约30的重量百分比、从大约5至大约35的重量百分比、从大约5至大约40的重量百分比、从大约5至大约45的重量百分比、从大约5至大约50的重量百分比、从大约10至大约20的重量百分比、从大约10至大约25的重量百分比、从大约10至大约30的重量百分比、从大约10至大约35的重量百分比、从大约10至大约40的重量百分比、从大约10至大约45的重量百分比、从大约10至大约50的重量百分比、从大约15至大约20的重量百分比、从大约15至大约25的重量百分比、从大约15至大约30的重量百分比、从大约15至大约35的重量百分比、从大约15至大约30的重量百分比、从大约15至大约45的重量百分比、从大约15至大约50的重量百分比。

II.宿主生物体

丝状真菌包括所有丝状形式的真菌亚门(Eumycota)和卵菌亚门(Oomycota)。丝状真菌的特征在于营养菌丝，其具有由几丁质、葡聚糖、壳聚糖、甘露聚糖和其它复杂多糖组成的细胞壁，营养生长是通过菌丝的延长，碳分解代谢是专性好氧的。

在本发明中，丝状真菌亲代细胞可以是下述种—但不限于这些种—的细胞：木霉，如长梗木霉(Trichoderma longibrachiatum)、绿色木霉(Trichoderma viride)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)；青霉属某种(Penicillium sp.)；腐质霉属某种(Humicola sp.)包括异常腐质霉(Humicola insolens)和灰腐质霉(Humicola grisea)；金孢菌某种(Chrysosporium sp.)包括拉克淖金孢菌(C. lucknowense)；粘帚霉某种(Gliocladium sp.)；曲霉属某种；镰孢菌属某种(Fusarium sp.)、脉孢菌属某种(Neurospora sp.)、肉座菌属某种(Hypocrea sp.)和裸孢壳属某种(Emericella sp.)。如本文中所使用的，术语“木霉”或“木霉属某种”指之前已被归入木霉属的任何真菌菌株或目前被归入木霉属的任何真菌菌株。

在一种优选实施方案中，丝状真菌亲代细胞是黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、棘孢曲霉(Aspergillus aculeatus)或构巢曲霉(Aspergillus nidulans)细胞。

在另外一种优选实施方案中，丝状真菌亲代细胞是里氏木霉细胞。

III.纤维素酶

在本领域中，已知纤维素酶是水解纤维素(β-1，4葡聚糖或者βD-葡糖苷键)从而导致形成葡萄糖、纤维二糖、纤维寡糖和类似物质的酶。如前面所阐明，纤维素酶传统地被分为三个主要类型：内切葡聚糖酶(EC 3.2.1.4)(″EG″)、外切葡聚糖酶或者纤维二糖水解酶(EC 3.2.1.91)(″CBH″)和β-葡糖苷酶(EC 3.2.1.21)(″BG″)(Knowles，et al.，TIBTECH 5，255-261，1987；Schulen，1988)。

一些真菌产生包括外切-纤维二糖水解酶或者CBH-型纤维素酶、内切葡聚糖酶或者EG-型纤维素酶、β-葡糖苷酶或者BG-型纤维素酶在内的完整的纤维素酶系统(Schulein，1988)。然而，有时这些系统缺乏CBH-型纤维素酶，细菌纤维素酶通常也含有很少的CBH-型纤维素酶或者不含有CBH-型纤维素酶。此外，已经表明，EG成分和CBH成分协同地相互作用，以更加有效地降解纤维素。参见，例如，Wood，1985。多组分或者完整的纤维素酶系统中的不同成分，即，各种内切葡聚糖酶和外切纤维二糖水解酶，通常具有不同的性质，如等电点、分子量、糖基化程度、底物特异性和酶作用方式。

据认为，内切葡聚糖酶型纤维素酶水解在纤维素酶的低结晶度区中的内部β-1，4-糖苷键，而外切纤维二糖水解酶型纤维素酶从纤维素的还原端和非还原端水解纤维二糖。随后，通过产生被外切纤维二糖水解酶识别的新的链末端，内切葡聚糖酶组分的作用可以极大地促进外切纤维二糖水解酶的作用。此外，已经标明，β-葡糖苷酶型纤维素酶可催化烷基和/或芳基β-D-糖苷例如甲基β-D-糖苷和对硝基苯基糖苷以及仅含有糖残基的糖苷例如纤维二糖的水解。这产生作为微生物唯一产物的葡萄糖，并降低或消除抑制纤维二糖水解酶和内切葡聚糖酶的纤维二糖。

还发现，纤维素酶在洗涤剂组合物中的许多用途，包括增强清洗能力、作为软化剂和改善棉织物的手感(Hemmpel，ITB Dyeing/Printing/Finishing 3：5-14，1991；Tyndali，Textile Chemist and Colorist 24：23-26，1992；Kumar etal.，Textile Chemist and Colorist，29：37-42，1997)。尽管该机理不是本发明的一部分，但是纤维素酶的软化和颜色保持性能被归因于纤维素酶组合物中的碱性内切葡聚糖酶组分，如美国专利5,648,263、5,691，178和5,776,757所例证，其公开：含有富集有专用碱性内切葡聚糖酶组分的纤维素酶组合物的洗涤剂组合物，相比于未富集有这样的组分的纤维素酶组合物，赋予被处理的衣物持色和改善的软化。此外，已经表明，碱性内切葡聚糖酶组分在洗涤剂组合物中的使用补足了所述洗涤剂组合物的pH要求。(例如，通过在7.5-10的碱性pH下表现出最大活性，如美国专利5,648,263、5,691,178和5,776,757中所描述)。

也已经表明，纤维素酶组合物可降解含棉织物，导致织物减弱的强度丧失(美国专利4,822,516)，这造成了在商业洗涤剂应用中不愿使用纤维素酶组合物。已经有提示，与含有完整的纤维素酶系统的组合物相比，包含内切葡聚糖酶成分的纤维素酶组合物对含棉织物显示出降低的强度丧失。

也已经表明，纤维素酶可以用于将纤维素生物物质降解为乙醇(其中纤维素酶降解纤维素为葡萄糖，酵母或者其它微生物进一步酵解葡萄糖为乙醇)，用于机械纸浆处理(Pere et al.，In Proc.Tappi Pulping Conf.，Nashville，TN，27-31，pp.693-696，1996)，用作饲料添加剂(WO 91/04673)和用在谷物湿磨(wet milling)中。

大多数CBH和EG具有由通过连接肽分隔开的纤维素结合结构域(CBD)和核心结构域组成的多结构域结构(Suurnakki et al.，2000)。核心结构域含有活性位点，而CBD通过使酶结合于纤维素而与纤维素发生作用(van Tilbeurgh et al.，FEBS Lett.204：223-227，1986；Tomme et al.，Eur.J.Biochem.170：575-581，1988)。CBD在晶体状纤维素的水解中特别重要。已经表明，当CBD不存在时，纤维二糖水解酶降解晶体状纤维素的能力明显降低(Linder and Teeri，J.Biotechnol.57：15-28，1997)。然而，CBD的确切作用和作用机制仍然是一种推论。已经有人提出，CBD仅仅通过增加纤维素表面的有效酶浓度(Stahlberg et al.，Bio/Technol.9：286-290，1991)，和/或通过从纤维素表面松开单个的纤维素链(Tormo et al.，EMBO J.vol.15， no.21，pp.5739-5751，1996)来增强酶活性。涉及纤维素酶结构域对不同底物的作用的大多数研究是应用纤维二糖水解酶的核心蛋白来进行的，原因是它们的核心蛋白可以容易地通过木瓜蛋白酶的有限蛋白水解而产生(Tomme et al.，1988)。许多纤维素酶已经在科学文献中被描述，其例子包括：来自里氏木霉：Shoemaker，S.et al.，Bio/Technology，1：691-696，1983，其公开了CBH1；Teeri，T.et al.，Gene，51：43-52，1987，其公开了CBH2。来自不同于木霉的其它种的纤维素酶也已经被描述，例如Ooi et al.NucleicAcids Research，vol.18，no.19，1990，其公开了编码棘孢曲霉产生的内切葡聚糖酶F1-CMC的cDNA序列；Kawaguchi T et al.，Gene 173(2)：287-8，1996，其公开了编码棘孢曲霉的β-葡糖苷酶的cDNA的克隆和测序；Sakamoto et al.，Curr.Genet.27：435-439，1995，其公开了编码白曲霉(Aspergillus kawachii)IFO 4308的内切葡聚糖酶CMCase-1的cDNA序列；Saarilahti et al.，Gene 90：9-14，1990，其公开了来自欧氏杆菌(Erwinia carotovara)的内切葡聚糖酶；Spilliaert R，et al.，EurJ Biochem.224(3)：923-30，1994，其公开了bglA的克隆和测序，bglA编码Rhodothermus marinus的热稳定β-葡聚糖酶；Halldorsdottir S et al.，Appl Microbiol Biotechnol.49(3)：277-84，1998，其公开了Rhodothermus marinus基因的克隆、测序和过量表达，Rhodothermus marinus基因编码糖基水解酶家族12的热稳定性纤维素酶。然而，仍然需要鉴定和表征新型的纤维素酶，它们应具有改良的特性，诸如在热应激下或在表面活性剂存在的情况下改善的性能、增加的比活性、改变的底物切割模式和/或体外高水平的表达。

对含有不同含量CBH类型纤维素酶的新的和改进的纤维素酶组合物的开发，对下列用途是有价值的：(1)用在洗涤剂组合物中，其表现出增强的清洗能力，起到柔软剂的作用和/或改善棉织物的手感(例如，“石洗”或者“生物抛光(biopolishing)”；(2)用在用于将木浆或者其它生物物质降解为糖的组合物中(例如，用于生物乙醇生产)；和/或(3)用在饲料组合物中。

IV分子生物学

在一种实施方案中，本发明提供了在丝状真菌中有功能的启动子的控制下表达变体cbh2基因。因此，本发明依赖于重组遗传学领域中的常规技术。公开了用于本发明的一般性方法的基本文献包括：Sambrook et al.，Molecular Cloning，A Laboratory Manual(2nd ed.1989)；Kriegler，Gene Transfer and Expression：A Laboratory Manual(1990)，和Ausubel et al.，eds.，Current Protocols in Molecular Biology(1994)。

用于鉴定同源cbh2基因的方法

在图1中显示了野生型红褐肉座菌CBH2的核酸序列。本发明，在一个方面，包括了此处描述的编码CBH2同源物的核酸分子。该核酸可以是DNA分子。

可以被用来分离编码同源CBH2的DNA序列的技术在本领域中是公知的，包括但不限于，用同源DNA探针进行cDNA文库筛选和/或基因组文库筛选，用活性分析或者抗CBH2抗体进行表达筛选。这些方法中的任一种都可以发现于Sambrook，et al.或者CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，F.Ausubel，et al.，ed.Greene Publishing and Wiley-Interscience，New York(1987)(″Ausubel″)。

突变cbh2核酸序列的方法

本领域中已知的可以引入突变的任何方法，均被本发明所预期。

本发明涉及CBH2变异体的表达、纯化和/或分离和应用。这些酶优选地通过利用红褐肉座菌的cbh2基因的重组方法来制备。发酵肉汤可以在纯化或不纯化的情况下被使用。

在红褐肉座菌的cbh2基因被分离和克隆之后，本领域中已知的其它方法，如定点诱变，被用于在对应于表达的CBH2变异体中取代氨基酸的位置进行替代、添加或者删除。此外，定点诱变和在DNA水平上实现在表达蛋白中引入氨基酸变化的其它方法，可以在Sambrook，et al和Ausubel，et al中找到。

编码红褐肉座菌CBH2的氨基酸序列变异体的DNA是通过本领域中已知的各种方法制备的。这些方法包括但不限于，通过对早先制备的编码红褐肉座菌CBH2的DNA进行定点(或者寡核苷酸介导)诱变、PCR诱变和盒式诱变来制备。

定点诱变是制备替代型变异体的优选方法。此技术在本领域中是公知的(参见，例如Carter et al.Nucleic Acids Res.13：4431-4443(1985)and Kunkel et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82：488(1987))。简言之，进行DNA的定点诱变时，起始DNA是通过首先将编码所需突变的寡核苷酸和此起始DNA的单链杂交来改变的。杂交后，以杂交的寡核苷酸作为引物，以起始DNA的单链作为模板，应用DNA聚合酶合成完整的第二链。由此，编码所需突变的寡核苷酸被并入到得到的双链DNA中。

PCR诱变也适用于制备起始多肽即红褐肉座菌CBH2的氨基酸序列变异体。参见，Higuchi，PCR Protocols，PP.177-183(Academic Press，1990)；和Vallette et al.，Nuc.Acids Res.17：723-733(1989)。还参见例如Cadwell et al.，PCR Methods and Applications，Vol 2，28-33(1992)。简言之，当小量的DNA模板在PCR中被用作起始物质时，在序列上与模板DNA的对应区域略微不同的引物可以被用于生成相对大量的特定DNA片段，这样的DNA片段仅在引物不同于模板的位置处不同于模板序列。

用于制备变异体的另一种方法，盒式诱变，是基于Wells et al.，Gene 34：315-323(1985)所描述的技术。起始材料是含有要被突变的起始多肽DNA的质粒(或者其它载体)。要被突变的起始DNA中的密码子被鉴定。在鉴定的突变位点的每一侧，必须存在特有的限制性内切酶位点。如果不存在这样的限制性位点，可以应用上述的寡核苷酸介导的诱变方法生成它们，以在起始多肽DNA的合适位置导入这样的位点。质粒DNA在这些位点被切割，以使之线性化。编码限制性位点之间的DNA序列但包含所需突变的双链寡核苷酸，应用标准方法被合成，其中寡核苷酸的两条链分别被合成，然后应用标准方法被杂交在一起。此双链寡核苷酸被称为序列盒。将此序列盒设计为具有与线性化质粒的末端相容的5’和3’末端，这样，可以将其直接连接入质粒。至此，此质粒含有突变的DNA序列。

选择地，或者附加地，编码CBH2变体的所需氨基酸序列可以被确定，编码这样的氨基酸序列变异体的核酸序列可以通过合成方法来生成。

这样制备的CBH2变体可以被进一步修饰，这时常是取决于纤维素酶的目的用途。这样的修饰可以涉及氨基酸序列的进一步变化、与异源多肽的融合和/或共价修饰。

V.Cbh2核酸和CBH2多肽

A.变异cbh2型核酸

野生型红褐肉座菌cbh2的核酸序列被示于图1中。本发明包括编码本文所描述的纤维素酶变体的核酸分子。所述核酸可以是DNA分子。

在cbh2的分离和克隆后，本领域中已知的其它方法，例如定点突变，被用于制备相应于表达的CBH2变体中的取代的氨基酸的取代、添加或删除。此外，定点突变和其它在DNA水平上在表达的蛋白质中掺入氨基酸变化的方法可以在Sambrook，et al.和Ausubel，et al.中找到。

在编码CBH2变异体的DNA序列克隆入DNA构建物之后，将该DNA转化到微生物中。根据本发明，用于表达变异体CBH2的要被转化的微生物，可以包括来源于木霉某种的菌株，这是较为有利的。因此，根据本发明，用于制备变异体CBH2纤维素酶的优选方式包括，用DNA构建物转化木霉宿主细胞，所述的DNA构建物包括编码变异体CBH2的部分或者全部的DNA的至少一个片段。DNA构建物通常功能性地连接于启动子。然后，被转化的宿主细胞在一定条件下生长，表达所需的蛋白。随后，所需的蛋白产物可以被纯化至基本同质。

然而，可能的事实是，编码变异体CBH2的特定DNA的最佳表达媒介可能不同于红褐肉座菌。因此，在与变异体CBH2的来源生物体种系发生相似的转化宿主中表达蛋白，可能会最有利。在一种可以选择的实施方案中，黑曲霉可以被用作表达媒介。关于黑曲霉的转化技术的描述，参见WO 98/31821，其公开内容通过引用方式整体并入。

因此，在此对木霉某些种(Trichoderma spp.)表达系统的描述，仅仅是提供用作阐释的目的，为表达本发明变异体CBH2提供一个选择。然而，本领域的技术人员可以选择在不同的宿主细胞中表达编码变异体CBH2的DNA，假若合适的话，并且应该理解，在确定最佳表达宿主时，变异体CBH2的来源应该被考虑。另外地，本领域技术人员将能够应用本领域中可利用的手段，通过常规技术选择针对特定基因的最佳表达系统。

B.变体CBH2多肽

图1显示了野生型红褐肉座菌CBH2的氨基酸序列。变体CBH2多肽包括，在对应于下列残基中的一个或者多个的位置处的取代或者缺失：来自红褐肉座菌的CBH2(SEQ ID NO：2)中的残基V94、P98、G118、M120、M134、T142、L144、M145、T148、T154、L179、Q204、V206、S210、I212、T214、L215、G231、T232、V250、Q276、N285、S291、G308、T312、S316、V323、N325、I333、G334、S343、T349、G360、S380、A381、S386、F411、S413、A416、Q426和/或A429。

在一个方面，本发明涉及Cel6A家族的分离的CBH2酶，所述CBH2酶在这样的区中具有至少一个氨基酸残基取代或删除，所述区选自(1)从位置92到100、(2)115-123、(3)140-155、(4)160-180、(5)198-218、(6)228-235、(7)240-260、(8)275-295、(9)305-318、(10)322-335、(11)340-350、(12)360-370、(13)378-390和(14)410-430。在另一个方面，本发明涉及Cel6A家族的分离的CBH2酶，所述CBH2酶在这样的区中具有至少一个氨基酸残基取代，所述区选自(1)从位置92到100、(2)115-123、(3)140-155、(4)160-180、(5)198-218、(6)228-235、(7)240-260、(8)275-295、(9)305-318、(10)322-335、(11)340-350、(12)360-370、(13)378-390和(14)410-430。

本发明的变异体CBH2具有衍生于前体CBH2氨基酸序列的氨基酸序列。通过对前体氨基酸序列的一个或者多个氨基酸的取代、删除或者插入，CBH2变异体的氨基酸序列不同于前体CBH2氨基酸序列。在优选的实施方案中，前体CBH2是红褐肉座菌CBH2。图1显示了红褐肉座菌CBH2的不成熟氨基酸序列。因此，本发明所涉及的CBH2变异体在与红褐肉座菌CBH2中具体鉴定的残基等价的位置含有氨基酸残基。如果CBH2同源物的残基(氨基酸)与红褐肉座菌CBH2的特定残基或残基的一部分同源(即，在一级结构或者三级结构中的位置相对应)或者功能上类似(即，在化学或者结构的组合、反应或者相互作用方面具有相同或者相似的功能能力)，那么CBH2同源物的该残基(氨基酸)便等价于红褐肉座菌CBH2的该残基。如此处所应用，编号是对应于成熟CBH2氨基酸序列的编号。除了前体CBH2内的位置，在前体CBH2中对应于与该前体CBH2在热应激时的不稳定性有联系的氨基酸位置处的特定残基在此被鉴定，以用于取代或者缺失。氨基酸位置编号(例如，+51)是指针对成熟红褐肉座菌CBH2序列设计的编号。

优选地，应用“序列比较算法”来进行氨基酸序列的联配，以确定同源性。用于比较的序列的最佳联配可以通过下列方法或算法来进行：例如，Smith & Waterman，Adv.Appl.Math.2：482(1981)的局部同源性算法(local homology algorithm)，Needleman & Wunsch，J.Mol.Biol.48：443(1970)的同源性联配算法，Pearson & Lipman，Proc.Nat′l Acad.Sci.USA 85：2444(1988)的相似性搜索方法，这些算法的计算机实施(GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，Wisconsin Genetics Software Package，Genetics Computer Group，575Science Dr.，Madison，WI)，视觉观察(visual inspection)，视觉观察可以利用图形包，诸如例如Chemical Computing Group，Montreal Canada的MOE。

适合于确定序列相似性的算法的一个例子是BLAST算法，在Altschul，et al.，J.Mol Biol.215：403-410(1990)中有描述。用于实施BLAST分析的软件可以通过美国国家生物技术信息中心(www.ncbi.nim.nih.gov)公开得到。此算法涉及，首先通过鉴别待询序列(query sequence)中长度为W的短的字串来确定高分序列对(high scoring sequence pairs，HSPs)，所述高分序列对在与数据库序列中同样长度的字串联配时，匹配或者满足某个正值的阈值T。这些初始的邻近字串被用作起始点以发现包含有它们的更长的HSPs。所述字串沿着被比较的这两个序列中的每一个向两个方向延伸，只要累积的联配分数在增加。出现下面情况时，字串的延伸便停止：累积的联配分数由达到的最大值下降了数量X；累积分数达到0或者0以下；或者延伸到了任一序列的末端。BLAST算法的参数W、T和X决定了联配的灵敏度和速率。BLASTN程序使用的默认的是：字串长度(W)为11，BLOSUM62记分矩阵(参见Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915(1989))，联配(B)为50，期望值(E)为10，M’5，N’-4，对两条链进行比较。

然后，BLAST算法进行两个序列之间的相似性的统计学分析(参见，例如，Karlin & Altschul，Proc.Nat′l.Acad.Sci.USA 90：5873-5787(1993))。由BLAST算法提供的一种相似性量度是最小合计概率(smallest sum probability，P(N))，其表示两个核苷酸或者氨基酸序列间的匹配将偶然发生的概率。例如，如果在受测氨基酸序列和蛋白酶氨基酸序列的比较中，最小合计概率是小于大约0.1，更优选地小于大约0.01，最优选地小于大约0.001，便认为该氨基酸序列与蛋白酶相似。

为了本发明的目的，利用本领域中已知的计算机程序，例如GCG程序包(Program Manual for the Wisconsin Package，Version 8，August 1994，Genetics Computer Group，575 Science Drive，Madison，Wis.，USA 53711)(Needleman，S.B.and Wunsch，C.D.，(1970)，Journal of Molecular Biology，48，443-45)中提供的GAP，采用多肽序列比较的具有下列设定值的GAP：5.0的GAP产生罚分(GAP creation penalty)和0.3的GAP延长罚分(GAP extension penalty)，同一性的程度可以被合适地确定。

当评价相对于GeneBank DNA Sequences和其它公共数据库中的核酸序列的给定核酸序列时，使用BLASTN程序典型地进行序列检索。BLASTX对于相对于GeneBank DNA Sequences和其它公共数据库检索这样的核酸序列是优选的，所述核酸序列在所有的阅读框被翻译。使用开放空位罚分11.0的默认参数，以及延长的空位罚分1.0，进行BLASTN和BLASTX，并采用BLOSUM-62矩阵(参见例如Altschul，et al.，1997)。

下面提供了用于改变CBH2纤维素酶的稳定性的另外的具体策略：

(1)减少主链去折叠的熵可以导致酶的稳定性。例如，脯氨酸残基的导入可以通过降低去折叠的熵而显著地稳定蛋白(参见，例如，Watanabe，et al.，Eur.J.Biochem.226：277-283(1994))。相似地，甘氨酸残基没有β-碳，因此与任何其它残基相比，具有大得多的骨架构象自由度。取代甘氨酸，优选地应用丙氨酸进行取代，可以降低去折叠的熵而改善稳定性(参见，例如，Matthews，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84；6663-6667(1987))。此外，通过缩短外部环结构(loops)，可能改善稳定性。已经观察到，由极端嗜热菌产生的蛋白与它们的嗜温同源物相比，具有更短的外部环结构(参见，例如，Russel，et al.，Current Opinions in Biotechnology6：370-374(1995))。二硫键的导入也可以有效地稳定相互关联的不同的三级结构。因此，在可接近已存在的半胱氨酸的残基位置处导入半胱氨酸，或者导入可以形成二硫键的成对半胱氨酸，可以改变CBH2变异体的稳定性。

(2)通过增加侧链疏水性来减少内部空腔，可以改变酶的稳定性。通过最大化疏水作用和减少堆积缺陷(packing defect)来降低内部空腔的数量和体积，可以增加酶的稳定性(参见，例如，Matthews，Ann.Rev.Biochem.62：139-160(1993)；Burley，et al.，Science 229：23-29(1985)；Zuber，Biophys.Chem.29：171-179(1988)；Kellis，et al.，Nature 333：784-786(1988))。已知来自嗜热生物的多聚体蛋白与其嗜温的对应物相比，常常具有更多的疏水亚基界面，具有更大程度的表面互补(Russel，et al.，supra)。认为此原则也适用于单聚体蛋白的结构域界面。特定的取代可以通过增加疏水性而改善稳定性，包括赖氨酸变为精氨酸、丝氨酸变为丙氨酸、苏氨酸变为丙氨酸(Russel，et al.，supra)。取代为丙氨酸或者脯氨酸的修饰可以增加侧链的尺寸，导致减少的空腔、更好的堆积和增加的疏水性。可以减小腔的尺寸、增加疏水性和改善CBH2结构域之间的界面互补的取代，可以改善酶的稳定性。特别地，将这些位置的特定残基改变为选自苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的不同残基，可以改善性能。

(3)在刚性的二级结构即α-螺旋和β-转角中平衡电荷，可以改善稳定性。例如，用天冬氨酸上的负电荷中和α-螺旋N末端的部分正电荷，可以改善该结构的稳定性(参见，例如，Eriksson，et al.，Science 255：178-183(1992))。相似地，用正电荷中和螺旋C末端的部分负电荷，可以改善稳定性。去除正电荷与β-转角的肽N末端的相互作用，应该可以有效地赋予三级结构稳定性。用非正电荷残基进行取代，可以去除不适宜的正电荷与转角中酰胺氮的相互作用。

(4)通过导入盐键和氢键来稳定三级结构，可以是有效的。例如，离子对相互作用，例如，在天冬氨酸或谷氨酸和赖氨酸、精氨酸或组氨酸之间的相互作用，可以引起强烈的稳定效应，并且可以被用来粘附不同的三级结构元件，导致热稳定性增加。此外，带电荷残基/不带电荷残基氢键作用数目的增加，和氢键数目的增加，通常可以改善热稳定性(参见，例如，Tanner，et al.，Biochemistry 35：2597-2609(1996))。用天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或者谷氨酰胺进行取代，可以导入与骨架酰胺的氢键。用精氨酸进行取代，可以改善盐桥和导入氢键到碳骨架碳酰基中。

(5)避免耐敏性残基通常可以增加热稳定性。例如，在高温下天冬酰胺和谷氨酰胺易发生脱酰胺作用，半胱氨酸易发生氧化。减少这些残基在敏感部位的数量，可以导致改善的热稳定性(Russel，et al.，supra)。由除谷氨酰胺或者半胱氨酸之外的任意残基造成的取代或者缺失，可以通过避免热敏性残基而增加稳定性。

(6)配体结合的稳定化和去稳定化致使CBH2变异体的稳定性发生改变。例如，在应用了本发明的CBH2变异体的基质中，一种成分可以结合于CBH2变异体的特定表面活性剂敏感位点/热敏性位点。通过借助于取代来修饰该位点，该成分与变异体的结合可以被加强或者减弱。例如，CBH2结合裂隙中的非芳香族残基，可以被苯丙氨酸或者酪氨酸取代，以导入芳香族侧链稳定化作用，其中，纤维素底物的作用可以和苯环顺利地发生，从而增加了CBH2变异体的稳定性。

(7)增加任意的表面活性剂/热敏感配体的电负性，可以改善在表面活性剂或者热应激条件下的稳定性。例如，用苯丙氨酸或者酪氨酸取代，可以通过改善对溶液的遮蔽而增加D(天冬氨酸)残基的电负性，从而改善稳定性。

VI.重组CBH2变体的表达

本发明的方法依赖于应用细胞来表达变异体CBH2，不要求CBH2表达的特定方法。CBH2优选地从所述细胞分泌。

本发明提供了用含有编码变异体CBH2的核酸序列的表达载体转导、转化或者转染的宿主细胞。培养条件，如温度、pH和类似条件，是在转导、转化或者转染之前用于亲代宿主细胞的那些条件，这对于本领域的技术人员将是显然的。

在一种方法中，用表达载体转染丝状真菌细胞或者酵母细胞，所述的表达载体具有能在宿主细胞系中发挥作用的启动子或者生物活性启动子片段或者一个或多个(例如，一系列)增强子，其可操纵性连接于编码CBH2的DNA片段，这样，CBH2表达于该细胞系中。

A.核酸构建物/表达载体

编码CBH2的天然或者合成的多核苷酸片段(“编码CBH2的核酸序列”)可以被并入异源的核酸构建物或者载体，它们能够导入到丝状真菌或者酵母细胞中并在其中复制。此处公开的载体和方法适于在宿主细胞中应用以便表达CBH2。任何载体都可以被应用，只要它能够在导入的细胞中复制和存活。大量的合适载体和启动子对本领域的技术人员是已知的，并且是商业上可得到的。在Sambrook et al.，1989，Ausubel FM et al.，1989和Strathern et al.，The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces，1981中也描述了克隆载体和表达载体，其每一个在此特意地并入作为参考。van den Hondel，C.A.M.J.J.et al.(1991)In：Bennett，J.W.and Lasure，L.L.(eds.)More Gene Manipulations in Fungi.Academic Press，pp.396-428中描述了用于真菌的合适表达载体。通过各种方法，可以将合适的DNA序列插入质粒或者载体(此处统称为“载体”)。一般地，通过标准方法，将DNA序列插入合适的限制性酶切位点。相信这样的方法和相关的亚克隆方法是在本领域技术人员的知识范围内。

通过将含有变异体CBH2的编码序列的异源核酸构建物导入经选择的丝状真菌株系的细胞中，可以产生包含变异体CBH2的编码序列的重组丝状真菌。

一旦获得所需纤维素酶核酸序列的期望形式，其可以通过各种方法被修饰。当该序列包括非编码侧翼区域时，侧翼区域可以被切除、突变等等。因此，转换、颠换、删除和插入可以在天然发生的序列上被进行。

选出的变异体cbh2的序列可以按照已知的重组技术插入到合适的载体中，并用于转化能够表达CBH2的丝状真菌。由于遗传密码的固有简并性，编码基本上相同的或者功能上等价的氨基酸序列的其它核酸序列，可以被用来克隆和表达变体CBH2。因此，应该理解到，编码区域中的这种取代在本发明覆盖的序列变异体的范围内。可以以和本文中对于编码亲代CBH2的核酸序列所述的相同的方法，使用任何和所有这些序列变异体。

本发明也包括重组核酸构建物，其包含如上所描述的一个或者多个编码变异体CBH2的核酸序列。所述构建物包括载体，例如质粒载体或者病毒载体，本发明的序列被插入其中，方向为正向或者反向。

异源核酸构建物可以包括变异体cbh2的编码序列，该编码序列可以处于如下的状态：(i)处于分离状态；(ii)与另外的编码序列组合，例如融合蛋白或者信号肽编码序列，其中cbh2的编码序列是主导的编码序列；(iii)与非编码序列组合，例如内含子和调控元件，如启动子和终止子元件或者5’和/或3’非翻译区，它们对编码序列在合适宿主中的表达是有影响的；和/或(iv)在载体或者宿主环境中，其中cbh2编码序列是异源基因。

在本发明的一个方面，应用异源核酸构建物，在体外将变异体CBH2的编码核酸序列转移到细胞中，已确立的丝状真菌和酵母系是优选的。对于变异体CBH2的长期生产，稳定的表达是优选的。遵循的原则是，可以有效地生成稳定的转化子的任何方法都可以被用于实施本发明。

合适的载体典型地带有编码选择性标记的核酸序列、插入位点和合适的控制元件，如启动子和终止序列。载体可以包括调节序列，包括，例如，非编码序列，如内含子和调控元件，即，启动子和终止元件或者5’和/或3’非翻译区，它们对宿主细胞中(和/或在修饰的可溶性蛋白抗原编码序列不被正常表达的载体或者宿主细胞环境中)编码序列的表达是有影响的，并可操作性地连接于编码序列。大量的合适载体和启动子对于本领域技术人员是已知的，它们中的许多可以从商业渠道获得和/或描述于Sambrook，et al.，(见上)。

代表性的启动子包括组成型启动子和诱导型启动子，其例子包括CMV启动子、SV-40早期启动子、RSV启动子和EF-1α启动子，在tet开启和tet关闭系统中含有tet应答元件(TRE)的启动子(ClonTech and BASF)、β-肌动蛋白启动子和金属硫蛋白启动子，其可以通过加入某些金属盐而被上调。启动子序列是用于表达目的而被特定的丝状真菌识别的DNA序列。它可操作性连接于编码变异体CBH2多肽的DNA序列。这样的连接包括在所公开的表达载体中将启动子相对于编码变异体CBH2多肽的DNA序列的起始密码子进行定位。启动子序列含有转录和翻译调控序列，其介导变异体CBH2多肽的表达。例子包括来自下列基因的启动子：黑曲霉、泡盛曲霉或米曲霉葡糖淀粉酶、α-淀粉酶或α-葡糖苷酶编码基因；构巢曲霉gpdA或trpC基因；粗糙脉孢菌cbh1或trp1基因；黑曲霉或Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶编码基因；红褐肉座菌(里氏木霉)cbh1、cbh2、egl1、egl2或其他纤维素酶编码基因。

合适的选择性标记的选择将取决于宿主细胞，不同宿主细胞的合适的标记是本领域熟知的。典型的选择性标记基因包括argB，来自构巢曲霉或红褐肉座菌；amdS，来自构巢曲霉；pyr4，来自粗糙脉孢菌或红褐肉座菌；pyrG，来自黑曲霉或构巢曲霉。其他的示范性选择性标记包括但不限于trpc、trp1、oliC31、niaD或leu2，它们可以被纳入用于转化突变菌株诸如trp-、pyr-、leu-和类似菌株的异源核酸构建物中。

这样的选择性标记赋予转化子利用通常不被丝状真菌代谢的代谢物的能力。例如，红褐肉座菌的编码乙酰胺酶的amdS基因使得转化细胞可以以乙酰胺作为氮源来生长。选择性标记(如pyrG)可以恢复营养缺陷型突变菌株在选择性基本培养基中生长的能力，或者选择性标记(如olic31)可以赋予转化子在抑制性药物或抗生素存在的条件下生长的能力。

使用本领域中通常使用的方法，将选择性标记的编码序列克隆到任何合适的质粒中。示范性的质粒包括pUC18、pBR322、pRAX和pUC100。pRAX质粒包含来自构巢曲霉的AMA1序列，这使得它能在黑曲霉中进行复制。

除非另有指明，本发明的实践将应用分子生物学、微生物学、重组DNA和免疫学的传统技术，它们在本领域技术人员的知识范围内。这样的技术在文献中有充分的描述。参见，例如，Sambrook et al.，1989；Freshney，Animal Cell Culture，1987；Ausubel，et al.，1993和Coligan et al.，Current Protocols in Immunology，1991。

B.用于产生CBH2的宿主细胞和培养条件

（i）丝状真菌

因此，本发明提供了丝状真菌，其包括已经被修饰、选择和培养的细胞，所述修饰、选择和培养的方式为，相对于对应的非转化亲代真菌，有效地产生或表达变异体CBH2。

可以被处理和/或修饰以表达变异体CBH2的亲代丝状真菌的种系的例子包括但不限于，木霉例如里氏木霉、长枝木霉、绿色木霉、康宁木霉；青霉菌属某种(Penicillium sp.)、腐质霉属某种(Humicola sp.)包括异常腐质霉；曲霉属某种(Aspergillus sp.)、金孢菌某种(Chrysosporium sp.)、镰孢菌某种(Fusarium sp.)、肉座菌某种(Hypocrea sp.)和裸孢壳属某种(Emericella sp.)。

将表达CBH2的细胞在典型地用于培养亲代真菌株系的条件下培养。通常地，将细胞在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养，如Pourquie，J.et al.，Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation，eds.Aubert，J.P. et al.，Academic Press，pp.71-86，1988和llmen，M.et al.，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306，1997中所描述。培养条件也是标准的，例如，将培养物在28℃，在振荡培养器或者发酵器中培育，直至获得所需水平的CBH2表达。

对于给定的丝状真菌的优选培养条件可以在科学文献中找到，和/或从真菌的来源处例如美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(ATCC； www.atcc.org)找到。真菌的生长条件被确立后，将细胞暴露于可有效引起或允许变异体CBH2表达的环境中。

当CBH2的编码序列处于诱导型启动子的调控之下时，诱导剂例如糖、金属盐或者抗生素，被加入到培养基，其浓度足以有效诱导CBH2的表达。

在一种实施方案中，菌株包括黑曲霉，该菌株是获得过量表达的蛋白质的有用菌株。例如，已经知道，黑曲霉泡盛变种(A.nigervar awamori)dgr246分泌数量提高的分泌型纤维素酶(Goedegebuur et al，Curr.Genet(2002)41：89-98)。黑曲霉泡盛变种的其他菌株，诸如GCDAP3、GCDAP4和GAP3-4也是已知的，参见Ward等(Ward，M，Wilson，L. J.and Kodama，K.H.，1993，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743)。

在另一实施方案中，菌株包括里氏木霉，其是获得过量表达的蛋白质的有用菌株。例如，已经知道，被Sheir-Neiss，et al.，Appl.Microbiol.Biotechnol.20：46-53(1984)描述的RL-P37分泌数量提高的纤维素酶。RL-P37的功能等同物包括里氏木霉菌株RUT-C30(ATCC号：56765)和菌株QM9414(ATCC号：26921)。预期这些菌株在过量表达变异体CBH2方面，也是有用的。

当希望在没有潜在不利的天然纤维素水解活性的情况下获得变异体CBH2时，在导入含有编码变异体CBH2的DNA片段的DNA构建物或质粒之前，获得一个或多个纤维素酶基因已被剔除的宿主细胞是有用的。此类菌株可以用美国专利5,246,853和WO 92/06209中公开的方法制备得到，其公开内容通过引用方式并入本文。通过在缺失一种或多种纤维素酶基因的宿主微生物中表达变异体CBH2，鉴定和随后的纯化程序可以被简化。已经被克隆的来自木霉属某种的任何基因可以被剔除，例如cbh1、cbh2、egl1和egl2基因以及编码EGIII和/或EGV蛋白的那些基因(分别参见例如美国专利5,475,101和WO 94/28117)。

基因的剔除可以这样来完成：应用本领域中已知的方法，将待剔除或破坏的基因的一种形式插入质粒。然后，将该剔除质粒(deletion plasmid)在位于基因编码区域内部的合适的限制性酶切位点(多个)处进行切割，并用选择性标记置换该基因编码序列或者其部分。待剔除或破坏的基因的基因座的侧翼DNA序列——优选地在大约0.5至2.0kb——位于选择性标记基因的两侧。合适的剔除质粒通常具有独特的限制性酶切位点，这样的位点的存在使得含有包括侧翼DNA序列在内的被剔除基因和选择性标记基因可以作为单个线性片段被移走。

选择性标记的选择必须能够便于检测转化的微生物。任何在选择的微生物中表达的选择性标记基因是合适的。例如，对于曲霉，选择性标记的选择要保证该选择性标记在转化子中的存在不会明显影响其性质。这样的选择性标记可以是编码可测定的产物的基因。例如，一种曲霉基因的功能拷贝可以被使用，如果在宿主菌株中缺少该基因拷贝，则会导致宿主菌株表现出营养缺陷型表型。类似地，对于木霉属某种，同样存在选择性标记。

在一种实施方案中，用功能性pyrG基因转化曲霉的pyrG^-衍生株，这便提供了在转化中有用的选择性标记。pyrG^-衍生株可以通过对氟乳清酸(FOA)有抗性的曲霉菌株进行选择而获得。pyrG基因编码乳清苷-5’-单磷酸脱羧酶，这是生物合成尿嘧啶核苷所需的一种酶。带有完整的pyrG基因的菌株在缺乏尿嘧啶核苷的培养基中生长，但是对氟乳清酸敏感。通过对FOA抗性的选择，便有可能选出缺乏功能性乳清苷单磷酸脱羧酶的pyrG^-衍生株，这样的衍生株需要尿嘧啶核苷才能生长。应用FOA选择技术，也可能获得需要尿嘧啶核苷、缺乏功能性的焦磷酸核糖乳清酯转移酶(orotate pyrophosphoribosyl transferase)的菌株。用编码此酶的基因的功能性拷贝转化这些细胞是可能的(Berges & Barreau，Curr.Genet.19：359-365(1991)和van Hartingsveldte et al.，(1986)Development of a homologous transformation system for Aspergillus niger based on the pyrG gene.Mol.Gen.Genet.206：71-75)。使用上面提及的FOA抗性技术，容易地进行衍生菌株的选择，因此，pyrG基因优选用作选择性标记物。

在另一种实施方案中，用功能性pyr4基因转化肉座菌属某种(肉座菌属某种(木霉属某种))的pyr4^-衍生株，这便提供了对于转化有用的选择性标记。Pyr4^-衍生株可以通过对抵抗氟乳清酸(FOA)的肉座菌属(木霉属)菌株进行选择而获得。pyr4基因编码乳清苷-5’-单磷酸脱羧酶，这是生物合成尿嘧啶核苷所需的一种酶。带有完整的pyr4基因的菌株在缺乏尿嘧啶核苷的培养基中生长，但是对氟乳清酸敏感。通过对FOA抗性的选择，便有可能选出缺乏功能性乳清苷单磷酸脱羧酶的pyr4^-衍生株，这样的衍生株需要尿嘧啶核苷才能生长。应用FOA选择技术，也可能获得需要尿嘧啶核苷、缺乏功能性的焦磷酸核糖乳清酯转移酶(orotate pyrophosphoribosyl transferase)的菌株。用编码此酶的基因的功能性拷贝转化这些细胞是可能的(Berges & Barreau，1991)。使用上面提及的FOA抗性技术，容易地进行衍生菌株的选择，因此，pyr4基因优选用作选择性标记物。

为了转化pyrG^-曲霉属某种或肉座菌属某种(木霉属某种)，以便它不能表达一种或多种纤维素酶基因，包含被破坏或剔除的纤维素酶基因的单个DNA片段从剔除质粒中分离出来，并用于转化合适的pyr^-曲霉或pyr^-木霉宿主。然后基于它们分别表达pyrG或pyr4基因产物和改变宿主菌株尿苷营养缺陷型的能力，鉴定和选择转化子。然后对所获得的转化子进行DNA印迹分析，以鉴定和确认双交换整合(double crossover integration)事件的发生，在该事件中合适的pyr选择性标记替换了待剔除的基因的基因组拷贝的部分或所有的编码区域。

尽管上面描述的特定质粒载体是涉及pyr^-转化子的制备，但本发明不限于这些载体。应用上面的技术，可以对曲霉某种或肉座菌属某种(木霉属某种)的菌株中的各种基因进行剔除和替换。此外，如上面所讨论，可以使用任何可利用的选择性标记。事实上，应用上面描述的策略，可以将已被克隆和鉴定的任何宿主例如曲霉属某种或肉座菌属某种的基因从基因组中剔除。

如上所述，所使用的宿主菌株可以是肉座菌属某种(木霉属某种)的衍生菌株，其缺少或者具有与所选的选择性标记相对应的一种或多种非功能基因。例如，如果选择用于曲酶属某种的pyrG选择性标记，那么特定的pyrG^-衍生菌株在转化程序中用作接受体。此外，例如，如果选择pyr4选择性标记用于肉座菌属某种，那么特定的pyr4^-衍生菌株在转化程序中用作接受体。类似地，也可使用包括肉座菌属某种(木霉属某种)基因的选择性标记，该基因等同于构巢曲霉基因amdS、argB、trpC、niaD。相应的接受体菌株因此必须是衍生菌株，诸如分别是argB^-、trpC^-、niaD^-。

然后，编码CBH2变异体的DNA被制备，用于插入到合适的微生物中。根据本发明，编码CBH2变异体的DNA包括编码具有功能性纤维水解活性的蛋白所必需的DNA。编码CBH2变异体的DNA片段可以功能性地接于真菌启动子序列，例如，在曲酶属中的glaA基因的启动子或在木霉属中的cbh1或egl1基因的启动子。

也考虑到，编码CBH2变异体的DNA的多于一个的拷贝可以被再组合到菌株中以帮助过量表达。编码CBH2变异体的DNA可以通过携带编码变异体的DNA的表达载体的构建而制备。携带编码所需纤维素酶的插入DNA片段的表达载体，可以是能够在特定宿主生物体中自我复制或者能够整合入宿主DNA的任何载体，典型地为质粒。在优选的实施方案中，用于获得基因的表达的两类表达载体被考虑。第一类含有DNA序列，其中启动子、基因编码区域和终止子序列均起源于将要被表达的基因。如果需要的话，可以通过删除不需要的DNA序列(例如，编码不需要的结构域的DNA序列)，以留下将要表达的结构域使其处于它自己的转录和翻译调控序列的控制之下，由此获得截短的基因。选择性标记物也可以被包含在载体中，以便整合到宿主中的多个拷贝的新基因序列得以选择。

第二类表达载体是预先装配的，并且含有高水平转录所需的序列和选择性标记。已预期到，基因的编码区域或其一部分可以被插入到这种通用的表达载体中，这样，它便处于表达序列盒启动子和终止子序列的转录调控之下。

例如，在曲酶属中，pRAX是这样的一种通用表达载体。基因或者其一部分可以被插入到glaA强启动子的下游。

例如，在肉座菌属中，pTEX是这样的一种通用表达载体。基因或者其一部分可以被插入到cbh1强启动子的下游。

在该载体中，编码本发明的变异体CBH2的DNA序列可以被可操作性连接于转录和翻译序列，即，合适的启动子序列和处于结构基因的阅读框架中的信号序列。启动子可以是在宿主细胞中表现出转录活性的任何DNA序列，可以是来自编码与宿主细胞同源或者异源的蛋白的基因。可任选的信号肽可用来使变异体CBH2在细胞外产生。编码信号肽的DNA优选是，与所要表达的基因有天然联系的DNA，然而，来自任何合适来源的信号序列，例如来自木霉属的外切纤维二糖水解酶或内切葡聚糖酶，均在本发明的考虑中。

用于连接编码本发明的变异体CBH2的DNA序列和启动子、并插入合适的载体中的方法，在本领域中是已知的。

根据已知的技术例如转化、转染、显微注射、电穿孔、生物弹道轰击(biolistic bombardment)和类似技术，可以将上面描述的DNA载体或者构建物导入到宿主细胞中。

在优选的转化技术中，必须考虑到，透过细胞壁到肉座菌属某种(木霉属某种)的DNA是非常低。因此，期望的DNA序列、基因或基因片段的摄取顶多为最少量。存在许多方法来在转化过程之前增加衍生株(即，缺乏相应于所使用的选择标记的功能基因)中肉座菌属某种(木霉属某种)细胞壁的渗透性。

本发明中制备用于转化的曲霉属某种或肉座菌属某种(木霉属某种)的优选方法，包括由真菌菌丝体制备原生质体。参见，Campbell et al.Improved transformation efficiency of A.nigerusing homologous niaD gene for nitrate reductase.Curr.Genet.16：53-56；1989。菌丝体可以从出芽的营养孢子获得。用消化细胞壁的酶处理菌丝体，得到原生质体。然后，通过在悬浮培养基中加入渗压稳定剂，原生质体得以被保护。这些稳定剂包括山梨糖醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁和类似物。通常地，这些稳定剂的浓度在0.8M到1.2M之间变化。优选地在悬浮培养液中应用大约1.2M的山梨醇溶液。

宿主菌株(曲霉属某种或肉座菌属某种(木霉属某种))对DNA的摄取，依赖于钙离子浓度。通常大约10mM CaCl₂至50mM CaCl₂之间的CaCl₂被应用于摄取溶液中。在该摄取溶液中，除了对钙离子的需求之外，通常被纳入的其它物质是缓冲系统如TE缓冲液(10Mm Tris，pH 7.4；1mM EDTA)或者10mM MOPS， pH 6.0缓冲液(吗啉代丙烷磺酸)和聚乙二醇(PEG)。聚乙二醇的作用被认为是融合细胞膜，从而使培养基的成分传送到宿主细胞——作为例子，曲酶属某种或肉座菌属某种的菌株——的胞浆，并且质粒DNA被传送至核。该融合常常使得多拷贝的质粒DNA整合入宿主染色体。

通常地，在转化中使用含有曲霉属某种的原生质体或者细胞的悬浮液，所述的原生质体或者细胞已经经历过渗透性处理，密度为10⁵至10⁶/mL，优选2×10⁵/mL。类似地，在转化中使用含有肉座菌属某种(木霉属某种)的原生质体或者细胞的悬浮液，所述的原生质体或者细胞已经经历过渗透性处理，密度为10⁸至10⁹/mL，优选2×10⁸/mL。体积为100μl的含有这些原生质体或者细胞的合适溶液(例如，1.2M山梨醇；50mM CaCl₂)与所需DNA混合。通常地，高浓度的PEG被加入到摄取溶液。0.1至1倍体积的25％PEG 4000可以被加入到原生质体悬浮液。然而，优选地向原生质体悬浮液中加入大约0.25个体积。添加剂如二甲基亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾和类似物质，也可以被加入到该摄取溶液，并协助转化。

通常地，然后在大约0℃温育该混合物，持续10至30分钟。之后，将另外的PEG加入该混合物，以进一步增强所需基因或DNA序列的摄取。通常地，将25％PEG4000以等同于转化混合物的体积的5至15倍的体积加入；然而，更大或者更小的体积可以是适合的。25％PEG4000的体积优选是转化混合物体积的大约10倍。将PEG加入之后，在加入山梨醇和CaCl₂溶液之前，将转化混合物在室温或者冰上温育。然后，将原生质体悬浮液进一步加入到生长培养基的熔化等份试样中。此生长培养基仅允许转化子生长。适于培养所需的转化子的任何生长培养基可以被用于本发明。然而，如果正在选择的是Pyr⁺转化子，则优选地使用不含有尿嘧啶核苷的生长培养基。随后获得的克隆被转移到剔除尿苷的生长培养基中，并被纯化。

在此阶段，可以将稳定的转化子与不稳定的转化子区分开来，前者具有更快的生长速度，并且例如在木霉属中，在缺乏尿苷的固体培养基上所形成的环状克隆具有平滑的而非粗糙的轮廓。此外，在一些情形下，可以对稳定性作进一步的测试，这通过在非选择性固体培养基(即，含有尿嘧啶核苷)上培养转化子、从该培养基中收获孢子并测定这些孢子随后在缺乏尿嘧啶核苷的选择性培养基中出芽并生长的百分数来完成。

在上述方法的具体实施方案中，作为CBH2变体合适的翻译后加工的结果，在液体培养基中进行培养之后，从宿主细胞中回收活性形式的CBH2变异体(一种或多种)。

(ii)酵母

本发明也考虑了将酵母细胞用作用于CBH2生产的宿主细胞。编码水解酶的几个其它的基因已经被在酿酒酵母的各种菌株中表达。这些包括编码来自里氏木霉的两种内切葡聚糖酶(Penttila et al.，Yeast vol.3，pp 175-185，1987)、两种纤维二糖水解酶(Penttila et al.，Gene，63：103-112，1988)和一种β-葡糖苷酶(Cummings and Fowler，Curr.Genet.29：227-233，1996)的序列，编码来自出芽短梗霉(Aureobasidlium pullulans)的木聚糖酶的序列(Li and Ljungdahl，Appl.Environ.Microbiol.62，no.1，pp.209-213，1996)，编码来自小麦的α-淀粉酶的序列(Rothstein et al.，Gene 55：353-356，1987)，等等。此外，编码溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)[β]-1，4-内切葡聚糖酶(END1)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)纤维二糖水解酶(CBH1)、生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)纤维糊精酶(CEL1)和Endomyces fibrilizer纤维二糖酶(Bgl1)的纤维素酶基因序列盒在酿酒酵母的实验室菌株中被成功表达(Van Rensburg et al.，Yeast，vol.14，pp.67-76，1998)。

C.将编码CBH2的核酸序列导入宿主细胞

本发明进一步提供了细胞和细胞组合物，其已经经过遗传修饰而含有外源提供的编码变体CBH2的核酸序列。亲代细胞或细胞系可以利用克隆载体或表达载体来进行遗传修饰(即，被转导、被转化或者被转染)。载体可以是，例如，质粒、病毒颗粒、噬菌体等的形式，如上面描述的。

本发明的转化方法可以导致转化载体的全部或者部分被稳定地整合到丝状真菌的基因组中。然而，转化也可以导致自我复制的染色体外转化载体的维持，这也被本发明预期。

许多标准的转染方法可以被用来产生表达大量异源蛋白的里氏木霉细胞系。用于将DNA构建物导入木霉的产纤维素酶菌株的一些已公开的方法包括，Lorito，Hayes，DiPietro and Harman，1993，Curr.Genet.24：349-356；Goldman，VanMontagu and Herrera-Estrella，1990，Curr.Genet.17：169-174；Penttila，Nevalainen，Ratto，Salminen and Knowles，1987，Gene 6：155-164，对于曲霉菌，Yelton，Hamerand Timberlake，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 81：1470-1474，对于镰刀菌，Bajar，Podila and Kolattukudy，1991，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：8202-8212，对于链霉菌，Hopwood et al.，1985，The John Innes Foundation，Norwich，UK，以及对于芽孢杆菌，Brigidi，DeRossi，Bertarini，Riccardi and Matteuzzi，1990，FEMS Microbiol.Lett.55：135-138。

将异源核酸构建物(表达载体)引入丝状真菌(例如，红褐肉座菌)中的其它方法包括但不限于颗粒或基因枪的使用、在转化过程之前丝状真菌细胞的渗透化处理(例如，利用高浓度碱例如0.05M到0.4M CaCl₂或乙酸锂)、原生质体融合或土囊杆菌介导的转化。通过用聚乙二醇和CaCl₂处理原生质体或原生质球转化丝状真菌的示例性方法被描述于Campbell，E.I.et al.，Curr.Genet.16：53-56，1989 和Penttila，M.et al.，Gene，63：11-22，1988。

用于将外源核苷酸序列导入宿主细胞的任何已知的方法都可以被应用。这些方法包括应用磷酸钙转染、凝聚胺法(polybrene)、原生质体融合、电穿孔、生物弹射、脂质体、微注射、等离子体载体、病毒载体和用于将克隆的基因组DNA、cDNA、合成的DNA或其它外源遗传物质导入宿主细胞的任何其它已知的方法(参见，例如，Sambrooket al.，supra)。也可以应用美国专利6,255,115中描述的农杆菌介导的转染方法。这里的要求仅是所使用的具体遗传工程方法能够成功地将至少1个基因导入能够表达该异源基因的宿主细胞。

此外，含有编码变体CBH2的核酸序列的异源核酸构建物可以在体外被转录，得到的RNA通过已知的方法被导入宿主细胞，例如，通过注射。

本发明进一步包括新的和有用的丝状真菌转化子，例如红褐肉座菌和黑曲霉转化子，它们可用于生产真菌纤维素酶组合物。本发明包括丝状真菌的转化子，特别是包含编码变体CBH2的序列或者剔除了内源性cbh编码序列的真菌。

在导入包含所述变体cbh2的编码序列的异源核酸构建物之后，可以在被改性成适合活化启动子、选择转化子或扩增编码变体CBH2的核酸序列表达的常规营养培养基中培养该遗传修饰的细胞。培养条件，例如温度、pH和类似条件，是以前用于所选择的用来表达的宿主细胞的那些条件，并且对于本领域普通技术人员是明显的。

已经导入此类异源核酸构建物的子代细胞通常被认为包含在所述异源核酸构建物中发现的编码变体CBH2的核酸序列。

本发明进一步包括新的和有用的丝状真菌转化子，所述丝状真菌例如用于产生真菌纤维素酶组合物的红褐肉座菌。黑曲酶也可以用于产生变体CBH2。本发明包括丝状真菌的转化子，尤其是包含变体cbh2编码序列或内源性cbh2编码序列缺失的真菌的转化子。

丝状真菌的稳定转化子通常可以与不稳定转化子区分开来，前者具有更快的生长速度，并且例如在木霉属中，在固体培养基上所形成的环状克隆具有平滑的而非粗糙的轮廓。此外，在一些情形下，可以对稳定性作进一步的测试，这通过在非选择性固体培养基上培养转化子、从该培养基中收获孢子，并测定这些孢子随后在选择性培养基中出芽并生长的百分数来完成。

VII.对CBH2核酸编码序列和/或蛋白表达的分析

在用编码变体CBH2的核酸构建物转化细胞系之后，为了评价该细胞系对变体CBH2的表达，可以在蛋白水平、RNA水平进行分析，或者应用特异于纤维二糖水解酶活性和/或产生的功能性生物分析进行分析。

在本文描述的变体CBH2核酸和蛋白序列的一个代表性应用中，丝状真菌例如里氏木霉的遗传修饰菌株，被加以改造以产生增加量的CBH2。这样的遗传修饰的丝状真菌对产生纤维水解能力大大增强的纤维素酶产物是有用的。在一种方法中，这是通过将cbh2的编码序列导入合适的宿主来完成的，合适的宿主例如丝状真菌，如黑曲霉。

因此，本发明包括用于在丝状真菌或者其它合适的宿主中表达变体CBH2的方法，这可以通过将含有编码变体CBH2的DNA序列的表达载体导入丝状真菌或者其它合适的宿主的细胞中来实现。

在另一个方面，本发明包括用于修饰CBH2在丝状真菌或者其它合适的宿主中的表达的方法。这样的修饰包括，降低或者消除内源性CBH2的表达。

一般地，用来分析变体CBH2的表达的试验包括，RNA印迹(Northern blotting)、斑点印迹(DNA或者RNA分析)、RT-PCR(反转录酶聚合酶链式反应)或者原位杂交，应用被恰当标记的探针(基于核酸编码序列)和传统的DNA印迹(Southern blotting)和放射自显影。

此外，可以在样品中直接测定变体CBH2的产生和/或表达，例如，分析纤维二糖水解酶活性、表达和/或产生。这样的试验描述于，例如Karlsson，J.et al.(2001)，Eur.J.Biochem，268，6498-6507，Wood，T.(1988)，Methods in Enzymology，Vol.160.Biomass Part a Cellulose and Hemicellulose(Wood，W.& Kellog，S.Eds.)，pp.19-25，Academic Press，San Diego，CA，USA)中，以及对于PAHBAH试验，被描述于(Lever，M.(1972)Analytical Biochemistry，47，273，Blakeney，A.B.& Mutton，L.L.(1980)Journal of Science of Food and Agriculture，31，889，Henry，RJ.(1984)Journal of the Institute of Brewing，90，37中。用于分析纤维二糖水解酶活性、内切葡聚糖酶活性或者β-葡糖苷酶活性的有用底物包括，晶体状纤维素、纤维纸、磷酸溶胀纤维素(phosphoric acid swollen cellulose)、纤维寡糖、甲基伞形酯乳糖苷(methylumbelliferyl lactoside)、甲基伞形酯纤维二糖苷(methylumbelliferyl cellobioside)、邻硝基苯基乳糖苷(orthonitrophenyl lactoside)、对硝基苯基乳糖苷(paranitrophenyl lactoside)、邻硝基苯基纤维二糖苷(orthonitrophenyl cellobioside)、对硝基苯基纤维二糖苷(paranitrophenyl cellobioside)。

此外，蛋白表达，可以通过免疫学方法来加以评价，例如细胞、组织切片的免疫组织化学染色或者组织培养基的免疫测定分析，如，蛋白质印迹(Western blot)或者ELISA。这样的免疫分析可以被用于定性和定量地评价CBH2变体的表达。这些方法的细节对本领域技术人员是已知的，用于实践这些方法的许多试剂是商业渠道可获得的。

所需CBH2变体的纯化形式可以被用于产生特异于该被表达的蛋白的单克隆或者多克隆抗体，它们可以用于各种免疫分析。(参见，例如，Hu et al.，Mol CellBiol，vol.11，no.11，pp.5792-5799，1991)。代表性的分析包括ELISA、竞争性免疫测定、放射免疫测定、蛋白质印迹、间接免疫荧光测定和类似的方法。总之，通过商业渠道获得的抗体和/或试剂盒可以被用于纤维二糖水解酶蛋白的表达水平的定量免疫测定。

VIII.重组CBH2蛋白的分离和纯化

一般地，在细胞培养物中产生的变体CBH2蛋白被分泌入培养基，并且可以被纯化或分离，例如，将细胞培养基中不需要的成分除去。然而，在一些情形下，变体CBH2蛋白可以以细胞内的形式产生，这就使得必须从细胞裂解液中进行回收。在这样的情形下，应用本领域技术人员常规应用的技术，将变体CBH2蛋白从产生它的细胞中纯化出来。例子包括但不限于，亲和层析(Tilbeurgh et al.，FEBS Lett.16：215，1984)、离子交换层析方法(Goyal et al.，Bioresource Technol.36：37-50，1991；Fliess et al.，Eur.J.Appl.Microbiol.Biotechnol.17：314-318，1983；Bhikhabhai et al.，J.Appl.Biochem.6：336-345，1984；Ellouz et al，J.Chromatography396：307-317，1987)，包括应用了具有高分辨能力的材料的离子交换层析(Medve et al.，J.Chromatography A 808：153-165，1998)、疏水作用层析(Tomaz and Queiroz，J.Chromatography A 865：123-128，1999)和两相分配(two-phase partitioning)(Brumbauer，et al.，Bioseparation 7：287-295，1999)。

典型地，变体CBH2蛋白被分级，以分离出具有选择的性质的蛋白，所述的性质例如对特定的结合试剂如抗体或受体的结合亲和性；或者具有选择的分子量范围或等电点范围。

一旦实现了给定变体CBH2蛋白的表达，由此产生的变体CBH2蛋白从细胞或者细胞培养物中纯化出来。适于这样的纯化的代表性方法包括：抗体-亲和柱层析、离子交换层析；乙醇沉淀；反相HPLC；在硅上或在阳离子交换树脂如DEAE上进行的层析；层析聚焦；SDS-PAGE；硫酸氨沉淀；以及应用例如Sephadex G-75的凝胶过滤。可以应用各种蛋白纯化方法，这些方法在本领域中是已知的，在例如Deutscher，Methods in Enzymology，vol.182，no.57，pp.779，1990；Scopes，Methods Enzymol.90：479-91，1982中有描述。所选择的纯化步骤将取决于，例如，所使用的生产工艺的性质和所产生的具体蛋白。

IX.Cbh2和CBH2的效用

应该了解，变体cbh核酸、变体CBH2蛋白和含有变体CBH2蛋白活性的组合物，在广泛的各种用途中具有应用价值，下面描述了其中的一些。

含有变化量的BG型、EG型和变体CBH型纤维素酶的新的和改进的纤维素酶组合物在洗涤剂组合物中是有用的，其表现出增强的清洗能力、充当柔软剂和/或改善棉织物的手感(例如，“石洗”或者“生物抛光”)，它们还可以用在将木浆降解为糖的组合物中(例如，用于生物乙醇生产)，和/或用在饲料组合物中。对每种类型的纤维素酶的分离和表征使得能够控制这样的组合物的各个方面。

发现具有增强的热稳定性的变体(或突变)CBHs在所有上述领域中是有用的，原因在于它们在升高的温度下保持活性的能力。

具有降低的热稳定性的变体(或突变)CBHs在某些情况中是有用的，例如，需要该酶的活性在较低温度时便被中和，以便可能存在的其它酶不受影响。此外，酶可以在纤维质的限制性转变中起作用，例如，可以用于控制结晶程度和纤维素链长度。在达到所需的转变程度之后，糖化过程的温度可以升至该去稳定化的CBH的存活温度以上。由于CBH2活性对于晶体状纤维素的水解是必需的，所以晶体状纤维素的转变在升高的温度下会停止。

在一种方法中，本发明的纤维素酶用于洗涤剂组合物或者织物的处理，以改善手感和外观。

由于纤维素产品的水解速率可以通过使用具有至少一个额外拷贝的、插入基因组的cbh基因的转化子来增加，所以含有纤维素或者杂多糖的产品可以以更快的速度和更大的程度被降解。在垃圾中由纤维素制成的产品如纸、棉布、纤维质尿布和类似物可以被更有效的降解。因此，从多个转化子或者单独的转化子获得的发酵产物可以被用于组合物中，以通过液化的方法来帮助降解加入在过度拥挤的填埋垃圾中的各种纤维素产品。

分开进行的糖化和发酵过程可以用来将存在于生物物质例如玉米秸秆中的纤维素转变为葡萄糖，随后酵母菌株将葡萄糖转变为乙醇。同时进行的糖化和发酵过程可以将存在于生物物质例如玉米秸秆中的纤维素转变为葡萄糖，同时在同一反应器中，酵母菌株将葡萄糖转变为乙醇。因此，在另一种方法中，本发明的变体CBH型纤维素酶可以在将生物物质降解为乙醇的过程中起作用。利用可容易地获得的纤维素来源进行乙醇生产，提供了稳定的、可更新的燃料资源。

基于纤维素的供给料由农业废物、草和木材和其它低价值的生物物质如城市废物(例如，回收纸、院落修剪物等等)组成。乙醇可以通过对任何这些纤维素质供给料进行发酵而产生。然而，在转变为乙醇之前，纤维素必须首先转变为糖。

各种不同的供给料可以与本发明的变体CBH联合应用，具体选择哪一种可能取决于实施转变过程的地区。例如，在美国中西部，农业废物如麦杆、玉米茎和甘蔗渣可能是主要的，而在加利福尼亚，稻杆可能是主要的。然而，应该理解，任何可获得的纤维素质生物物质可以被用于任何地区。

含有增加数量的纤维二糖水解酶的纤维素酶组合物，在乙醇生产中有用。由该方法获得的乙醇可以进一步用作辛烷助剂或者直接作为替代汽油的燃料，这是有优势的，因为乙醇作为燃料来源，比石油衍生产品更加环保。已知知道，乙醇的应用会改善空气质量，并且可能降低局部臭氧水平和烟雾。而且，乙醇替代汽油的应用在缓冲由不可再生能源和石油化学品供应的突然变化造成的影响方面，具有战略上的重要性。

利用纤维素质生物物质例如树、草本植物、城市固体废物和农业残留物及林业残留物的糖化和发酵过程可以产生乙醇。然而，由微生物产生的天然发生的纤维素酶混合物中各纤维素酶的比例对于生物物质中的纤维素至葡萄糖的快速转变，可能不是最有效的。已知，内切葡聚糖酶的作用是，生成新的纤维素链末端，而这样的末端本身又是纤维二糖水解酶的作用底物，由此可以改善整个纤维素酶系统的水解效率。因此，应用增加的和优化的纤维二糖水解酶活性，可以大大提高乙醇的产量。

因此，本发明的纤维二糖水解酶可以用于将纤维素水解为其糖组分。在一种实施方案中，在加入发酵生物之前，将变体纤维二糖水解酶加入到生物物质中。在第二种实施方案中，变体纤维二糖水解酶与发酵生物体同时被加到生物物质中。可任选地，在每种实施方案中，可以存在其它的纤维素酶成分。

在另一种实施方案中，纤维素质的供给料可以被预处理。预处理可以是通过升高温度和加入稀酸、浓酸或者稀碱溶液中的任意一种。加入预处理溶液处理一段时间，使其足以至少部分地水解半纤维素成分，然后再进行中和。

CBH2对纤维素的作用的主要产品是纤维二糖，其对于通过BG活性转化成葡萄糖是可利用的(例如在真菌纤维素酶产物中)。或通过纤维质生物物质的预处理或通过对所述生物物质的酶促作用，除了葡萄糖和纤维二糖之外，其它糖，可以通过所述生物物质制得。所述生物物质的半纤维素含量可以被转化(通过半纤维素酶)成糖例如木糖、半乳糖、甘露糖和阿拉伯糖。因此，在生物物质转化过程中，酶促糖化可以产生对于生物转化或化学转化成其它中间体或终产物可利用的糖。因此，除了乙醇生产之外，发现从生物物质产生的糖在许多过程中有用。此类转化的例子是葡萄糖发酵成乙醇(如在M.E.Himmel et al.pp^2-45，″Fuels and Chemicals from Biomass″，ACS Symposium Series 666，ed B.C.Saha and J.Woodward，1997中所综述)以及葡萄糖向2，5-二酮-D-葡糖酸盐(美国专利6,599,722)、乳酸(R.Datta and S-P.Tsai pp224-236，同前)、琥珀酸盐(R.R.Gokarn，M.A.Eiteman and J.Sridhar pp237-263，同前)、1，3-丙二醇(A-P.Zheng，H.Biebl and W-D.Deckwer pp264-279，同前)、2，3-丁二醇(CS.Gong，N.Cao and GT.Tsao pp280-293，同前)的其它生物转化，以及木糖向木糖醇的化学和生物转化(B.C.Saha and R.J.Bothastpp307-319，同上)。还参见例如WO 98/21339。

除了纤维素酶组合物(不论纤维二糖水解酶的含量为多少，即，没有纤维二糖水解酶、基本上没有纤维二糖水解酶，或者具有增加的纤维二糖水解酶)，本发明的洗涤剂组合物还可以使用表面活性剂，包括阴离子、非离子和两性表面活性剂、水解酶、增洁剂、漂白剂、蓝色漂白剂和荧光染料、抗结块剂、增溶剂、阳离子表面活性剂和类似物。所有这些成分在洗涤剂领域中是已知的。上面描述的纤维素酶组合物可以被加入洗涤剂组合物，以液体稀释液、颗粒、乳剂、凝胶、浆糊或者类似的任意形式加入。这些形式对本领域技术人员是已知的。当使用的是固体洗涤剂组合物时，纤维素酶组合物优选地被配制为颗粒。优选地，配制的颗粒可以含有纤维素酶保护剂。对于更全面的讨论，参见美国专利6,162,782，标题是“Detergent compositions containing cellulase compositions deficient in CBH2 typecomponents”，在此并入作为参考。

优选地，被使用的纤维素酶组合物相对于整个洗涤剂组合物的重量百分数为大约0.00005至大约5。更优选地，被使用的纤维素酶组合物相对于整个洗涤剂组合物的重量百分数为大约0.0002至大约2。

另外，变体CBH2核酸序列可以用于鉴定和表征相关的核酸序列。可以用于确定(预测或证实)相关基因或基因产物的功能的众多技术包括但不限于，(A)DNA/RNA分析，如(1)过量表达、异常表达和在其它物种中的表达；(2)基因敲除(反向遗传学(Reverse gentics)、靶向敲除(targeted knock-out)、病毒诱导的基因沉默(VIGS，参见Baulcombe，，100Years ofVirology，Calisher and Horzinek eds.，Springer-Verlag，New York，NY 15：189-201，1999)；(3)基因甲基化状况的分析，特别是侧翼调控区域；和(4)原位杂交；(B)基因产物分析，诸如(1)重组蛋白表达；(2)抗血清产生；(3)免疫定位；(4)催化活性或其他活性的生物化学测定；(5)磷酸化作用状况；和(6)通过酵母双杂交分析与其他蛋白质的相互作用；(C)通路分析，诸如基于基因过量表达的表型或与相关基因的序列同源性，将基因或基因产物置于特定的生物化学或信号通路中；和(D)其他分析，也可以被实施以便确定或证实分离出的基因和它的产物参与特定的代谢或信号通路的情况，并帮助确定基因功能。

本文所提及的所有专利、专利申请、文章和出版物被因此明确引入本文作为参考。

实施例

下面的实施例进一步详细描述了本发明，这些实施例的意图并不在于以任何方式限制要求保护的本发明的范围。附图被认为是本发明的说明书和描述的一个完整部分。所有引用的参考文献在此特意地并入作为参考，用于在此描述的所有内容。

实施例1

已知Cel6A纤维素酶的比对

通过使用结构信息和建模程序首先比对红褐肉座菌Cel6A至八(8)家族成员，确定几种突变的选择。图3显示了衍生自异常腐质霉(Q9C1S9)、Acremonium cellulotyticus(093837)、双孢蘑菇(Agaricus bisporus)(P49075)、康宁肉座菌(AF315681)、黄孢原毛平革菌(S76141)、Talaromyces emersonii(Q8N1B5)、香菇(Lentinula edodes)(AF244369)、红褐肉座菌(P07987)的CBH2分子的比对。利用VectorNTI Suite软件程序，通过Clustal W进行比对，其中空位罚分为10。

基于该比对，通过位点突变，在蛋白质中进行各种单个和多个氨基酸突变。通过使用共有序列，鉴定可能提高酶的热稳定性的可能突变。参见图3。进行3D结构的视觉检测，以检查它们与所述结构的相容性。由于空间原因不适合CBH2分子或者接近活性位点的所有变化在初始突变组中被省略。

通过如本文所述比对CBH2序列，确定CBH2的共有序列。图3的比对作为确定所谓的共有序列的基础。比对的共有序列是这样的序列：其在每个位置具有这样的氨基酸，所述氨基酸在大多数氨基酸序列中被发现，所述氨基酸序列被用于创建该比对。其中共有序列从CBH2里氏木霉氨基酸序列偏离的那些位置通过分析蛋白(PDB代码1QK2)的3D结构而被评价。使用计算机程序BRAGI(D.Schomburg，J.Reichelt，J.Mol.Graphics，Vol 6，161-165(1988))，在Silicon Graphics Indigo2Solid Impact计算机上，进行图形检测。根据3D模型，那些毫无障碍地拟合到所述结构并可能提高酶稳定性的那些突变被选择作为置换，以便提高红褐肉座菌CBH2的热稳定性。在一些情况下，CBH2分子的3D结构的视觉检测使得红褐肉座菌CBH2的非保守残基被另一种氨基酸而不是序列比对所建议的氨基酸取代成为必须。糖基化位置——其基于该比对而被研究，为S109和N310。这些位置不变。在位置V94，缬氨酸被谷氨酸残基取代，因为它可能稳定与位置213和/或237上的一个或两个精氨酸的电荷相互作用。在位置T142，我们决定引入脯氨酸，根据序列比对其可能适合。该氨基酸在许多比对的序列上被发现，并可以稳定化，原因在于脯氨酸的熵效应。在位置L179，我们决定检测引入丙氨酸的效应，其是在该比对中，在CBH2中唯一可选的氨基酸。在位置Q204，我们决定用谷氨酸残基，而不是共有序列中所建议的丙氨酸取代谷氨酰胺，因为该丙氨酸的引入可能破坏疏水核心中的有利相互作用，而通过电荷由Q到E突变的引入应该能改善该分子表面上的电荷网络。我们用亮氨酸取代V206，因为在疏水核心中的适合度似乎优于拟合异亮氨酸。在V250的情况下，由于空间限制原因，我们决定用亮氨酸，而不是用稍微更大的异亮氨酸取代它。在位置N285，我们通过用谷氨酰胺取代天冬酰胺研究了侧链长度对稳定性的影响。在位置S291，我们决定检测引入甘氨酸的影响，其是在该比对中，在CBH2中唯一可选的氨基酸。在位置S316，我们决定检测引入脯氨酸的影响，其是在该比对中，在CBH2中唯一可选的氨基酸。在位置S343，我们决定引入脯氨酸，原因在于其对骨架的稳定效应以及这样的事实：该氨基酸是在该比对中在该位置频率最高的一个。在位置T349，苏氨酸被亮氨酸，而不是共有序列所建议的缬氨酸取代。在位置S413，我们决定通过用酪氨酸取代丝氨酸检测在该位置芳族残基对稳定性的影响。

实施例2

cbh2构建物的制备

在图2中所描述的CBH2的cDNA序列作为扩增该基因的模板。它还作为引入突变的模板。

下面的DNA引物被构建，以用在从分离自各种微生物的基因组DNA中扩增突变体cbh2基因。本文中所使用的蛋白质和DNA序列的所有符号对应于IUPACIUB Biochemical Nomenclature Commission(生物化学命名委员会)代码。

基于来自里氏木霉的cbh2序列，开发出同源5′(FRG361)和3′(FRG362)引物。两种引物在引物的5′端都包含的Gateway克隆序列。引物361含有attB1序列，而引物FRG362含有attB2序列。

无attB1的FRG361序列：

ATGATTGTCGGCATTCTCAC(这起始该基因的5′端，所述基因编码红褐

肉座菌CBH2的信号序列)(SEQ ID NO：3)

无attB2的FRG362序列：

TTACAGGAACGATGGGTTTGCG (这起始该基因的3′端，所述基因编码红

褐肉座菌CBH2的催化结构域)(SEQ ID NO：4)

红褐肉座菌cbh2的cDNA作为模板。所使用的cDNA来源于如Pamela K.Foreman et al， Journal of Biological Chemistry Vol 278 No 342003 page 31989所述制备的cDNA文库。利用下面的引物，用特异的CBH2催化域探针筛选该文库：

表1

PCR条件如下：10μL 10×反应缓冲液(10×反应缓冲液，包含100mM Tris HCl，pH 8-8.5；250mM KCl；50mM (NH₄)₂SO₄；20mM MgSO₄)；dATP、dTTP、dGTP、dCTP各0.2mM(终浓度)，1μL 100ng/μL基因组DNA，0.5μL 1单位/μL的PWO聚合酶(Boehringer Mannheim，Cat#1644-947)，0.2μM每种引物FRG361和FRG362(终浓度)，4μl DMSO，以及加水到100μL。

通过琼脂糖凝胶，使用Qiagen Gel Extaction KIT，纯化编码所述变体的片段。利用

的Gateway^TM Technology指导手册(版本C)——因此被引入本文作为参考，纯化的片段被用于进行与

的pDONR^TM201载体的克隆酶反应。因此制备的pENTRYCBH2克隆在图4中给出。

在红褐肉座菌CBH2的各个位点可能与所述变体的热稳定性有关，并且红褐肉座菌cbh2基因因此经受使用如下所述的引物和反应试剂的突变。

每一反应(单位点突变、随机突变、区域突变或组合)的循环参数是相同的：

表2

阶段	循环	温度	时间

1	1	95℃	1分钟
				2	30	95℃	1分钟
		55℃	1分钟
						65℃	12分钟
3	1	4℃	2分钟

如下所述分离和表征扩增产物(参见实施例3-6)。

然后，将具有正确序列的基因(变体或野生型)从该ENTRY载体转移到目标载体(pRAXdes2)，以获得表达载体pRAXdesCBH2。

用含有编码CBH2纤维素酶变体的核酸的表达载体转化细胞。根据Cao et al(Cao Q-N，Stubbs M，Ngo KQP，Ward M，Cunningham A，Pai EF，Tu G-C and HofmannT(2000)Penicillopepsin-JT2a recombinant enzyme from Penicilliumjanthinellum andcontribution of a hydrogen bond in subsite S3 to kcat Protein Science 9：991-1001)所述的方法，该构建物被转化进黑曲霉泡盛变种。

实施例3

定点突变(Site Directed Mutagenesis)

基于实施例1所描述的基本原理，用下面的5’磷酸化引物制备定点CBH2突变体，该5’磷酸化引物通过使用本领域中已知的技术开发和合成：

表3：单定点突变体的引物

编码突变的密码子加下划线并以粗体表示。

为开发定点突变体，QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Stratagene，La Jolla，CA；Cat#200513)被使用。

使用下面的反应试剂，进行突变反应。

表4

成分	浓度	量
			磷酸化引物(来自上面的表2)	100μM	1μl
pEntryCBH2	50ng/μl	1μl
			dNTP’s	10mM	1μl
10*QC缓冲液	Stratagene	2.5μl
			QC酶	Stratagene	1μl
无菌MilliQ水		18.5μl

扩增产物被回收(从引物、核苷酸、酶、矿物油、盐和其它杂质纯化)，并用Dpn1消化。一微升Dpn1(10U/μl)被加到PCR混合物中并在37℃下温育90分钟。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(250)(Qiagen，Cat.No.28106)，根据制造商的指导，纯化PCR反应产物。洗脱体积为35μl洗脱缓冲液。

为除去双链未突变的DNA，用Dpn1限制性酶消化洗脱的样品第二时间。1μl Invitrogen的Dpn1(Cat.No.15242-019)和4μl反应缓冲液(反应4由10×溶液的Dpn1补给；在最终的反应混合物中1∶10稀释)被加入到样品，并在37℃下温育90分钟。两微升反应样品被用于转化10μl One-Shot Top10电感受态细胞(Invitrogen，Cat.No.C4040-50)。在37℃下在SOC培养基中生长1小时后(参见Hanahan(1983)J.Mol.Biol.166：557-580)，所述细胞已经被种到卡那霉素选择板上，并在37℃下温育过夜。

阳性克隆在含100μg/ml氨苄青霉素的2*TY培养基中生长，以及用QIAprep Spin Miniprep Kit(Cat.No.27106)分离质粒DNA。对该质粒进行测序，以确认突变序列已被正确地掺入。

根据Gateway Cloning Procedure(Invitrogen；Cat No.11791019)，用LR反应，将具有正确序列的突变体转移到黑曲酶表达载体pRAXdest#2。在表达克隆经原生质体转化到黑曲酶AP4后，筛选具有改变的热稳定性的定点突变体(Site Directed Mutants，SDM)(表14)。

实施例4

组合文库

两个QuikChange文库(QC2C和QC2D)被开发出，这基于在SDM筛选中鉴定的单位点突变的结果：98、134、206、212、312、316、411和413。

采用快速改变法(quick-change，QC)，突变P98L、M134V、V206L、I212V、T312S、S316P、F411Y和S413Y在文库中被随机组合。为开发QC文库，使用Multi Site-Directed Mutagenesis Kit(Cat#200513，来自Strategene)。

引物如下表所列制备：

表5

名称	引物
		98FP	CAACCCTTTTGTTGGGGTCACTCTTTGGGCCAATGC
134FP	GCTGTCGCAAAGGTTCCCTCTTTTGTGTGGCTAGATACTCTTG
		206FP	CGACACCATTCGTCAAATTCTCGTGGAATATTCCGATATCCG
212FP	GAATATTCCGATGTCCGGACCCTCCTGGTTATTGAGCCTG
		206/212FP	CGTCAAATTCTCGTGGAATATTCCGATGTCCGGACCCTCC
312FP	CAACGGGTGGAACATTAGCAGCCCCCCATCGTAC
		316FP	CATTACCAGCCCCCCACCGTACACGCAAGGC
312/316FP	GGTGGAACATTAGCAGCCCCCCACCGTACACGCAAGGC
		411FP	AGTGCGCCACGATATGACTCCCACTGTGCGCTC
413FP	GCCACGATTTGACTACCACTGTGCGCTCCCAGATG
		411/413FP	GTGCGCCACGATATGACTACCACTGTGCGCTCCCAGATG

如下制备引物混合物：

将30微升引物98和134(参见上表)与10μl的每一种其它引物(参见上表)混合。两种不同的引物浓度被检测，导致两个文库，其中一个文库中每分子含有平均2个氨基酸取代，而第二个文库中每分子含有6个氨基酸取代。

使用下面的反应试剂，进行突变反应。

表6

成分	浓度	QC2C	QC2D

磷酸化引物混合物	10μM	1μl	10

pEntryCBH2	250ng/μl	1μl	1μl
				dNTP’s	10mM	1μl	1μl
10*QC缓冲液	Stratagene	2.5μl	2.5μl
				QC酶	Stratagene	1μl	1μl
无菌MilliQ水		18.5μl	9.5μl

扩增产物用Dpn1消化。1微升Dpn1(10U/μl)被加到PCR混合物中并在37℃下温育90分钟。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(250)(Qiagen，Cat.No.28106)，根据制造商的指导，纯化PCR反应产物。洗脱体积为35μl洗脱缓冲液。

为除去双链未突变的DNA，用Dpn1限制性酶消化洗脱的样品第二时间。1μl Invitrogen的Dpn1(Cat.No.15242-019)和4μl反应缓冲液(反应4由10×溶液的Dpn l补给；在最终的反应混合物中以1∶10稀释)被加入到样品，并在37℃下温育90分钟。2微升反应样品被用于转化10μl One-Shot Top10电感受态细胞(Invitrogen，Cat.No.C4040-50)。在37℃下在SOC培养基中生长1小时后(参见Hanahan(1983)J.Mol.Biol.166：557-580)，所述细胞已经被接种到卡那霉素选择板上，并在37℃下温育过夜。

将阳性克隆在含100μg/ml氨苄青霉素的2*TY培养基中生长，以及用QIAprep Spin Miniprep Kit(Cat.No.27106)分离质粒DNA。对该质粒进行测序，以确认突变序列已被正确地掺入。

根据Gateway Cloning Procedure(Invitrogen；Cat No.11791019)，用LR反应，将具有正确序列的突变体转移到黑曲酶表达载体pRAXdest#2。在表达克隆经原生质体转化到黑曲酶AP4后，针对改变的热稳定性对QC文库进行筛选(Site Directed Mutants，SDM)(表15、16)。

实施例5

区域突变(Regional Mutagenesis)

如下所述，基于在SDM筛选期间鉴定的单位点突变的结果，在CBH2的3D结构中区域被鉴定，在热稳定性试验中被随机突变和筛选。组成这样的空间区域的氨基酸是(在各组中)：[210，214]、[253，255，257，258]、[411，413，415]、[412，414，416]、[312，313]、323、[212，149，152]、[134，144]和98。

在上述位置(即[210，214]、[253，255，257，258]、[411，413，415]、[412，414，416]、[312，313]、323、[212，149，152]、[134，144]和98)处的完全随机文库被筛选。在上面的名单中在括号之间的氨基酸(例如[210，214])被一起随机化，氨基酸323和98被单独随机化。变体CBH2-S316P或CBH2-V206L-S316P作为这些文库的骨架。

NNS引物被构建并从Invitrogen订购：

表7

根据下面的方案，用Pfu Ultra DNA聚合酶(Stategene；Cat.No.600380)进行PCR：

表8

成分	浓度	量
			正向引物	10μM	2μl
反向引物	10μM	2μl

骨架序列	-	1μl
			dNTP’s	10mM	1μl
10*Pfu缓冲液	Stratagene	5μl
			Pfu Ultra酶	Stratagene	0.5μl
DMSO	-	2μl
			无菌MilliQ水		36.5μl

将PCR片段置于1％LMT凝胶上，并用Qiagen Gel Extraction Kit(Stategene Cat.No.28706)纯化。纯化的片段与Pfu Ultra(参上)和具有attB侧翼序列的cbh2引物融合。

根据手册(Invitrogen；Cat.No.11789013)，使用BP反应，将纯化的cbh2基因转移进Gateway Entry-Vector pDON201。用卡那霉素(50μg/ml)在2*TY板上选择阳性克隆，并刮擦所述板，以制备质粒，所述质粒利用Gateway LR反应(Invitrogen；Cat.No.11791019)转移到pRAXdest#2(表达载体)。该载体用Notl消化，以最优化LR反应的转化频率。原生质体转化已被用于在黑曲酶AP4中建立9个CBH2区域文库(CBH2Regional Libraries)，其被筛选以获得改变的热稳定性(表17)。

实施例6

多点突变体(Mutiple Mutants)

基于单位点突变的表达和热稳定性结果，设计一组多点突变，其仅在摇瓶中被产生。

来自CBH2变体FCA557(P98L/M134V/S316P/S413Y)(来自QC文库，实施例4)的突变与来自CBH2变体FCA564(S316P/V323Y)、FCA568(V206L/S210R/T214Y/S316P)和FCA570(M134L/L144R/S316P)(来自区域文库，实施例5)的那些突变组合，以获得具有改善的热稳定性的CBH2分子。

引物被构建并从Invitrogen订购：

表10

使用表11(下面)中的反应试剂，进行PCR，以获得构建所有9种CBH2组合所需的所有片段(A-M)。使用DNA聚合物Phusion(Finnzymes；Cat.No.F-530)。引物浓度为10μM。循环条件在表2(上面)中给出。

表11

将PCR片段置于1％LMT凝胶上，并用Qiagen Gel Extraction Kit(Stategene Cat.No.28706)纯化。使用Phusion DNA聚合酶(参上)，用CBH2-attB引物(如上)，融合纯化的片段，以获得表12的完整CBH2组合。

表12

通过1％LMT琼脂糖纯化完整的CBH2-attB分子，并转移到黑曲酶AP4表达载体pRAXdest#2。所使用的方法是“将attB-PCR产物直接克隆进目标载体的 One-tube Protocol”(根据Invitrogen手册)。

根据手册，3μl反应样品被用于转化100μl DH5α最大效率感受态细胞(Invitrogen Cat.No.18258012)。在37℃下在SOC培养基中生长1小时后，所述细胞被铺平板于卡那霉素选择板上，并在37℃下温育过夜。阳性克隆在2*TY培养基和100μg/ml氨苄青霉素中生长。以及用QIAprep Spin Miniprep Kit(Cat.No.27106)分离质粒DNA并测序。

根据Gateway Cloning Procedure(Invitrogen；Cat No.11791019)，用LR反应，将具有正确序列的突变体转移到黑曲酶表达载体pRAXdest#2。在表达克隆经原生质体转化到黑曲酶AP4后，多点突变体被表达和分离(如在实施例7中所述)，并分析热稳定性(表17、18)。

实施例7

来自摇瓶生长的CBH2和其变体的表达和分离

为提供在热变性研究(实施例9)中用于Tm测量的材料，使表达克隆在摇瓶中生长，然后CBH2分子被纯化，如下：

用含有编码CBH2纤维素酶变体的核酸的表达载体转化细胞。进根据Cao etal(Cao Q-N，Stubbs M，Ngo KQP，Ward M，Cunningham A，Pai EF，Tu G-C and Hofmann T(2000)Penicillopepsin-JT2a recombinant enzyme from Penicillium janthinellum and contribution of a hydrogen bond in subsite S3 to kcat Protein Science9：991-1001)所述的方法，该构建物被转化进黑曲霉泡盛变种。

黑曲霉泡盛变种转化子在缺乏尿嘧啶的基本培养基上生长(Balance et al.1983)。如Cao et al.(2000)所述，通过在37℃将1cm²来自孢子萌发生长琼脂板的孢子悬液接种到100ml摇瓶中3天，培养转化子，然后筛选纤维素酶活性。

CBH2活性测定是基于磷酸溶涨纤维素(PASC：0.5％PASC，在0.5mM醋酸钠中，pH 4.85)的水解。通过PAHBAH测定测量还原糖。(PAHBAH：2.975gPAHBAH，9.75g Na-K-酒石酸盐，在195ml 2％NaOH中)。PASC：(Karlsson，J.et al.(2001)，Eur.J.Biochem，268，6498-6507，Wood，T.(1988)in Methods in Enzymology，Vol.160.Biomass Part a Cellulose and Hemicellulose(Wood，W.& Kellog，S.Eds.)，pp.19-25，Academic Press，San Diego，CA，USA)以及PAHBAH：(Lever，M.(1972)Analytical Biochemistry，47，273，Blakeney，A.B.&Mutton，L.L.(1980)Journal of Science of Food and Agriculture，31，889，Henry，R.J.(1984)Journal of the Institute of Brewing，90，37)。

然后，通过疏水相互作用层析(hydrophobic interaction chromatography，HIC)，经由下面两个步骤的一个，从这些培养液的无细胞上清中纯化Cel6A野生型和变体：

对于SDM变体(实施例3)，Bio-RAD Poly-Prep Columns CAT#731-1550被使用，采用Pharmacia Phenyl Sepharose树脂(1.6ml＝1ml柱)CAT#17-0973-05。该树脂在用1-2柱体积(column volume，CV)水洗涤之前被设置，然后，用5CV 0.020M磷酸钠、0.5M硫酸铵、pH 6.8(缓冲液A)平衡。将4M硫酸铵加到上清液中，终浓度达到约0.5M。2CV上清液被上样，然后在用4CV 0.020M pH 6.8的磷酸钠洗脱之前，用5CV缓冲液A洗涤柱子。滤液包含纯化的CBH2。

对于多点突变(实施例6)，使用由Applied Biosystems制备的

20HP2树脂，在Novagen真空岐管(Vacuum Manifold)上运行柱子。用5CV缓冲液A平衡HIC柱。将硫酸铵加到上清液中，终浓度达到约0.5M，并且调节pH到6.8。在过滤后，上清液被上样，用10CV缓冲液A洗涤柱子，然后用10CV的0.020M pH6.8的磷酸钠洗脱。级分被收集，并在CBH2存在的基础上被富集，如通过还原性SDS-PAGE凝胶分析所检测。

当需要时，根据所提供的步骤(Sigma-Aldrich)，通过用内切糖苷酶H处理上清液，在纯化之前CBH2分子被去糖基化。

实施例8

通过热失活的CBH2变体的热稳定性

通过测量在严格条件下、在升高的温度中温育之前和之后的无细胞上清等分试样的PASC活性，鉴定与野生型CBH2相比具有改变的稳定性到不可逆热失活的CBH2分子。所应用的严格条件为在61℃或65℃下(如所示)在0.1M pH4.85的乙酸钠中1∶1稀释的上清液温育1小时，随后在冰上冷却10分钟。通过将残留活性除以初始活性(在严格温育之前CBH2对PASC的活性)计算残留活性％(在升高的条件下温育后的剩余活性％)。

根据下面的步骤，进行CBH2变体和野生型的稳定性到热失活的筛选：

A.溶液和培养基

下面的溶液/培养基被用于测定CBH2突变体稳定性至不可逆热失活：

1.如表13所示，制备加麦芽糖基本培养基(MM培养基)：

表13：用于黑曲酶的基本培养基+麦芽糖

2.0.5％PASC溶液，在50mMNaAc中，pH4.85：

i.将5克Avicel PH101(Fluka 11365)加入到1升烧杯，并加入～12ml水，以制备稠的浆液。

ii.将烧杯置于冰上。

iii.加入150ml冰冷的85％正磷酸(Art.1000573Merck)并用ultra turrax高速(防止喷洒)混合约1小时。

iv.加入100ml冰冷的丙酮，其导致非晶型纤维素缓慢沉淀成非常稠的浆液。

最后使用抹刀(spatula)，以便更好混合。

v.用水将该非常稠的浆液稀释到～1升，以使其的流动性足以将其转移到6×250ml Sorvall容器中。

vi.在10k下离心15分钟，并弃上清。

vii.用烧杯所能够容纳的水混合沉淀小球，并再次离心。

viii.重复步骤5和6至少3次，直到pH增加到pH4.0-5.0。

ix.为增强磷酸的洗涤，一滴4N NaOH可以被加入到水中。

x.用水混合最终的沉淀小球到～300ml并均化。

xi.采用干重测量，测定所述浆液的浓度。

在121℃下对所述浆液灭菌20分钟。冷却并储存在冰箱中。

3.如下制备PAHBAH试剂：1.5g PAHBAH+5g酒石酸-钠-钾，在100ml 2％NaOH中。

4.纤维二糖储液；在MQ水中制备0、0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、0.7和1mg/ml溶液。

B.样品制备

1.在轨道式摇床(225rpm)上，在每孔含有200μl基本培养基+麦芽糖(见上)的96W filter MTP′s(Millipore，#MAGVS2210)中，于33℃生长黑曲酶变体7天，湿度为80-90％。

2.在生长温育之后，使用真空歧管过滤培养基，在新的96W flat MTP′s(Greiner，#655101)中收集滤液(上清)，在4℃下储存。

C.在升高的温度下的严格温育

1.每孔用60μl 100mM pH 4.85的NaAc稀释60μl上清(sup)(1∶1)。

(任选的：当剩余的上清需要被检查残留糖时，每孔加入190μl100mM pH4.8的NaAc到10μl上清，并将20μl该稀释的上清转移到150μl PAHBAH试剂，进行PAHBAH还原糖实验(参见E))。

2.将20μl该稀释的上清转移到新的flat 96W MTP，并在4℃下储存(用于初始活性)

3.在61℃下(或65℃)温育剩余的稀释的上清(约100μl)1小时(用于残留活性)

4.在冰上冷却10′。

D.PASC温育；小规模转化(small scale conversion，SSC)试验

1.在新的flat MTP′s中制备：180μl/孔的、在50mM pH4.85的NaAc中的充分搅拌的0.5％的PASC溶液。

2a.在一个设计用于测量残留活性的板中，在预温育后将每孔20μl的处理的稀释上清(sup)转移(伴随上下混合)到PASC-MTP′s。

2b.在设计用于测量初始活性的第二个板中，将每孔180μl的PASC溶液转移(伴随上下混合)到储存的20μl未处理的稀释上清。

3.密封sup-PASC MTP′s，并在50℃下温育2小时，以900rpm搅拌。

4.在冰上冷却10′。

5.将sup-PASC混合物转移到新的MTP，在真空歧管中过滤并收集滤液。

E.PAHBAH还原糖测定

1.制备具有每孔150μl PAHBAH试剂的新96W flat MTP。

2.将20μl的sup-PASC滤液转移到PAHBAH(上下混合)。

3.在第一MTP中的柱1中设置校准线；20μl的纤维二糖储存液(参见上面的A4)。

4.在69℃、900rpm下温育1小时，冷却到室温，并在2000rpm下离心2′。

5.在SpectraMax分光光度计(Spectra，Sunnyvale，CA，U.S.A.)中，直接测量MTP读数的端点OD410。

F.数据处理(Spad-it)

1.由纤维二糖稀释孔的读数，以mg/ml纤维二糖对OD40，绘制纤维二糖校正线

2.使用校正曲线以及样品孔的读数，计算以mg/ml纤维二糖计的每一上清的初始值和残留值

3.计算残留活性％。

定点突变的CBH2变体的残留活性测量

表14：Cel6A野生型和变体残留活性

每一野生型(w.t.)和变体的残留活性％数为3个测定值的均值。stdev＝计算的测定值的标准偏差。

上表示出了在6l℃或在65℃下1小时的严格温育后单定点突变体(SDM，实施例3)的剩余的残留活性％。在数据的每一个亚组中示出了WT克隆的残留活性(在每一个板上都有一个WT参考)。WT的平均值分别为61℃下21.4％和65℃下6.6％。清楚的是，具有比WT更高的残留活性的每一突变体是在筛选条件下具有改善的热稳定性的分子。

CBH2组合突变体的残留活性测量

表15和16中的两个结果栏示出了实施例4所产生的变体在两个不同的温度下温育后的残留活性％。

两个表(表15和16)被描述如下，因为这些值在两个独立的试验中产生。

清楚的是，具有比WT更高的残留活性的每一突变体是在筛选条件下具有改善的热稳定性的分子。

表15：Cel6A野生型和变体的残留活性

除非另外说明，平均残留活性％由4个测定值计算。如所示出地，“(8)”，进行8次测定。stdev＝计算的测定值的标准偏差。

表16：Cel6A野生型和变体的残留活性

平均残留活性％通过括号中所述的测定值数量计算。stdev＝计算的测定值的标准偏差。

区域突变的CBH2变体的残留活性测量

表17示出了实施例5所产生的变体在61℃下温育后的残留活性％。

表17：Cel6A野生型和变体的残留活性

除非另外说明，每一个残留活性％值是3个测定值的平均值。如所示出地，“(32)”，进行32次测定。stdev＝计算的测定值的标准偏差。

明显的是，具有比WT和/或S316P更高残留活性的每一突变体是在筛选条件下具有改善的热稳定性的分子。

实施例9

通过Tm测量的CBH2变体的热稳定性

CBH2纤维素酶被如上克隆、表达和纯化(实施例7)。在来自Microcal(Nothampton，Massachusetts，US)的VP-DSC显微量热器上采集热变性数据。缓冲条件为50mM Bis Tris Propane/50mM乙酸铵/冰醋酸，pH5.5或pH5.0，如所示。蛋白质浓度为大约0.25mgs/ml。在90(℃/hr)的扫描速率下从25℃-80℃进行三次热扫描。第一扫描示出了CBH2的热变性，并且被用于确定热变性的表观中间点(apparent mid-point)Tm。仪器软件产生了Cp(卡/℃)对温度(℃)曲线，并且从该曲线手工确定Tm。在所有情况下热变性是不可逆的，如在第二和第三热扫描中不存在热变性的情况所显示。

表18：在pH5.5下通过DSC测定的Tm

所有的变体数据参照依然糖基化的FAC500(rCBH2野生型)Tm。“Tm G”＝对所纯化的重组蛋白测量的Tm。“Tm DG”＝对在被纯化之前用EdoH去糖基化的重组蛋白测量的Tm。

表19：在pH5.0下通过DSC测定的Tm

与野生型相比，引入CBH2纤维素酶突变体的突变影响突变体CBH2纤维素酶的热稳定性。

采用本领域中已知的用于去除N-连接多糖的方法，制备在本实施例和下面的实施例中使用的去糖基化蛋白(参见例如Biochem.J.(2001)358：423-430)。还参见Tai，T.，et al.J.Biol.Chem.(1975)250，8569。

实施例10

CBH2变体对PASC的比活性

与已经克隆到黑曲酶中的野生型红褐肉座菌CBH2相比，本实施例研究了CBH2变体对磷酸溶涨纤维素的特异性能。

磷酸溶涨纤维素(PASC)——根据在Walseth(1971)Tappi 35：228(1971)和 Wood Biochem J.121：353(1971)中描述的方法，通过Avicel制备PASC。用缓冲液和水稀释该材料，达到1％w/v的混合物，使得乙酸钠的终浓度为50mM，pH 5.0。

通过本领域中已知的技术，确定这些变体对纤维素底材的相对特异性能。例如参见Baker et al，Appl Biochem Biotechnol 1998Spring；70-72()：395-403。

标准的纤维素转化在试验中被使用。参见在前的Baker。在该试验中，酶和缓冲的底物被置于容器中，并在某一温度下温育一段时间。用足够的100mM pH11.0的Glycine结束反应，以使反应混合物的pH达到至少pH 10.0。一旦反应结束，反应混合物的等分试样通过0.2微米膜过滤，以除去固体。然后，根据Baker et al.，Appl.Biochem.Biotechnol.70-72：395-403(1998)中描述的方法，通过HPLC测定过滤的溶液的可溶性糖。

在53℃下，用在50mM pH5.0的NaOAc中的1％PASC，测定这些变体的相对比活性，这在1400rpm摇动下进行3.5小时。酶剂量为0.75、1.5和3mg/克纤维素。如在Leach和Scheraga 1960(J.Am.Chem.Soc.82：4790-4792)中所述，通过OD 280确定蛋白浓度。被比较的变体为FCA500.3、FCA523、FCA536和FCA540-550。为简化起见，图8仅示出了FCA540、FCA542、FCA545、FCA547、FCA549和FCA550。所有其它变体样品具有由FCA542和FCA545结果确定的线所限制的比活。

温度稳定性筛选得到的几个新CBH2变体具有与野生型一样的活性。

为了比较上面的剂量依赖性数据的数(如图8所示)，在相同的剂量下，由变体产生的(平均)总糖与由FCA500.3(野生型)产生的(平均)总糖的比率被平均。图9中描述的这些比率都非常类似，除了活性低许多的FCA547、FCA549和FCA550。误差条形图是所述比率的平均值的单标准偏差(single standard deviation)。比率1将表示，所述变体在该试验中具有与野生型相似的活性。所有稳定化的变体保持对该底物的活性。

实施例11

CBH2变体对PCS的比活性

本实施例比较了CBH2变体对预处理的玉米秸秆(pretreated corn stover)的比活，如与已被克隆进黑曲酶的野生型红褐CBH2。

预处理玉米秸秆(PCS)——如Schell，D.et al.， J.Appl.Biochem.Riotechnol.105：69-86(2003)中所述，用2％w/w H₂SO₄预处理玉米秸秆，随后用去离子水多次洗涤，以获得pH 4.5的糊。然后，加入醋酸钠缓冲液(pH 5.0)(终浓度为50mM醋酸钠)，并且，如果必要，该混合物随后用1N NaOH滴定到pH 5.0。在该反应混合物中纤维素浓度大约为7％。在53℃下，在700rpm下20小时，使用PCS检测CBH2的特异性能。三个不同剂量的CBH2变体，0.75、1.5和2.5mg/g纤维素(在PCS中)，被加到8.5mg CBH2缺失纤维素酶菌株肉汤/g纤维素。(对于在红褐肉座菌(也称为里氏木霉)中删除CBH2基因的讨论，参见美国专利第5,861,271和5,650,322。)结果被示于图10中。CBH2缺失菌株(无CBH2被添加回)的基线活性被示出。在重构的完整纤维素酶对PCS中，CBH2变体与CBH2野生型具有相似的活性。这表明，当被添加回缺失的菌株时，野生型给予所述缺失菌株如上的一些活性。在相似的条件下所述变体达到大概相同的活性。

如上所述，对其它变体进行相似的试验。在每一剂量下对重复两次的总糖的值求平均，然后将该值除以相应的FCA500.3(野生型)重复两次的平均值。图11中描述的这些比率都非常类似，除了活性低得多的FCA547、FCA549和FCA550。误差条形图是在不同剂量下所述比率的单标准偏差。比率1将表示，所述变体在该试验中具有与野生型相似的活性。所有稳定化的变体保持对该底物的活性。

实施例12

在不同温度下CBH2变体的比活性

本实施例证明了，每一种酶(稳定化变体和野生型)在不同温度下保持活性多长时间。

实施例10中描述的试验经如下修改后被用在本实施例中。由CBH2(0.5mg/g纤维素)在1％PASC中，于53、65和75℃下并伴随着300PRM的摇动，经过不同的温育时间而产生的总糖，被用于确定每一种酶(稳定化变体和野生型)在这些温度下保持活性多长时间。

在53℃下，所述变体随着时间变化具有与野生型酶大致相同的活性(参见图12)。由于在53℃下酶的稳定性，所述酶的半衰期不能从该数据确定。在65℃，由FCA543和FCA500产生的总糖显示，FCA543比FCA500具有更长时间的活性(图13)。所述变体的半衰期被确定为大约24小时，而野生型半衰期为约4小时。然后，两种酶都在72小时的温育时间内开始失效。在75℃时，在第一小时中FCA543比FCA500产生更多的糖(参见图14)。

实施例13

与其它纤维素酶一起的CBH2变体比活性

本实施例说明了变体(即，稳定化的)CBH2结合其它纤维素酶在生物物质转化中的使用。

在标准转化试验中，使用PCS作为底物(参见实施例11)，在5mg/g纤维素和10mg/g纤维素下以及在38、53和65℃下，检测具有嗜酸耐热菌(Acidothermus cellulolyticus)E1核心加上野生型CBH 1和2(分别为FCA301和FCA500)或稳定化的CBH 1和2(分别为FCA469和FCA543)的三种酶混合物(参见WO05/093050)。在第一天、第二天和第五天时淬灭样品。

CBH1变体在美国专利公开第20050054039号中被描述，其被引入于此作为参考。来自嗜酸耐热菌的E1酶在美国专利第5,712,142中被公开。参考下列专利文件：WO 91/05039；WO 93/15186；US专利第5,275,944号；WO 96/02551；US专利第5,536,655号和WO 00/70031。还参考GenBank U33212。

结果显示，在38℃下，所述变体混合物的特异性能与野生型混合物大致相同(见图15)。在53℃下，观察到相似的性能模式(数据未示出)。

在65℃下，稳定化变体混合物显示出相比于野生型混合物显著增强的特异性能。(参见图16)

使用如实施例11所述的相同标准转化试验，在56、59和62℃下以及在5和10mg/g纤维素下检测所述稳定化变体混合物的特异性能，并且在24、48和120小时时淬灭样品。在所有三种时间下，56℃比其它更高的温度更好。参见图17。在所有检测的时间下，最适温度为59℃以下。

本发明所述的方法和系统的各种修改和变化对于本领域技术人员而言将是显然的，而不背离本发明的范围和精神。尽管本发明以具体的优选实施方式作为对象进行描述，但是应该理解，要求保护的本发明不应该过多地受到这些具体实施方式的限制。事实上，用于实施本发明的所述方式的各种修改——其对分子生物学或相关领域的技术人员而言是显然的，都意欲包含在权利要求书的范围之内。

Claims

1.CBH2纤维素酶变体，其中所述变体在对应于来自红褐肉座菌(Hypocrea jecorina)的CBH2的成熟序列中的残基P98处的取代是P98L，其中所述残基P98对应于SEQ ID NO：2中的残基P122。

2.根据权利要求1所述的CBH2纤维素酶变体，其中所述变体CBH2由选自下列的突变组成：来自由SEQ ID NO：2的氨基酸残基25-471所示的红褐肉座菌的CBH2的成熟序列中的

i. P98L/M134L/L144R/S210L/T214Y/S316P/V323Y/S413Y

ii. P98L/M134L/L144R/S210R/T214Y/S316P/V323Y/S413Y

iii. P98L/M134L/L144R/S316P/S413Y

iv. P98L/M134L/L144R/S316P/V323Y/S413Y

v. P98L/M134L/L144R/V206L/S210R/T214Y/S316P/S413Y

vi. P98L/M134L/L144R/V206L/S210R/T214Y/S316P/V323Y/S413Y

vii. P98L/M134V/I212V/S316P/S413Y

viii. P98L/M134V/I212V/T312S/S316P/S413Y

ix. P98L/M134V/S316P

x. P98L/M134V/S316P/S413Y

xi. P98L/M134V/S316P/V323Y/S413Y

xii. P98L/M134V/T154A/I212V/S316P/F411Y/S413Y

xiii. P98L/M134V/T154A/I212V/S316P/S413Y

xiv. P98L/M134V/T154A/I212V/T312S/S316P/S413Y

xv. P98L/M134V/T154A/V206L/I212V/S316P/F411Y/S413Y

xvi. P98L/M134V/T154A/V206L/S316P

xvii. P98L/M134V/V206L/I212V/S316P/F411Y

xviii. P98L/M134V/V206L/I212V/T312S/S316P/S413Y

xix. P98L/M134V/V206L/S210R/T214Y/S316P/S413Y

xx. P98L/M134V/V206L/S210R/T214Y/S316P/V323Y/S413Y

xxi. P98L/M134V/V206L/S316P/S413Y

xxii. P98L/V206L/I212V/T312S/S316P/F411Y/S413Y

3.核酸，所述核酸编码根据权利要求1所述的CBH2变体。

4.核酸，所述核酸编码根据权利要求2所述的CBH2变体。

5.载体，所述载体包含权利要求3所述的编码CBH2变体的核酸。

6.载体，所述载体包含权利要求4所述的编码CBH2变体的核酸。

7.宿主细胞，其用权利要求5所述的载体转化。

8.宿主细胞，其用权利要求6所述的载体转化。

9.产生CBH2变体的方法，所述方法包括步骤：

(a)在合适的条件下，在合适的培养基中，培养根据权利要求7所述的宿主细胞，以产生CBH2变体；

(b)获得所述产生的CBH2变体。

10.产生CBH2变体的方法，所述方法包括步骤：

(a)在合适的条件下，在合适的培养基中，培养根据权利要求8所述的宿主细胞，以产生CBH2变体；

(b)获得所述产生的CBH2变体。

11.洗涤剂组合物，其包含表面活性剂和CBH2变体，其中所述CBH2变体是根据权利要求1所述的CBH2变体。

12.根据权利要求11所述的洗涤剂，其中所述洗涤剂是洗衣洗涤剂或盘碟洗涤剂。

13.饲料添加剂，其含有根据权利要求1所述的CBH2变体。

14.处理木浆的方法，其包括用根据权利要求1所述的CBH2变体接触所述木浆。

15.将含纤维素的生物物质转化为糖类的方法，其包括用根据权利要求1所述的CBH2变体接触所述含纤维素的生物物质。