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CN102596224B - 用于治疗lewy体病的alpha-突触核蛋白表位之模拟表位的用途 - Google Patents

用于治疗lewy体病的alpha-突触核蛋白表位之模拟表位的用途 Download PDF

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CN102596224B CN201080047744.9A CN201080047744A CN102596224B CN 102596224 B CN102596224 B CN 102596224B CN 201080047744 A CN201080047744 A CN 201080047744A CN 102596224 B CN102596224 B CN 102596224B
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Abstract

本发明涉及用于生成供预防和/或治疗突触核蛋白病用的药物的肽或多肽。

Description

用于治疗lewy体病的alpha-突触核蛋白表位之模拟表位的用途
本发明涉及用于预防和/或治疗突触核蛋白病(synucleinopathy)的药物。
突触核蛋白病是多种多样的一组共享共同的病理学特征的神经变性性病症：在神经病理学检查中，可以检出特征性损伤，其在神经元和神经胶质细胞的选定群体中含有alpha-突触核蛋白(alpha-syn，a-syn)蛋白的异常聚集体。
alpha-syn(最初鉴定为PARK1和PARK4)是一种在新皮质、海马、齿状回、嗅球、纹状体、丘脑和小脑中广泛表达的140个氨基酸的蛋白质。alpha-Syn也在造血细胞，包括B-、T-、和NK细胞及单核细胞和血小板中高度表达。在这些细胞中的确切作用是未知的，但是其已经牵涉巨核细胞(血小板前体)的分化。
最常见的突触核蛋白病包括但不限于Lewy体病(LewyBodyDisorder，LBD)，如帕金森氏病(Parkinson’sDisease，PD)、帕金森氏病伴痴呆(Parkinson’sDiseasewithDementia，PDD)和痴呆伴Lewy体(DementiawithLewyBodies，DLB)，及多系统萎缩(MultipleSystemAtrophy，MSA)或神经变性伴脑铁积累(NeurodegenerationwithBrainIronAccumulation)I型(NBIAI型)。这些疾病目前的治疗选项包括症状药物，诸如L-多巴、抗胆碱能药物及单胺氧化酶抑制剂。然而，目前存在的所有治疗机会仅导致症状性缓解，而没有在患者中诱导长效的疾病减轻效果。
Lewy体病(LBD)是以震颤、强直、运动徐缓及以脑中丧失多巴胺能神经元为特征的进行性神经变性性病症。在DLB和PDD的病例中，体征还包括认知病损(cognitiveimpairment)。在西方国家年龄60岁之上的人群的多至2％形成PD/LBD的典型体征。目前，仅可用症状治疗。不幸地，这些疗法仅提供早期症状的暂时缓解，而不停止疾病进展。PD/LBD的发病机制仍不完全了解，但是似乎疾病的形成中牵涉遗传易感性和环境因素。尽管所有遗传进展，PD/LBD仍主要是没有已知原因的散发性病症(又称作特发性PD/LBD)。
患有此疾病的患者在脑的皮质和皮质下区中形成称作Lewy体(LB)的特征性泛素化胞内内含物。特别地，具有高含量多巴胺能神经元或神经元投射的区域显示这种典型的病理学特征。最近，几项研究可以显示突触蛋白alpha-syn在LBD发病机制中发挥中心作用。在LBD中，alpha-syn在遍及受影响的脑区的LB中积累。另外，可以表明alpha-syn基因中的单一点突变及双倍或多倍增殖(duplicationormultiplication)与罕见的家族型帕金森氏综合征(parkinsonism)有关。重要地，基于来自转基因(tg)小鼠中及黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)中的过表达研究的结果，强调其在PD/LBD发病机制中的关键作用，因为这些动物模型模拟PD的数种特征。
另一种非常重要的突触核蛋白病是多系统萎缩(MSA)。MSA是一种以L-多巴抗性帕金森氏综合征、小脑性共济失调(cerebellarataxia)、和家族性自主神经异常(dysautonomia)的症状为特征的散发性神经变性性病症。患者遭受影响各个脑区，包括纹状体、黑质、小脑、脑桥，及下橄榄体和脊髓的多系统神经元损失。MSA以遍及中枢神经系统的alpha-syn-阳性神经胶质细胞质内含物(GCI)和罕见的神经元内含物为特征。这些内含物与纹状体黑质变性(striatonigraldegeneration)、橄榄体脑桥小脑萎缩、及髓质和脊髓中牵涉自主核有关。GCI对于MSA发病机制的重要性得到普遍公认，并且通过分析alpha-syn过表达在少突神经胶质中的效果的对转基因小鼠模型的新近分析得到强调。在过表达人alpha-syn的tg小鼠中，观察到GCI样聚集体和MSA的生化标志物两者。
虽然alpha-syn积累导致突触核蛋白病中的典型神经变性特征的精确机制没有得到完全了解，但是新近的研究暗示alpha-syn的异常形成和积累牵涉突触核蛋白病根本的变性过程。最近，已经在LB中鉴定出不同形式的alpha-syn。除了蛋白质的全长形式外，已经鉴定出不同形式的经修饰的alpha-syn，包括磷酸化的、硝化的、和单-、二-、或三-泛素化的alpha-syn。另外，已经在来自转基因小鼠和PD病例两者的脑组织中检出蛋白质的C端截短形式，如alpha-syn1-119、alpha-syn1-122和alpha-syn1-123。目前认为，LB和Lewy(lewy)神经突中检出的多至15％的alpha-syn是截短的。使用截短的alpha-syn的先前的体外研究可以证明，缺乏C端20-30个氨基酸的alpha-syn显示聚集及形成Lewy神经突和LB中找到的细丝的趋势升高。如此，这些截短的型式可以以与阿耳茨海默氏病(Alzheimer’sdisease，AD)中的淀粉状蛋白beta(Aβ)的截短和经修饰形式相似的方式起作用。认为Aβ的这些截短和经修饰形式充当斑沉积的种子分子(seedmolecule)，并且在体内及在体外显示了较高的聚集倾向及高神经毒性和突触毒性。
如此，然后，认为积累全长alpha-syn及截短的和/或经修饰形式的alpha-syn(其显示潜在的播种效应)，导致寡聚物形成。基于新近的研究，认为例如在突触末端和轴突中的此类寡聚体形成对于PD/LBD形成发挥重要的作用，并且如此可以通过存在截短形式的alpha-syn来增强。因此，alpha-syn沉积和寡聚化的降低在治疗突触核蛋白病，尤其是特发性LBD/PD和MSA中应当是有益的，并且在源自目前的治疗策略，如L-多巴应用的仅仅症状减轻外，可以呈现用于治疗这些神经变性性疾病的第一种策略。
在IwatsuboT.(Neuropathology27(5)(2007)：474-478)中，检查了alpha-突触核蛋白沉积物及其磷酸化与alpha-突触核蛋白病发病机制的关联。此出版物的作者发现，突触核蛋白病损伤中沉积的alpha-突触核蛋白的丝氨酸129是广泛磷酸化的。US2007/213253涉及突变体人alpha-突触核蛋白及自其衍生的肽，其可以用于抑制野生型人alpha-突触核蛋白的聚集。在WO2004/041067中，披露了用于预防或治疗与alpha-突触核蛋白聚集体有关的疾病的手段和方法，其包括使用alpha-突触核蛋白片段。在US2003/166558中，描述了可用于诱导对蛋白质沉积物的免疫应答的肽。US2005/198694涉及包含至少100个氨基酸，并具有1至23个氨基酸的C端删除的alpha-突触核蛋白片段。
Liang等(J.Neurochem.99(2006)：470-482)研究了在大鼠中调节alpha-突触核蛋白。他们观察到在好酒大鼠(alcoholpreferringrat)中，与非好酒大鼠(alcohol-nonpreferringrat)相比，alpha-突触核蛋白的表达速率增加。
在HamiltonBA(Genomics83(2004)：739-742)中，检查了alpha-突触核蛋白53Thr和53Ala在灵长类中的分布。
在US2005/0037013中，披露了免疫原性alpha-突触核蛋白片段，其能够诱导针对alpha-突触核蛋白的残基70-140内的特定表位的免疫应答。
WO2006/045037涉及C端截短的alpha-突触核蛋白分子，其可以用于筛选具有可用于治疗Lewy体病的药理学活性的药剂。
虽然利用神经营养因子并嫁接多巴胺能细胞的实验疗法已经产生有希望的结果，但是需要为了降低alpha-syn的神经元积累而设计的备选方法。积累了可以通过免疫疗法靶向alpha-syn聚集体的令人信服的证据。实际上，最近已经显示了用于治疗突触核蛋白病的潜力。用人alpha-syn蛋白接种过表达人alpha-syn的Tg小鼠。在疫苗接种后生成高相对亲和力抗体的小鼠中，神经元细胞体和突触中的聚集alpha-syn的积累降低，这与降低的神经变性有关。此外，由经免疫的动物生成的抗体也检出与神经元膜结合的alpha-syn的异常聚集形式，并且可能经由溶酶体途径促进对这些聚集体的降解。用外源应用的alpha-syn特异性抗体使用被动免疫疗法(passiveimmunotherapy)观察到类似的效果。这些结果提示了疫苗接种在降低alpha-syn聚集体的神经元积累中是有效的，而且此方法的进一步开发可以引发LBD和突触核蛋白病治疗中的有益效果。
本发明的目的是提供基于疫苗的用于预防和治疗突触核蛋白病的药物。
本发明涉及提供在预防和/或治疗突触核蛋白病中使用的至少一种包含以下氨基酸序列的肽或多肽：
(X1)nX2X3X4X5GX6P(X7)m(式I)，
其中
X1是任何氨基酸残基，
X2是选自下组的氨基酸残基：赖氨酸(K)、精氨酸(R)、丙氨酸(A)和组氨酸(H)，
X3是选自下组的氨基酸残基：天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)，优选地天冬酰胺(N)、丝氨酸(S)、甘氨酸(G)和丙氨酸(A)，
X4是选自下组的氨基酸残基：谷氨酸(E)、天冬氨酸(D)和丙氨酸(A)，
X5是选自下组的氨基酸残基：谷氨酸(E)和天冬氨酸(D)，
X6是选自下组的氨基酸残基：丙氨酸(A)和酪氨酸(Y)，
X7是任何氨基酸残基，
n和m独立的是0或大于0的整数，
且其中依照式I的氨基酸序列与具有氨基酸序列KNEEGAP的alpha-突触核蛋白的7聚体多肽片段不相同，或者不包含所述7聚体多肽片段，
所述至少一种肽或多肽具有对抗体的结合性能，所述抗体对包含氨基酸序列KNEEGAP的alpha-突触核蛋白表位是特异性的。
依照本发明的这些肽或多肽可以在适合于预期用于预防和/或治疗突触核蛋白病的用途的组合物，特别地在药物组合物中提供，优选地与药学可接受载体组合。可以以实现预防和/或治疗效果的有效量对有此需要的患者施用此类药物组合物。
依照本发明的肽和多肽能够诱导针对(结合)alpha-突触核蛋白，特别地包含氨基酸序列KNEEGAP的alpha-突触核蛋白片段的抗体及其片段的体内形成。然而，针对(结合)所述肽和多肽的抗体没有或基本上没有显示对beta-突触核蛋白(beta-syn，b-syn)的免疫反应性。因此，与初始的alpha-突触核蛋白或其片段不一样，依照本发明的肽和多肽提供针对疾病相关媒介(agent)的特异性，并且避免与疾病无关的突触核蛋白的交叉反应性。这强烈地提示了关于功效和安全性的显著优越性，特别是后者，这是由于已经对beta-突触核蛋白描述的神经保护特征(HashimotoM.等，JBiolChem.2004年5月28日；279(22)：23622-9.HashimotoM，Neuron.2001年10月25日；32(2)：213-23)。
通过施用本发明的化合物诱导的alpha-突触核蛋白特异性抗体不仅能结合单体形式的alpha-突触核蛋白，而且结合多聚体形式。这容许减少要治疗的个体的身体中的alpha-突触核蛋白寡聚体的量。alpha-突触核蛋白的减少在治疗突触核蛋白病中是特别有益的。
认为氨基酸序列(X1)nX2X3X4X5GX6P(X7)m是包含氨基酸序列KNEEGAP的alpha-突触核蛋白表位的模拟表位。依照本发明，术语“模拟表位”指具有与其模拟的表位具有等同拓扑学的构象的分子。模拟表位结合免疫特异性结合期望抗原的抗体的同一抗原结合区。模拟表位会引发与其模拟的抗原反应性的宿主中的免疫学应答。模拟表位还可以在牵涉表位和结合所述表位的抗体的体外抑制测定法(例如，ELISA抑制测定法)中充当其模拟的表位的竞争物。然而，本发明的模拟表位可以不必在体外抑制测定法中阻止或竞争其模拟的表位的结合，尽管它能够在对哺乳动物施用时诱导特定的免疫应答。
如本文中所使用的，术语“表位”指抗原中被特定的抗体分子识别的免疫原性区域。一般地，抗原会拥有一个或多个表位，每个表位能够结合识别特定表位的抗体。
本发明的模拟表位可以通过本领域中公知的化学合成法以分离的肽或者作为另一种肽或多肽的一部分合成生成。或者，可以在生成肽模拟表位的微生物中生成肽模拟表位，然后，将其分离，并且若想要的话，将其进一步纯化。可以在微生物，诸如细菌、酵母或真菌中，在真核细胞诸如哺乳动物或昆虫细胞中，或在重组病毒载体诸如腺病毒、痘病毒、疱疹病毒、塞姆利基(Simliki)森林病毒、杆状病毒、噬菌体、辛德比斯病毒(sindbisvirus)或仙台病毒中生成肽模拟表位。适合于生成肽模拟表位的细菌包括大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或任何其它能够表达诸如肽模拟表位的肽的细菌。适合于表达肽模拟表位的酵母类型包括酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、粟酒裂殖酵母菌(Schizosaccharomycespombe)、假丝酵母属(Candida)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)或任何其它能够表达肽的酵母。相应的方法是本领域中公知的。用于分离和纯化重组生成的肽的方法也是本领域中公知的，并且包括例如凝胶过滤、亲和层析、离子交换层析等。
为了便于分离肽模拟表位，可以生成融合多肽，其中将肽模拟表位与通过亲和层析实现分离的异源多肽在翻译上融合(共价连接)。典型的异源多肽是His-Tag(例如His6；6个组氨酸残基)、GST-标签(谷胱甘肽-S-转移酶)等。融合多肽不仅便于模拟表位的纯化，而且还阻止模拟表位多肽在纯化期间被降解。若期望在纯化后除去异源多肽，则融合多肽可以包含肽模拟表位与异源多肽间接合处的切割位点。切割位点由用对该位点的氨基酸序列特异性的酶(例如蛋白酶)切割的氨基酸序列组成。
依照本发明的一个优选的实施方案，X2是选自下组的氨基酸残基：赖氨酸(K)和精氨酸(R)和/或X6是丙氨酸(A)。
依照本发明的一个特别优选的实施方案，肽或多肽包含选自下组的氨基酸序列：(X1)nKNDEGAP(X7)m，(X1)nANEEGAP(X7)m，(X1)nKAEEGAP(X7)m，(X1)nKNAEGAP(X7)m，(X1)nRNEEGAP(X7)m，(X1)nHNEEGAP(X7)m，(X1)nKNEDGAP(X7)m，(X1)nKQEEGAP(X7)m，(X1)nKSEEGAP(X7)m，(X1)nKNDDGAP(X7)m，(X1)nRNDEGAP(X7)m，(X1)nRNEDGAP(X7)m，(X1)nRQEEGAP(X7)m，(X1)nRSEEGAP(X7)m，(X1)nANDEGAP(X7)m，(X1)nANEDGAP(X7)m，(X1)nHSEEGAP(X7)m，(X1)nASEEGAP(X7)m，(X1)nHNEDGAP(X7)m，(X1)nHNDEGAP(X7)m，(X1)nRNAEGAP(X7)m，(X1)nHNAEGAP(X7)m，(X1)nKSAEGAP(X7)m，(X1)nKSDEGAP(X7)m，(X1)nKSEDGAP(X7)m，(X1)nRQDEGAP(X7)m，(X1)nRQEDGAP(X7)m，(X1)nHSAEGAP(X7)m，(X1)nRSAEGAP(X7)m，(X1)nRSDEGAP(X7)m，(X1)nRSEDGAP(X7)m，(X1)nHSDEGAP(X7)m，(X1)nHSEDGAP(X7)m，(X1)nRQDDGAP(X7)m，优选地(X1)nKNDEGAP(X2)m，(X1)nRNEEGAP(X2)m，(X1)nRNDEGAP(X2)m，(X1)nKNAEGAP(X2)m，(X1)nKSDEGAP(X2)m，(X1)nRNAEGAP(X2)m或(X1)nRSEEGAP(X2)m。
证明了不仅依照式I的肽和多肽可以在治疗和预防突触核蛋白病中使用，而且其它肽和多肽亦然。因此，本发明的另一方面涉及在预防和/或治疗突触核蛋白病中使用，特别地用于生成供其使用的药物的至少一种肽或多肽，其包含选自下组的氨基酸序列：(X1)nKNEAGAP(X7)m，(X1)nKNEEAAP(X7)m，(X1)nKNEEGAA(X7)m，(X1)nKPSFKNE(X7)m，(X1)nQPSFAME(X7)m，(X1)nSPSFKQE(X7)m，(X1)nTPSWKGE(X7)m，(X1)nDPSFALE(X7)m，(X1)nLPSFRLE(X7)m，(X1)nEPNSRMD(X7)m，(X1)nQPSSKLD(X7)m，(X1)nHIHQSKFFDAPP(X7)m，(X1)nQASFAME(X7)m，(X1)nTASWKGE(X7)m，(X1)nQASSKLD(X7)m，(X1)nQPAFAME(X7)m，(X1)nTPAWKGE(X7)m，(X1)nQPASKLD(X7)m，(X1)nQPSFAMA(X7)m，(X1)nTPSWKGA(X7)m，(X1)nQPSSKLA(X7)m，(X1)nAPSWKGE(X7)m，(X1)nTPSAKGE(X7)m，(X1)nTPSWAGE(X7)m，(X1)nTPSWKAE(X7)m，(X1)nTPSWKGE(X7)m，特别地选自下组的氨基酸序列：(X1)nQASFAME(X7)m，(X1)nTASWKGE(X7)m，(X1)nQASSKLD(X7)m，(X1)nTPAWKGE(X7)m，(X1)nTPSWAGE(X7)m，(X1)nTPSWKGE(X7)m
其中
X1是任何氨基酸残基，
X7是任何氨基酸残基，
n和m独立的是0或大于0的整数，
所述至少一种肽或多肽具有对抗体的结合性能，所述抗体对包含氨基酸序列KNEEGAP的alpha-突触核蛋白表位是特异性的。
本发明的肽和多肽也可以其N-和/或C-端处或附近修饰，使得在所述位置，半胱氨酸残基被其结合。在一个优选的实施方案中，使用末端定位的(位于肽的N-和C-端)半胱氨酸残基来交联所述分子与载体分子诸如KLH或者经由二硫键环化所述肽。因此，优选地，n和/或m是1，而优选地，X1和/或X7是半胱氨酸(C)。
本发明的模拟表位也可以在各种测定法和试剂盒，特别地在免疫学测定法和试剂盒中使用。因此，特别优选的是，本发明的肽和多肽可以是另一种肽或多肽，特别地在免疫学测定法中用作报告物的酶的一部分。此类报告酶包括例如碱性磷酸酶或辣根过氧化物酶。
优选地，依照本发明的alpha-突触核蛋白模拟表位是抗原性多肽，该抗原性多肽在其氨基酸序列上与alpha-突触核蛋白或alpha-突触核蛋白片段的氨基酸序列不同。在此方面，发明性的模拟表位不仅可以包含一个或多个天然存在的氨基酸残基的氨基酸替代，而且包含一个或多个非天然的氨基酸(即，不来自20种“经典的”氨基酸)的氨基酸替代或者它们可以是此类非天然的氨基酸完全合成的。此外，诱导抗alpha-突触核蛋白抗体的发明性抗原可以是D-或L-氨基酸或DL-氨基酸组合装配的，并且任选地，它们可以已经通过进一步修饰、环闭合或衍生物来改变。可以自商品化肽文库提供合适的抗alpha-突触核蛋白抗体诱导抗原。优选地，这些肽是至少7个氨基酸，且优选的长度可以多至16，优选地多至14或20个氨基酸残基(例如7或8至20，7或8至16等)。如此，本发明的肽或多肽包含7至30，优选地7至20，更优选地7至16，最优选地8个氨基酸残基。然而，依照本发明，更长的肽也可以非常好地作为抗alpha-突触核蛋白抗体诱导抗原采用。此外，本发明的模拟表位也可以是多肽的一部分，并且因此在其N和/或C端包含至少一个别的氨基酸残基。
当然，为了制备alpha-突触核蛋白模拟表位(即抗alpha-突触核蛋白抗体诱导抗原)，噬菌体文库、肽文库也是合适的，例如依靠组合化学生成或者依靠用于变化最大的结构的高通量筛选技术来获得(Display：ALaboratoryManualbyCarlosF.Barbas(编)等；WillatsWGPhagedisplay：practicalitiesandprospects.PlantMol.Biol.2002年12月；50(6)：837-54)。
此外，依照本发明，也可以采用基于核酸(“适体”)的抗alpha-突触核蛋白抗体诱导抗原，并且这些也可以用变化最大的(寡核苷酸)文库(例如，具有2-180个核酸残基)找到(例如Burgstaller等，Curr.Opin.DrugDiscov.Dev.5(5)(2002)，690-700；Famulok等，Acc.Chem.Res.33(2000)，591-599；Mayer等，PNAS98(2001)，4961-4965，等等)。在基于核酸的抗alpha-突触核蛋白抗体诱导抗原中，核酸主链可以例如通过天然磷酸二酯化合物，或者也通过磷硫酰化合物(phosphorotioate)或组合或化学变化(例如以PNA)提供，其中依照本发明，主要可以采用U、T、A、C、G、H和mC作为碱基。优选地，可以依照本发明使用的核苷酸的2’-残基是H、OH、F、Cl、NH2、O-甲基、O-乙基、O-丙基或O-丁基，其中核酸也可以差别修饰，即例如用保护基团，因为它们通常在寡核苷酸合成中采用。如此，基于适体的抗alpha-突触核蛋白抗体诱导抗原也是本发明范围内的优选的抗alpha-突触核蛋白抗体诱导抗原。
依照本发明，术语“突触核蛋白病”包括以病理性突触核蛋白聚集体为特征的所有神经变性性病症。数种神经变性性病症共同分组为突触核蛋白病，包括帕金森氏病(PD)、Lewy体病(LBD)、弥漫性Lewy体病(DLBD)、痴呆伴Lewy体(DLB)、帕金森氏综合征伴痴呆(PDD)、多系统萎缩(MSA)和神经变性伴脑铁积累I型(NBIAI型)。
依照本发明的肽和多肽不仅可以用于治疗突触核蛋白病，而且还可用于预防有风险形成突触核蛋白病(例如，有形成突触核蛋白病的素因，例如遗传素因)的个体中的所述疾病。
本发明中公开的氨基酸残基的缩写遵循IUPAC推荐：
本发明的肽和多肽也可以是包含7至30个氨基酸残基的多肽的一部分。因此，n和m可以独立地是选自下组的整数：1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，14，15，20和25。
依照本发明的至少一种肽或多肽可以由氨基酸序列(X1)nX2X3X4X5GX6P(X7)m组成，其中n和m独立地是0或1或是包含至少7个氨基酸残基，优选地至少10个氨基酸残基，更优选地至少15个氨基酸残基，和/或最大50个氨基酸残基，优选地最大30个氨基酸残基，更优选地16个氨基酸残基的多肽的一部分。
令人惊讶地，证明了包含上文所列的氨基酸序列或由上文所列的氨基酸序列组成的依照本发明的化合物特别适合于用于制造要用于治疗或预防突触核蛋白病的药物。这些肽(模拟表位)能够诱导针对人alpha-突触核蛋白中包含氨基酸序列KNEEGAP的初始表位和人alpha-突触核蛋白蛋白质自身的抗体的体内形成。然而，所述肽(模拟表位)不能诱导针对人beta-突触核蛋白蛋白质的免疫反应性。肽诱导的抗体负责除去alpha-突触核蛋白(其牵涉alpha-突触核蛋白聚集体，即Lewy体的形成)和/或溶解个体中的alpha-突触核蛋白聚集体(Lewy体)。
可以使用依照本发明的肽和多肽来制备可用于治疗alpha-突触核蛋白病的药物，特别地疫苗，由此所述药物特别适合于治疗选自下组的突触核蛋白病：帕金森氏病(PD)、Lewy体病(LBD)、弥漫性Lewy体病(DLBD)、痴呆伴Lewy体(DLB)、帕金森氏综合征伴痴呆(PDD)、多系统萎缩(MSA)和神经变性伴脑铁积累I型(NBIAI型)。
依照本发明的一个优选的实施方案，所述至少一种肽或多肽与药学可接受载体，优选地KLH(匙孔血蓝蛋白)、破伤风毒素、清蛋白结合蛋白、牛血清清蛋白、树状聚体(MAP；Biol.Chem.358：581)、肽接头(或侧翼序列)及Singh等，Nat.Biotech.17(1999)，1075-1081(特别地，所述文件的表1中的那些物质)和O’Hagan等，NatureReviews，DrugDiscovery2(9)(2003)，727-735(特别地，其中所描述的内源免疫加强化合物和投递系统)中所描述的佐剂物质及其它载体或其混合物偶联。在此背景中的缀合化学(例如，经由异双功能性化合物诸如GMBS，并且当然还有其它化合物，如记载于“BioconjugateTechniques”，GregT.Hermanson的)可以选自本领域技术人员已知的反应。此外，可以用佐剂，优选地，低溶解度铝组分，特别地氢氧化铝来配制疫苗组合物。当然，也可以使用以下佐剂，如MF59磷酸铝、磷酸钙、细胞因子(例如IL-2、IL-12、GM-CSF)、皂苷(例如，QS21)、MDP衍生物、CpG寡聚物、IC31、LPS、MPL、聚磷杂烯(polyphosphazenes)、乳剂(例如，弗氏、SAF)、脂质体、病毒体、免疫刺激复合物(iscoms)、蜗形物(cochleates)、PLG微粒、泊洛沙姆(poloxamer)颗粒、病毒样颗粒、热不稳定性肠毒素(LT)、伤害毒素(CT)、突变体毒素(例如LTK63和LTR72)、微粒和/或聚合的脂质体。
优选地，本发明的肽或多肽经由接头与载体或佐剂结合，所述接头选自下组：NHS-聚(氧化乙烯)(PEO)(例如NHS-PEO4-马来酰亚胺)。
可以通过任何合适的施用模式，例如i.d.、i.p.、i.m.、鼻内、口服、皮下等及在任何合适的投递装置中(O’Hagan等，NatureReviews，DrugDiscovery2(9)，(2003)，727-735)施用包含本化合物(模拟表位)和药学可接受载体的疫苗。优选地，配制本发明的化合物以皮下、皮内或肌肉内施用(参见例如“HandbookofPharmaceuticalManufacturingFormulations”，SarfarazNiazi，CRCPressInc，2004)。
通常，疫苗含有0.1ng至10mg，优选地10ng至1mg，特别地100ng至100μg，或备选地，例如100fmol至10μmol，优选地10pmol至1μmol，特别地100pmol至100nmol量的依照本发明的化合物。通常，以1至99％(重量)，更优选地5至80％(重量)，特别地10至70％(重量)量含有疫苗还可以含有辅助性物质，例如缓冲液、稳定剂等。优选地，此类辅助性物质，例如药学可接受赋形剂，诸如水、缓冲液和/或稳定剂。可能的施用方案包括每周、每两周、每四周(每月)或每两月治疗，持续约1至12月；然而，还2至5，特别地3至4次初始疫苗施用(在一个或两个月中)，接着此后6至12个月或甚至此后数年进行加强疫苗接种也是优选的(除了已经对其它疫苗建议的其它方案外)。
本发明的另一方面涉及一种肽，其具有选自下组的氨基酸序列：(X1)nKNDEGAP(X7)m，(X1)nANEEGAP(X7)m，(X1)nKAEEGAP(X7)m，(X1)nKNAEGAP(X7)m，(X1)nKNEAGAP(X7)m，(X1)nKNEEAAP(X7)m，(X1)nKNEEGAA(X7)m，(X1)nRNEEGAP(X7)m，(X1)nHNEEGAP(X7)m，(X1)nKNEDGAP(X7)m，(X1)nKQEEGAP(X7)m，(X1)nKSEEGAP(X7)m，(X1)nKNDDGAP(X7)m，(X1)nKPSFKNE(X7)m，(X1)nQPSFAME(X7)m，(X1)nSPSFKQE(X7)m，(X1)nTPSWKGE(X7)m，(X1)nDPSFALE(X7)m，(X1)nLPSFRLE(X7)m，(X1)nEPNSRMD(X7)m，(X1)nQPSSKLD(X7)m，(X1)nHIHQSKFFDAPP(X7)m，(X1)nQASFAME(X7)m，(X1)nTASWKGE(X7)m，(X1)nQASSKLD(X7)m，(X1)nQPAFAME(X7)m，(X1)nTPAWKGE(X7)m，(X1)nQPASKLD(X7)m，(X1)nQPSFAMA(X7)m，(X1)nTPSWKGA(X7)m，(X1)nQPSSKLA(X7)m，(X1)nAPSWKGE(X7)m，(X1)nTPSAKGE(X7)m，(X1)nTPSWAGE(X7)m，(X1)nTPSWKAE(X7)m，(X1)nTPSWKGE(X7)m，(X1)nRNDEGAP(X7)m，(X1)nRNEDGAP(X7)m，(X1)nRQEEGAP(X7)m，(X1)nRSEEGAP(X7)m，(X1)nANDEGAP(X7)m，(X1)nANEDGAP(X7)m，(X1)nHSEEGAP(X7)m，(X1)nASEEGAP(X7)m，(X1)nHNEDGAP(X7)m，(X1)nHNDEGAP(X7)m，(X1)nRNAEGAP(X7)m，(X1)nHNAEGAP(X7)m，(X1)nKSAEGAP(X7)m，(X1)nKSDEGAP(X7)m，(X1)nKSEDGAP(X7)m，(X1)nRQDEGAP(X7)m，(X1)nRQEDGAP(X7)m，(X1)nHSAEGAP(X7)m，(X1)nRSAEGAP(X7)m，(X1)nRSDEGAP(X7)m，(X1)nRSEDGAP(X7)m，(X1)nHSDEGAP(X7)m，(X1)nHSEDGAP(X7)m和(X1)nRQDDGAP(X7)m，特别地选自选自下组的氨基酸序列：(X1)nKNDEGAP(X7)m，(X1)nANEEGAP(X7)m，(X1)nKAEEGAP(X7)m，(X1)nKNAEGAP(X7)m，(X1)nRNEEGAP(X7)m，(X1)nHNEEGAP(X7)m，(X1)nKNEDGAP(X7)m，(X1)nKQEEGAP(X7)m，(X1)nKSEEGAP(X7)m，(X1)nKNDDGAP(X7)m，(X1)nQASFAME(X7)m，(X1)nTASWKGE(X7)m，(X1)nQASSKLD(X7)m，(X1)nTPAWKGE(X7)m，(X1)nTPSWAGE(X7)m，(X1)nTPSWKGE(X7)m，(X1)nRNDEGAP(X7)m，(X1)nRNEDGAP(X7)m，(X1)nRQEEGAP(X7)m，(X1)nRSEEGAP(X7)m，(X1)nANDEGAP(X7)m，(X1)nANEDGAP(X7)m，(X1)nHSEEGAP(X7)m，(X1)nASEEGAP(X7)m，(X1)nHNEDGAP(X7)m，(X1)nHNDEGAP(X7)m，(X1)nRNAEGAP(X7)m，(X1)nHNAEGAP(X7)m，(X1)nKSAEGAP(X7)m，(X1)nKSDEGAP(X7)m，(X1)nKSEDGAP(X7)m，(X1)nRQDEGAP(X7)m，(X1)nRQEDGAP(X7)m，(X1)nHSAEGAP(X7)m，(X1)nRSAEGAP(X7)m，(X1)nRSDEGAP(X7)m，(X1)nRSEDGAP(X7)m，(X1)nHSDEGAP(X7)m，(X1)nHSEDGAP(X7)m和(X1)nRQDDGAP(X7)m，其中X1和X7是半胱氨酸，而n和m独立地是0或1。
依照本发明的一个优选的实施方案，肽与药学可接受载体，优选地KLH(匙孔血蓝蛋白)偶联。
可以在治疗任何种类的突触核蛋白病中使用依照本发明的药物组合物，其可以配制为供例如皮下、皮内和/或肌肉内施用的疫苗。
本发明在以下图和实施例中进一步例示，然而其不限于此。
图1显示了全长alpha-突触核蛋白(140aa；swissprot条目：P37840)的序列和创建用于检测全长alpha-突触核蛋白及其C端截短的和经修饰的型式的单克隆抗体使用的序列。用于生成单克隆抗体的第100位-第109位的肽加下划线。肽(p4453)与C端位置的C偶联。
图2显示了使用对人alpha-突触核蛋白第100位-第109位特异性的生成的单克隆抗体通过ELISA检测alpha-突触核蛋白。生成单克隆抗体12-9-9，并在ELISA中测试其对突触核蛋白的特异性。检出alpha-突触核蛋白(p4446)和p4453人表位。未检出阴性对照蛋白p4447(beta-突触核蛋白)。
图3显示了通过ELISA限定单克隆抗体12-9-9的最小表位。
通过抗体检测肽p4446(alpha-突触核蛋白)、p4453(用于创建测试的抗体的人表位)。将初始表位p4453在N-或C-端截短，并用于ELISA以限定特异性结合需要的最小表位。肽p5399和p5403丧失对单克隆抗体12-9-9的结合。如此，12-9-9结合需要的最小序列预测为位于alpha-突触核蛋白的第102位-第108位的KNEEGAP，而侧翼氨基酸之一的截短消除结合。数据以线性标度呈现。
图4显示了使用对人alpha-突触核蛋白第100位-第109位特异性的单克隆通过ELISA检测表位和模拟表位。通过单克隆抗体12-9-9类似地检出alpha-突触核蛋白及肽p5436(人最小表位)和模拟表位p5439。通过单克隆单抗12-9-9没有检出模拟表位p5440，而模拟表位p5444比人表位弱得多地检出。
图5显示了肽免疫后针对alpha-突触核蛋白的免疫应答的诱导。经免疫小鼠(p5436至p5590)的血清在3次疫苗接种后显示针对alpha-突触核蛋白的效价。经免疫小鼠(p5463至p5466)的血清没有检出alpha突触核蛋白(ELISA中测量的效价为1∶50半最大值(halfmax)左右或之下)。如下限定免疫原性的种类：2类：以高于1∶1000的OD半最大值诱导免疫应答的肽。1类：以1000和51之间的OD半最大值诱导免疫应答的肽。0类：没有诱导或诱导非常低的免疫应答的肽，OD半最大值为50左右或更低。
实施例
为了鉴定可以用于治疗和/或预防突触核蛋白病的肽和多肽，使用能够检测人alpha-突触核蛋白衍生的氨基酸序列LGKNEEGAPQ(＝初始表位，SEQIDNo.3，p4453)和全长人alpha-突触核蛋白(SEQIDNo.1，p4446)的抗体。它不识别人beta-突触核蛋白(SEQIDNo.2，p4447；登录号Q16143：mdvfmkglsmakegvvaaaektkqgvteaaektkegvlyvgsktregvvqgvasvaektkeqashlggavfsgagniaaatglvkreefptdlkpeevaqeaaeeplieplmepegesyedppqeeyqeyepea)。抗体可以是单克隆或多克隆抗体制备物或者其任何抗体部分或衍生物，并且特异性结合人alpha-突触核蛋白的LGKNEEGAPQ表位，即它确实结合肽和全长蛋白质，但是不结合人beta-突触核蛋白。将模拟表位鉴定，并用此类单克隆抗体(检测人alpha-突触核蛋白蛋白质的氨基酸100-109内的序列)和肽文库进一步表征。
实施例1：特异性结合初始人alpha-突触核蛋白表位LGKNEEGAPQCSEQIDNo.3、p4453和人alpha-突触核蛋白，而不结合人beta-突触核蛋白的单克隆抗体的生成。
自融合物“AFFiRiS6”衍生的单克隆抗体：用与作为佐剂的BTG(牛甲状腺球蛋白)和CFA(完全弗氏佐剂；第一次注射)及IFA(不完全弗氏佐剂；3次加强注射)偶联的初始alpha-突触核蛋白表位LGKNEEGAPQ-C免疫Balb/c小鼠(CharlesRiver)。通过ELISA(经LGKNEEGAPQC肽包被的ELISA板)检测LGKNEEGAPQ-肽特异性抗体生成杂交瘤。使用人alpha-突触核蛋白(重组蛋白，p4446)作为阳性对照肽：包括识别固定化于ELISA上的重组蛋白的杂交瘤，因为它们特异性结合肽和全长alpha-突触核蛋白两者。使用人beta-突触核蛋白(重组蛋白，p4447)作为阴性对照肽：排除识别固定化于ELISA上的重组蛋白的杂交瘤，因为它们不能区别两种不同突触核蛋白蛋白质。对杂交瘤克隆(12-9-9；IgG1，kappa)分析天然人alpha-突触核蛋白表位LGKNEEGAPQ的特异性检测。12-9-9在ELISA中识别注射的表位及全长alpha-突触核蛋白蛋白质(重组蛋白；获自rPeptide，Bogart，GA，USA)(参见图2)。然而，它没有在ELISA中检出beta-突触核蛋白蛋白质(重组蛋白，获自rPeptide，Bogart，GA，USA)(参见图2)。随后，已经使用肽p4446，p4453，p5397，p5398，p5399，p5400，p5401，p5402，p5403，p5404，p5405，p5406(参见图3)和p5436(参见图4)通过ELISA限定抗体结合需要的最小表位。p4446，p4453，p5397，p5398和p5402及p5436保留完整的结合性能，而p5399，p5400，p5401，p5403，p5404，p5405和p5406丧失对12-9-9的结合。如此，对于结合的最小需要表位已经限定为KNEEGAP。
实施例2：噬菌体展示、体外结合和抑制ELISA
在此实施例中使用的噬菌体展示文库是：Ph.D.7：NewEnglandBioLabsE8102L(线性7聚体文库)、Ph.D.12：NewEnglandBioLabsE8111L(线性12聚体文库)和Ph.D.C7C：NewEnglandBioLabsE8120L(二硫化物约束的七肽文库)。依照制造商的方案(www.neb.com)完成噬菌体展示。随后的2或3轮淘选后，挑出单一噬菌体克隆，并将噬菌体上清液在经用于淘选规程的抗体包被的板上进行ELISA。对在此ELISA中呈阳性(针对靶物的强烈信号，而没有针对非特异性对照的信号)的噬菌体克隆测序。从DNA序列推出肽序列。将这些肽合成，并在结合和抑制ELISA中表征。对于一些肽，将额外的AA附接于C端。另外，通过组合来自筛选中鉴定的模拟表位的序列信息来创建一些新的模拟表位。使用含有新设计的模拟表位的这两组来支持供模拟表位疫苗接种用的共有序列的鉴定。
1.体外结合测定法(ELISA)
将自噬菌体展示衍生的肽及其N端截短变体与BSA偶联，并结合ELISA板(1μM)，随后与用于筛选规程的单克隆抗体一起温育以分析鉴定的肽的结合性能(参见图4)。
2.体外抑制测定法(ELISA)
将不同量的自噬菌体展示衍生的肽(浓度范围为400μg/ml至3μg/ml(连续稀释))与用于筛选规程的单克隆抗体一起温育。认为消除随后抗体对经初始人alpha-突触核蛋白表位(p5436)和人alpha-突触核蛋白蛋白质(p4446)包被的ELISA板的结合的肽是此测定法中抑制性的。
实施例3：体内测试模拟表位：分析免疫原性
1.体内测试模拟表位
将抑制性及非抑制性肽与KLH偶联，并与合适的佐剂(氢氧化铝)一起注射入小鼠(野生型C57/B16或BalbC小鼠；皮下注射入体侧中)。将动物以每两周的时间间隔疫苗接种3次，并且也每两周采集血清。用每种血清测定注射肽及无关肽的效价。以血清2开始，分别测定针对重组人alpha-突触核蛋白蛋白质和重组人beta-突触核蛋白的效价。一般地，通过针对固定化于ELISA板上的与牛血清清蛋白(BSA)偶联的肽和重组全长蛋白质的反应来分析血清。使用抗小鼠IgG特异性抗体来测定效价。关于针对注射的肽和alpha-突触核蛋白的免疫原性的例子，参见表5和表6。
2.结果
2.1.alpha-突触核蛋白特异性单抗的鉴定：图2描绘了自融合物Affiris6衍生的alpha-突触核蛋白特异性单克隆抗体12-9-9(IgG1，kappa)的表征。
2.2.alpha-突触核蛋白特异性模拟表位的筛选：
2.2.1.噬菌体展示PhD7、PhD12和PhDC7C和突变筛选
2.2.1.1.用针对LGKNEEGAPQ的单克隆抗体筛选
通过筛选PhD7、PhD12和PhDC7C噬菌体展示文库和单一氨基酸的选择性置换，鉴定总共60个序列(见表1；ID18-77)。
表1显示了所使用所有肽的例子。
SEQ ID 肽No 序列
1 p4446 Alpha-突触核蛋白(图1；P37840)
2 p4447 Beta-突触核蛋白；Q16143
3 p4453 LGKNEEGAPQC
4 p4454 MGKGEEGYPQC
5 p5397 GKNEEGAPQC
6 p5398 KNEEGAPQC
7 p5399 NEEGAPQC
8 p5400 EEGAPQC
9 p5401 EGAPQC
10 p5402 LGKNEEGAPC
11 p5403 LGKNEEGAC
12 p5404 LGKNEEGC
13 p5405 LGKNEEC
14 p5406 LGKNEC
15 p5435 CKNEEGAP
16 p5436 KNEEGAPC
17 p1253 DAEFRHDSGY-C
18 p5437 ANEEGAPC
19 p5438 KAEEGAPC
20 p5439 KNAEGAPC
21 p5440 KNEAGAPC
22 p5441 KNEEAAPC
23 p5442 KNEEGAAC
24 p5443 RNEEGAPC
25 p5444 HNEEGAPC
26 p5445 KNDEGAPC
27 p5446 KNEDGAPC
28 p5447 KQEEGAPC
29 p5448 KSEEGAPC
30 p5449 KNDDGAPC
31 p5461 KPSFKNEC
32 p5462 QPSFAMEC
33 p5463 SPSFKQEC
34 p5464 TPSWKGEC
35 p5465 DPSFALEC
36 p5466 LPSFRLEC
37 p5467 EPNSRMDC
38 p5468 QPSSKLDC
39 p5469 HIHQSKFFDAPPC
40 p5547 QASFAMEC
41 p5548 TASWKGEC
42 p5549 QASSKLDC
43 p5550 QPAFAMEC
44 p5551 TPAWKGEC
45 p5552 QPASKLDC
46 p5553 QPSFAMAC
47 p5554 TPSWKGAC
48 p5555 QPSSKLAC
49 p5556 APSWKGEC
50 p5557 TPSAKGEC
51 p5558 TPSWAGEC
52 p5559 TPSWKAEC
53 p5560 CTPSWKGE
54 p5587 RNDEGAPC
55 p5588 RNEDGAPC
56 p5589 RQEEGAPC
57 p5590 RSEEGAPC
58 p5591 ANDEGAPC
59 p5592 ANEDGAPC
60 p5593 HSEEGAPC
61 p5594 ASEEGAPC
62 p5595 HNEDGAPC
63 p5596 HNDEGAPC
64 p5597 RNAEGAPC
65 p5598 HNAEGAPC
66 p5599 KSAEGAPC
67 p5600 KSDEGAPC
68 p5601 KSEDGAPC
69 p5602 RQDEGAPC
70 p5603 RQEDGAPC
71 p5604 HSAEGAPC
72 p5605 RSAEGAPC
73 p5606 RSDEGAPC
74 p5607 RSEDGAPC
75 p5608 HSDEGAPC
76 p5609 HSEDGAPC
77 p5610 RQDDGAPC
表2显示了与初始表位相比肽及其结合性能的例子。
表2：结合单克隆抗体12-9-9的alpha-突触核蛋白表位和模拟表位的例子结合性能通过以下代码编码：
0：ELISA中不可检出对12-9-9的结合
1：弱结合：与最小初始序列p5436相比更弱的模拟表位结合
2：强结合：与最小初始序列p5436相似的模拟表位结合
2.3.用针对alpha-突触核蛋白的单克隆抗体体外表征筛选(噬菌体展示和肽筛选)中鉴定的模拟表位：
图2和3显示了用于体外表征模拟表位的结合和抑制测定法的代表性例子。获得的数据分别在表2和3中汇总。
表3：抑制测定法
名称 序列 竞争 备注
p5435 CKNEEGAP 1 初始的
p5436 KNEEGAPC 2 初始的
p5439 KNAEGAPC 1 模拟表位
p5443 RNEEGAPC 2 模拟表位
p5445 KNDEGAPC 2 模拟表位
p5446 KNEDGAPC 1 模拟表位
p5448 KSEEGAPC 1 模拟表位
p5449 KNDDGAPC 1 模拟表位
p5398 KNEEGAPQC 2 初始的
p5402 LGKNEEGAPC 2 初始的
p5397 GKNEEGAPQC 2 初始的小鼠的
p5464 TPSWKGEC 1 模拟表位
p5548 TASWKGEC 1 模拟表位
p5556 APSWKGEC 1 模拟表位
p5557 TPSAKGEC 1 模拟表位
p5587 RNDEGAPC 2 模拟表位
p5588 RNEDGAPC 1 模拟表位
p5590 RSEEGAPC 1 模拟表位
p5597 RNAEGAPC 1 模拟表位
p5600 KSDEGAPC 1 模拟表位
p5602 RQDEGAPC 1 模拟表位
p5603 RQEDGAPC 1 模拟表位
表3：在抑制测定法中给出阳性结果的本发明中鉴定的alpha-突触核蛋白模拟表位
表3的图例：竞争性能由以下代码编码：
0：在ELISA中检测不到对12-9-9的竞争
1：弱竞争：与最小初始序列p5436相比更弱的模拟表位竞争
2：强竞争：与最小初始序列p5436相似的模拟表位竞争
表4：非模拟表位肽和蛋白质
SEQ ID No. 名称 序列
1 p4446 Alpha-突触核蛋白
2 p4447 Beta-突触核蛋白
3 p4453 LGKNEEGAPQC
4 p4454 MGKGEEGYPQC
5 p5397 GKNEEGAPQC
6 p5398 KNEEGAPQC
7 p5399 NEEGAPQC
8 p5400 EEGAPQC
9 p5401 EGAPQC
10 p5402 LGKNEEGAPC
11 p5403 LGKNEEGAC
12 p5404 LGKNEEGC
13 p5405 LGKNEEC
14 p5406 LGKNEC
15 p5435 CKNEEGAP
16 p5436 KNEEGAPC
17 p1253 DAEFRHDSGY-C
2.4.用针对alpha-突触核蛋白的单克隆抗体体内表征筛选噬菌体展示文库中鉴定的模拟表位：
用30μg与KLH偶联的肽皮下免疫雌性C57/B16小鼠或BalbC，每组5-6只小鼠。给对照组注射PBS或初始表位。使用明矾作为佐剂。所施用的肽都能够结合特异性结合人alpha-突触核蛋白aa100-109的单克隆抗体，尽管一些肽确实在体外仅较弱地抑制初始表位对其亲本抗体的结合(在体外抑制测定法)。在每次疫苗接种后以两周的时间间隔用单一小鼠的血清(参见表5)实施测定抗体效价的体外ELISA测定法。用模拟表位-BSA缀合物包被ELISA板的孔。通过亲本抗体与相应的模拟表位-BSA缀合物的反应来实施阳性对照。用抗小鼠IgG实施检测。另外，将重组蛋白在ELISA板上固定化，并且因而，血清起反应。对于C57/B16小鼠或BalbC中测试的所有模拟表位，可以在重复疫苗接种后检出与个别注射的肽起反应的抗体。尽管不是所有小鼠都诱导较高的针对alpha-突触核蛋白的效价(参见例如表5)。
表5：免疫应答的诱导通过针对注射肽(p4446)的效价指示。效价通过ELISA来测量，并且以OD半最大值指示。
表6：针对Syn的模拟表位的免疫原性等级
名称 序列 免疫原性的等级：Syn 备注
p5402 LGKNEEGAP-C 2 初始的
p5436 KNEEGAPC 2 初始的
p5445 KNDEGAPC 2 模拟表位
p5443 RNEEGAPC 1 模拟表位
p5587 RNDEGAPC 1 模拟表位
p5439 KNAEGAPC 1 模拟表位
p5600 KSDEGAPC 1 模拟表位
p4454 MGKGEEGYPQC 1 初始的小鼠的
p5597 RNAEGAPC 1 模拟表位
p5590 RSEEGAPC 1 模拟表位
p5463 SPSFKQEC 0 模拟表位
p5556 APSWKGEC 0 模拟表位
p5462 QPSFAMEC 0 模拟表位
p5464 TPSWKGEC 0 模拟表位
p5468 QPSSKLDC 0 模拟表位
p5461 KPSFKNEC 0 模拟表位
p5465 DPSFALEC 0 模拟表位
p5466 LPSFRLEC 0 模拟表位
免疫原性等级：
将肽依照其诱导免疫应答的性能来分级
2类：以高于1∶1000的OD半最大值诱导免疫应答的肽。
1类：以1000和51之间的OD半最大值诱导免疫应答的肽。
0类：没有诱导或诱导非常低的免疫应答的肽，OD半最大值为50左右或更低。

Claims (16)

1.包含至少一种肽或多肽的组合物，所述肽或多肽组成为选自下述组成组的氨基酸序列:p5445(KNDEGAPC),p5443(RNEEGAPC),p5587(RNDEGAPC),p5439(KNAEGAPC),和p5600(KSDEGAPC)，其中所述肽或多肽与alpha-突触核蛋白的氨基酸序列KNEEGAP不相同或者其不包含alpha-突触核蛋白的氨基酸序列KNEEGAP，和其中所述肽或多肽结合抗体，所述抗体对包含氨基酸序列KNEEGAP的alpha-突触核蛋白的表位是特异性的，其在预防和/或治疗人中的帕金森氏病(PD)中使用。
2.权利要求1的组合物，其中所述肽含有N-和/或C-末端半胱氨酸(C)残基。
3.依照权利要求1或2的组合物，其特征在于所述至少一种肽或多肽与药学可接受载体偶联。
4.依照权利要求3的组合物，其中所述药学可接受载体是KLH(匙孔虫戚血蓝蛋白)。
5.依照权利要求1至4中任一项的组合物，其特征在于所述至少一种肽或多肽配制用于静脉内、皮下、皮内或肌肉内施用。
6.依照权利要求1至5中任一项的组合物，其特征在于所述至少一种肽或多肽与佐剂一起配制。
7.依照权利要求6的组合物，其中所述佐剂是氢氧化铝。
8.依照权利要求1至7中任一项的组合物，其特征在于所述至少一种肽或多肽以0.1ng至10mg的量包含在所述药物中。
9.依照权利要求8的组合物，其特征在于所述至少一种肽或多肽以10ng至1mg的量包含在所述药物中。
10.依照权利要求9的组合物，其特征在于所述至少一种肽或多肽以100ng至100μg的量包含在所述药物中。
11.由选自下组的氨基酸序列组成的肽：p5445(KNDEGAPC),p5443(RNEEGAPC),p5587(RNDEGAPC),p5439(KNAEGAPC)和p5600(KSDEGAPC)。
12.依照权利要求11的肽，其特征在于所述肽与药学可接受载体偶联。
13.依照权利要求12的肽，其中所述药学可接受载体是KLH(匙孔虫戚血蓝蛋白)。
14.依照权利要求11-13中任一项的肽，其用于预防和/或治疗PD。
15.药物配制剂，其包含至少一种依照权利要求11至14中任一项的肽。
16.依照权利要求15的药物配制剂，其为疫苗。
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Families Citing this family (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PL2579042T3 (pl) 2011-10-04 2014-12-31 Affiris Ag Sposób wykrywania przeciwciał swoistych wobec Aß w próbce biologicznej
EP2659907A1 (en) * 2012-05-01 2013-11-06 Affiris AG Compositions
EP2659906A1 (en) * 2012-05-01 2013-11-06 Affiris AG Compositions
KR102202925B1 (ko) 2013-11-21 2021-01-14 에프. 호프만-라 로슈 아게 항-알파-시누클레인 항체 및 사용 방법
BR112018008697A2 (pt) 2015-11-03 2018-10-30 Affiris Ag método e kit para vacinação contra um auto-antígeno, uso de um kit, e, vacina para uso em vacinação.
KR101726549B1 (ko) 2016-06-29 2017-04-12 정상문 모바일 실시간 시뮬레이션 게임에서의 터치 조작 방식
KR102087494B1 (ko) 2018-03-15 2020-03-10 정상문 모바일 실시간 시뮬레이션 게임에서 객체를 표시하는 방법
BR112021012055A2 (pt) 2018-12-20 2021-11-16 Saiba AG Partículas semelhantes a vírus do cmv modificado por fusão
US20230242601A1 (en) * 2020-07-29 2023-08-03 Tohoku University Peptide used to prevent or treat synucleinopathy
CN116261464A (zh) 2020-08-04 2023-06-13 Ac免疫有限公司 免疫原性化合物
BR112023020640A2 (pt) 2021-04-12 2023-12-05 Saiba AG Partículas similares a vírus de bacteriófago ap205 modificadas
TW202306966A (zh) * 2021-06-18 2023-02-16 日商住友製藥股份有限公司 人類α突觸核蛋白之抗原決定位肽及包含該肽之醫藥組合物
WO2023152260A1 (en) 2022-02-09 2023-08-17 Ac Immune Sa Anti-alpha-synuclein therapeutic vaccines
MX2024010450A (es) 2022-02-28 2024-09-18 Tridem Bioscience Gmbh & Co Kg Conjugado que consiste de o que comprende al menos un beta-glucano o un manano.
CN119136838A (zh) 2022-02-28 2024-12-13 特瑞德姆生物科技有限责任两合公司 由至少一种β-葡聚糖或甘露聚糖组成或包含至少一种β-葡聚糖或甘露聚糖的偶联物

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004041067A2 (en) * 2002-11-01 2004-05-21 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and treatment of synucleinopathic disease
WO2006045037A2 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in lewy body disease

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2007325595A (ja) * 2000-12-22 2007-12-20 Locomogene Inc 滑膜細胞タンパク質
WO2003045128A2 (en) * 2001-11-21 2003-06-05 New York University SYNTHETIC IMMUNOGENIC BUT NON-DEPOSIT-FORMING POLYPEPTIDES AND PEPTIDES HOMOLOGOUS TO AMYLOID β, PRION PROTEIN, AMYLIN, α-SYNUCLEIN, OR POLYGLUTAMINE REPEATS FOR INDUCTION OF AN IMMUNE RESPONSE THERETO
US20080014194A1 (en) * 2003-10-31 2008-01-17 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and Treatment of Synucleinopathic and Amyloidogenic Disease
US8697082B2 (en) * 2002-11-01 2014-04-15 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
US8506959B2 (en) * 2002-11-01 2013-08-13 Neotope Biosciences Limited Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
DK1633189T3 (en) 2003-05-19 2017-08-21 Prothena Biosciences Ltd TRUNCTED FRAGMENTS OF ALFA SYNUCLEIN IN LEWY BODY DISEASE
JPWO2004113535A1 (ja) 2003-06-22 2007-09-20 早出　広司 凝集抑制作用を有するシヌクレイン変異体
WO2006004066A1 (ja) * 2004-07-02 2006-01-12 Locomogene, Inc. S1-5を含有するタンパク質製剤
EA013752B1 (ru) * 2004-08-09 2010-06-30 Элан Фармасьютикалз, Инк. Предупреждение и лечение синуклеинопатических и амилоидогенных заболеваний
ZA200701531B (en) 2004-08-09 2009-03-25 Elan Pharm Inc Prevention and treatment of synucleinopathic and amyloidogenic disease
EP1959991B1 (en) * 2005-12-12 2013-03-20 AC Immune S.A. Therapeutic vaccine
CA2746778C (en) * 2008-12-19 2019-04-23 University Of Zurich Human anti-alpha-synuclein autoantibodies

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2004041067A2 (en) * 2002-11-01 2004-05-21 Elan Pharmaceuticals, Inc. Prevention and treatment of synucleinopathic disease
WO2006045037A2 (en) * 2004-10-19 2006-04-27 Elan Pharmaceuticals, Inc. Truncated fragments of alpha-synuclein in lewy body disease

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