CN102317785B

CN102317785B - Psa的分析方法、以及使用上述分析方法的前列腺癌和前列腺肥大症的鉴别方法

Info

Publication number: CN102317785B
Application number: CN201080006611.7A
Authority: CN
Inventors: 山下克子; 福岛庆子; 马场志郎; 佐藤威文
Original assignee: Tokyo Institute of Technology NUC
Current assignee: Otsuka Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2009-02-04
Filing date: 2010-02-04
Publication date: 2015-01-14
Anticipated expiration: 2030-02-04
Also published as: CN102317785A; CA2751400A1; JPWO2010090264A1; US20110294141A1; JP5754767B2; CA2751400C; US10866240B2; WO2010090264A1; EP2395357A1; EP2395357A4; EP2395357B1

Abstract

本发明提供可以切实地鉴别前列腺癌和前列腺肥大症的PSA的分析方法以及PSA的分析试剂盒。本发明的课题通过使与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素和/或与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素、与有可能含有PSA的样品接触，判定对于上述凝集素具有亲和性的PSA的量来解决。通过该方法，可以提供前列腺癌和前列腺肥大症的鉴别方法。

Description

PSA的分析方法、以及使用上述分析方法的前列腺癌和前列腺肥大症的鉴别方法

技术领域

本发明涉及PSA的分析方法、使用该PSA分析方法的前列腺癌和前列腺肥大症的鉴别方法、以及PSA的分析试剂盒。根据本发明，通过使用与由前列腺癌的癌细胞分泌的PSA特异性表达的糖链结合的凝集素，可以切实地鉴别前列腺癌和前列腺肥大症。

背景技术

前列腺癌主要是60岁以上的男性发病，在欧美各国，男性的癌症中，是仅次于肺癌的死亡原因。前列腺癌的发生率在1975年以后增加，其原因之一为，利用前列腺特异抗原(Prostate Specific Antigen，以下称为PSA)的诊断方法的普及。通过该PSA的测定，利用以往的直肠指检难以发现的早期癌症得以发现。

PSA为由前列腺的腺细胞分泌到前列腺的腺腔内的蛋白质，是前列腺特异性地表达的蛋白质，而不是前列腺癌特异性地表达的蛋白质。因此已知在前列腺癌以外的前列腺肥大症和前列腺炎等疾病中也升高。

现在，广泛使用的PSA测定法为对与α1-抗糜蛋白酶（antichymotrypsin）结合的结合型PSA(以下有时称为PSA-ACT)和游离型PSA(以下有时称为游离PSA)进行测定的总PSA测定法，总PSA的测定值为10ng/mL以上时，50%以上的人发现前列腺癌，4～10ng/mL的人中，25%的人发现前列腺癌，2～4ng/mL的人中，15%的人发现前列腺癌。特别是将总PSA值为4～10ng/mL的区域称为灰区(gray zone)，但是在前列腺肥大症的患者中，表现出该灰区的总PSA值的患者多，期待开发可以鉴别前列腺癌和前列腺肥大症的患者的PSA的分析方法。

对于表现出上述灰区的总PSA值的患者，为了鉴别前列腺肥大症和前列腺癌，对游离PSA与总PSA的比率进行测定。有报告指出，前列腺癌患者中，游离PSA相对于总PSA的比率减少，若通过仅测定游离型PSA的游离PSA的测定法来测定游离PSA值，求出游离PSA值与总PSA值的比(以下有时称为“游离PSA/总PSA比”)，则该值为25%以下时，前列腺癌的可能性高。但是在灰区的检样中，上述游离PSA/总PSA比为0～10%范围时，前列腺癌的可能性为56%，10～15%时为28%，15～20%时为20%，20～25%时为16%，即使使用游离PSA/总PSA比，也不容易鉴别前列腺癌和前列腺肥大症。

对于总PSA为10ng/mL以上的患者和总PSA为4～10ng/mL的灰区、且游离PSA/总PSA比为25%以下的患者的情况，为了对前列腺癌进行确诊，进行前列腺的活体组织检查。但是，特别是后者中，发现前列腺癌的比率为30%左右，患者承受过度的负担，从该观点考虑，要求开发简便地鉴别前列腺癌和前列腺肥大症的方法。

已知PSA为具有1根天冬酰胺结合型糖链(以下有时称为N-聚糖链)的糖蛋白质，而前列腺癌患者的PSA具有高分支化复合型糖链，此外认为前列腺癌的患者具有特异性的糖链。例如有报告指出，对由来源于前列腺癌的LNCaP细胞分泌的PSA的N-聚糖链用质量分析仪进行分析后可知，与正常精浆中的PSA相比，N-乙酰己糖胺(HexNAc)和岩藻糖的含量多，唾液酸欠缺(非专利文献1)。但是该LNCaP细胞的PSA的糖链由于唾液酸欠缺等，与生物体内的前列腺癌患者的血清中的PSA的糖链不同，认为为特殊的PSA。

此外，大山等人在精浆中的PSA的N-聚糖链中发现唾液酸α(2,3)半乳糖残基(Sialic acid alpha 2,3 Gal-R)，有报告指出，与前列腺肥大症的患者相比，前列腺癌的患者的PSA中，该唾液酸α(2,3)半乳糖残基多(专利文献1和非专利文献2)。从而发现，使与上述唾液酸α(2,3)半乳糖残基特异性地结合的怀槐凝集素(M.amurensis agglutinin，以下有时称为MAA)与前列腺癌患者的PSA结合，测定与MAA结合的游离PSA的比率，由此可以鉴别前列腺癌和前列腺肥大症(专利文献1和非专利文献2)。但是上述唾液酸α(2,3)半乳糖残基，除了PSA之外，在α1-抗糜蛋白酶中也有发现，因此MAA对于α1-抗糜蛋白酶也具有亲和性，因此α1-抗糜蛋白酶与PSA结合的情况下，即PSA-ACT的情况下，不能将具有唾液酸α(2,3)半乳糖残基的PSA与不具有唾液酸α(2,3)半乳糖残基的PSA分离。因此，利用总PSA的测定法时，不能鉴别前列腺癌患者和前列腺肥大症患者，有必要测定游离PSA。

进一步地，タジリ等人，对2位前列腺癌患者的血清中的PSA的N-聚糖链，通过质量分析与正常的精浆中的PSA的N-聚糖链进行比较研究后报告，前列腺癌的患者的PSA被唾液酸化和岩藻糖化(非专利文献3)。但是除了上述唾液酸α(2,3)半乳糖残基之外，实际上未报告可以鉴别前列腺癌患者的PSA与前列腺肥大症的PSA的糖链。

现有技术文献

专利文献

专利文献1：日本特开2002-55108号公报

非专利文献

非专利文献1 ：《Glycobiology》2003年(美国)第13卷、p.457～470

非专利文献2 ：《Glycobiology》2004年(美国)第14卷、p.671～679

非专利文献3 ：《Glycobiology》2008年(美国)第18卷、p.2～8。

发明内容

本发明人尝试使用上述专利文献1中记载的作为凝集素的MAA的色谱柱来分离健康人的PSA和前列腺癌患者的PSA，测定对于MAA具有亲和性的PSA。但是，使用MAA色谱柱分离PSA时，不具有唾液酸α(2,3)半乳糖残基的正常的PSA的回收率为70%，认为与PSA非特异性地结合。此外，前列腺癌患者的PSA的回收率为40%，认为除了对于MAA的非特异性的结合之外，具有唾液酸α(2,3)半乳糖残基的PSA未从MAA洗脱。因此可知，使用MAA色谱柱时，不能正确地测定具有唾液酸α(2,3)半乳糖残基的PSA的量。

凝集素，仅是现在市售品也有100种以上，而本发明人深入研究将糖结合特异性不同的多种植物凝集素组合，进行前列腺癌患者的PSA表达的糖链的鉴定，对前列腺癌患者的PSA和前列腺肥大症的PSA进行鉴别后发现，对于日本栝蒌凝集素-II(Trichosanthes japonica Agglutinin-II，以下有时称为TJA-II)、多花紫藤凝集素(Wisteria floribunda，以下有时称为WFA)或荆豆凝集素-I(Ulex europaeus agglutinin-I，以下有时称为UEA-I)具有亲和性的PSA存在于前列腺癌患者的血液中，从而发现通过使用上述TJA-II、WFA或UEA-I，可以鉴别前列腺癌患者的PSA和前列腺肥大症的PSA。即发现，前列腺癌患者的PSA大多具有β-N-乙酰基半乳糖胺残基(GalNAcβ1→R)和/或岩藻糖α(1,2)半乳糖残基(Fucα1→2Galβ1→R)。

本发明是基于这种发现而提出的。

因此本发明涉及PSA的分析方法，其特征在于，使与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素与有可能含有PSA的样品接触，判定对于上述凝集素具有亲和性的PSA的量。

本发明的PSA的分析方法的优选方式中，含有(a)通过使上述凝集素与有可能含有PSA的样品接触，将对于上述凝集素具有亲和性的PSA和对于上述凝集素不具有亲和性的PSA分离的阶段，和(b)判定上述样品中的对于凝集素具有亲和性的PSA的量的阶段。

此外，本发明的PSA的分析方法的优选方式中，对于上述凝集素具有亲和性的PSA量的判定为通过测定分离的对于凝集素具有亲和性的PSA的量进行的判定，通过测定分离之前的样品中的PSA量和测定分离的对于凝集素具有亲和性的PSA量进行的判定，或通过测定分离之前的样品中的PSA量、和测定分离的对于凝集素不具有亲和性的PSA量进行的判定。

此外，本发明的PSA的分析方法的优选方式中，上述PSA量的测定为总PSA或游离PSA的测定。

此外，本发明的PSA的分析方法的优选方式中，上述凝集素为日本栝蒌凝集素-II或多花紫藤凝集素。

此外，本发明的PSA的分析方法的其它的优选方式中，上述凝集素为进一步与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素。

进一步地，本发明的PSA的分析方法的优选方式中，上述样品为由怀疑患有前列腺癌的患者得到的样品。

进一步地，本发明的PSA的分析方法的优选方式中，用于前列腺癌的诊断。

本发明涉及PSA的分析方法，其特征在于，使与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素与有可能含有PSA的样品接触，判定对于上述凝集素具有亲和性的PSA的量。

本发明的PSA的分析方法的优选方式中，含有(a)通过使上述与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素与有可能含有PSA的样品接触，将对于上述凝集素具有亲和性的PSA和对于上述凝集素不具有亲和性的PSA分离的阶段，和(b)判定对于上述凝集素具有亲和性的PSA的量的阶段。

此外，本发明的PSA的分析方法的优选方式中，对于上述凝集素具有亲和性的PSA量的判定，为通过测定分离的对于凝集素具有亲和性的PSA的量进行的判定，通过测定分离之前的样品中的PSA量、和测定分离的对于凝集素具有亲和性的PSA量进行的判定，或通过测定分离之前的样品中的PSA量、和测定分离的对于凝集素不具有亲和性的PSA量进行的判定。

此外，本发明的PSA的分析方法的优选方式中，上述凝集素为日本栝蒌凝集素-II或荆豆凝集素。

进一步地，本发明涉及PSA的分析方法，其特征在于，使与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素和与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素、与有可能含有PSA的样品接触，判定对于上述凝集素具有亲和性的PSA的量。

本发明的PSA的分析方法的优选方式中，含有(a)通过使上述与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素和与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素与有可能含有PSA的样品接触，将对于上述凝集素具有亲和性的PSA和对于上述凝集素不具有亲和性的PSA分离的阶段，和(b)判定对于上述凝集素具有亲和性的PSA的量的阶段。

此外，本发明的PSA的分析方法的优选方式中，对于上述凝集素具有亲和性的PSA量的判定为通过测定分离的对于凝集素具有亲和性的PSA的量进行的判定，通过测定分离之前的样品中的PSA量、和测定分离的对于凝集素具有亲和性的PSA量进行的判定，或通过测定分离之前的样品中的PSA量、和测定分离的对于凝集素不具有亲和性的PSA量进行的判定。

此外，本发明的PSA的分析方法的优选方式中，上述与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素为日本栝蒌凝集素-II或多花紫藤凝集素，与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素为日本栝蒌凝集素-II或荆豆凝集素。

此外，本发明涉及前列腺癌和前列腺肥大症的鉴别方法，其特征在于，通过上述PSA的分析方法，分析样品中的对于凝集素具有亲和性的PSA量。

此外，本发明涉及PSA的分析试剂盒，其含有与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素。

本发明的PSA的分析试剂盒的优选方式中，进一步含有抗PSA抗体。

此外，本发明的PSA的分析试剂盒的优选方式中，上述凝集素为日本栝蒌凝集素-II或多花紫藤凝集素。

进一步地，本发明的PSA的分析试剂盒的其它优选方式中，上述凝集素为进一步与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素。

本发明涉及PSA的分析试剂盒，其含有与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素。

本发明的PSA的分析试剂盒的优选方式中，含有与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素和与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素。

根据本发明的PSA的分析方法，前列腺癌和前列腺肥大症的鉴别方法，以及PSA的分析试剂盒，可以切实地鉴别前列腺癌和前列腺肥大症。此外，与作为可以用于本发明的凝集素的TJA-II和WFA以及UEA-I结合的PSA基本上可以以100%的回收率回收，可以正确地测定前列腺癌分泌的来源于前列腺癌的具有β-N-乙酰基半乳糖胺残基的PSA的量。进一步地，TJA-II和WFA色谱柱以及UEA-I色谱柱可以再生，可以再利用。

附图说明

[图1] 为纯化了的TJA-II的电泳的照片。M表示分子量标记物，泳道1表示还原的TJA-II，泳道2表示非还原的TJA-II。

[图2] 为表示前列腺癌患者和前列腺肥大症患者的通过TJA-II色谱柱分离之前的血清样品的PSA量(A)和TJA-II结合级分中的PSA量(B)的图。黑圆(●)表示前列腺癌患者，白圆(○)表示前列腺肥大症患者。

[图3] 为表示前列腺癌患者(PC：●)和前列腺肥大症患者(BHP：○)的TJA-II非结合级分中的PSA量的图。

[图4] 为表示将正常游离PSA(A)和前列腺癌患者的血清(B)通过MAA色谱柱分级，进行总PSA的测定得到的结果的图。

具体实施方式

[1] PSA的分析方法

本发明的PSA的分析方法的特征在于，使与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素与有可能含有PSA的样品接触，判定对于上述凝集素具有亲和性的PSA的量。

可以用于本发明的凝集素，可以举出与键合在非还原末端的β-N-乙酰基半乳糖胺残基(GalNAcβ1→R)具有亲和性的凝集素。此时，非还原末端的β-N-乙酰基半乳糖胺残基中，β-N-乙酰基半乳糖胺必须没有被唾液酸、硫酸基取代。对于上述与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素不特别限定，可以举出TJA-II或WFA。

此外，作为可用于本发明的凝集素，可以举出与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基(Fucα1→2Galβ1→R)具有亲和性的凝集素。岩藻糖α(1,2)半乳糖残基为具有α-岩藻糖与半乳糖1,2键合的结构的末端糖链。作为与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素，不特别限定，可以举出UEA-I或TJA-II。

进一步地，作为可用于本发明的凝集素，可以举出与键合在非还原末端的β-N-乙酰基半乳糖胺残基(GalNAcβ1→R)和岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素。前列腺癌患者的PSA中，有可能存在单独表达β-N-乙酰基半乳糖胺残基或岩藻糖α(1,2)半乳糖残基的PSA。此外，根据前列腺癌患者，在该PSA中，β-N-乙酰基半乳糖胺残基或岩藻糖α(1,2)半乳糖残基中的任意一种以优势地位表达的可能性也高。因此，本发明的PSA的分析方法中，优选使用与键合在非还原末端的β-N-乙酰基半乳糖胺残基(GalNAcβ1→R)和岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素。作为上述与键合在非还原末端的β-N-乙酰基半乳糖胺残基(GalNAcβ1→R)和岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素，不特别限定，可以举出TJA-II。

TJA-II为由日本栝蒌的块茎提取及纯化得到的凝集素，非还原状态的通过电泳得到的分子量为64kDa，为S-S键合的二聚物，还原状态的通过电泳得到的分子量为32kDa和29kDa。TJA-II对于β-N-乙酰基半乳糖胺残基(GalNAcβ1→R)和岩藻糖α(1,2)半乳糖残基(Fucα1→2Galβ1→R)表现出强的亲和性。

WFA为由多花紫藤的种子提取及纯化得到的凝集素，对于β-N-乙酰基半乳糖胺残基(GalNAcβ1→R)本身表现出强的亲和性。此外，对于GalNAcβ1→4Gal残基和GalNAcβ1→4GlcNAc残基也表现出强的亲和性。

UEA-I(Ulex europaeus agglutinin-I)为由荆豆(Ulex europaeus)制备的凝集素，分子量约为26700。α-L-Fuc具有糖特异性，对于岩藻糖α(1,2)半乳糖残基(Fucα1→2Galβ1→4GlcNAc→R)表现出强的亲和性。

本发明的PSA的分析方法中，上述对于β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素、对于岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素，以及与β-N-乙酰基半乳糖胺残基和岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素可以组合1种或2种以上来使用。

本发明中使用的凝集素可以使用市售品，也可以通过常规方法来纯化。可以将植物体(例如叶、茎、花、根或种子等)切碎或粉碎，溶解在缓冲液中。通过离心分离回收上清，使用硫酸铵盐析、离子交换柱色谱、疏水性柱色谱、凝胶过滤柱色谱、亲和柱色谱、透析或冷冻干燥等来纯化。具体地说，TJA-II的纯化可以根据山下等人的报告(Yamashita et al., J. Biol. Chem., 267, 25441-25422, 1992)纯化。此外，WFA可以根据丰岛等人的报告(Toyoshima et al., Biochemistry, 10, 4457-4463, 1971)纯化。此外，UEA-I可以根据Hindsgaul等人的报告((Hindsgaul et al., Carbohydr. Res., 109, 109-142, 1982)纯化。

本发明的PSA的分析方法，只要使上述凝集素与有可能含有PSA的样品接触，判定对于凝集素具有亲和性的PSA的量，则不特别限定，可以举出(A)通过凝集素，将对于凝集素具有亲和性的PSA和对于上述凝集素不具有亲和性的PSA分离，判定对于凝集素具有亲和性的PSA的量的分析方法(以下有时称为分析方法(A))，和(B)以凝集素与对于凝集素具有亲和性的PSA结合的状态，判定对于凝集素具有亲和性的PSA的量的分析方法(以下有时称为分析方法(B))。

《分析方法(A)》

上述分析方法(A)含有：

(a)通过使作为本发明的凝集素的例如与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素与有可能含有PSA的样品接触，将对于上述凝集素具有亲和性的PSA和对于上述凝集素不具有亲和性的PSA分离的阶段(以下有时称为“分离阶段(a)”)，和

(b)判定上述样品中的对于凝集素具有亲和性的PSA的量的阶段(以下有时称为“判定阶段(b)”)。

上述分离阶段(a)中，将对于凝集素具有亲和性的PSA和对于凝集素不具有亲和性的PSA分离的方法，若为利用凝集素与PSA的亲和性的方法，则不特别限定，例如可以通过使载体与凝集素结合，使结合在载体上的凝集素(以下有时称为“凝集素亲和色谱柱”)与有可能含有PSA的样品接触，将与凝集素结合的PSA和未与凝集素结合的PSA分离来进行。

作为载体，若为可以结合凝集素的载体，则不加以限定，可以举出例如琼脂糖（sepharose）、纤维素、琼脂糖（agarose）、葡聚糖、聚丙烯酸酯、聚苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚甲基丙烯酰胺、苯乙烯与二乙烯基苯的共聚物、聚酰胺、聚酯、聚碳酸酯、聚环氧乙烷、羟丙基甲基纤维素、聚氯乙烯、聚丙烯酸甲酯、聚苯乙烯及聚苯乙烯·共聚物、聚乙烯醇、聚丙烯酸、胶原、藻酸钙、胶乳、聚砜、二氧化硅、氧化锆、氧化铝、二氧化钛、陶瓷。对载体的形状不特别限定，可以使用粒子状的珠、板状和凝胶状等形状的载体。例如将对于凝集素具有亲和性的PSA和对于上述凝集素不具有亲和性的PSA分离使用凝集素亲和色谱柱时，载体优选为凝胶的形状。

凝集素亲和色谱柱可以根据常规方法来制造。例如可以使用CNBr-活化琼脂糖（sepharose）4B，根据厂商推荐的方案，进行偶联，制造凝集素色谱柱。凝集素对于琼脂糖凝胶的结合量优选为2mg/mL～10mg/mL。

使用凝集素亲和色谱柱，将对于上述凝集素具有亲和性的PSA和对于上述凝集素不具有亲和性的PSA分离的方法，可以通过通常的使用凝集素亲和色谱柱的糖蛋白质的分离方法来进行。

凝集素亲和色谱柱，在将有可能含有PSA的样品上样之前，用缓冲液平衡化。作为平衡化缓冲液，例如可以使用含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液、或含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的Tris盐酸缓冲液。

将色谱柱平衡化后，添加有可能含有PSA的样品，静置一定时间，使凝集素与PSA接触。对接触时间不特别限定，可以根据凝集素的种类和PSA的亲和性来适当决定，但是若考虑到结合的速度和效率，则通常进行15分钟～30分钟。

对使凝集素与PSA接触的温度不特别限定，可以根据凝集素的种类和与PSA的亲和性来适当决定，可以在0℃～40℃下进行，优选为0℃～30℃。低于0℃时，色谱柱有可能冻结，若超过40℃则有可能产生对于凝集素不具有亲和性的蛋白质的非特异结合。例如对TJA-II与PSA接触的温度不特别限定，通常优选在4℃～10℃下接触。此外，对WFA与PSA接触的温度不特别限定，通常优选在4℃～10℃下接触。

接着将对于凝集素具有亲和性的结合级分(以下有时称为“结合级分”)和对于凝集素不具有亲和性的非结合级分(以下有时称为“非结合级分”)分离。

不与凝集素结合的级分可以通过将洗涤用缓冲液添加到色谱柱中，将不停留的级分回收来得到。洗涤用缓冲液，若为不会使凝集素与PSA的结合解离，可以使非结合成分流出的缓冲液，则不加以限定，例如可以使用上述平衡化中使用的缓冲液。洗涤用缓冲液的容量可以根据凝集素的种类和与PSA的亲和性来适当决定，优选为色谱柱容量的3～7倍，更优选为5倍左右。

与凝集素结合的级分，可以通过将洗脱用缓冲液添加到色谱柱中，回收洗脱级分来得到。洗脱用缓冲液含有半抗原糖，由此可以将与凝集素结合的PSA从凝集素分离。半抗原糖可以根据凝集素的特异性来适当选择，TJA-II的情况下，可以使用乳糖等作为半抗原糖，例如可以使用含有10mM乳糖、0.1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液，回收洗脱级分。此外，WFA的情况下，可以使用GalNAc等作为半抗原糖，例如可以使用含有10mM GalNAc、0.1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液，回收洗脱级分。洗脱用缓冲液的容量可以适当选择，但是优选为色谱柱容量的3～7倍，更优选为5倍左右。对洗脱温度不特别限定，可以在0℃～40℃下进行，优选在2℃～25℃、更优选4℃～20℃下进行。低于0℃时，色谱柱冻结，若超过40℃则产生对于凝集素不具有亲和性的蛋白质的非特异结合。例如对于从TJA-II洗脱PSA的温度不特别限定，优选在室温下洗脱。对于从WFA洗脱PSA的温度也不特别限定，优选在室温下洗脱。

上述判定阶段(b)中的对于凝集素具有亲和性的PSA的量的判定，可以举出

(1) 通过测定分离的对于凝集素具有亲和性的PSA的量进行的判定，

(2) 通过测定分离之前的样品中的PSA量、和测定分离的对于凝集素具有亲和性的PSA量进行的判定，或

(3) 通过测定分离之前的样品中的PSA量、和测定分离的对于凝集素不具有亲和性的PSA量进行的判定。

上述通过测定所分离的对于凝集素具有亲和性的PSA的量进行的判定(1)，可以通过定量性地或半定量性地测定与上述凝集素结合的级分中的PSA量来进行。即，通过测定患者的血液中含有的对于凝集素具有亲和性的PSA的绝对量来进行判定。

上述通过测定分离之前的样品中的PSA量、和测定分离的对于凝集素具有亲和性的PSA量进行的判定(2)，可以通过将分离之前的样品中的PSA量(或与上述凝集素结合的级分和不与凝集素结合的级分的PSA的总量)与与上述凝集素结合的级分中PSA量进行比较来进行。具体地说，通过计算与上述凝集素结合的级分中PSA量相对于分离之前的样品中的PSA量(或与上述凝集素结合的级分和不与凝集素结合的级分的PSA的总量)的比率，可以判定对于凝集素具有亲和性的PSA的量，例如可以通过以下的任意一式来求得。

PSA的结合率=(结合级分中PSA量/结合级分和非结合级分的PSA的总量)×100%

PSA的结合率=(结合级分中的PSA量/分离之前的样品中PSA量)×100%

此外，通过测定分离之前的样品中的PSA量、和测定分离的对于凝集素不具有亲和性的PSA量进行的判定(3)，可以通过将分离之前的样品中的PSA量(或与上述凝集素结合的级分和不与凝集素结合的级分的PSA的总量)与不与上述凝集素结合的级分中的PSA量进行比较来进行。具体地说，通过由分离之前的样品中的PSA量(或与上述凝集素结合的级分和不与凝集素结合的级分的PSA的总量)，减去不与上述凝集素结合的级分中的PSA量，可以判定对于凝集素具有亲和性的PSA的量。例如可以通过以下的任意一式来求得。

凝集素亲和性PSA量=分离之前的样品中的PSA量－非结合级分中的PSA量

凝集素亲和性PSA量=结合级分和非结合级分的PSA的总量－非结合级分中的PSA量

上述(1)和(2)的判定中，将与凝集素结合的PSA从凝集素分离来测定其量，而在上述(3)的判定中，在由分离之前的样品中的PSA量和非结合级分中的PSA量进行的判定中，不测定与凝集素结合的PSA量，因此可以不分离与凝集素结合的PSA来进行判定。

此外，分取的结合级分和非结合级分的PSA量，优选对于全部级分进行PSA量的测定，但是也可以预先调查含有PSA的分取级分，对其级分进行测定，进行PSA的分析。

上述判定阶段(b)中，作为用于判定对于凝集素具有亲和性的PSA量的PSA的测定方法，若为可以定量性或半定量性地判定PSA的方法，则不特别限定，可以使用总PSA的测定方法或游离PSA的测定方法。总PSA的测定方法或游离PSA的测定方法可以根据常规方法，通过使用抗体或其片段的免疫学的方法(例如酶免疫测定法、胶乳凝集免疫测定法、化学发光免疫测定法、荧光抗体法、放射免疫测定法、免疫沉降法、免疫组织染色法、或蛋白质印迹(Western blot)等)来测定，也可以使用作为PSA测定试剂盒的市售品。

总PSA的测定方法使用免疫学分析方法时，使用可以与PSA-ACT和游离PSA的两种PSA结合的单克隆抗体或多克隆抗体。另一方面，游离PSA的测定方法使用免疫学分析方法时，使用仅可以与游离PSA结合的单克隆抗体或多克隆抗体。单克隆抗体或多克隆抗体，除了免疫抗原使用PSA-ACT或游离PSA之外，可以通过公知的方法来制备，例如单克隆抗体可以根据Koehler和Milstein的方法(Nature 256 : 495-497, 1975)来制备。此外，对于多克隆抗体，例如将PSA-ACT或游离PSA单独作为抗原或与BSA、KLH等结合形成抗原，单独或与弗氏完全佐剂等佐剂混合定期性地对兔子的皮内进行免疫。在血中的抗体效价上升的时点采血，可以直接以血清的方式或将抗体用公知的方法纯化来使用。

通过后述的实施例的分析可知，可以用于本发明的PSA的分析方法中的使用TJA-II或WFA的凝集素亲和色谱柱，可以回收约100%(至少97%以上)的样品中的PSA。与此相对地，专利文献1中记载的MAA的情况下，使用含有乳糖的磷酸缓冲液作为洗脱液的回收率为30～70%，即使将洗脱液改变为0.1M乙酸液，回收率也未得到改善。

《分析方法(B)》

上述分析方法(B)为通过凝集素直接检测对于凝集素具有亲和性的PSA的方法，具体地说，可以举出利用电泳的凝集素印迹法、或利用斑点印迹法进行的凝集素印迹法。任意一种凝集素印迹法都可以根据常规方法来进行，利用电泳进行凝集素印迹法时，将有可能含有PSA的样品电泳，将PSA转印到硝化纤维素膜、PVDF膜上，用作样品膜。利用斑点印迹法进行凝集素印迹法时，通过斑点印迹装置，使有可能含有PSA的样品吸附在硝化纤维素膜或PVDF膜等上，用作样品膜。样品膜用封闭缓冲液进行封闭，在含有生物素标记的凝集素例如生物素标记WFA或生物素标记TJA-II的溶液中接触。然后，与用显色酶或发光酶例如HRP标记的抗生物素蛋白接触，接触显色液或发光液，检测得到的信号。

进一步地，作为通过凝集素直接检测对于凝集素具有亲和性的PSA的方法(B)，可以改变免疫印迹法和酶免疫法的一部分来进行。具体地说，将上述PSA的单克隆抗体或多克隆体固相化在硝化纤维素膜等或ELISA板等上，用封闭缓冲液进行封闭。使有可能含有PSA的样品与硝化纤维素膜或ELISA板等接触，接着接触生物素标记的凝集素例如生物素标记WFA或生物素标记TJA-II。然后，结合显色酶或发光酶例如用HRP标记的抗生物素蛋白，通过显色液或发光液，可以检测信号。

作为本发明的PSA的分析方法中使用被检样品，可以举出含有PSA的生物体样品或生物体来源样品、或有可能含有PSA的生物体样品或生物体来源样品。可以举出例如尿、血液、血清、血浆、脊髓液、唾液、细胞、组织、器官、或它们的调制物(例如活体组织检查标本、特别是前列腺活体组织检查标本)等，优选为血液、血清、血浆或前列腺的活体组织检查标本，特别优选为血液、血清或血浆。这是由于，在健康人和前列腺肥大症患者的血液、血清或血浆中，几乎不存在具有β-N-乙酰基半乳糖胺残基和/或岩藻糖α(1,2)半乳糖残基的PSA，在前列腺癌患者中，从病期的初期释放到血液中，因此作为用于检测前列腺癌的被检样品是适当的。

上述尿、血液、血清、血浆、脊髓液、唾液等液体性的样品，在上述分析方法(A)或分析方法(B)中，可以根据各种分析方法通过适当的缓冲液稀释来使用。此外，细胞、组织或器官等固体样品，可以用固体的样品的体积的2～10倍左右的适当的缓冲液均化，将悬浮液或其上清直接或进一步稀释来用于上述分析方法(A)或分析方法(B)中。

例如，在上述分析方法(A)中，使用凝集素亲和色谱柱时，可以将上述液体样品或固体的样品的悬浮液或其上清通过适当的缓冲液稀释来使用。稀释倍率，若不阻碍凝集素与PSA的结合，则不特别限定，优选为2～400倍，更优选为2～300倍，最优选为4～200倍。此外，凝集素亲和色谱柱的样品上样容量，优选为色谱柱的柱床体积的40%以下，更优选为30%以下，最优选为20%以下。例如使用1mL的柱床体积的凝集素亲和色谱柱时，优选为400μL以下，更优选为300μL以下，最优选为200μL以下。

[2] 前列腺癌和前列腺肥大症的鉴别方法

通过上述PSA的分析方法，分析样品中的对于凝集素具有亲和性的PSA的量，由此可以鉴别前列腺癌和前列腺肥大症。

通过上述PSA的分析方法，测定对于凝集素具有亲和性的PSA的量，与从前列腺肥大症或健康人采取的血液等中的对于凝集素具有亲和性的PSA的量进行比较，由此可以判定上述患者是否为前列腺癌。更具体地说，与存在于前列腺肥大症或健康人的样品中的对于凝集素具有亲和性的PSA相比，存在于上述患者的样品中的对于凝集素具有亲和性的PSA显著多时，上述患者可以判定为前列腺癌。

上述分析方法(A)中，对于识别β-N-乙酰基半乳糖胺残基和岩藻糖α(1,2)半乳糖残基的TJA-II的结合率，和对于仅识别β-N-乙酰基半乳糖胺残基的WFA的结合率不同。因此，优选根据所使用的凝集素的测定值，分别决定可以鉴别前列腺癌和前列腺肥大症的临界值。临界值最优选为可以将前列腺癌患者的100%判定为阳性，将前列腺肥大症患者的100%判定为阴性的值。若由于所分析的前列腺癌和前列腺肥大症的总体增加，而前列腺癌患者与前列腺肥大症患者之间的测定值重叠时，优选选择将前列腺癌患者的100%判断为阳性的值作为临界值，但是也可以将重叠范围的任意的值作为临界值。具体地说，测定后述的实施例的TJA-II结合级分中的PSA量时，用于检测前列腺癌患者的临界值，若为可以检测前列腺癌患者的PSA的值，则不加以限定，例如可以设定为超过200pg/mL、小于240pg/mL，优选为220pg/mL。

此外，后述的实施例的PSA对于凝集素的结合率可以由可以用下式得到的的百分率决定。

PSA的结合率=(结合级分中的PSA量/分离之前的样品中的PSA量)×100%

PSA的结合率的临界值，最优选为可以将前列腺癌患者的100%判定为阳性，可以将前列腺肥大症患者的100%判定为阴性的值。若由于所分析的前列腺癌和前列腺肥大症的总体增加，而在前列腺癌患者与前列腺肥大症患者之间，PSA对于凝集素的结合率重叠时，优选为将前列腺癌患者的100%判断为阳性的值，但是也可以将重叠范围的任意的值作为临界值。具体地说，后述的实施例的PSA的TJA-II结合率的临界值，若为可以检测前列腺癌的值，则不加以限定，例如可以设定为超过1.8%、小于3%，优选为2.4%。

[3] 前列腺癌的诊断试剂盒

本发明的诊断试剂盒含有与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素。此外，本发明的诊断试剂盒，也可以含有与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素。进一步地，本发明的诊断试剂盒也可以含有与β-N-乙酰基半乳糖胺残基(GalNAcβ1→R)和岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素。本发明的诊断试剂盒中含有的凝集素也含有与上述载体结合的状态的凝集素。

本发明的诊断试剂盒可以含有上述对于β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素、对于岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素、和对于β-N-乙酰基半乳糖胺残基和岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素的1种或2种以上的组合。

作为与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素，不特别限定，可以举出TJA-II和WFA。此外，作为与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素，不特别限定，可以举出UEA-I和TJA-II。进一步地，作为与β-N-乙酰基半乳糖胺残基(GalNAcβ1→R)和岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素，可以举出TJA-II。

本发明的诊断试剂盒可以进一步含有抗PSA抗体(例如与PSA-ACT或游离PSA特异性结合的抗体)或其片段。作为上述抗体，可以使用单克隆抗体或多克隆抗体中的任意一种。作为上述抗体片段，只要保持对于PSA-ACT或游离PSA的特异性结合能力，则不特别限定，例如可以使用Fab、Fab’、F(ab’)₂、或Fv。

上述含有凝集素和抗PSA抗体的本发明的诊断试剂盒，可以根据所使用的免疫学方法，以所需方式含有上述抗PSA抗体或其片段。

例如使用标记化抗体的免疫学的方法，例如酶免疫测定法、化学发光免疫测定法、荧光抗体法或放射免疫测定法等情况下，可以以用标记物质标记的标记化抗体或标记化抗体片段的方式含有。作为标记物质的具体例，作为酶，可以举出过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-D-半乳糖苷酶、或葡萄糖氧化酶等，作为荧光物质，可以举出异氰酸荧光素或稀土类金属螯合物等，作为放射性同位素，可以举出³H、¹⁴C或¹²⁵I等，此外可以举出生物素、抗生物素蛋白或化学发光物质等。酶或化学发光物质等情况下，其本身单独不能产生可以测定的信号，因此优选选择并含有各自对应的适当的基质等。

《作用》

表现出灰区的PSA值(总PSA值为4～10ng/mL)的患者中，如上所述进行血清样品的游离PSA/总PSA比(F/T值)的测定。如表1所示，前列腺肥大症患者9例中的7例的F/T值为25%以下，这些患者成为为了确诊的活体组织检查的对象，但是实际上为前列腺肥大症，对于患者来说，形成过度的负担。

本发明中可以使用的TJA-II为识别存在于糖链的非还原末端的岩藻糖α(1,2)半乳糖残基和β-N-乙酰基半乳糖胺残基的凝集素。WFA为识别存在于糖链的非还原末端的β-N-乙酰基半乳糖胺残基的凝集素。此外，UEA-I为识别存在于糖链的非还原末端的岩藻糖α(1,2)半乳糖残基的凝集素。通过本说明书说明在前列腺癌患者的体内存在与TJA-II和WFA结合的PSA，即首次说明，随着癌化，在PSA糖链中出现这些糖链结构。如上所述，有报告指出来源于前列腺癌的LNCaP细胞的PSA，在非还原末端侧具有HexNacβ1–HexNAc残基。HexNAc含有β-N-乙酰基半乳糖胺(GalNAcβ)和β-N-乙酰基葡糖胺(GlcNAcβ)，但是在质量分析中，分子量相同，不能区别。此外，由该LNCaP细胞分泌的PSA糖链由于唾液酸欠缺等，因此认为不能反映前列腺癌患者的生物体的PSA。因此，本说明书中，首次可以通过使用TJA-II色谱柱、WFA色谱柱和UEA-I色谱柱，来鉴定前列腺癌患者的血清PSA中的非还原末端β-N-乙酰基半乳糖胺和岩藻糖α(1,2)半乳糖残基。认为伴随着癌化的PSA糖链结构的变化、即岩藻糖α(1,2)半乳糖残基或β-N-乙酰基半乳糖胺残基的出现的背景在于，由于前列腺癌的发病，而参与糖链的合成的糖基转移酶活性量的变化。

此外，如专利文献1和非专利文献2所述，要用特异性地识别NeuAcβ2-3Galβ1-4GlcNAc的MAA检测前列腺癌中的糖链的结构变化时，一定的比率的血中PSA，以与血清α1-抗糜蛋白酶结合的PSA-ACT的状态存在。由于MAA也与α1-抗糜蛋白酶结合，因此即使PSA的糖链结构不同，也不能分离与α1-抗糜蛋白酶结合的PSA。因此，用MAA分离PSA时，有必要测定游离PSA。

另一方面，本发明中可以使用的TJA-II识别存在于PSA糖链的非还原末端的岩藻糖α(1,2)半乳糖残基和β-N-乙酰基半乳糖胺残基，WFA识别存在于PSA糖链的非还原末端的β-N-乙酰基半乳糖胺残基，由于这些糖链结构不存在于血清α1-抗糜蛋白酶上，可以使用总PSA测定试剂盒来进行定量。通常游离PSA量为总PSA量的20%以下，本发明的分析方法中，由于可以使用总PSA测定试剂盒，与非专利文献2和专利文献1中记载的发明相比，在灵敏度上有利。

实施例

以下举出实施例和比较例，对本发明进行具体的说明，但是这些实施例和比较例并非限定本发明的范围。

《TJA-II纯化例》

由日本栝蒌(Trichosanthes japonica)的块茎20g，根据现有报告(Yamashita et al., J. Biol. Chem., 267, 25441-25422, 1992)纯化TJA-II。具体地说，将日本栝蒌的块茎切碎，使用韦林氏搅切器(Waring blender)，用含有0.15M的NaCl的10mM磷酸缓冲液(pH 7.4)16mL均化。以1000×g离心30分钟，将得到的上清的35～55%饱和的硫酸铵级分沉淀物溶解在水中，用蒸馏水透析。冷冻干燥后，将435mg的35～55%饱和的硫酸铵沉淀物溶解在6mL的PBS中，上样于用PBS平衡化的猪胃粘蛋白(porcine stomach mucin)琼脂糖4B(10mg/mL凝胶)色谱柱10ml。洗涤色谱柱后，用含有0.1M的乳糖的PBS洗脱，得到TJA-II。

《色谱柱制造例》

使用纯化了的TJA-II，偶联在琼脂糖色谱柱上，制造TJA-II色谱柱和WFA色谱柱。具体地说，使用CNBr-Sepharose(GE healthcare公司制)，根据厂商推荐的随附的方案，以每1mL凝胶容积为3mg的密度键合TJA-II，制造TJA-II色谱柱。

此外，使用WFA(EYラボラトリー社制)和CNBr-Sepharose(GE healthcare公司制)，同样地制造WFA色谱柱。

《实施例1：使用TJA-II的PSA的分析》

本实施例中，使用上述色谱柱制造例中制造的TJA-II色谱柱，对诊断为前列腺癌的15名患者和诊断为前列腺肥大症的总PSA为4.0ng/mL以上的9名患者，通过本发明的PSA的分析方法，测定PSA的量。

4℃的条件下，将TJA-II色谱柱(1mL容量)用含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲液平衡化。将血清样品1μL～50μL用磷酸缓冲液稀释，制成200μL，上样于色谱柱，保持30分钟。然后，用5倍容量的洗涤用缓冲液(含有0.1%BSA的磷酸缓冲液)洗涤色谱柱，以每1mL为1个级分，得到TJA-II非结合级分。将色谱柱恢复至室温后，用5倍容量的洗脱缓冲液(含有10mM乳糖、0.1%BSA的磷酸缓冲液)，以每1mL为1个级分进行洗脱，得到TJA-II结合级分。对于通过TJA-II色谱柱进行的分离之前的血清样品，TJA-II非结合级分、和TJA-II结合级分，使用アクセスハイブリテック总PSA(ベックマンコールター社制)测定总PSA量。TJA-II色谱柱的PSA回收率总是为97%～100%。表1表示分离之前的血清样品的PSA量、TJA-II结合级分的PSA量、和PSA的TJA-II结合率。而且，TJA-II结合率通过下式算出。

TJA-II结合率=(TJA-II结合级分中的PSA量/TJA-II非结合级分和TJA-II结合级分中的PSA量)×100%

此外，使用アクセスハイブリテック游离PSA(ベックマンコールター社制)测定分离之前的血清样品的游离PSA。由上述总PSA的量和游离PSA的量，计算游离PSA/总PSA比。结果如表1、图2和图3所示。而且，癌患者的年龄、病期(stage)、格里森分数(gleason score)如表2所示。病期(stage)表示前列腺癌的发展程度。此外，格里森分数(gleason score)将前列腺癌的恶性度通过病理学上的分类分为5个阶段。“1”意味着最温和的癌，“5”意味着最恶性的癌，而大多数前列腺癌具有多种恶性度不同的成分，将最多的成分和第二多的成分相加评分得到的值为格里森分数(gleason score)。例如，最多的成分为“3”、第二多的成分为“4”时，格里森分数(gleason score)为“3”＋“4”=“7”。格里森分数(gleason score)为“6”以下，认为为恶性度低的癌，“7”认为为中等程度的恶性度，“8”～“10”认为为恶性度高的癌。

[表1]

[表2]

如图2和图3所示，TJA-II结合级分中的PSA量和TJA-II结合率在前列腺癌患者和前列腺肥大症患者之间都不重复，说明可以鉴别前列腺癌患者和前列腺肥大症患者。若暂时性地使TJA-II结合级分中的PSA量的临界值为250pg/mL，使TJA-II结合率的临界值为2%，则可以以100%的精度区别前列腺肥大症患者和前列腺癌患者。在不同的临床病期、格里森分数下，TJA-II结合率和TJA-II结合PSA量也未发现显著的差异。

《实施例2》

本实施例中，使用上述色谱柱制造例中制造的WFA色谱柱，对于诊断为前列腺癌的3名患者，通过本发明的PSA的分析方法，测定PSA的量。

具体地说，除了使用WFA色谱柱和洗脱缓冲液(含有10mM GalNAc、0.1%BSA的磷酸缓冲液)来替代TJA-II色谱柱和洗脱液(含有10mM 乳糖、0.1%BSA的磷酸缓冲液)之外，重复上述实施例1的操作，对3位前列腺癌患者的血清样品进行分析，得到WFA结合级分中的PSA量和WFA结合率。WFA结合率的结果如表3所示。

而且，WFA结合率通过下式计算。

WFA结合率=(WFA结合级分中PSA量/WFA非结合级分和WFA结合级分中的PSA量)×100%

此外，为了进行比较，TJA-II结合率如表3所示。

[表3]

WFA色谱柱的PSA回收率为90%～98%。此外，WFA结合率大致与TJA-II结合率相关，WFA与具有β-N-乙酰基半乳糖胺残基的PSA结合，可以分离前列腺癌患者的PSA。

但是，WFA结合率比TJA-II结合率稍低，为84.0%～93.8%。这表示在前列腺癌患者的血液中有可能存在仅对于TJA-II具有亲和性的PSA。即，暗示了有可能存在不具有β-N-乙酰基半乳糖胺残基(GalNAcβ1→R)、仅具有岩藻糖α(1,2)半乳糖残基(Fucα1→2Galβ1→R)的PSA。

《实施例4》

本实施例中，对于前列腺肥大症的患者血清中的PSA、前列腺癌的患者的血清中的PSA、和精浆中的PSA，调查PSA分别对于TJA-II色谱柱、UEA-I色谱柱、或WFA色谱柱的PSA结合率。

对于TJA-II色谱柱的结合率的测定根据实施例1中记载的方法。对于WFA色谱柱的结合率的测定根据实施例2中记载的操作。

此外，对于UEA-I色谱柱的结合率的测定如下进行。使用结合了荆豆凝集素-I(Ulex europaeus agglutinin-I：UEA-I)的琼脂糖(UEA-I琼脂糖：Jオイルミルズ)，测定与UEA-I结合的PSA的量。具体地说，除了使用UEA-I琼脂糖和洗脱缓冲液(含有50mM 岩藻糖(fucose)、0.1%BSA的磷酸缓冲液)来替代TJA-II色谱柱和洗脱液(含有10mM 乳糖、0.1%BSA的磷酸缓冲液)之外，重复上述实施例1的操作，测定UEA-I结合率。结果如表4所示。

[表4]

前列腺肥大症的患者血清中的PSA几乎不与TJA-II色谱柱、UEA-I色谱柱、或WFA色谱柱结合。另一方面，对于前列腺癌患者血清中的PSA，16%的PSA与TJA-II色谱柱结合，5%的PSA与UEA-I色谱柱结合，11%的PSA与WFA色谱柱结合。这些数据说明前列腺癌患者血清中的PSA具有非还原末端β-N-乙酰基半乳糖胺和/或岩藻糖α(1,2)半乳糖残基。

《比较例1》

本比较例中，使用专利文献1中记载的作为凝集素的MAA，进行前列腺癌患者的PSA的分离以及测定。

MAA的纯化，根据现有报告(Kawaguchi et al., J. Biol. Chem., 249, 2786-2792, 1974)的方法。具体地说，将朝鲜槐 (Maackia amurensis)的种子50g在数百mL的PBS中通过均化器均化至变细，进一步搅拌一晚后，通过9000rpm离心分离30分钟，除去沉淀物。将该提取液(210mL)的50～80%的硫酸铵分级级分在PBS中透析，通过离心操作除去沉淀后，将一部分(30mL)添加到甲状腺球蛋白琼脂糖(19mg/mL、15mL)中，用PBS洗涤后，用含有0.1M乳糖、0.075M NaCl的0.15M甘氨酸盐酸缓冲液(pH 2.5)洗脱。将凝集素活性高的部分储备并浓缩后，在50mM磷酸缓冲液(pH 4.5)中通过透析进行置换。通过离心操作除去沉淀后，添加到用50mM磷酸缓冲液(pH 4.5)平衡化的SP SEPHADEX C-50(100mL)中，收集非吸附级分并进行浓缩，得到纯化MAA。

使用纯化的MAA，制造琼脂糖色谱柱。使用CNBr-Sepharose(GE healthcare公司制)，根据厂商推荐的随附的方案，以每1mL凝胶容积为3mg的密度结合MAA，制造MAA色谱柱。

首先，为了确认MAA色谱柱与唾液酸α(2,3)半乳糖残基的结合特性，使用具有3个唾液酸α(2,3)半乳糖残基的低聚糖确认结合。4℃的条件下，用含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)和0.02% Tween的磷酸缓冲液将MAA色谱柱(1mL容量)平衡化。将含有具有3个唾液酸α(2,3)半乳糖残基的复合型3根链低聚糖的样品上样于色谱柱，保持30分钟。然后，用5倍容量的洗涤用缓冲液(含有0.1%BSA、0.02%的Tween的磷酸缓冲液)洗涤色谱柱，以每1mL为1个级分，得到MAA非结合级分。将色谱柱恢复至室温后，用5倍容量的洗脱缓冲液(含有400mM乳糖、0.1%BSA、0.02%tween的磷酸缓冲液)，以每1mL为1个级分进行洗脱，得到MAA结合级分。上述具有3个唾液酸α(2,3)半乳糖残基的低聚糖未与色谱柱结合，95%以上被回收到MAA非结合级分中。

接着，使用该MAA色谱柱，调查前列腺癌患者的PSA对于MAA色谱柱的结合。4℃的条件下，用含有0.1%牛血清白蛋白(BSA)和0.02% Tween的磷酸缓冲液将MAA色谱柱(1mL容量)平衡化。将血液样品10μL用磷酸缓冲液稀释，制成200μL，应用于色谱柱，保持30分钟。然后，用5倍容量的洗涤用缓冲液(含有0.1%BSA、0.02%的Tween的磷酸缓冲液)洗涤色谱柱，以每1mL为1个级分，得到5个MAA非结合级分。将色谱柱恢复至室温后，用5倍容量的洗脱缓冲液(含有400mM乳糖、0.1%BSA、0.02%tween的磷酸缓冲液)，以每1mL为1个级分进行洗脱，得到5个MAA结合级分。对于各级分，使用アクセスハイブリテック总PSA(ベックマンコールター社制)测定总PSA量。作为对照，使用纯化的正常游离PSA 5ng，重复相同操作，测定总PSA量。前列腺癌患者的PSA的结果如图4(B)所示，正常游离PSA的结果如图4(A)所示。

正常游离PSA，大部分在第2个MAA非结合级分中检出。但是，将全部级分的PSA的量总计的正常游离PSA量，相对于应用于MAA色谱柱的 5ng的正常游离PSA，为3.5ng，回收率为70%，认为30%与色谱柱结合。

另一方面，前列腺癌患者的PSA分为第2个MAA非结合级分中检出的未吸附的PSA、第3个MAA非结合级分的肩部分检出的稍微吸附的PSA、和用400mM乳糖洗脱的吸附PSA。全部级分的PSA量总计为4ng/mL，相对于分离之前的血清样品的PSA量10ng/mL，仅回收40%左右。该回收率，即使使用0.1M乙酸溶液作为洗脱溶液，也未得到改善。进一步地，对于所使用的前列腺癌患者的PSA，游离PSA/总PSA比为3.6，96.4%的PSA以与α-抗糜蛋白酶结合的PSA-ACT的状态存在。α-抗糜蛋白酶由于每1分子具有1个唾液酸α(2,3)半乳糖残基，PSA-ACT应与MAA色谱柱结合，但是大部分PSA以第2个MAA非结合级分中检出的未吸附的PSA、和第3个MAA非结合级分的肩部分检出的稍微吸附的PSA的方式检出。

即说明，具有3个唾液酸α(2,3)半乳糖残基的低聚糖不与MAA色谱柱结合，以及存在未结合的PSA-ACT，PSA对于MAA凝集素色谱柱的结合弱。然而，尽管PSA对于MAA的结合弱，但是PSA的回收率差，难以利用半抗原糖进行洗脱，认为利用MAA时，难以重现性良好地、正确地进行测定。

产业实用性

本发明的PSA的分析方法和PSA分析试剂盒，可以切实地鉴别前列腺癌和前列腺肥大症的患者。因此，在健康诊断中，可以早期发现前列腺癌。此外，由于可以切实地鉴别前列腺癌和前列腺肥大症，可以减少为了确定诊断而进行的前列腺的活体组织检查的对象者，可以减轻患者的负担。

以上，根据特定的方式对本发明进行了说明，但是对于所属技术领域的技术人员来说熟知的变形、改良在本发明的范围内。

Claims

1.PSA的分析方法，其特征在于，使与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素、与有可能含有PSA的样品接触，判定对于所述凝集素具有亲和性的PSA的量。

2.如权利要求1所述的PSA的分析方法，其含有：

(a) 通过使所述与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素与有可能含有PSA的样品接触，将对于所述凝集素具有亲和性的PSA和对于所述凝集素不具有亲和性的PSA分离的阶段，和

(b) 判定所述样品中的对于凝集素具有亲和性的PSA的量的阶段。

3.如权利要求2所述的PSA的分析方法，其中，对于所述凝集素具有亲和性的PSA量的判定为：

通过测定分离的对于凝集素具有亲和性的PSA的量进行的判定，

通过测定分离之前的样品中的PSA量、和测定分离的对于凝集素具有亲和性的PSA量进行的判定，或

通过测定分离之前的样品中的PSA量、和测定分离的对于凝集素不具有亲和性的PSA量进行的判定。

4.如权利要求3所述的PSA的分析方法，其中，所述PSA量的测定为总PSA或游离PSA的测定。

5.如权利要求1～4中任意一项所述的PSA的分析方法，其中，所述凝集素为日本栝蒌凝集素-II或多花紫藤凝集素。

6.如权利要求1～4中任意一项所述的PSA的分析方法，其中，所述凝集素为进一步与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素。

7.如权利要求1所述的PSA的分析方法，其中，所述样品为由怀疑患有前列腺癌的患者得到的样品。

8.如权利要求1所述的PSA的分析方法，其用于前列腺癌的诊断。

9.PSA的分析方法，其特征在于，使与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素和与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素、与有可能含有PSA的样品接触，判定对于所述凝集素具有亲和性的PSA的量。

10.如权利要求9所述的PSA的分析方法，其含有：

(a) 通过使所述与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素和与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素与有可能含有PSA的样品接触，将对于所述凝集素具有亲和性的PSA和对于所述凝集素不具有亲和性的PSA分离的阶段，和

(b) 判定对于所述凝集素具有亲和性的PSA的量的阶段。

11.与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素在制备用于鉴别前列腺癌和前列腺肥大症的试剂盒中的用途。

12.PSA的分析试剂盒，其含有与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素和抗PSA抗体。

13.如权利要求12所述的PSA的分析试剂盒，其中，所述凝集素为日本栝蒌凝集素-II或多花紫藤凝集素。

14.如权利要求12所述的PSA的分析试剂盒，其中，所述凝集素为进一步与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素。

15.如权利要求14所述的PSA的分析试剂盒，其中，所述凝集素为日本栝蒌凝集素-II。

16.PSA的分析试剂盒，其含有与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素和与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素、以及抗PSA抗体。

17.如权利要求16所述的PSA的分析试剂盒，其中，所述与β-N-乙酰基半乳糖胺残基具有亲和性的凝集素为日本栝蒌凝集素-II或多花紫藤凝集素，与岩藻糖α(1,2)半乳糖残基具有亲和性的凝集素为日本栝蒌凝集素-II或UEA-I。

18.使用权利要求12～17中任一项所述的PSA的分析试剂盒的前列腺癌诊断试剂盒。

19.使用权利要求12～17中任一项所述的PSA的分析试剂盒的前列腺癌与前列腺肥大症的鉴别试剂盒。