CN104130323B - 结合半乳糖的凝集素及其诊断类风湿性关节炎的应用 - Google Patents
结合半乳糖的凝集素及其诊断类风湿性关节炎的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了结合半乳糖的凝集素，其编码基因、载体、细胞和制备方法等。该凝集素可以结合半乳糖并可以凝集胸腺细胞。另外，本发明还提供了利用该凝集素在制备诊断类风湿性关节炎的试剂盒中的应用等。
Description
技术领域
本发明属于生物医学技术领域，具体而言，本发明提供了结合半乳糖的凝集素及其在制备早期诊断类风湿性关节炎的试剂盒中的应用等。
背景技术
类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis，RA)是以关节进展性破坏为主、并累及其他多种脏器的常见病，其发病率可高达5％。RA的病情特点为反复发作，呈进展性加重，如从关节晨僵、红肿到关节破坏，及使病人丧失活动能力等。类风湿关节炎被称为“不死的癌症”，它给病人带来了极大的身心痛苦和经济负担。类风湿关节炎如能在早期予以正确诊断并合理治疗，病情将可得到缓解或趋于稳定。
目前类风湿关节炎现常用的诊断方法有实验室检测和X-光片方法等。其中实验室检测方法主要包括IgG、类风湿因子(RF)、血沉、C-反应蛋白测定等。但是这些方法各有不足之处：IgG测定是病人血中总IgG水平的测定，不同人IgG水平变化范围较大，且免疫功能低下的病人并不伴有IgG升高；血沉和C-反应蛋白是反映病情活动期的一个指标，在多种疾病可有不同程度的升高，如结核、血液病和炎症等；类风湿因子出现较晚，并且仅有30-40％的病人为阳性，并同时受总IgG水平的影响；X-光片诊断是依据骨关节密度等诊断类风湿关节炎的指标，当类风湿关节炎病人出现骨改变时有意义，它也只能是一个较晚期出现的指标。
然而，本发明人在长期研究RA诊断的过程中，令人意外地发现了一种具有结合半乳糖能力的凝集素，其不但具有更强的促胸腺细胞凝集的作用，能够与游离的半乳糖更完全地结合，而且能够与糖蛋白（如人IgG）的糖链中暴露出来的半乳糖等非游离的半乳糖结合，特别适合在ELISA（酶联免疫吸附测定）诊断类风湿性关节炎的方法中应用。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于提供新的凝集素，其具有结合半乳糖的能力，其中半乳糖无论是游离的，还是处于诸如糖蛋白的糖链中的，和/或，其具有凝集胸腺细胞的能力。另外，本发明还提供了该凝集素的编码核酸、载体、细胞和制备方法以及其应用，包括制备凝集胸腺细胞或者结合半乳糖的试剂的应用和制备用于诊断类风湿性关节炎的方法的试剂盒的应用等。
具体而言，在第一个方面，本发明提供了凝集素，其具有的氨基酸序列：
（1）如SEQ ID NO：1所示；或，
（2）是在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列上缺失、取代和/或添加一个或几个氨基酸而获得的氨基酸序列，而且其具有结合半乳糖的能力或者仍旧具有凝集胸腺细胞的能力。
本发明的第一个方面的凝集素的氨基酸序列可以是在如SEQ ID NO：1所示的序列的基础上添加、缺失和/或取代一个或几个(优选一个至五个，更优选一个至三个)氨基酸残基而得的氨基酸序列，并且仍旧具有结合半乳糖的能力，如结合游离的半乳糖和/或结合糖蛋白的糖链中的半乳糖，或者仍旧具有凝集胸腺细胞的能力。本领域技术人员知晓，通过改变已知多肽的编码基因序列并将其导入表达载体，可以制备出取代、添加或缺失了氨基酸残基的多肽，这些方法广泛记载于《分子克隆实验指南》(北京：科学出版社，2002年)等本领域公知的文献中。在取代的氨基酸残基中，优选取代为与原氨基酸残基侧链性质相似的其他氨基酸，从而更得以保持原有功能活性。侧链性质相似的氨基酸分别有疏水性氨基酸(A、I、L、M、F、P、W、Y、V)、亲水性氨基酸(R、D、N、C、E、Q、G、H、K、S、T)、脂肪族侧链的氨基酸(G、A、V、L、I、P)、含羟基侧链的氨基酸(S、T、Y)、含硫原子侧链的氨基酸(C、M)、含羧酸和酰胺侧链的氨基酸(D、N、E、Q)、含碱性基团侧链的氨基酸(R、K、H)、含芳香族侧链的氨基酸(H、F、Y、W)。在本发明的第一个方面中，优选所述凝集素的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
在第二个方面，本发明提供了编码本发明第一个方面所述的凝集素的核酸。本发明的核酸，可以是DNA形式，也可以是RNA形式，优选DNA形式。DNA形式包括天然cDNA和人工合成的cDNA，DNA 可以是编码链或模板链。通过常规技术，如PCR方法、重组法或人工合成的方法，本领域技术人员可以很容易获得本发明的核酸或其片段。这些序列一旦获得，就可以将其克隆入载体，再转化或转染入相应的细胞，然后通过常规的宿主细胞进行增殖，从中分离得到大量的核酸分子。优选本发明的核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。该优选序列优化了在大肠杆菌的表达，使得在大肠杆菌BL21 (DE3)中的表达比例可以占到总蛋白的20%。
在第三个方面，本发明提供了包含本发明第二个方面所述的核酸的载体。常用的载体包括细菌质粒、粘粒、噬菌粒、酵母质粒、植物细胞病毒、动物病毒及其它各种病毒载体。本文中的载体优选是重组表达载体（简称为表达载体），包括但不限于：在细菌中表达用的载体(原核表达载体)、在酵母中表达用的载体(如毕赤酵母载体、汉逊酵母载体等)、在昆虫细胞中表达的杆状病毒载体、在哺乳动物细胞中表达用的载体(痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴病毒载体等)、在植物中表达用的植物病毒载体以及在哺乳动物乳腺中表达用的各种载体。优选的表达载体通常包含选择标记基因，如细菌的氨苄青霉素抗性基因、四环素抗性基因、卡那霉素抗性基因、链霉素抗性基因、氯霉素抗性基因；酵母菌的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因，酵母菌的缺陷选择标记（如His，Leu，Trp缺陷选择标记）等；真核细胞的新霉素抗性基因、Zeocin抗性基因、二氢叶酸还原酶基因及荧光蛋白标记基因等。
在第四个方面，本发明提供了宿主细胞，其包含本发明第三个方面所述的载体，或者其用本发明第二个方面所述的核酸转化或转染。宿主细胞可以是原核细胞，也可以是真核细胞，如，细菌细胞、酵母细胞、植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。宿主细胞在转化或转染含本发明所述编码融合蛋白的基因序列后，即构成工程化细胞或细胞株，可用于生产所需融合蛋白。本领域技术人员能够恰当地选择适当的载体、宿主细胞，并熟知如何将载体高效地转化或转染入宿主细胞中，所用方法包括但不限于：氯化钙法、电穿孔法用于细菌细胞，电穿孔法和原生质体融合法用于酵母细胞，脂质体包裹、磷酸钙共沉淀、电融合法以及显微注射法用于哺乳动物细胞等真核细胞。优选本发明的宿主细胞是原核细胞，更优选是大肠杆菌，最优选是大肠杆菌BL21(DE3)。该最优选的宿主细胞与序列1所示的核苷酸序列配合，能高效表达本发明的凝集素。
在第五个方面，本发明提供了制备本发明第一个方面所述的凝集素的方法：
（1）在适合蛋白质表达的条件下，培养本发明第四个方面所述的宿主细胞；和，
（2）从步骤（1）获得的培养产物中分离出本发明第一个方面所述的凝集素。优选本发明的制备方法，包括将获得的宿主细胞的包涵体裂解，依次经Q-Sepharose层析柱和Sephedex G-25层析柱纯化，然后用肠激酶酶切，再依次经NTA层析柱和Q-Sepharose层析柱纯化。这样获得的凝集素纯度高、重复性好。
在第六个方面，本发明提供了凝集胸腺细胞的方法，其包括将本发明第一个方面所述的凝集素与胸腺细胞混合的过程。本发明优选的凝集素对小鼠胸腺细胞的凝集作用显著强于目前市售的凝集素，因此特别适合用于凝集胸腺细胞，尤其是特别适合用于体外凝集胸腺细胞。所以，优选本发明第六个方面所述的方法是体外方法，即体外凝集胸腺细胞的方法。相应地，本发明提供了本发明第一个方面所述的凝集素在制备凝集胸腺细胞的试剂中的应用。
在第七个方面，本发明提供了结合半乳糖的方法，其包括将本发明第一个方面所述的凝集素与含半乳糖的物质混合的过程。本发明优选的凝集素对游离的和在糖蛋白糖链中的半乳糖都有结合作用，而且比目前市售的凝集素结合地更为完全，因此特别适合用于结合半乳糖，尤其是特别适合用于体外结合半乳糖。所以，优选本发明第七个方面所述的方法是体外方法，即体外结合半乳糖的方法。相应地，本发明提供了本发明第一个方面所述的凝集素在制备结合半乳糖的试剂中的应用。
在第八个方面，本发明提供了本发明第一个方面所述的凝集素在制备用于诊断类风湿性关节炎的方法的试剂盒中的应用。本发明的凝集素可以用于ELISA检测免疫球蛋白中的包被试剂，从而可以构成试剂盒，即优选本发明第八个方面的应用中的诊断类风湿性关节炎的方法包括ELISA检测样品结合在用本发明第一个方面所述的凝集素包被的酶标板上的免疫球蛋白的量（可以直接经过计算的量，也可以是未经计算的间接量，如吸光值（记为值A），更优选是450nm处的吸光值）。该ELISA方法已经能在较高准确度上诊断是否患有类风湿性关节炎，因此可以单独使用，但是由于对健康人群的诊断准确率为约60%，有着40%左右的误诊率，因此优选试剂盒还包括蘑菇凝集素作为包被试剂，即优选本发明第八个方面的应用中的诊断类风湿性关节炎的方法进一步包括ELISA检测样品结合在用蘑菇凝集素包被的酶标板上的免疫球蛋白的吸光值（优选是405nm处的吸光值），得到值B，计算A/B的比值。通过A/B的比值，可以使得诊断准确率达到95%以上。优选在本发明第八个方面的应用中，得到值A的ELISA方法和得到值B的ELISA方法并行实施。
本发明取得的有益效果有：获得了新的凝集素，给市场提供更多选择；凝集素可以结合游离的和糖蛋白糖链的半乳糖，也可以凝集胸腺细胞，用途范围广，包括可以用于诊断类风湿性关节炎，不但可以用于更为方便的单一的ELISA中用于诊断类风湿性关节炎，而且可以用于更为准确的组合的ELISA中用于诊断类风湿性关节炎；制备方法表达量高，纯度高，均一性好。
为了便于理解，本发明引用了公开文献，这些文献是为了更清楚地描述本发明，其全文内容均纳入本文进行参考。以下将通过具体的实施例对本发明进行详细地描述。需要特别指出的是，这些描述仅仅是示例性的描述，并不构成对本发明范围的限制。依据本说明书的论述，本发明的许多变化、改变对所属领域技术人员来说都是显而易见了。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明的内容。如未详尽之处，可以按照《分子克隆实验指南》（2002年，第三版，科学出版社）、《细胞实验指南》（2001年，科学出版社）等实验手册所述的方法进行，或者根据药物监管部门（如，SFDA）的相关规定以及实验中所用到的试剂、仪器的厂商所提供的说明书或手册来进行。
实施例1 凝集素的构建和克隆
根据我们新发现的凝集素，设计了在大肠杆菌中优化表达的凝集素基因序列，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示，并通过商业渠道委托合成。在得到该购买的合成的基因序列后，我们通过上游引物（其核苷酸序列如SEQ ID NO：3所示）和下游引物（其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示）进行PCR扩增，从而在以上合成的序列两端分别引入EcoRI和XhoI酶切位点以及肠激酶酶切位点。其中，PCR扩增条件为：H2O 34μL，10×PCR缓冲液5μL，25mM MgSO4 2μL，2mM dNTP 5μL，上游引物(50uM)1μL，下游引物(50uM)1μL，合成的聚谷氨酸基因(稀释成10ng/uL浓度)1μL，KOD PLUS DNA聚合酶(Toyoba)1μL，总体积50μL；94℃变性3分钟，然后94℃30秒、50℃30秒、69℃30秒，共30个循环，最后69℃5分钟。
PCR扩增后，在琼脂糖凝胶上电泳PCR扩增产物，割胶回收约700bp大小的核酸片段。用EcoRI和XhoI分别双酶切该回收的PCR产物和pET28a+质粒（Invitrogen），将酶切后的PCR产物和pET28a质粒用T4连接酶连接，构建成表达载体pET28-lectin，然后转化大肠杆菌DH5α细胞。取转化的大肠杆菌DH5α细胞抽提质粒，经测序检测质粒上克隆有如序列2所示的正确序列后，将该质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，由此得到凝集素表达菌。
实施例2 凝集素的表达和纯化
取实施例1获得的表达菌，接种到100mL LB液体培养基中，在37℃振荡培养6小时，然后加入10uL的1mol/L IPTG，于37℃继续诱导培养4小时。诱导前后培养的少量菌液经SDS-PAGE电泳检测比对，确认诱导后产生约25kDa的凝集素表达条带，约占菌体总蛋白量的20%。
将上述诱导培养后的菌液于4℃以5000rpm离心5分钟，弃上清，取1克军体（湿重），用10mL 50mM Tris-HCl(pH 8.0)缓冲液重悬，冰上超声破碎菌体。菌体破碎液于4℃以10000rpm离心15分钟，弃上清，收集沉淀并用30mL 2M尿素裂解液洗涤，然后于4℃以10000rpm离心15分钟，弃上清，收集沉淀并用30mL 8M尿素裂解液溶解，然后于4℃以10000rpm离心15分钟，弃去沉淀。将上清液（即，包涵体裂解液）用Q-Sepharose Fast Flow柱(GE公司) 纯化，先后用A液（配方：8 mol/L尿素、25 mmol/L Tris-HCl(pH 9.0)、1 mmo/L EDTA和1 mmol/L DTT）和B液（配方：0.5 mol/L NaCl、8 mol/L尿素、25 mmol/L、Tris-HCl(pH 9.0)、1 mmol/L EDTA和1 mmol/L DTT）进行梯度洗脱，280 nm紫外监测，洗脱至不再出峰，分步收集洗脱液，取少量洗脱液进行SDS-PAGE电泳检测，合并收集含有25kD蛋白的洗脱液。然后将收集的洗脱液过Sephedex G-25柱(GE公司)脱去洗脱液中的小分子盐离子。然后，根据厂商说明书的指导，将包含25kDa蛋白的洗脱液在20℃、20mM Tris-HCl（pH7.6），100mM NaCl的条件下，用1μl的rEK(重组肠激酶，购自上海生工公司)反应8小时。然后，将反应液流经鳌合有Ni的NTA柱(Merck公司)以去除未酶切完全的带有标记的蛋白，取流出液1ml上样于Q-Sepharose Fast Flow柱，用含0至1mol/L NaCl的50mM Tris-HCl（pH7.0）缓冲液梯度洗脱，收集含25kD蛋白的洗脱峰，冷冻干燥后得到凝集素。
取上述三个批次制备的凝集素，经SDS-PAGE电泳检测，纯度均在95％以上，而且分子量均一性好，结果重复性佳。
实施例3 凝集素对半乳糖结合能力的研究
取本发明实施例2纯化获得的凝集素进行研究，具体而言，根据郑新民等（上海免疫学杂志，3（2）：65-70）报道的方法，研究其对小鼠胸腺细胞的凝集能力以及被半乳糖抑制（结合）的能力，同时以目前市售的花生凝集素（Medicago AB公司）作为对比。结果如表1所示，本发明的凝集素对小鼠胸腺细胞的凝集作用显著强于目前市售的花生凝集素，大约提升5%左右；本发明和对比的凝集素对小鼠胸腺细胞的凝集作用都能够为外加的半乳糖所抑制（结合），尤其是本发明的凝集素被抑制（结合）得更为完全。
表1 本发明和对比的凝集素对小鼠胸腺细胞的凝集作用及半乳糖的抑制影响
实施例4 糖蛋白糖链的半乳糖的检测
由于本发明人发现该凝集素不但可以结合游离的半乳糖，还可以结合糖蛋白（如免疫球蛋白G）糖链的半乳糖，所以可以用于如下人IgG的检测方法中：取本发明实施例2纯化获得的凝集素溶于包被缓冲液（配方：1.59克Na2CO3和2.93克NaHCO3，用蒸馏水定容至1000mL）中，配制成0.5μg/ml的凝集素溶液，加于酶标板上，每孔加300μL，于4℃放置10小时，使得凝集素包被在酶标板上。用PBST缓冲液（10×PBST缓冲液（pH7.4）购自Amresco公司）洗涤3次，每次洗涤是向酶标板上的每个包被凝集素的孔加400μL PBST缓冲液，轻轻震荡酶标板5分钟，然后弃去。洗涤后每孔加含3%（W/W）小牛血清的PBST缓冲液400μL，于4℃放置10小时。再按上述洗涤方法用PBST缓冲液洗涤3次。然后，向每孔中加入待测样品或者标准品100μL，于37℃温育10分钟。再按上述洗涤方法用PBST缓冲液洗涤3次。然后，向每孔中加200μl以1:500稀释度稀释的用辣根过氧化物酶标记的鼠抗人IgG抗体（Sigma公司），于37℃温育10分钟。再按上述洗涤方法用PBST缓冲液洗涤3次。然后，向每孔中加200μl显色底物四甲基联苯胺（Sigma公司），避光保存15分钟用以显色。再按上述洗涤方法用PBST缓冲液洗涤3次。然后，向每孔中加40μl 2mol/L H2SO4终止反应，在酶标仪上检测450nm处的吸光值。经检测，当用含10ng人免疫球蛋白标准品（桂林英美特生物技术有限公司）的时候，吸光值稳定于0.70左右。
实施例5 类风湿性关节炎的诊断
对58名确诊患有类风湿性关节炎的患者和92名健康人群（诊断未患类风湿性关节炎）取血清或者关节滑膜液样本100μL，分别采用实施例4的方法进行检测，发现对58名患者检测的吸光值均为0.15~0.55，显著小于0.70；大部分（55名）健康人检测的吸光值在0.60以上，但是有37名健康人检测的吸光值在0.60以下，难以与类风湿性关节炎患者区分，即对健康人群的检测，实施例4预计仅有60%的准确率。
为此，我们结合对受试者样品与蘑菇凝集素结合性能的检测，来进一步提供诊断的准确率。具体而言，取蘑菇凝集素（南京德宝生化器材有限公司）溶于包被缓冲液（配方：1.59克Na2CO3和2.93克NaHCO3，用蒸馏水定容至1000mL）中，配制成20μg/ml的凝集素溶液，加于酶标板上，每孔加300μL，于4℃放置10小时，使得凝集素包被在酶标板上。用PBST缓冲液（10×PBST缓冲液（pH7.4）购自Amresco公司）洗涤3次，每次洗涤是向酶标板上的每个包被凝集素的孔加400μL PBST缓冲液，轻轻震荡酶标板5分钟，然后弃去。洗涤后每孔加含1%（W/W）小牛血清的PBST缓冲液400μL，于4℃放置10小时。再按上述洗涤方法用PBST缓冲液洗涤3次。然后，向每孔中加入待测样品或者标准品100μL，于37℃温育10分钟。再按上述洗涤方法用PBST缓冲液洗涤3次。然后，向每孔中加200μl以1:2000稀释度稀释的用碱性磷酸酶标记的鼠抗人IgG抗体（Sigma公司），于37℃温育10分钟。再按上述洗涤方法用PBST缓冲液洗涤3次。然后，向每孔中加300μl显色底物对-硝基苯磷酸酯（Sigma公司），避光保存15分钟用以显色。再按上述洗涤方法用PBST缓冲液洗涤3次。然后，向每孔中加50μl 1mol/L NaOH溶液终止反应，在酶标仪上检测405nm处的吸光值。经检测，当用含10ng人免疫球蛋白标准品（桂林英美特生物技术有限公司）的时候，吸光值稳定于0.25左右。对上述患者和健康人群检测，患者的吸光值基本处于0.40~1.0，而健康人群0.20~0.50，也有交集，无法直接准确检测。但是用实施例4的方法获得的吸光值处以该方法获得的吸光值的比值，除两名健康人的比值小于2以外，其他人的比值均处于2~4之间；所有患者的比值均小于2，而且50名患者的比值处于0.3~0.9之间。
所以，用本发明的凝集素和蘑菇凝集素分别对样品测得的比值来诊断类风湿性关节炎，准确率预计至少在95%以上。而且，无论是实施例4的方法，还是本实施例额外的方法，步骤都是对应的，因此可以并行实施，甚至在同一块酶标板的不同孔中并行实施，因此基本上不增加检测的时间，同时易于用自动化设备（包括自动加样仪）来实施。
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aacgataacg gcgatattac caccattgcg caggtggtgg atctgaaaat taaactgccg 600
gaacgcgtga aatttggctt tagcgcgagc ggcagcctgg gcggccgcca gattcatctg 660
attcgcagct ggagctttac cagcagcctg attaccacca cccgcagcta a 711
<210> 3
<211> 42
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 上游引物
<400> 3
ttggaattcg acgacgacga caagatggcg gaaaccgtga gc 42
<210> 4
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 下游引物
<400> 4
ttgctcgagt tagctgcggg tggtgg 26
Claims (17)
1.凝集素，其具有的氨基酸序列：
（1）如SEQ ID NO：1所示；或，
（2）是在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列上缺失、取代和/或添加一个至五个氨基酸而获得的氨基酸序列，而且其具有结合半乳糖的能力并且仍旧具有凝集胸腺细胞的能力。
2.权利要求1所述的凝集素，其具有的氨基酸序列：
（1）如SEQ ID NO：1所示；或，
（2）是在如SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列上缺失、取代和/或添加一个至三个氨基酸而获得的氨基酸序列，而且其具有结合半乳糖的能力并且仍旧具有凝集胸腺细胞的能力。
3.权利要求1所述的凝集素，其具有的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
4.编码权利要求1或2或3所述的凝集素的核酸。
5.权利要求4所述的核酸，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
6.包含权利要求4或5所述的核酸的载体。
7.权利要求6所述的载体，其是表达载体。
8.宿主细胞，其包含权利要求6所述的载体，或者其用权利要求4或5所述的核酸转化或转染。
9.权利要求8所述的宿主细胞，其是原核细胞。
10.制备权利要求1或2或3所述的凝集素的方法，其包括：
（1）在适合蛋白质表达的条件下，培养权利要求8或9所述的细胞；和，
（2）从步骤（1）获得的培养产物中分离出权利要求1或2或3所述的凝集素。
11.凝集胸腺细胞的体外方法，其包括将权利要求1或2或3所述的凝集素与胸腺细胞混合的过程。
12.结合半乳糖的体外方法，其包括将权利要求1或2或3所述的凝集素与含半乳糖的物质混合的过程。
13.权利要求1或2或3所述的凝集素在制备凝集胸腺细胞的试剂中的应用。
14.权利要求1或2或3所述的凝集素在制备结合半乳糖的试剂中的应用。
15.权利要求1或2或3所述的凝集素在制备用于诊断类风湿性关节炎的方法的试剂盒中的应用。
16.权利要求15所述的应用，其中诊断类风湿性关节炎的方法包括ELISA检测样品结合在用权利要求1或2或3所述的凝集素包被的酶标板上的免疫球蛋白的吸光值，得到值A。
17.权利要求16所述的应用，其中诊断类风湿性关节炎的方法进一步包括ELISA检测样品结合在用蘑菇凝集素包被的酶标板上的免疫球蛋白的吸光值，得到值B，计算A/B的比值。
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Citations (4)
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| CN1693463A (zh) * | 2005-04-28 | 2005-11-09 | 武汉大学 | 一种真菌半乳糖凝集素蛋白活性的多肽、其编码序列及制备方法和应用 |
| CN1982458A (zh) * | 2006-04-30 | 2007-06-20 | 中山大学 | 文昌鱼半乳糖凝集素AmphiGAL13基因及其应用 |
| CN101074951A (zh) * | 2007-06-26 | 2007-11-21 | 大连医科大学 | 一种早期诊断类风湿关节炎的免疫球蛋白g糖基化检测试剂及制备方法 |
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-
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Non-Patent Citations (1)
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|---|
| GenPept 登录号 2PEL_A;NCBI;《GenPept》;20131231;ORIGIN序列 * |
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