CN102309782A - 一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，先制备水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶胶，再制备两份水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将两份混合液装入细胞打印机的两套不同的注射器中，然后在培养皿表面打印混合液，直至形成所需三维结构的载细胞水凝胶支架，将载细胞水凝胶支架置于培养箱中培养，再将载细胞水凝胶支架在十二烷基硫酸钠浸泡使细胞完全裂解死亡后，分别用杜氏磷酸缓冲液和去离子水先后冲洗，最终获得带有复杂微通道的三维多孔水凝胶支架，本发明使用活细胞作为致孔剂，通过控制细胞的浓度和培养条件，能够控制孔的大小和密度，通过打印平台能够控制孔的分布，并能够在水凝胶支架中形成复杂可控的微通道结构。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程技术领域，具体涉及一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法。
背景技术
多孔材料在许多领域如存储、分离、催化、微电子以及生物医学与组织工程等，具有广泛的应用范围。近些年来，基于水凝胶的多孔支架材料在组织工程中得到了越来越多的重视。在水凝胶中引入微孔可以提高水凝胶支架的比表面积，有利于细胞的生长、组织的侵入和局部血管的再生，并且可以大大提高水凝胶的扩散性能。例如，研究表明在海藻酸盐水凝胶中引入孔隙可以提高内部流体流速和物质输运速度近三个数量级。
微孔的大小和形貌等对水凝胶支架的力学和扩散性能以及细胞的调控行为等有重要的影响。例如，最适合细胞植入生长，创伤愈合和血管化的的微孔的尺寸范围分别在100～400微米，20～120微米和5～15微米。与内部微孔连通的支架表面的微孔尺寸较大时有助于细胞植入和细胞的均匀分布。目前，已经有多种方法被用来制备多孔水凝胶，包括溶液浇注/粒子沥滤法、冷冻干燥法、气体发泡法、聚合物相分离法和电纺法等。但是以上这些方法难以在生物范围内调控微孔的尺寸和形貌。
为了保证多孔水凝胶中充分的物质扩散速度和更好的对微环境的调控能力，在多孔水凝胶中引入微通道网络，模拟人体血管网络的结构和功能，可以有效提高水凝胶中营养物的输送，调控细胞的力学和化学微环境。目前，构造微通道水凝胶的方法主要有模板法、生物打印技术、基于光图形化的方法和模块组装方法，已经应用于不同的水凝胶和细胞。但是，这些方法在操作性、可控性和构造三维复杂的连通的多孔微通道水凝胶的能力上仍然有待提高。
发明内容
为了克服上述现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，能够在水凝胶支架中形成复杂可控的微通道结构。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂分别按质量比0～1∶2～30∶100和0～1∶1～20∶100混合均匀配制成水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮或艳固佳2959，水凝胶单体为胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸纳或聚乙二醇及其衍生物，水凝胶溶剂为去离子水、纯水或PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶单体浓度高的水凝胶溶胶与细胞浓度为107～1011cells/mL细胞培养液按体积比20～100∶1混合均匀形成第一混合液A，将水凝胶单体浓度低的水凝胶溶胶与细胞浓度为107～1011cells/mL细胞培养液按体积比1～20∶1混合均匀形成第二混合液B，细胞培养液中的细胞为酵母菌、乳酸菌、双歧杆菌、放线菌、酪酸梭菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或粪链球菌；
第三步，分别将第一混合液A和第二混合液B装入细胞打印机的两套不同的注射器中，设定好细胞打印机的运行程序；
第四步，在培养皿表面打印一层细胞与水凝胶溶胶的混合液，其中需要微孔的地方打印第一混合液A，需要微通道的地方打印第二混合液B，因第二混合液B水凝胶单体浓度低，细胞浓度高，有助于形成连通的微通道；
第五步，改变温度、离子浓度或紫外照射，使打印的混合液发生交联形成载细胞的水凝胶；
第六步，重复第四步和第五步，直至形成所需三维结构的载细胞水凝胶支架；
第七步，将上述制备的载细胞水凝胶支架置于培养箱中培养0～15天；
第八步，将培养后的载细胞水凝胶支架在质量浓度3％～10％的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡12～24小时使细胞完全裂解死亡后，分别用杜氏磷酸缓冲液和去离子水先后冲洗2～8小时，最终获得带有复杂微通道的三维多孔水凝胶支架。
由于本发明使用活细胞作为致孔剂，细胞生长汇合并去除后能够在水凝胶中形成连通的孔或微通道，通过控制细胞的浓度和培养条件，能够控制孔的大小和密度，通过打印平台能够控制孔的分布，并能够在水凝胶支架中形成复杂可控的微通道结构。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明：
实施例1
一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将水凝胶单体和水凝胶溶剂分别按质量比2∶100和1.5∶100混合均匀配制成水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶胶，水凝胶单体为胶原，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶单体浓度高的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比100∶1混合均匀形成第一混合液A，将水凝胶单体浓度低的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比10∶1混合均匀形成第二混合液B，细胞培养液中的细胞为酵母菌；
第三步，分别将第一混合液A和第二混合液B装入细胞打印机的两套不同的注射器中，设定好细胞打印机的运行程序；
第四步，在培养皿表面打印一层细胞与水凝胶溶胶的混合液，其中需要微孔的地方打印第一混合液A，需要微通道的地方打印第二混合液B，因第二混合液B水凝胶单体浓度低，细胞浓度高，有助于形成连通的微通道；
第五步，改变温度，使打印的混合液发生交联形成载细胞的水凝胶；
第六步，重复第四步和第五步，直至形成所需三维结构的载细胞水凝胶支架；
第七步，将上述制备的载细胞水凝胶支架置于培养箱中培养7天；
第八步，将培养后的载细胞水凝胶支架在质量浓度5％的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡12小时使细胞完全裂解死亡后，分别用杜氏磷酸缓冲液和去离子水先后冲洗2小时，最终获得带有复杂微通道的三维多孔水凝胶支架。
实施例2
一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂分别按质量比0.5∶30∶100和0.5∶15∶100混合均匀配制成水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮，水凝胶单体为分子量为3400的聚乙二醇二丙烯酸酯，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶单体浓度高的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比30∶1混合均匀形成第一混合液A，将水凝胶单体浓度低的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比5∶1混合均匀形成第二混合液B，细胞培养液中的细胞为乳酸菌；
第三步，分别将第一混合液A和第二混合液B装入细胞打印机的两套不同的注射器中，设定好细胞打印机的运行程序；
第四步，在培养皿表面打印一层细胞与水凝胶溶胶的混合液，其中需要微孔的地方打印第一混合液A，需要微通道的地方打印第二混合液B，因第二混合液B水凝胶单体浓度低，细胞浓度高，有助于形成连通的微通道；
第五步，紫外照射，使打印的混合液发生交联形成载细胞的水凝胶；
第六步，重复第四步和第五步，直至形成所需的三维结构的载细胞水凝胶支架；
第七步，将上述制备的载细胞水凝胶支架置于培养箱中培养10天；
第八步，将培养后的载细胞水凝胶支架在质量浓度3％的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡24小时使细胞完全裂解死亡后，分别用杜氏磷酸缓冲液和去离子水先后冲洗4小时，最终获得带有复杂微通道的三维多孔水凝胶支架。
实施例3
一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂分别按质量比0.5∶2∶100和0.5∶1∶100混合均匀配制成水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶胶，光引发剂为艳固佳2959，水凝胶单体为透明质酸，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶单体浓度高的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比50∶1混合均匀形成第一混合液A，将水凝胶单体浓度低的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比20∶1混合均匀形成第二混合液B，细胞培养液中的细胞为双歧杆菌；
第三步，分别将第一混合液A和第二混合液B装入细胞打印机的两套不同的注射器中，设定好细胞打印机的运行程序；
第四步，在培养皿表面打印一层细胞与水凝胶溶胶的混合液，其中需要微孔的地方打印第一混合液A，需要微通道的地方打印第二混合液B，因第二混合液B水凝胶单体浓度低，细胞浓度高，有助于形成连通的微通道；
第五步，紫外照射，使打印的混合液发生交联形成载细胞的水凝胶；
第六步，重复第四步和第五步，直至形成所需三维结构的载细胞水凝胶支架；
第七步，将上述制备的载细胞水凝胶支架置于培养箱中培养14天；
第八步，将培养后的载细胞水凝胶支架在质量浓度5％的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡12小时使细胞完全裂解死亡后，分别用杜氏磷酸缓冲液和去离子水先后冲洗2小时，最终获得带有复杂微通道的三维多孔水凝胶支架。
Claims (4)
1.一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂分别按质量比0～1∶2～30∶100和0～1∶1～20∶100混合均匀配制成水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮或艳固佳2959，水凝胶单体为胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸纳或聚乙二醇及其衍生物，水凝胶溶剂为去离子水、纯水或PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶单体浓度高的水凝胶溶胶与细胞浓度为107～1011cells/mL细胞培养液按体积比20～100∶1混合均匀形成第一混合液A，将水凝胶单体浓度低的水凝胶溶胶与细胞浓度为107～1011cells/mL细胞培养液按体积比1～20∶1混合均匀形成第二混合液B，细胞培养液中的细胞为酵母菌、乳酸菌、双歧杆菌、放线菌、酪酸梭菌、蜡样芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌或粪链球菌；
第三步，分别将第一混合液A和第二混合液B装入细胞打印机的两套不同的注射器中，设定好细胞打印机的运行程序；
第四步，在培养皿表面打印一层细胞与水凝胶溶胶的混合液，其中需要微孔的地方打印第一混合液A，需要微通道的地方打印第二混合液B，因第二混合液B水凝胶单体浓度低，细胞浓度高，有助于形成连通的微通道；
第五步，改变温度、离子浓度或紫外照射，使打印的混合液发生交联形成载细胞的水凝胶；
第六步，重复第四步和第五步，直至形成所需三维结构的载细胞水凝胶支架；
第七步，将上述制备的载细胞水凝胶支架置于培养箱中培养0～15天；
第八步，将培养后的载细胞水凝胶支架在质量浓度3％～10％的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡12～24小时使细胞完全裂解死亡后，分别用杜氏磷酸缓冲液和去离子水先后冲洗2～8小时，最终获得带有复杂微通道的三维多孔水凝胶支架。
2.根据权利要求1所述的一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将水凝胶单体和水凝胶溶剂分别按质量比2∶100和1.5∶100混合均匀配制成水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶胶，水凝胶单体为胶原，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶单体浓度高的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比100∶1混合均匀形成第一混合液A，将水凝胶单体浓度低的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比10∶1混合均匀形成第二混合液B，细胞培养液中的细胞为酵母菌；
第三步，分别将第一混合液A和第二混合液B装入细胞打印机的两套不同的注射器中，设定好细胞打印机的运行程序；
第四步，在培养皿表面打印一层细胞与水凝胶溶胶的混合液，其中需要微孔的地方打印第一混合液A，需要微通道的地方打印第二混合液B，因第二混合液B水凝胶单体浓度低，细胞浓度高，有助于形成连通的微通道；
第五步，改变温度，使打印的混合液发生交联形成载细胞的水凝胶；
第六步，重复第四步和第五步，直至形成所需三维结构的载细胞水凝胶支架；
第七步，将上述制备的载细胞水凝胶支架置于培养箱中培养7天；
第八步，将培养后的载细胞水凝胶支架在质量浓度5％的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡12小时使细胞完全裂解死亡后，分别用杜氏磷酸缓冲液和去离子水先后冲洗2小时，最终获得带有复杂微通道的三维多孔水凝胶支架。
3.根据权利要求1所述的一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂分别按质量比0.5∶30∶100和0.5∶15∶100混合均匀配制成水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮，水凝胶单体为分子量为3400的聚乙二醇二丙烯酸酯，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶单体浓度高的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比30∶1混合均匀形成第一混合液A，将水凝胶单体浓度低的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比5∶1混合均匀形成第二混合液B，细胞培养液中的细胞为乳酸菌；
第三步，分别将第一混合液A和第二混合液B装入细胞打印机的两套不同的注射器中，设定好细胞打印机的运行程序；
第四步，在培养皿表面打印一层细胞与水凝胶溶胶的混合液，其中需要微孔的地方打印第一混合液A，需要微通道的地方打印第二混合液B，因第二混合液B水凝胶单体浓度低，细胞浓度高，有助于形成连通的微通道；
第五步，紫外照射，使打印的混合液发生交联形成载细胞的水凝胶；
第六步，重复第四步和第五步，直至形成所需的三维结构的载细胞水凝胶支架；
第七步，将上述制备的载细胞水凝胶支架置于培养箱中培养10天；
第八步，将培养后的载细胞水凝胶支架在质量浓度3％的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡24小时使细胞完全裂解死亡后，分别用杜氏磷酸缓冲液和去离子水先后冲洗4小时，最终获得带有复杂微通道的三维多孔水凝胶支架。
4.根据权利要求1所述的一种基于活细胞的复杂三维微通道多孔支架的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂分别按质量比0.5∶2∶100和0.5∶1∶100混合均匀配制成水凝胶单体浓度不同的两份水凝胶溶胶，光引发剂为艳固佳2959，水凝胶单体为透明质酸，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐(PBS)缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶单体浓度高的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比50∶1混合均匀形成第一混合液A，将水凝胶单体浓度低的水凝胶溶胶与细胞浓度为1010cells/mL细胞培养液按体积比20∶1混合均匀形成第二混合液B，细胞培养液中的细胞为双歧杆菌；
第三步，分别将第一混合液A和第二混合液B装入细胞打印机的两套不同的注射器中，设定好细胞打印机的运行程序；
第四步，在培养皿表面打印一层细胞与水凝胶溶胶的混合液，其中需要微孔的地方打印第一混合液A，需要微通道的地方打印第二混合液B，因第二混合液B水凝胶单体浓度低，细胞浓度高，有助于形成连通的微通道；
第五步，紫外照射，使打印的混合液发生交联形成载细胞的水凝胶；
第六步，重复第四步和第五步，直至形成所需三维结构的载细胞水凝胶支架；
第七步，将上述制备的载细胞水凝胶支架置于培养箱中培养14天；
第八步，将培养后的载细胞水凝胶支架在质量浓度5％的十二烷基硫酸钠溶液中浸泡12小时使细胞完全裂解死亡后，分别用杜氏磷酸缓冲液和去离子水先后冲洗2小时，最终获得带有复杂微通道的三维多孔水凝胶支架。
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