CN102266589B - 一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法 - Google Patents
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Abstract
一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法，先制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合溶液，将溶胶-细胞混合液倒入中间插有毛细管或纤维的聚甲基丙烯酸甲酯模具中，使之发生一次交联，将毛细管或纤维抽出，在载细胞水凝胶的微通道中通入水凝胶溶胶，重新插入毛细管或纤维，或将微通道中多余的水凝胶溶胶吸出，紫外照射使之发生二次交联在微通道壁面区域形成带有水凝胶密层的载细胞水凝胶，再次将毛细管或纤维抽出，在载细胞水凝胶的微通道中通入内皮细胞培养液，培养使内皮细胞生长铺展后形成内皮化的微通道，本发明中水凝胶密层的引入可以维持水凝胶中微通道的稳定性，同时可以防止内皮细胞脱落和侵入，还可以对微通道中的培养液进行过滤和筛选。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学工程领域，具体涉及一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法。
背景技术
水凝胶是近些年来组织工程中应用最为广泛的一种生物材料。它由三维交联聚合物网络包含大量的水构成，具有特殊的“软”、“湿”环境，与生物体细胞外基质相似。基于水凝胶的组织工程技术已经被成功的用来构建一些较为简单的组织结构如皮肤、膀胱和软骨等。但是，在构建具有高细胞浓度、细胞代谢活动旺盛的三维复杂组织/器官如心脏、肝脏、肾脏时，从表面扩散到组织内的营养物会很快被细胞耗尽，单纯依靠营养物从表面扩散很难保证水凝胶内部的细胞获得充足的营养物以及排出代谢产物。营养物的缺乏和代谢产物的积累均会影响细胞的正常代谢活动以及组织工程化组织的生理功能，如何加强营养物供应已成为组织工程中亟待解决的问题之一。
近些年的研究表明，通过在水凝胶中引入微通道网络，可以有效的提高水凝胶中营养物的输送能力和调控细胞的化学微环境，模拟人体微血管的功能。目前，一些生物微制造技术，如模板法、生物打印技术、基于光图形化的方法和模块组装法等，已经被用来在不同的载细胞水凝胶中构造微通道，通过在微通道中种内皮细胞可以形成内皮化通道。但是，受水凝胶力学性能及细胞生长的影响，载细胞水凝胶中的微通道在结构上通常并不稳定，容易堵塞、裂开或坍塌，内皮细胞容易脱落；另外，粘附在微通道表面的内皮细胞和微通道中的大分子异物有可能侵入水凝胶内部，影响细胞的正常生长和功能表达。
发明内容
为了克服上述现有现有技术的缺点，本发明的目的在于提供一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法，通过该方法制备的载细胞微通道水凝胶中微通道结构稳定，内皮细胞不容易脱落和侵入，在水凝胶交联过程中能够包裹细胞，微通道形成后注入内皮细胞培养液以形成内皮化的微通道。
为了达到上述目的，本发明采取的技术方案为：
一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按质量比0～1：3～30：100混合均匀配制成水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮或艳佳固2959，水凝胶单体为琼脂糖、胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸纳或聚乙二醇及其衍生物与透明质酸或聚乙二醇及其衍生物的混合物，混合物的质量比为1：0～20，水凝胶溶剂为去离子水、纯水或PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶溶胶与细胞浓度为105～107cells/mL的细胞培养液按体积比1～4：1混合均匀，细胞培养液中的细胞为软骨细胞、造骨细胞、骨髓基质细胞、肝细胞、成纤维细胞、心肌细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或神经前体细胞；
第三步，将第二步中制备的水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）模具中，模具中间插入一根外径为0.1～1mm的毛细管或纤维；
第四步，改变温度、离子浓度或紫外照射，使模具中的混合液发生一次交联形成载细胞的水凝胶；
第五步，将毛细管或纤维抽出，在载细胞的水凝胶中形成微通道，给微通道里注入由光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按照质量比为0.1～1：2～30：100制成的水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮或艳佳固2959，水凝胶单体为透明质酸或聚乙二醇及其衍生物，水凝胶溶剂为去离子水、纯水或PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第六步，等待0～10min后，重新插入毛细管或纤维，紫外照射使之发生二次交联在微通道壁面区域形成带有水凝胶密层的载细胞水凝胶，再次将毛细管或纤维抽出；
第七步，在发生二次交联形成的载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为105～107cells/mL的内皮细胞培养液0.1～1mL，培养使内皮细胞生长铺展以形成内皮化的微通道。
由于本发明中水凝胶密层力学性能好，能够维持微通道的稳定性，微通道不容易堵塞、裂开或坍塌；经过化学修饰的水凝胶密层有助于内皮细胞粘附，防止内皮细胞脱落和侵入；另外，通过调控水凝胶密层的结构，还可以对微通道中的培养液进行过滤和筛选。
具体实施方式
下面结合具体实施实例对本发明进行详细说明：
实施例1
一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按质量比1：20：100混合均匀配制成水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮，水凝胶单体为琼脂糖与聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEG-DMA)的混合物，混合物的质量比为1：4，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶溶胶与细胞浓度为3×106cells/mL的细胞培养液按体积比1：1在40℃混合均匀，细胞培养液中的细胞为成纤维细胞；
第三步，将第二步中制备的水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）模具中，模具中间插入一根外径为0.5mm的不锈钢毛细管；
第四步，改变温度，使模具中的混合液发生一次交联形成载细胞的水凝胶；
第五步，将不锈钢毛细管抽出，在载细胞的水凝胶中形成微通道，给微通道里注入由光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按照质量比为0.5：20：100制成的水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮，水凝胶单体为聚乙二醇衍生物，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第六步，等待1min后，重新插入不锈钢毛细管，紫外照射使之发生二次交联在微通道壁面区域形成带有水凝胶密层的载细胞水凝胶，再次将不锈钢毛细管抽出；
第七步，在发生二次交联形成的载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为2×106cells/ml的内皮细胞培养液0.7mL，培养使内皮细胞生长铺展以形成内皮化的微通道。
实施例2
一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按质量比0.2：4：100混合均匀配置成水凝胶溶胶，光引发剂为艳佳固2959，水凝胶单体为琼脂糖与透明质酸的混合物，混合物的质量比为1：1，水凝胶溶剂是PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶溶胶与细胞浓度为3×106cells/mL的细胞培养液按体积比1：1在40℃混合均匀，细胞培养液中的细胞为平滑肌细胞；
第三步，将第二步中制备的水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）模具中，模具中间插入一根外径为0.2mm的不锈钢毛细管；
第四步，改变温度，使模具中的混合液发生一次交联形成载细胞的水凝胶；
第五步，将不锈钢毛细管抽出，在载细胞的水凝胶中形成微通道，给微通道里注入由光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按照质量比为0.1：2：100制成的水凝胶溶胶，光引发剂为艳佳固2959，水凝胶单体为透明质酸，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第六步，等待2min后，重新插入不锈钢毛细管，紫外照射使之发生二次交联在微通道壁面区域形成带有水凝胶密层的载细胞水凝胶，再次将不锈钢毛细管抽出；
第七步，在发生二次交联形成的载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为2×106cells/ml的内皮细胞培养液0.1mL，培养使内皮细胞生长铺展以形成内皮化的微通道。
实施例3
一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按质量比1：30：100混合均匀配置成水凝胶溶胶，光引发剂为艳佳固2959，水凝胶单体为聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA），水凝胶溶剂是PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶溶胶与细胞浓度为3×106cells/mL的细胞培养液按体积比1：1在40℃混合均匀，细胞培养液中的细胞为软骨细胞；
第三步，将第二步中制备的水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）模具中，模具中间插入一根外径为0.4mm的不锈钢毛细管；
第四步，紫外照射，使模具中的混合液发生一次交联形成载细胞的水凝胶；
第五步，将不锈钢毛细管抽出，在载细胞的水凝胶中形成微通道，给微通道里注由入光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按照质量比为1：30：100制成的水凝胶溶胶，光引发剂为艳佳固2959，水凝胶单体为聚乙二醇衍生物，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第六步，等待3min后，重新插入毛细管或纤维，紫外照射使之发生二次交联在微通道壁面区域形成带有水凝胶密层的载细胞微通道水凝胶，再次将毛细管或纤维抽出；
第七步，在发生二次交联形成的载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为2×106cells/ml的内皮细胞培养液0.4mL，培养使内皮细胞生长铺展以形成内皮化的微通道。
Claims (4)
1.一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按质量比0～1：3～30：100混合均匀配制成水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮或艳佳固2959，水凝胶单体为琼脂糖、胶原、明胶、透明质酸、壳聚糖、海藻酸纳或聚乙二醇及其衍生物与透明质酸或聚乙二醇及其衍生物的混合物，混合物的质量比为1：0～20，水凝胶溶剂为去离子水、纯水或PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶溶胶与细胞浓度为105～107cells/mL的细胞培养液按体积比1～4：1混合均匀，细胞培养液中的细胞为软骨细胞、造骨细胞、骨髓基质细胞、肝细胞、成纤维细胞、心肌细胞、间充质干细胞、脂肪干细胞或神经前体细胞；
第三步，将第二步中制备的水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）模具中，模具中间插入一根外径为0.1～1mm的毛细管或纤维；
第四步，改变温度、离子浓度或紫外照射，使模具中的混合液发生一次交联形成载细胞的水凝胶；
第五步，将毛细管或纤维抽出，在载细胞的水凝胶中形成微通道，给微通道里注入由光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按照质量比为0.1～1：2～30：100制成的水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮或艳佳固2959，水凝胶单体为透明质酸或聚乙二醇及其衍生物，水凝胶溶剂为去离子水、纯水或PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第六步，等待0～10min后，重新插入毛细管或纤维，紫外照射使之发生二次交联在微通道壁面区域形成带有水凝胶密层的载细胞水凝胶，再次将毛细管或纤维抽出；
第七步，在发生二次交联形成的载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为105～107cells/mL的内皮细胞培养液0.1～1mL，培养使内皮细胞生长铺展以形成内皮化的微通道。
2.根据权利要求1所述的一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按质量比1：20：100混合均匀配制成水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮，水凝胶单体为琼脂糖与聚乙二醇二甲基丙烯酸酯(PEG-DMA)的混合物，混合物的质量比为1：4，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶溶胶与细胞浓度为3×106cells/mL的细胞培养液按体积比1：1在40℃混合均匀，细胞培养液中的细胞为成纤维细胞；
第三步，将第二步中制备的水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）模具中，模具中间插入一根外径为0.5mm的不锈钢毛细管；
第四步，改变温度，使模具中的混合液发生一次交联形成载细胞的水凝胶；
第五步，将不锈钢毛细管抽出，在载细胞的水凝胶中形成微通道，给微通道里注入由光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按照质量比为0.5：20：100制成的水凝胶溶胶，光引发剂为2-羟基-2-甲基苯丙酮，水凝胶单体为聚乙二醇衍生物，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第六步，等待1min后，重新插入不锈钢毛细管，紫外照射使之发生二次交联在微通道壁面区域形成带有水凝胶密层的载细胞水凝胶，再次将不锈钢毛细管抽出；
第七步，在发生二次交联形成的载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为2×106cells/ml的内皮细胞培养液0.7mL，培养使内皮细胞生长铺展以形成内皮化的微通道。
3.根据权利要求1所述的一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按质量比0.2：4：100混合均匀配置成水凝胶溶胶，光引发剂为艳佳固2959，水凝胶单体为琼脂糖与透明质酸的混合物，混合物的质量比为1：1，水凝胶溶剂是PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶溶胶与细胞浓度为3×106cells/mL的细胞培养液按体积比1：1在40℃混合均匀，细胞培养液中的细胞为平滑肌细胞；
第三步，将第二步中制备的水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）模具中，模具中间插入一根外径为0.2mm的不锈钢毛细管；
第四步，改变温度，使模具中的混合液发生一次交联形成载细胞的水凝胶；
第五步，将不锈钢毛细管抽出，在载细胞的水凝胶中形成微通道，给微通道里注入由光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按照质量比为0.1：2：100制成的水凝胶溶胶，光引发剂为艳佳固2959，水凝胶单体为透明质酸，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第六步，等待2min后，重新插入不锈钢毛细管，紫外照射使之发生二次交联在微通道壁面区域形成带有水凝胶密层的载细胞水凝胶，再次将不锈钢毛细管抽出；
第七步，在发生二次交联形成的载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为2×106cells/ml的内皮细胞培养液0.1mL，培养使内皮细胞生长铺展以形成内皮化的微通道。
4.根据权利要求1所述的一种力学增强型载细胞微通道水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
第一步，制备水凝胶溶胶，将光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按质量比1：30：100混合均匀配置成水凝胶溶胶，光引发剂为艳佳固2959，水凝胶单体为聚乙二醇二丙烯酸酯（PEG-DA），水凝胶溶剂是PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第二步，制备水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液，将第一步中制备的水凝胶溶胶与细胞浓度为3×106cells/mL的细胞培养液按体积比1：1在40℃混合均匀，细胞培养液中的细胞为软骨细胞；
第三步，将第二步中制备的水凝胶溶胶与细胞培养液的混合液倒入聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）模具中，模具中间插入一根外径为0.4mm的不锈钢毛细管；
第四步，紫外照射，使模具中的混合液发生一次交联形成载细胞的水凝胶；
第五步，将不锈钢毛细管抽出，在载细胞的水凝胶中形成微通道，给微通道里注由入光引发剂、水凝胶单体和水凝胶溶剂按照质量比为1：30：100制成的水凝胶溶胶，光引发剂为艳佳固2959，水凝胶单体为聚乙二醇衍生物，水凝胶溶剂为PH值为5.7～8.0的磷酸盐（PBS）缓冲溶液；
第六步，等待3min后，重新插入毛细管或纤维，紫外照射使之发生二次交联在微通道壁面区域形成带有水凝胶密层的载细胞微通道水凝胶，再次将毛细管或纤维抽出；
第七步，在发生二次交联形成的载细胞水凝胶的微通道中注入细胞浓度为2×106cells/ml的内皮细胞培养液0.4mL，培养使内皮细胞生长铺展以形成内皮化的微通道。
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