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CN113290844B - 一种构建复杂异质组织/器官的多级悬浮打印方法 - Google Patents

一种构建复杂异质组织/器官的多级悬浮打印方法 Download PDF

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CN113290844B CN202110526251.3A CN202110526251A CN113290844B CN 113290844 B CN113290844 B CN 113290844B CN 202110526251 A CN202110526251 A CN 202110526251A CN 113290844 B CN113290844 B CN 113290844B
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Abstract

本发明公开了一种构建复杂异质组织/器官的多级悬浮打印方法。所述方法包括如下步骤：S1、制备生物墨水，生物墨水由已交联的载细胞的凝胶微球形成，或由已交联的载细胞的凝胶微球与一种或多种未交联的凝胶材料混合得到；S2、在悬浮介质中，打印生物墨水以构建特定的组织/器官结构；S3、在S2得到的组织/器官结构内部，进一步进行二级或多级的子结构打印；S4、打印结束后，经整体交联后溶出悬浮介质即得。本发明多级悬浮3D打印方法基于兼具剪切变稀和自愈合特性的凝胶微球墨水，可在悬浮介质中打印成形，其后又可用作下一级结构打印的悬浮介质，适合于构建出具有血管通道和异质细胞结构的组织器官模型，有利于推动工程化组织/器官在再生修复治疗方面的临床应用。

Description

一种构建复杂异质组织/器官的多级悬浮打印方法
技术领域
本发明涉及一种构建复杂异质组织/器官的多级悬浮打印方法，属于组织工程和生物制造技术领域。
背景技术
组织工程与再生医学作为一门新兴交叉学科，旨在体外构建具有仿生结构与功能的人工组织与器官，在组织器官再生修复、药物开发与筛选、病理模型构建等方面具有广阔的应用前景。目前，以膀胱、皮肤、软骨和血管为代表的组织工程产品已经得到初步应用，然而，对于心脏和肝脏等复杂异质组织/器官的体外构建仍进展缓慢。
传统的组织工程方法主要采用自上而下策略，以细胞-支架复合技术为代表，即通过细胞和多孔支架的复合直接构建出结构体，再通过细胞组装、细胞外基质重构来诱导结构体的功能成熟；然而，这种策略面临着细胞分布不均匀、种植效率低和异质细胞种植困难等挑战，难以构建复杂异质组织与器官。近年来，随着生物制造技术的迅猛发展，自下而上的组织器官构建策略正逐渐成为主流。该策略以生物3D打印技术为代表，通过将含细胞的生物墨水按照预定义路径，逐层堆积形成具有复杂结构的组织与器官。其中，微挤出式打印方法由于材料适用范围广，成为目前主流的3D打印工艺。然而，由于水凝胶的力学性能较差，难以直接打印空壳、悬梁、卷曲等非自支撑式结构，从而限制了其在复杂组织器官构建上的应用。
一种思路为水凝胶增强策略，即引入高强度的合成聚合物结构，为载细胞的生物墨水的打印提供必要的支撑，以韩国Kang课题组的工作为代表(Kang,H.et al.A 3Dbioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structuralintegrity.Nature Biotechnology,2016,34,312-319.)。他们开发了复合细胞挤出式打印和熔融沉积成型技术的多喷头打印设备，成功打印出下颌骨、耳软骨和颅骨等组织。尽管这种水凝胶增强策略能够为水凝胶提供结构支持，同时能够精确控制细胞沉积，然而，聚合物相对较低的打印精度(≈200μm)极大地限制了组织成熟的空间，同时较硬的聚合物材料并不适合于心脏等软组织的构建。
另一种思路为悬浮打印策略，即依靠悬浮介质为打印结构提供支撑，从而可实现高度复杂结构的成形(McCormack,A.,Highley,C.B.,Leslie,N.R.&Melchels,F.P.W.3Dprinting in suspension baths:keeping the promises of bioprintingafloat.Trends in Biotechnology,2020,38,584-593)。另外，悬浮打印可以使用如胶原、纤维蛋白等细胞外基质材料的低粘度生物墨水，为组织器官的功能成熟提供了更适宜的微环境。如2019年以色列Tal Dvir课题组基于悬浮打印策略，采用脱细胞外基质制备的生物墨水打印了含血管结构的心脏模型(Noor,N.,et al.,3D Printing of personalizedthick and perfusable cardiac patches and hearts.Advanced Science,2019.6(11):p.190034.)；虽然该研究实现了多种墨水的悬浮打印，然而，难以构建精度在百微米以下的结构特征(如微血管和神经)，限制了其在复杂组织器官的仿生构建方面的应用。
综上，生物3D打印技术在组织/器官构建方面具有巨大的优势，然而，体外构建具有复杂血管通道和异质细胞结构的组织/器官仍然是再生医学领域的关键挑战，极大地限制了其在转化医学领域的应用。
发明内容
本发明的目的是提供一种新的多级悬浮3D打印方法，利用载细胞的凝胶微球墨水的剪切变稀和自愈合的特性，其可在悬浮介质中打印成形，同时又可作为下一级打印的悬浮介质，为复杂异质组织/器官构建提供了新的技术手段，该方法具有重要的医学转化和临床应用前景。
本发明所提供的构建具有复杂血管通道和/或异质细胞结构的组织/器官模型的多级悬浮3D打印方法，包括如下步骤：
S1、制备生物墨水，所述生物墨水由已交联的载细胞的凝胶微球形成，或由已交联的载细胞的凝胶微球与一种或多种未交联的凝胶材料混合得到；
当包括两种材料时，所述载细胞的凝胶微球作为分散相，所述凝胶材料作为连续相；
S2、在悬浮介质中，打印所述生物墨水以构建特定的组织/器官结构；
S3、在步骤S2得到的所述组织/器官结构的内部，进一步进行二级或多级的子结构打印；
S4、打印结束后，经整体交联后溶出所述悬浮介质，即得到具有复杂血管通道和异质细胞结构的组织/器官模型。
上述的方法步骤S1中，按照下述方法制备所述载细胞的凝胶微球：
悬滴法培养、超低附着性培养板、磁力悬浮培养、动态旋转培养和微流控技术中至少一种；
所述细胞可为多能干细胞、诱导多能干细胞、各种组织实质细胞、血管生成细胞、基质细胞和肿瘤细胞中至少一种；
所述凝胶微球内细胞密度为106/mL～108/mL，具体可为1×106/mL～1×107/mL、1×107/mL、2×106/mL或5×106/mL；
所述载细胞的凝胶微球内凝胶材料的质量-体积浓度可为10～100mg/mL，如20～50mg/mL。
上述方法中的步骤S1中，所述载细胞的凝胶微球采用的凝胶、所述凝胶材料均可为天然高分子水凝胶和/或合成高分子水凝胶；
所述天然高分子水凝胶材料可为海藻酸钠、明胶、胶原、Matrigel、壳聚糖、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、硫酸软骨素、白蛋白以及它们的甲基丙烯酰化产物(如甲基丙烯酰化明胶(GelMA)、甲基丙烯酰化海藻酸钠(AlgMA)等)中的至少一种；
所述合成高分子水凝胶材料可为聚乙二醇(PEG)、聚丙烯醇(PVA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、聚环氧乙烷(PEO)、聚丙烯酰胺(PAM)、聚丙烯酸(PAA)、聚磷腈(PAMPS)、聚N-异丙基丙烯酰胺类水凝胶(PNIPAAm)以及它们的甲基丙烯酰化产物(如凹臂聚乙二醇丙烯酸酯(4-arm-PEG-AC)、甲基丙烯酰化聚乙烯醇(PVAMA)等)中的至少一种；
所述载细胞的凝胶微球的尺寸(直径)为50μm～1000μm，如100μm～150μm、400μm～450μm或450μm～500μm，在所述生物墨水中的体积含量可为40％～100％，当为100％时即仅由所述载细胞的凝胶微球形成所述3D打印生物墨水。
上述的方法步骤S1中，作为所述连续相的所述凝胶材料的质量-体积浓度可为1～100mg/mL，如4～25mg/mL；
作为所述连续相的所述凝胶材料可载有细胞；
所述凝胶材料内细胞密度可为106/mL～5×107/mL，如1×107/mL～5×107/mL。
上述方法中的步骤S2中，所述悬浮介质可为具有自愈合特性的水凝胶材料，具体可为超分子自愈合水凝胶和/或微凝胶结构；
所述超分子自愈合水凝胶可为环糊精基超分子水凝胶、DNA超分子水凝胶、聚氨酯脲超分子水凝胶、透明质酸-葡聚糖超分子水凝胶、丹参酮II-A多肽超分子水凝胶和石墨烯复合超分子水凝胶中至少一种；
所述微凝胶结构的尺寸为1μm～50μm；
所述微凝胶结构为卡波姆(英文名：Carbomer)、明胶和海藻酸钠中至少一种。
具体地，所述卡波姆为以季戊四醇等与丙烯酸交联得到的丙烯酸交联树脂，溶剂为去离子水、PBS缓冲液和细胞培养基中至少一种；
所述明胶和所述海藻酸钠可以采用高速搅拌工艺制备，转速为1000～10,000转每分钟；
所述明胶还可以通过明胶-阿拉伯胶的复合凝聚反应制备，具体步骤可为：将3～5克A型明胶、0.2～0.5克的阿拉伯胶和0.5～1.0克的普朗尼克F127依次加入到200毫升的水和酒精(体积比例在1:2～2:1范围)混合体系中，在50℃～60℃下搅拌溶解，并用1M盐酸滴定调节溶液pH为6.2～6.7，然后冷却降至室温，得到10μm～50μm明胶微球。
上述的方法步骤S2中，所述组织/器官结构包括心脏、肝脏、肾脏、胰腺和脑结构中至少一种；
所述组织/器官结构的尺寸为500μm～100mm。
上述方法中的步骤S3中，按照下述1)和/或2)的方式打印所述子结构：
1)采用载其他细胞的所述生物墨水打印特定的生理或病理结构；
2)打印载血管生成细胞的牺牲墨水来构建复杂血管通道，直径为100μm～5mm；
根据目标组织/器官模型的具体结构，确定打印级数，如构建血管化心肌腔室时，进行二级打印，即按照上述2)的方式打印二级子结构；构建脑胶质瘤模型时，进行三级打印，即按照上述1)和2)的方式依次打印二级和三级的子结构。
上述方法中的步骤4)中，所述整体交联的方法可为光、温度交联、离子交联、酶交联和共价交联方式中至少一种；
去除所述悬浮介质的方法可为温度变化、摇晃、水洗、酶溶解等方式中至少一种。
上述的方法中，采用2)的方式打印所述子结构时，步骤S4还包括去除所述牺牲墨水的步骤；
去除所述牺牲墨水的方式可为温度变化、pH变化和离子作用中至少一种。
当所述悬浮介质或所述牺牲墨水为温敏性凝胶材料时，包括明胶、普兰尼克(Pluronic-F127)明胶时，可以采用如下方法去除：利用其“凝胶-溶胶”转变的温敏特性，置于凝胶温度点溶出。
本发明提供的多级悬浮3D打印方法，基于兼具剪切变稀和自愈合特性的凝胶微球墨水，可在悬浮介质中打印成形，其后又可用作下一级结构打印的悬浮介质，适合于构建出具有血管通道和异质细胞结构的组织器官模型，可用于病损组织器官修复、药物开发与筛选和病理研究模型等，为复杂功能性组织和器官的构建提供了新的技术手段，同时也为未来的全器官打印打下基础，有利于推动工程化组织/器官在再生修复治疗方面的临床应用。
附图说明
图1为本发明采用的载细胞的凝胶微球墨水的示意图，图中，1为载细胞的凝胶微球，2为微球内细胞，3为凝胶微球周围的连续相凝胶材料。
图2为本发明实施例1制备的载心肌细胞的凝胶微球墨水的表征，图中，图2a为采用T型微流控装置得到的凝胶微球的图片，图2b为载心肌细胞的凝胶微球的活死染色结果(绿色为活细胞，红色为死细胞)，图2c为采用凝胶微球墨水打印的网格结构，图2d为图2c中的局部放大图。
图3为本发明实施例1制备的载细胞的凝胶微球墨水的流变学性能表征，图中，图3a为粘度随剪切速率的变化曲线，图3b为在交替高低应变下的储能模量变化曲线。
图4为本发明实施例1体外构建仿生血管化心肌腔室的流程图，图中，4表示心肌腔室结构，5表示血管化通道。
图5为本发明实施例2体外构建仿生脑胶质瘤模型的流程图，图中，6表示神经组织，7表示脑胶质瘤结构，8表示血管化通道。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、仿生血管化心肌腔室的体外构建
1、制备生物墨水(载心肌细胞)
采用人源诱导多能干细胞体外培养、并诱导分化获得多能干细胞来源的心肌细胞和血管内皮细胞，采用可光交联的甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)作为微球载体材料。
采用T型微流控装置，将含心肌细胞密度为1×107/mL的7.5wt％GelMA溶液通入T型微流控装置的分散相入口，流速为0.5mL/h，将含10％司盘80(span 80，表面活性剂)的矿物油通入T型微流控装置的连续相入口，流速为6.0mL/h，在芯片出口处进行光照交联，得到直径为400μm～450μm的凝胶微球(图2a)。通过活死染色，可以发现本实施例制备的GelMA凝胶微球内心肌细胞存活率达到90％以上(图2b)。
在4℃下将载心肌细胞的凝胶微球，依次通过清洗、过滤、离心等步骤去除凝胶微球中的矿物油，按1：1的体积比混合I型鼠尾胶原和Matrigel溶液得到凝胶微球墨水，结构示意图如图1所示，其中，凝胶微球墨水中凝胶微球的体积含量为50％，凝胶微球内细胞密度为1×107/mL，作为连续相的胶原和Matrigel凝胶材料的质量-体积浓度为5mg/mL。
实验表明这些GelMA凝胶微球墨水具有良好的打印性能，可以打印成复杂的网格结构(图2c)，出丝均匀稳定(图2d)。
通过流变学测试，可以发现本实施例制备的GelMA凝胶微球墨水除了表现出剪切变稀(图3a)，还具有自愈合的特性(图3b)。其中，自愈合特性是常规GelMA凝胶生物墨水所不具备的。需要说明的是，已有研究通常能实现的GelMA打印最低浓度一般为75mg/mL，本发明提供的基于凝胶微球的3D打印生物墨水，能够实现浓度在50mg/mL及更低浓度，可以满足特殊细胞对超软基质环境的要求。
2、体外构建血管化心肌腔室
制备流程图如图4所示。
通过对人体心脏影像进行三维重构，得到心室和血管的拓扑结构，等比缩小使心室外径尺寸至10mm左右。通过复合凝聚反应制备出温敏性明胶颗粒作为悬浮介质，颗粒尺寸在20μm～25μm。在明胶悬浮介质中采用步骤1制备的载心肌细胞的凝胶微球打印心肌腔室结构，打印温度为22℃，打印速度为2mm/s，挤出速度为0.5mm3/s；随后，将打印后的腔室结构作为新的悬浮介质，采用浓度为5wt％的明胶溶液作为牺牲墨水，在其中打印心肌腔室的血管网络结构，打印温度为20℃，打印速度为1mm/s，挤出速度为0.2mm3/s；打印完成后放入培养箱(37℃和5％CO2)中孵育30min，使得整个打印结构进行整体的温度交联，同时溶出明胶悬浮介质和牺牲墨水，从而构建含有中空通道的心肌腔室(心室外径～10mm，壁厚～1.5mm)；最后，通过灌注种植的方式在通道内种植内皮细胞，形成血管化的通道。进一步，体外通过对心肌腔室的血管通道进行持续的培养液灌流，为心肌细胞提供必要的氧和营养，培养1周后，心肌腔室出现整体的跳动，从而获得大尺度、功能成熟的血管化心肌腔室，尺寸为10mm。
实施例2、仿生脑胶质瘤模型的体外构建
1、制备生物墨水(载神经细胞)
采用患者来源的胶质瘤细胞进行体外培养、扩增，同时将人源诱导多能干细胞诱导分化为神经细胞和内皮细胞，采用同轴聚焦型微流控装置。将神经细胞悬液、质量分数为10.0％的透明质酸溶液与体积分数为40％的Matrigel溶液(购买自BD公司)按1:2:1的比例均匀混合，最终的神经细胞密度为2×106/mL。将载神经细胞的透明质酸/Matrigel溶液通入同轴聚焦型微流控装置的分散相入口，流速为1mL/h，将含2％司盘80的矿物油通入同轴聚焦型微流控装置的连续相入口，流速为10.0mL/h，得到直径为100μm～150μm的凝胶微球。通过活死染色，可以发现本实施例制备的透明质酸/Matrigel凝胶微球内神经细胞存活率达到80％以上。
将载神经细胞的透明质酸/Matrigel凝胶微球，依次通过清洗、过滤、离心等步骤去除凝胶微球中的矿物油，并按5:4的体积比混合甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)溶液，得到载神经细胞的凝胶微球墨水，结构示意图如图1所示，其中，凝胶微球墨水中凝胶微球的体积含量为55％，凝胶微球内细胞密度为2×106/mL，作为连续相的GelMA凝胶材料的质量-体积浓度为25mg/mL。
通过流变学测试，可以发现本实施例制备的透明质酸/Matrigel凝胶微球墨水除了表现出剪切变稀，还具有自愈合的特性。
2、制备生物墨水(载胶质瘤细胞)
将胶质瘤细胞悬液、质量分数为10.0％的透明质酸溶液与质量分数为5.0％的纤维蛋白原溶液按1:3:1的比例均匀混合，最终的胶质瘤细胞密度为5×106/mL。将载胶质瘤细胞的透明质酸/纤维蛋白原溶液通入同轴聚焦型微流控装置的分散相入口，流速为0.2mL/h，将含5％司盘80的矿物油通入同轴聚焦型微流控装置的连续相入口，流速为4.0mL/h，得到直径为450μm～500μm的凝胶微球。通过活死染色，可以发现本实施例制备的透明质酸/纤维蛋白原凝胶微球内神经细胞存活率达到95％以上。
将载胶质瘤细胞的透明质酸/纤维蛋白原凝胶微球，依次通过清洗、过滤、离心等步骤去除凝胶微球中的矿物油，并按3:2的体积比混合甲基丙烯酸酯明胶(GelMA)溶液，得到载胶质瘤细胞的凝胶微球墨水，结构示意图如图1所示，其中，凝胶微球墨水中凝胶微球的体积含量为60％，凝胶微球内细胞密度为5×106/mL，作为连续相的GelMA凝胶材料的质量-体积浓度为10mg/mL。
通过流变学测试，可以发现本实施例制备的透明质酸/纤维蛋白原凝胶微球墨水除了表现出剪切变稀，还具有自愈合的特性。
3、体外构建仿生脑胶质瘤模型
制备流程图如图5所示。
通过对胶质瘤患者的大脑影像资料进行三维重构，得到含血管通道和胶质瘤的大脑结构，等比缩小使大脑外径尺寸至25mm左右。在低温(0～4℃)下通过高速搅拌制备海藻酸钠颗粒作为悬浮介质，海藻酸钠颗粒尺寸为10μm～50μm。在海藻酸钠悬浮介质中采用载神经细胞的凝胶微球墨水打印类大脑结构；随后，将打印后的类大脑结构作为新的悬浮介质进行第二级结构打印，即采用载胶质瘤细胞的透明质酸/纤维蛋白原凝胶微球墨水打印胶质瘤结构；进一步，将打印后的胶质瘤结构作为新的悬浮介质进行第三级结构打印，即采用载内皮细胞(细胞密度为7.5×106/mL)的明胶溶液(浓度为7.5wt％)作为牺牲墨水来打印血管网络结构。打印完成后，采用光照射交联的方式进行打印结构的整体交联。然后，放入培养箱中孵育30min，溶出明胶牺牲墨水，并去除海藻酸钠的悬浮介质，从而构建含有血管通道的仿生胶质瘤模型，尺寸为15mm。

Claims (6)

1.一种构建具有复杂血管通道和异质细胞结构的组织/器官模型的多级悬浮打印方法，包括如下步骤：
S1、制备生物墨水，所述生物墨水由已交联的载细胞的凝胶微球与一种或多种未交联的凝胶材料混合得到，其中，所述载细胞的凝胶微球作为分散相，所述凝胶材料作为连续相；
S2、在悬浮介质中，打印所述生物墨水以构建特定的组织/器官结构；
所述组织/器官结构包括心脏、肝脏、肾脏、胰腺和脑结构中至少一种；
所述组织/器官结构的尺寸为500μm~100mm；
S3、在步骤S2得到的所述组织/器官结构内部，进一步进行二级和三级的子结构打印；
按照下述1）和2）的方式打印所述二级和三级的子结构：
1）采用载其他细胞的所述生物墨水打印特定的生理或病理结构；
2）打印载血管生成细胞的牺牲墨水来构建复杂血管通道，直径为100μm~5mm；
步骤2）后还包括去除所述牺牲墨水的步骤；
去除所述牺牲墨水的方式为温度变化、pH变化和离子作用中至少一种；
S4、打印结束后，经整体交联后溶出所述悬浮介质，即得到具有复杂血管通道和异质细胞结构的组织/器官模型；
所述整体交联的方法为光、温度交联、离子交联、酶交联和共价交联方式中至少一种；
去除所述悬浮介质的方法为温度变化、摇晃、水洗、酶溶解等方式中至少一种。
2.根据权利要求1所述的多级悬浮打印方法，其特征在于：步骤S1中，按照下述方法制备所述载细胞的凝胶微球：
悬滴法培养、超低附着性培养板、磁力悬浮培养、动态旋转培养和微流控技术中至少一种；
所述细胞为组织实质细胞、多能干细胞、诱导多能干细胞、血管生成细胞、基质细胞和肿瘤细胞中至少一种；
所述载细胞的凝胶微球内细胞密度为106/mL~108/mL；
所述载细胞的凝胶微球内凝胶材料的质量-体积浓度为10~100mg/mL；
作为所述连续相的所述凝胶材料的质量-体积浓度为1~100mg/mL；
作为所述连续相的所述凝胶材料可载有细胞；
所述凝胶材料内细胞密度为106/mL~5×107/mL。
3.根据权利要求1或2所述的多级悬浮打印方法，其特征在于：步骤S1中，所述载细胞的凝胶微球采用的凝胶与所述凝胶材料均为天然高分子水凝胶和/或合成高分子水凝胶；
所述天然高分子水凝胶材料为海藻酸钠、明胶、胶原、基质胶、壳聚糖、丝素蛋白、透明质酸、纤维蛋白原、硫酸软骨素、白蛋白以及它们的甲基丙烯酰化产物中的至少一种；
所述合成高分子水凝胶材料为聚乙二醇、聚丙烯醇、聚乙二醇二丙烯酸酯、聚环氧乙烷、聚丙烯酰胺、聚丙烯酸、聚磷腈、聚N-异丙基丙烯酰胺类水凝胶以及它们的甲基丙烯酰化产物中的至少一种；
所述载细胞的凝胶微球的直径为50μm~1000μm，在所述生物墨水中的体积含量为40%~100%。
4.根据权利要求1或2所述的多级悬浮打印方法，其特征在于：步骤S2中，所述悬浮介质为具有自愈合特性的水凝胶材料，具体为超分子自愈合水凝胶和/或微凝胶结构；
所述超分子自愈合水凝胶为环糊精基超分子水凝胶、DNA超分子水凝胶、聚氨酯脲超分子水凝胶、透明质酸-葡聚糖超分子水凝胶、丹参酮II-A多肽超分子水凝胶和石墨烯复合超分子水凝胶中至少一种；
所述微凝胶结构的尺寸为1μm~50μm；
所述微凝胶结构为卡波姆、明胶和海藻酸钠中至少一种。
5.根据权利要求4所述的多级悬浮打印方法，其特征在于：所述卡波姆为以季戊四醇与丙烯酸交联得到的丙烯酸交联树脂，溶剂为去离子水、PBS缓冲液和细胞培养基中至少一种；
所述明胶和所述海藻酸钠采用高速搅拌工艺制备，转速为1000~10，000转每分钟；
所述明胶通过明胶-阿拉伯胶的复合凝聚反应制备。
6.权利要求1-5中任一项所述方法构建的具有复杂血管通道和异质细胞结构的组织/器官模型。
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