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CN117586876B - 一种血管化类器官芯片及血管化类器官 - Google Patents

一种血管化类器官芯片及血管化类器官 Download PDF

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CN117586876B CN202311288041.0A CN202311288041A CN117586876B CN 117586876 B CN117586876 B CN 117586876B CN 202311288041 A CN202311288041 A CN 202311288041A CN 117586876 B CN117586876 B CN 117586876B
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Abstract

本发明提供了一种血管化类器官芯片及血管化类器官，所述血管化类器官芯片基于流体限位结构可增大细胞与培养基的接触面，通过流体刺激促进血管网络自发生成，进而得到血管化类器官模型。本发明为类器官血管化体外模型构建提供了可行方法，模拟了更仿生的体内微环境，同时得到的模型也可用于免疫共培养、血管新生等研究。

Description

一种血管化类器官芯片及血管化类器官
技术领域
本发明涉及类器官培养技术领域，尤其涉及一种血管化类器官芯片及血管化类器官。
背景技术
类器官由于其具备的自我更新和自组织能力，并表现出与起源组织相似的器官功能，能更好地用于模拟器官组织的发生过程及生理病理状态，因而在基础研究以及临床诊疗方面具有广阔的应用前景。从2009年荷兰科学家Hans Clevers实验室培育出首个肠道类器官，经过十余年的发展，类器官现今已作为一种优质的体外模型用于临床前癌症的治疗检测及药物药效和毒性测试，并逐渐走向肿瘤癌症基础研究和临床治疗的中央舞台，此外，不少实验室及企业致力于肿瘤类类器官生物库的建立使生理学相关的药物筛选成为可能。然而，目前的类器官培养相较于人体正常组织器官的生理环境由于缺乏血管结构而无法长期培养，在类器官体积增长至一定大小时会出现因培养基及氧气，营养物质等无法进入而导致的类器官中心细胞坏死现象。此外，血管化使类器官模型更能模拟体内微环境，与免疫细胞共培养可模拟体内免疫微环境。
利用生物3D打印技术及微流控芯片等技术可实现体外血管系统的重建，目前已有不少研究者基于此两项技术实现基于水凝胶的体外三维血管网络构建。但3D打印技术构建的血管网络主要由人为设计，与人体本身血管网络存在一定的差别。基于微流控芯片的三维血管网络由细胞自发形成，与体内血管具有形态结构的高度相似性，但是现有的芯片基本采用微柱结构限制凝胶的空间分布，此结构由于微柱结构本身会占据一部分空间，导致细胞与培养基的接触面积减少，此外，微柱结构也可能挡住自发形成的血管结构端口，影响血管灌注。同时现有的微流控血管化芯片基本为封闭式结构，且流道间利用微柱隔开，不利于培养基的流通，极易造成非均匀或非充分的流体刺激。此外，芯片基本为封闭结构，往往只能依赖于人工操作且操作难度较大，同时芯片中培养的器官组织难以取出，限制了后续的分析检测手段。此种封闭芯片也无法与自动化加液等仪器设备适配，不满足自动化和通量化的需求。现有开放式血管化器官芯片采用PMMA和玻璃通过双面胶粘合的方式制作血管芯片，芯片制作完成后在PMMA与玻璃接触外侧再涂抹PDMS固化后增加密封性。水凝胶用枪头通过储液槽一侧打入圆环结构底部，通过毛细力使水凝胶分布于中间的圆环结构底部，形成环状。水凝胶的厚度由圆环结构与基底间的空隙高度决定，水凝胶的宽度由圆环结构的宽度决定。但该方法存在以下问题：1，需要使用切割机对双面胶进行相应形状切割后与上层PMMA对准粘合，操作过程较繁琐，且对准过程中易产生误差造成芯片结构的细微差别；2，由于水凝胶加入时需倾斜枪头注入，自动化仪器难以满足其需求，不利于通量化；3，后续与细胞球进行共培养时细胞球从中间孔中加入，由于距离原因导致血管很难进入细胞球内部得到血管化细胞微球；4，血管结构位于圆环结构底部，与封闭式芯片一样存在样品取出困难，无法满足后续多样性分析检测手段的需求。
因此，亟需提供一种血管化类器官芯片以解决上述技术问题。
发明内容
本发明旨在至少一定程度上解决相关技术中的技术问题之一。为此，本发明提供了一种血管化类器官芯片及血管化类器官，所述血管化类器官芯片基于流体限位结构可增大细胞与培养基的接触面，通过流体刺激促进血管网络自发生成，进而得到血管化类器官模型。本发明为类器官血管化体外模型构建提供了可行方法，模拟了更仿生的体内微环境，同时得到的模型也可用于免疫共培养、血管新生等研究。
为此，本发明第一方面提供了一种血管化类器官芯片，所述血管化类器官芯片包括依次设置的储液层、细胞培养层和基底层；
其中，所述储液层设置至少一个通孔单元，每个所述通孔单元包括依次排列的第一通孔、第二通孔和第三通孔，相邻通孔的直径呈相异设置；
所述细胞培养层设置至少一个培养单元，所述培养单元与所述通孔单元一一对应，每个所述培养单元包括依次排列的第一微孔、第二微孔和第三微孔，所述第一微孔、第二微孔和第三微孔分别与所述第一通孔、第二通孔和第三通孔一一对应，所述第二微孔底部形成目标高度的间隙以形成通道，所述第一微孔、第二微孔和第三微孔通过所述通道实现联通。
本发明提供了一种基于流体限位结构的血管化类器官芯片，该结构可增大细胞与培养基的接触面，通过流体刺激促进血管网络自发生成，得到血管化类器官芯片模型。该血管化类器官芯片解决了以下问题：
1)解决了目前芯片大多采用微柱阵列等微结构来控制水凝胶空间分布，进而造成非均匀或非充分的流体刺激问题；2)解决了现有封闭式芯片样品难以取出以及后续分析手段受限的问题；3)解决了封闭式芯片只能手动操作难以匹配自动化加样设备的问题，4)本芯片结构设计避免了由于对准键合中的误差而造成的芯片结构性差异。
根据本发明的实施例，所述储液层、细胞培养层和基底层的厚度比为(20-50):2:1。
根据本发明的实施例，所述储液层的厚度为5-10mm。由此满足培养基的需求量。
根据本发明的实施例，所述细胞培养层的厚度为0.2-1mm。由此便于水凝胶材料的灌注，避免出现凝胶材料粘附于孔壁而无法铺满孔底部的情况。
根据本发明的实施例，所述基底层的厚度为0.1-0.5mm。由此便于后续通过显微镜观察。
根据本发明的实施例，所述细胞培养层的厚度与所述目标高度的比为(1.2-1.5):1。由此满足第二微孔中的血管化细胞和/或类器官细胞与凝胶混合物不会溢出至两侧流道中。
根据本发明的实施例，所述目标高度为200-500μm。
根据本发明的实施例，所述第二微孔的周缘底部具有楔形结构以形成目标高度的间隙，所述楔形结构的宽度沿着所述储液层到所述基底层方向逐渐缩小。
根据本发明的实施例，所述第一通孔和/或所述第三通孔的直径大于所述第二通孔。由此满足培养基的需求量。
根据本发明的实施例，所述第一通孔和所述第三通孔的直径相同。
根据本发明的实施例，所述第二微孔的直径小于所述第二通孔的直径。由此使得血管化细胞和/或类器官细胞与水凝胶混合物集中在第二微孔中，避免由于表面张力的影响，在添加血管化细胞和/或类器官细胞与水凝胶混合物时出现凝胶黏附在孔壁上无法填充整个微孔。同时也减少了水凝胶材料的使用量，节约成本。
根据本发明的实施例，所述第一通孔、第二通孔、第三通孔的直径比为8:5:8。
根据本发明的实施例，所述第一通孔的直径为8mm，所述第二通孔的直径为5mm，所述第三通孔的直径为8mm。
根据本发明的实施例，所述第二微孔的直径为2mm。
根据本发明的实施例，所述细胞培养层与所述基底层相接触。
根据本发明的实施例，所述储液层的材质为PMMA、PS、COC中的一种或多种。
根据本发明的实施例，所述细胞培养层的材质为PMMA、PS、PC中的一种或多种。
根据本发明的实施例，所述基底层的材质为玻璃、PC、PS中的一种或多种。
本发明第二方面提供了第一方面所述的血管化类器官芯片在制备血管模型或血管化类器官中的应用。
本发明第三方面提供了一种血管模型的制备方法，所述制备方法采用第一方面所述的血管化类器官芯片，包括将血管化细胞与水凝胶材料混合后注入所述第二通孔，向所述第一通孔与第三通孔中的至少一个和所述第二通孔注入培养基，进行培养。
根据本发明的实施例，所述血管化细胞包括人脐静脉内皮细胞、人肺成纤维细胞。
根据本发明的实施例，所述水凝胶材料包括选自明胶或基质胶。
根据本发明的实施例，所述制备方法还包括将所述血管化类器官芯片置于流体剪切力细胞培养自动化装置或半自动化装置。
本发明第四方面提供了一种血管化类器官的制备方法，所述制备方法采用第一方面所述的血管化类器官芯片，包括将血管化细胞、类器官与水凝胶材料混合后注入所述第二通孔，向所述第一通孔与第三通孔中的至少一个和所述第二通孔注入培养基，进行培养。
根据本发明的实施例，所述血管化细胞包括人脐静脉内皮细胞、人肺成纤维细胞。
根据本发明的实施例，所述类器官包括选自肿瘤类器官、胰腺类器官、肝脏类器官、肾脏类器官、胃类器官、肠类器官中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述肿瘤类器官包括选自肠癌类器官、肺癌类器官、胃癌类器官、胰腺癌类器官中的至少一种。
根据本发明的实施例，所述类器官包括选自肠癌类器官。
根据本发明的实施例，所述水凝胶材料包括选自明胶或基质胶。
根据本发明的实施例，所述方法还包括将所述血管化类器官芯片置于流体剪切力细胞培养自动化装置或半自动化装置。
本发明第五方面提供了一种血管模型，所述血管模型通过第三方面所述的制备方法得到。
本发明第六方面提供了一种血管化类器官，所述血管化类器官通过第四方面所述的制备方法得到。
本发明第七方面提供了第五方面所述的血管模型或第六方面所述的血管化类器官在药物筛选中的应用。
本发明相对于现有技术的有益效果：
1、本发明提供的血管化类器官芯片底部具有目标高度的流道，可防止中间通孔血管化细胞和/或类器官细胞不会溢出至两侧流道中，此结构与传统的微柱型设计相比能够大大增加细胞与培养基的接触面积，进而实现更加均匀及充分的流体刺激；
2、本发明提供的血管化类器官芯片上层储液层较厚可满足培养基需求量；中间细胞培养层较薄，且第二微孔较小，避免水凝胶材料由于芯片疏水性材质而粘附在壁上及减少水凝胶材料的用量，降低成本；基底层较薄便于后续显微镜下观察。同时该芯片设计结构集中于中间细胞培养层，避免了对准键合中可能出现的误差及结构的差异化；
3、本发明提供的血管化类器官芯片为开放式设计，便于使芯片加样与自动化设备相匹配使用，同时开放式设计便于培养组织的取出进行后续的多手段分析测试；
4、本发明提供的血管化类器官芯片可采用塑料材质，可避免传统PDMS材质对小分子药物的吸附，使后续药筛应用中结果更准确。同时该芯片可用注塑工艺量产加工，可避免传统PDMS芯片只能手工制作而无法批量生产的弊端，及手动加工中易出现的批次差；
5、本发明提供的血管化类器官芯片可采用模块化设计可适配科研工作的少量需求，以及孔板化设计满足药物筛选的高通量需求。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明显，或通过本发明的实践了解到。
附图说明
本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
图1显示了本发明提供的血管化类器官芯片的结构示意图；
图2显示了本发明提供的血管化类器官芯片的剖面结构示意图；
图3显示了本发明提供的包含多个结构单元的血管化类器官芯片的结构示意图；
图4显示了本发明提供的血管化类器官芯片进行血管模型培养的示意图；
图5显示了流体剪切力细胞培养自动化装置的实物图；
图6显示了本发明实施例1中采用血管化类器官芯片生成的三维血管网络；
图7显示了本发明实施例1中三维血管网络经70kD FITC-Dextran灌注的结果图；
图8显示了本发明实施例1中三维血管网络经荧光微球灌注的结果图；
图9显示了本发明实施例2中采用血管化类器官芯片生成的血管网络包围类器官。
附图标记：
100-血管化类器官芯片；
101-储液层；1011-通孔单元；10111-第一通孔；10112-第二通孔；10113-第三通孔；
102-细胞培养层；1021-培养单元；10211-第一微孔；10212-第二微孔；10213-第三微孔；103-基底层。
具体实施方式
下面详细描述本发明的实施例。下面描述的实施例是示例性的，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。
需要说明的是，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。进一步地，在本发明的描述中，除非另有说明，“多个”的含义是两个或两个以上。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除显而易见在本文件中的它处另有明确定义，否则本文中使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。
在本文中，术语“包含”或“包括”为开放式表达，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
在本文中，术语“任选地”、“任选的”或“任选”通常是指随后所述的事件或状况可以但未必发生，并且该描述包括其中发生该事件或状况的情况，以及其中未发生该事件或状况的情况。
本发明第一方面提供了一种血管化类器官芯片100，如图1和图2所示，该芯片100包括依次设置的储液层101、细胞培养层102和基底层103。其中，所述储液层设置至少一个通孔单元1011，每个所述通孔单元1011包括依次排列的第一通孔10111、第二通孔10112和第三通孔10113。所述细胞培养层102设置至少一个培养单元1021，所述培养单元1021与所述通孔单元1011一一对应，每个所述培养单元1021包括依次排列的第一微孔10211、第二微孔10212和第三微孔10213，所述第一微孔10211、第二微孔10212和第三微孔10213分别与所述第一通孔10111、第二通孔10112和第三通孔10113一一对应。其中通孔单元1011中的第一通孔10111和第三通孔10113用于注入培养基，培养基将从储液层流入细胞培养层。通孔单元1011中的第二通孔10212用于注入血管化细胞和/或类器官。第二通孔10212底部形成目标高度的间隙以形成通道，所述第一微孔10211、第二微孔10212和第三微孔10213通过所述通道实现联通。
其中，储液层、细胞培养层和基底层的厚度比可为(20-50):2:1。储液层厚度的设定应满足培养基需求量，可设定为5-10mm。细胞培养层厚度的设定应便于后续水凝胶材料的灌注，避免出现水凝胶粘附于孔壁而无法铺满孔底部的情况，可设定为0.2-1mm，基底层厚度的设定应便于后续通过显微镜观察，可设定为0.1-0.5mm。但需要指出的是，以上结构厚度的选择为示例性的，并不对本发明保护范围构成限制。储液层中每一个通孔单元中相邻通孔的直径应呈相异设置，且所述第二微孔的直径小于所述第二微孔对应的第二通孔的直径。优选地，第一通孔和/或第三通孔的直径大于第二通孔；更优选地，第一通孔和第三通孔的直径相同。具体地第一通孔的直径为8mm，所述第三通孔的直径为8mm，所述第二通孔的直径为5mm，所述第二微孔的直径为2mm。但需要指出的是，通孔和微孔的直径选择并不限于以上直径范围，可根据实际类器官尺寸制备需要进行合理调整。
根据本发明的具体的实施例，细胞培养层中第二微孔底部设定目标高度的间隙以形成通道，使一个培养单元中的三个微孔实现联通。目标高度应满足第二微孔中细胞不会溢出至两侧流道中，但不影响两侧微孔中培养基在整个流道中的流动，细胞培养层的厚度与目标高度的比可为(1.2-1.5):1。具体地，实现目标高度的结构可有多种结构形式，例如在优选情况下，如图2所示，第二微孔10212的周缘底部具有楔形流体限位结构，其宽度沿着储液层到基底层方向逐渐缩小，以减少细胞与培养基间距离，避免两侧通孔加培养基时在中间流道空气难排除而产生气泡，从而影响培养基流动性。该目标高度的选择可根据第二微孔中细胞类型进行合理选择，例如200-500μm，但并不限于此数值范围。
根据本发明的具体的实施例，储液层、细胞培养层和基底层可键合得到血管化类器官芯片，储液层的材质可选择PMMA、PS、COC，细胞培养层的材质可选择PMMA、PS、PC，基底层的材质可选择玻璃、PC、PS以满足观察细胞培养层10212内类器官或血管的生成情况的需求。
根据本发明的具体的实施例，血管化类器官芯片可设计为包含多个结构单元的单元模块化，如图3所示，其包含32个通孔单元，每个通孔单元可分别培养各自的类器官，满足不同的实验需求。
本发明还提供了一种血管模型的制备方法，该制备方法基于前述的血管化类器官芯片，包括将血管化细胞与水凝胶材料混合后注入第二通孔，分别向所述第一通孔与第三通孔中的至少一个和所述第二通孔注入培养基，进行培养。其中血管化细胞可选择人脐静脉内皮细胞、人肺成纤维细胞等，水凝胶材料可选择明胶或基质胶等。具体地，可选择人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及人肺成纤维细胞(NHLF)以一定比例在纤维蛋白原、凝血酶、基质胶中混合均匀后注入第二通孔，待基质胶凝固后从两侧通孔中的一侧注入培养基，并向第二通孔注入一定量培养基，由于液面高度差，培养基将通过通道流至另一侧通孔中，直至两侧通孔中液体高度一致，如图4所示。由于表面张力，第二通孔中的细胞外基质将聚集在中间通孔而不会溢出至两侧流道中。
本发明还提供了一种血管化类器官的培养方法，该方法基于前述的血管化类器官芯片，包括将血管化细胞、类器官与水凝胶材料混合后注入所述第二通孔，分别向所述第一通孔与第三通孔中的至少一个和所述第二通孔注入培养基，进行培养。其中血管化细胞可选择人脐静脉内皮细胞、人肺成纤维细胞等，类器官包括选自肿瘤类器官、胰腺类器官、肝脏类器官、肾脏类器官、肠类器官、胃类器官中的至少一种，肿瘤类器官包括选自肠癌类器官、肺癌类器官、胃癌类器官、胰腺癌类器官中的至少一种，水凝胶材料可选择明胶或基质胶等。具体地，可将类器官、人脐静脉内皮细胞及人肺成纤维细胞以一定比例在纤维蛋白原、凝血酶及基质胶中混合均匀后注入第二通孔，第二通孔中的细胞外基质凝固后，向三个通孔中注入培养基进行培养。培养一段时间后，还可将该芯片放置于流体剪切力细胞培养自动化装置或半自动化装置上，如图5所示，该设备倾斜产生液面高度差，培养基将通过流道流至另一侧通孔中，直至两侧通孔中液体高度一致，再反向倾斜，继续产生流体剪切力刺激。在培养过程中利用两侧通孔中的液面高度差产生的流体剪切力刺激，HUVEC细胞自发生长形成三维血管网络。血管网络在动态条件下培养10天后形成可灌注血管网络。
下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1血管化类器官芯片用于生成三维血管网络
准备人脐静脉内皮细胞与人肺成纤维细胞培养于T25细胞培养瓶，待细胞汇合度达到100％时，胰酶消化，计数。分别取8×106个人脐静脉内皮细胞与4×106个人肺成纤维细胞混合于15ml离心管，转速300×g离心5min。小心吸弃上清，加入提前准备好的浓度为10mg/ml纤维蛋白原凝胶，混合均匀，置于冰上待用。用内皮细胞完全培养基将10U/ml的凝血酶稀释为1U/ml，以10μL每份分装于1.5ml EP管，置于冰上待用。取10μL含有细胞的纤维蛋白原凝胶与其中一份含有凝血酶的完全培养基混合均匀，灌注到芯片的第二通孔，于37℃细胞培养箱凝固20min。凝固后在两侧通孔加入内皮细胞完全培养基，将芯片放置于配套设备上，设备倾斜产生液面高度差，培养基将通过流道流至另一侧通孔中，直至两侧通孔中液体高度一致，再反向倾斜，继续产生流体刺激。培养10天后产生可灌注的三维血管网络，如图6所示。70kD FITC-Dextran灌注显示，血管具有良好的可灌注性，如图7所示。此外，使用荧光微球进行灌注，如图8所示，荧光微球可以顺着血管内壁从血管网络一侧到达另一侧，说明血管已形成闭合管状网络结构，具有良好的可灌注性。
实施例2血管化类器官芯片用于血管类器官共培养
准备1000个左右100μm左右大小的肠癌类器管，转移到15ml离心管，加入5ml的类器官回收液在冰上轻轻晃动30min将基质胶去除，加入DPBS定容至10ml，300×g离心5min，弃上清，加入100μL基质胶吹打混匀置于冰上待用。将血管内皮完全培养基与肠癌类器官培养基按照1：1的比例混合，待用。将10mg/ml纤维蛋白原与含有类器官的基质胶按照9:1的比例混合，置于冰上待用。准备10U/ml的凝血酶，将其以2μL每份分装于1.5ml EP管置于冰上待用。准备8×106个人脐静脉内皮细胞与4×106个人肺成纤维细胞混合于15ml离心管，转速300×g离心5min。小心吸弃上清，加入提前准备好的含有类器官的混合胶，混合均匀，置于冰上待用。取8μL混合胶与分装好的凝血酶吹打2-3次混合，迅速灌注于芯片的第二通孔，37℃培养箱放置10min使其凝固。凝固后在两侧通孔加入混合后的培养基，将芯片放置于配套设备上，设备倾斜产生液面高度差，培养基将通过流道流至另一侧通孔中，直至两侧通孔中液体高度一致，再反向倾斜，继续产生流体剪切力刺激。3天可见内皮细胞逐渐形成血管网络包围类器官(图9)。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (10)

1.一种开放式血管化类器官芯片，其特征在于，所述开放式血管化类器官芯片包括依次设置的储液层、细胞培养层和基底层；
其中，所述储液层设置至少一个通孔单元，每个所述通孔单元包括依次排列的第一通孔、第二通孔和第三通孔，相邻通孔的直径呈相异设置；
所述细胞培养层设置至少一个培养单元，所述培养单元与所述通孔单元一一对应，每个所述培养单元包括依次排列的第一微孔、第二微孔和第三微孔，所述第一微孔、第二微孔和第三微孔分别与所述第一通孔、第二通孔和第三通孔一一对应，所述第二微孔底部形成目标高度的间隙以形成通道，所述第一微孔、第二微孔和第三微孔通过所述通道实现联通，所述第二微孔的周缘底部具有楔形结构以形成目标高度的间隙，所述楔形结构的宽度沿着所述储液层到所述基底层方向逐渐缩小；
其中，将血管化细胞、类器官与水凝胶材料混合后注入所述第二通孔，分别向所述第一通孔与第三通孔的至少一个和所述第二通孔注入培养基，进行培养。
2.根据权利要求1所述的开放式血管化类器官芯片，其特征在于，所述储液层、细胞培养层和基底层的厚度比为（20-50）:2:1；
任选地，所述储液层的厚度为5-10mm；
任选地，所述细胞培养层的厚度为0.2-1mm；
任选地，所述基底层的厚度为0.1-0.5mm；
任选地，所述细胞培养层的厚度与所述目标高度的比为（1.2-1.5）:1；
任选地，所述目标高度为200-500μm。
3.根据权利要求1所述的开放式血管化类器官芯片，其特征在于，所述第一通孔和/或所述第三通孔的直径大于所述第二通孔；
任选地，所述第一通孔和所述第三通孔的直径相同；
任选地，所述第二微孔的直径小于所述第二通孔的直径；
任选地，所述第一通孔、第二通孔、第三通孔的直径比为8:5:8；
任选地，所述第一通孔的直径为8mm，所述第二通孔的直径为5mm，所述第三通孔的直径为8mm；
任选地，所述第二微孔的直径为2mm。
4.根据权利要求1所述的开放式血管化类器官芯片，其特征在于，所述细胞培养层与所述基底层相接触。
5.根据权利要求1所述的开放式血管化类器官芯片，其特征在于，所述储液层的材质为PMMA、PS、COC中的一种或多种；
任选地，所述细胞培养层的材质为PMMA、PS、PC中的一种或多种；
任选地，所述基底层的材质为玻璃、PC、PS中的一种或多种。
6.根据权利要求1所述的开放式血管化类器官芯片，其特征在于，所述血管化细胞包括人脐静脉内皮细胞和人肺成纤维细胞；
任选地，所述类器官包括选自肿瘤类器官、胰腺类器官、肝脏类器官、肾脏类器官、肠类器官、胃类器官中的至少一种；
任选地，所述水凝胶材料包括选自基质胶或纤维蛋白原。
7.根据权利要求6所述的开放式血管化类器官芯片，其特征在于，所述类器官为肿瘤类器官。
8.根据权利要求7所述的开放式血管化类器官芯片，其特征在于，所述肿瘤类器官包括选自肠癌类器官、肺癌类器官、胃癌类器官、胰腺癌类器官中的至少一种。
9.根据权利要求1所述的开放式血管化类器官芯片，其特征在于，还包括将所述开放式血管化类器官芯片置于流体剪切力细胞培养自动化装置或半自动化装置。
10.权利要求1~9中任一项所述的开放式血管化类器官芯片在药物筛选中的应用。
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Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109804057A (zh) * 2016-06-15 2019-05-24 米梅塔斯私人有限公司 细胞培养装置以及细胞培养方法
CN109929756A (zh) * 2017-12-15 2019-06-25 深圳先进技术研究院 超声微泡刺激细胞装置及其操作方法
CN112143642A (zh) * 2020-08-28 2020-12-29 上海交通大学 用于体外培养的血管化肿瘤微流控器官芯片及其制备方法

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113773959B (zh) * 2021-08-20 2023-09-26 合肥燃音生物科技有限公司 一种类器官培养芯片和类器官培养方法
CN116286353A (zh) * 2023-03-22 2023-06-23 复旦大学附属金山医院(上海市金山区眼病防治所、上海市金山区核化伤害应急救治中心) 一种模拟内异症多个受累脏器免疫微环境的类器官芯片

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109804057A (zh) * 2016-06-15 2019-05-24 米梅塔斯私人有限公司 细胞培养装置以及细胞培养方法
CN109929756A (zh) * 2017-12-15 2019-06-25 深圳先进技术研究院 超声微泡刺激细胞装置及其操作方法
CN112143642A (zh) * 2020-08-28 2020-12-29 上海交通大学 用于体外培养的血管化肿瘤微流控器官芯片及其制备方法

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