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CN102067250B - 磁性粒子 - Google Patents

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CN102067250B CN200980122736.3A CN200980122736A CN102067250B CN 102067250 B CN102067250 B CN 102067250B CN 200980122736 A CN200980122736 A CN 200980122736A CN 102067250 B CN102067250 B CN 102067250B
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Abstract

一种磁性粒子，其包含多糖基质和分散于基质中的多个磁性晶体。一种制造磁性粒子的方法，其包含组合碱性溶液与金属离子溶液，氧化金属离子以形成磁性晶体，和组合磁性晶体与多糖溶液以形成磁性粒子。

Description

磁性粒子
技术领域
本发明涉及可用于细胞分离的磁性粒子。更具体地说，本发明涉及具有低光散射性质的磁性粒子。
背景技术
在许多应用中，需要富集或者耗尽生物样品中的某些细胞群体。举例来说，对于血液学、免疫学和肿瘤学领域的研究，以及某些恶性肿瘤和免疫病症的诊断和治疗，从外周血、骨髓、脾、胸腺和胎肝中分离特定细胞类型是很关键的。
细胞、分子和生化过程的研究需要分析呈分离物形式的某些细胞类型。举例来说，纯化的免疫细胞(例如T细胞和抗原呈递细胞)群体是研究免疫功能所必需的，并用于免疫治疗中。大多数细胞分离技术要求输入样品是单细胞悬浮液。为此，历史上血液是最常用于细胞分离的组织。已经利用多种技术从血液中分离T细胞亚组、B细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞和树突状细胞用于这些研究。
最近，已经开发了酶消化方法用于将实体器官的组织离解成单细胞悬浮液，从而允许分离不同的细胞类型。这对于研究成人的多能干细胞和组织特异干细胞尤其有利。这些细胞修复患病或受损组织的潜力促进了干细胞研究领域的快速发展。骨髓(造血)干细胞是最早被纯化并临床使用的成人干细胞，且造血干细胞的治疗潜力现已得到充分证明。外周血和/或骨髓的造血细胞的移植越来越多地联合高剂量化疗和/或放疗使用，以用于治疗包括恶性、非恶性和遗传病症的多种病症。所述移植物中只有极少细胞能进行长期造血重建，且因此迫切需要开发造血干细胞的纯化技术。此外，严重的并发症和实际上移植程序的成功在很大程度上依赖于用于去除移植物中对移植物接受者产生危险的细胞的程序的有效性。所述细胞包括T淋巴细胞，其负责同种异体移植物中的移植物抗宿主疾病(GVHD)，和自体移植物中的肿瘤细胞，其可能引起恶性生长的复发。通过去除不必要的细胞且因此减小欲输注的冷冻保存物(cyropreservant)的体积来缩减移植物的体积也很重要。
在某些情况下，需要去除或耗尽生物样品中的肿瘤细胞，例如在骨髓移植物的情况下。支气管、乳腺导管、胃肠道和泌尿生殖道的上皮癌代表当今发现的一大类实体肿瘤。微转移肿瘤细胞迁移被认为是上皮癌患者的重要预后因子(Braun等人，2000；Vaughan等人，1990)。检测所述转移细胞的能力受组织或流体取样的有效性和肿瘤检测方法的灵敏性限制。富集血样中循环上皮肿瘤细胞的技术会提高检测转移疾病的能力，并帮助研究所述稀少细胞以便确定导致疾病扩散的生物变化。
已经基于物理特征如密度并且基于对杀死循环细胞的某些药理学药剂的敏感性分离了造血细胞和免疫细胞。针对细胞表面抗原的单克隆抗体的出现极大地扩充了区别和分离不同细胞类型的可能性。存在使用单克隆抗体从血液和相关细胞悬浮液分离细胞群体的两种基础概念方法。它们的不同之处在于用抗体区别/标记的细胞是想要的细胞还是不想要的细胞。
在阳性筛选技术中，用抗体标记想要的细胞并将其从剩余的未标记/不想要细胞中移出。在阴性筛选中，标记不想要的细胞并予以去除。抗体/补体处理和使用免疫毒素是阴性筛选技术，但荧光活化细胞分选(FACS)和大多数分批免疫吸附技术可用于阳性和阴性筛选两者。在免疫吸附技术中，用单克隆抗体筛选细胞，且其优先结合于可从剩余细胞中去除的表面，例如珠柱、烧瓶、磁性粒子。免疫吸附技术在临床和研究中赢得了广泛赞誉，因为其保持了用单克隆抗体靶向细胞的高特异性，但不同于FACS，其可经规模化以直接处理临床收集物中的大量细胞，且避免了使用细胞毒性试剂如免疫毒素和补体所带来的危险。
磁性分离是利用磁场梯度将磁性物质选择性地截留在容器(例如离心管或柱)内的方法。目的靶标如特异性生物细胞可通过磁性粒子经由特异性相互作用(包括免疫亲和相互作用)结合于靶标表面而被磁性标记。其它有用的相互作用包括药物-药物受体、抗体-抗原、激素-激素受体、生长因子-生长因子受体、碳水化合物-凝集素、核酸序列-互补核酸序列、酶-辅因子或酶-抑制剂结合。合适容器内的含有目的靶标的悬浮液然后暴露于足够强度的磁场梯度下，以分离靶标与悬浮液中的其它实体。容器然后用合适流体洗涤以去除未标记的实体，从而获得被纯化的目的靶标悬浮液。
大部分磁性标记系统使用表面共价结合有抗体或抗生蛋白链菌素的超顺磁粒子。在细胞分离应用中，这些粒子可用于阳性筛选，其中目的细胞被磁性标记，或用于阴性筛选，其中大部分不想要的细胞被磁性标记。目的靶标是蛋白质或核酸的磁性分离应用被视为阳性筛选方法，因为目的实体典型地被捕获于磁性粒子上。所用粒子的直径相差很大，从MACS粒子(Miltenyi Biotec)和StemSepTM胶体(StemCell Technologies)的约50-100nm到EasySepTM(StemCellTechnologies)和Imag(BD Biosciences)粒子的150nm-1.5μm和Dynabeads(Invitrogen)的1-4.2μm不等。所用粒子的类型受用于分离被标记实体的磁体技术影响。
存在两类重要的磁性分离技术，它们出于便利和实用原因皆使用永磁体而不是电磁体。第一类是基于柱的高梯度磁场分离技术，其使用小型弱磁性粒子标记目的靶标，并在填充有可磁化基质的柱中分离这些靶标。当对柱施加磁场时，在紧靠基质元件表面的地方产生极高的梯度。高梯度是分离用这些相对弱磁性粒子标记的靶标所必需的。第二类是基于管的技术，其使用磁性更强的粒子标记目的靶标。这些目的靶标然后在离心管内通过用管外部的磁体产生的磁场梯度分离。这种方法具有的优点是它不依赖于可磁化基质来产生梯度，因此不需要昂贵的一次性柱(disposable column)，或涉及不便的清洁和去污程序的可再生柱。
一旦放在磁体内，被靶向细胞就会朝着最高磁场强度的一个或一个以上区域迁移，并被截留在磁场内，而未标记的细胞则被排出。然后可在从磁场移出被靶向细胞之后收集被靶向细胞，并将其用于期望应用中。在需要阴性筛选的情况下，未标记的细胞被排出并可用于例如细胞分选等多种应用。
EasySep标记方法使用四聚体抗体复合物(TAC)(美国专利4,868,109)。TAC是由四聚体阵列中通过两个大鼠抗小鼠IgG1抗体分子维持的两个小鼠IgG1单克隆抗体构成。EasySepTM试剂利用TAC使可磁化粒子与目的细胞交联，其中一小鼠抗体靶向粒子且另一小鼠抗体靶向目的细胞上的表面标志物。EasySepTM磁体然后分离标准离心管内的经磁性标记的细胞与未标记的细胞。
在磁性标记和初始磁性分离后，有必要洗掉非特异性分离的细胞，以便样品以期望水平分离成被标记细胞和未标记细胞。在基于试管的系统如和中，分离容器典型地是维持在磁场中的标准离心管。为了在阳性筛选应用中获得高纯度的靶标细胞，使用一系列分批洗涤步骤从分离管中去除未标记的细胞，其中从分离容器中去除含有大部分未标记细胞的上清液，然后将剩余的细胞视需要再悬浮和再分离多次。
较大的磁性粒子(＞0.5μm)具有以下优势：分离时间可较短，且可使用较弱的磁场。举例来说，1.0、2.5和4.2μm直径的Dynal粒子可用具有约0.3T的峰值磁场强度的简单侧拉磁体(side-pull magnet)分离。1.0μm直径的Polysciences BioMag Plus粒子可使用下拉平板磁体(pull-down plate magnet)如Dexter Magnetics LifeSep 96F在96孔板中分离。然而，众所周知较大的磁性粒子还会在FACS分析中强烈影响粒子所结合的细胞的光散射特征信号。结合于细胞的较大粒子影响前向散射和侧向散射信号，其中侧向散射信号受到的影响更为严重。前向散射信号与细胞大小有关，而侧向散射信号与粒度有关。前向和侧向散射信号是FACS分析的重要组分，且这些信号的失真会显著妨碍对结果的解释。当结合于细胞时不会对细胞的光散射性质展现这种影响的大磁性粒子对于磁性细胞分离方案具有很高的实用性。较大粒子还通过改变表观细胞形态来干扰细胞的可见光显微检查。当结合于细胞时不会显著改变细胞在用可见光显微检查观察时的表观形态的大粒子对于磁性细胞分离方案也有很高的实用性。
发明内容
本申请涉及具有低光散射性质的磁性粒子、制造所述磁性粒子的方法和所述磁性粒子的用途。
一个广义方面提供包含多糖基质和分散于基质中的多个磁性晶体的磁性粒子。已经确定了根据此广义方面的磁性粒子可展现低光散射性质，甚至是在直径大于0.5微米的情况下。更特定地说，磁性粒子可具有大于约0.5微米的直径，可对弱磁场有反应，且当连接于多个细胞时可引起细胞的侧向散射信号变化小于100％，如流式细胞术所检测。
在一些实施方案中，磁性粒子的直径在0.5与10微米之间。更特定地说，直径可在0.9与2.5微米之间。
在一些实施方案中，磁性晶体占粒子的60到85wt％。更特定地说，磁性晶体可占粒子的75到83wt％。
在一些实施方案中，磁性晶体包含过渡金属氧化物，如氧化铁。举例来说，过渡金属氧化物可包含Fe2O3和Fe3O4中的至少一种。
在一些实施方案中，磁性晶体可具有5nm与50nm之间的晶体直径。
在一些实施方案中，多糖是葡聚糖(dextran)。
在一些实施方案中，磁性晶体均匀地分散在基质中。
另一个广义方面提供制造磁性粒子的方法。所述方法包含组合碱性溶液与金属离子溶液，使金属离子氧化以形成磁性晶体，组合磁性晶体与多糖溶液，形成磁性粒子。
优选地，由所述方法形成的磁性粒子包含多糖基质和分散于基质中的多个磁性晶体。
在一些实施方案中，碱性溶液具有至少9.5的pH。
在一些实施方案中，碱性溶液和金属离子溶液是以1∶1与5∶1之间的体积比组合。
在一些实施方案中，碱性溶液和金属离子溶液组合形成pH为约10.5的混合物。
在一些实施方案中，碱性溶液和金属离子溶液是通过流动混合来组合。
在一些实施方案中，所述方法进一步包含通过将磁性粒子解聚到0.5与10微米之间，且更特定地说0.9与2.5微米之间来减小磁性粒子的平均直径。在一些其它实施方案中，通过膜挤压法和均质化法中的一种来减小直径。
在一些实施方案中，碱性溶液是氢氧化铵。在一些实施方案中，金属离子溶液包含钴、锰、镍、铁和其合金中的至少一种。在一些实施方案中，金属溶液是铁溶液。在其它实施方案中，铁溶液包含1份Fe2+∶2份Fe3+。
在一些实施方案中，使碱性溶液和铁溶液流到一起一段时间。在一些实施方案中，所述一段时间大于约0.1秒且小于约180秒，且更特定地说，大于约0.1秒且小于约0.5秒。
在一些实施方案中，多糖溶液包含淀粉、葡聚糖、羟乙基淀粉、纤维素和部分或完全取代氨基-葡聚糖中的至少一种。在优选实施方案中，多糖溶液包含葡聚糖。
另一个广义方面提供使用磁性粒子分离悬浮于流体中的第一细胞群体与第二细胞群体的方法。所述方法包含使磁性粒子连接于第一细胞群体，将第一和第二细胞群体放在磁场中，和回收第一或第二细胞群体中的一种。
在一些实施方案中，使用四聚体抗体复合物使磁性粒子连接于第一细胞群体。
在一些实施方案中，所述方法进一步包含用FACS分析所述第一细胞群体，其中在结合于磁性粒子时第一细胞群体的侧向散射信号的变化小于100％。
附图说明
结合以下描述将对这些和其它优势获得更充分和更具体的理解。
图1是显示与微米粒子相比使用本文描述的示例性粒子对通过CD3阳性筛选纯化的细胞的侧向散射影响的图。图A、B是CD3阳性筛选后分析细胞的CD3和CD45抗原表达的代表性FACS图示。图C、D是CD3筛选的细胞的前向散射特征对比侧向散射特征的代表性FACS图示。图A和C描绘用微米粒子筛选的细胞。图B和D描绘用本文描述的粒子筛选的细胞。
图2是显示与纳米粒子相比，使用本文描述的粒子通过CD14阳性筛选纯化的细胞的侧向散射性质的图。图A、B是CD14阳性筛选后分析细胞的CD66b和CD14抗原表达的代表性FACS图示。图C、D是CD14筛选的细胞的前向散射特征对比侧向散射特征的代表性FACS图示。图A和C描绘用纳米粒子筛选的细胞。图B和D描绘用本文描述的粒子筛选的细胞。
图3是本文描述的示例性粒子的透射电子显微照片。
具体实施方式
本发明涉及磁性粒子、制造磁性粒子的方法和磁性粒子的用途。所述粒子可包含多糖基质和分散于基质中的多个磁性晶体。如本文所用，术语“磁性粒子”是指对磁场有反应的粒子。在一些实施方案中，磁性粒子可具有0.5微米与10微米之间的直径。更特定地说，磁性粒子可具有0.9微米与2.5微米之间的直径。在所述实施方案中，粒子可允许相对短的细胞分离时间，且可允许使用相对低的磁场(例如小于20T/m)。此外，在所述实施方案中，当用FACS分析磁性粒子所结合的细胞时，磁性粒子可对前向和侧向散射展现相对低的影响。
根据所述方法的一个实施方案，作为第一步骤，通过组合金属离子溶液与碱性溶液并氧化金属离子来形成磁性晶体。
金属离子溶液可包含过渡金属，例如铁、钴、锰和镍和其合金中的一种或一种以上。优选地，金属离子溶液是铁盐溶液。铁盐溶液可具有例如约8mM与约231mM之间的总铁浓度。
铁溶液可包含各种铁化合物。优选地，铁溶液包含氧化铁。更优选地，铁溶液包含Fe2+和Fe3+。举例来说，铁溶液可包含约1∶2Fe2+∶Fe3+摩尔比的氯化铁(II)四水合物和氯化铁(III)六水合物的水溶液。在替代实施方案中，铁溶液可包含硫酸铁(II)四水合物、乙酸铁(II)、乙酰丙酮铁(II)、溴化铁(II)、碘化铁(II)、碘化铁(III)、磷酸铁(III)、硝酸铁(III)、溴化铁(III)、乙酰丙酮铁(III)、硫酸铁(III)五水合物或其它含铁化合物的溶液，其中Fe2+∶Fe3+摩尔比是约1∶2。
在一些实施方案中，碱性溶液具有至少9.5的pH。在优选实施方案中，碱性溶液具有11到11.5的pH。优选地，碱性溶液包含氢氧化铵(NH4OH)水溶液。在替代实施方案中，碱性溶液可包含例如氢氧化钠(NaOH)、氢氧化钾(KOH)或另一种布朗斯特-洛瑞碱(Bronsted-Lowry base)。
金属离子溶液和碱性溶液可以各种方式和各种体积比组合。举例来说，金属离子溶液和碱性溶液可以约1∶1与约5∶1之间的体积比组合。所述溶液优选以使所得混合物的pH为至少约9.5，更优选地在9.5与13.5之间，且最优选地约10.5的方式组合。
优选地，通过流动混合将金属离子溶液与碱性溶液组合，并使其一起流动一段时间以便氧化金属离子并形成磁性晶体。举例来说，可将金属离子溶液和碱性溶液泵送通过对应的第一和第二段管道到达接合部，它们在此处混合并流入第三段管道。当溶液混合并流过第三段管道时，金属离子可在碱存在下氧化以形成磁性晶体。优选地，使溶液流到一起持续约0.1秒到约180秒，且更特定地说，约0.1秒到约5秒。举例来说，第三段管道的尺寸可允许通过其中的转运时间为约0.1秒。
在一些实施方案中，除了在混合后流到一起之外或非在混合后流到一起，可在伴有或不伴有其它混合或搅动的情况下在容器中温育碱性溶液与金属离子溶液的混合物。
在其它替代实施方案中，金属离子溶液和碱性溶液可通过添加到容器中，然后搅动而以分批方法组合，而不是流动混合。
组合金属离子溶液与碱性溶液的步骤可在各种温度下进行。举例来说，组合金属离子溶液与碱性溶液的步骤可在室温与95℃之间的温度下进行。优选地，组合金属离子溶液与碱性溶液的步骤在低于50℃的温度下进行。
磁性晶体优选具有5nm与50nm之间的直径。
当形成磁性晶体时，将它们与多糖溶液组合并形成磁性粒子。多糖溶液可为例如淀粉、葡聚糖、羟乙基淀粉、纤维素、部分或完全取代氨基-葡聚糖和其组合的水溶液。优选地，多糖溶液包含葡聚糖。葡聚糖可具有例如在5,000Da与110,000Da之间的平均分子量。
多糖溶液可为各种浓度。举例来说，多糖溶液可具有约0.5％与约20％重量/体积之间的浓度。此外，多糖溶液可具有例如在约5与约11.5之间的pH。
磁性晶体可以多种方式与多糖溶液组合。举例来说，磁性晶体和多糖溶液的混合物可如上文所述通过流动混合来组合。或者，磁性晶体和多糖溶液可添加到容器中，并手动或自动混合。
在一些实施方案中，将磁性晶体与多糖溶液在高温下组合，随后冷却。举例来说，与磁性晶体组合时多糖的温度是在约20℃与约95℃之间。优选地，与磁性晶体组合时多糖溶液的温度是约85℃。
在组合后，可将磁性晶体和多糖溶液温育一段时间。举例来说，磁性晶体和多糖溶液可温育1小时到7小时。
不受理论限制，认为当组合磁性晶体与多糖溶液时，多糖被吸附到金属表面并可完全或部分包覆金属氧化物晶体表面。被包覆的晶体然后聚集形成磁性粒子，其包含多糖基质和分散于基质中的多个磁性晶体。磁性粒子也可被描述为包覆有多糖的磁性晶体的聚集体。
磁性晶体可占粒子的约60wt％与约85wt％之间。更特定地说，晶体可占粒子的75wt％与83wt％之间。
在一些实施方案中，通过组合磁性粒子与多糖溶液而初始形成的磁性粒子可为大聚集体，直径在0.5-400微米范围内。因此，在一些所述实施方案中，所述方法可进一步包含减小粒子直径。
粒子直径可以各种方式减小。在一些实施方案中，通过解聚作用将直径减小到约0.5微米与10微米之间。更特定地说，可将直径减小到0.9与2.5微米之间。举例来说，可使用微射流法(microfluidization)来减小粒子直径。在所述实施方案中，可使用外部空气压缩机迫使粒子通过一个或一个以上含有指定尺寸腔室的腔室。或者，可使用挤压法来减小粒子直径。在所述实施方案中，可在气体压力下或经由正排量(positive displacement)迫使粒子通过膜中指定尺寸的孔。
视情况，在形成粒子后，将其洗涤以去除未结合的多糖、具有较低磁化强度的磁性粒子和/或剩余的溶解金属。此外，可将其洗涤以降低悬浮液的pH。举例来说，pH可降低至约7。粒子可例如通过离心洗涤、磁性洗涤和/或切向过滤(tangential filtration)来洗涤。优选地，洗涤是在17℃与25℃之间进行。粒子可用水或用缓冲盐溶液洗涤。
磁性粒子可根据用于磁性分离细胞的多种方法使用。举例来说，在希望分离第一细胞群体与第二细胞群体的实施方案中，磁性粒子可连接于第一细胞群体。磁性粒子可例如通过使用四聚体抗体复合物而连接于第一细胞群体。细胞混合物然后可放在磁场中，并可回收想要的细胞群体。在粒子具有例如＞1微米的大直径的实施方案中，分离时间可相对短，例如小于2分钟，且可使用相对弱的磁场，例如小于20T/m。
在一些实施方案中，希望用FACS分析第一细胞群体。在所述实施方案中，细胞的侧向散射信号的变化可小于约100％，如流式细胞术所检测。
应了解，为了清晰而在分开的实施方案或分开的方面中描述的某些特征也可在单个实施方案中组合提供。相反，为了简洁而在单个实施方案或方面中描述的各种特征也可分开地或以任何适当子组合提供。
虽然已经结合特定实施方案进行了描述，但显然许多替代、修改和变化将为所属领域技术人员显而易见。因此，打算涵盖所有属于随附权利要求书的精神和广泛范围内的所述替代、修饰和变化。此外，本申请中对任何参考文献的引用或鉴别都不应视为承认所述参考文献可用作本发明的现有技术。
实施例
实施例1-粒子合成
根据下文所述的新颖方法制备磁性粒子。
制备铁溶液和碱溶液
在N2通气的去离子水中，使用氯化铁(II)四水合物和氯化铁(III)六水合物，以约1∶2/Fe2+∶Fe3+的摩尔比制备铁溶液。此溶液在使用前用N2通气。试剂储存在顶部空间用N2清洁的条件下以防止氧化。
使用稀释于先前用N2通气的去离子水中的NH4OH溶液，或使用在先前用N2通气的去离子水中的NaOH来制备碱溶液。
结晶
通过流动混合将碱溶液添加到铁溶液中。使用蠕动泵(Dynamax RP-1型)以受控的体积比组合铁溶液与碱溶液。将碱溶液和铁溶液独立地泵送通过Tygon管道(Cole-Parmer)到达Y或T接合部，它们在此处混合并反应，同时组合溶液通过第三长度的管道从接合部流走。当混合物流过此第三长度的管道时发生结晶反应，并导致形成磁性晶体。流动混合结晶步骤是在高达70℃的温度下进行。晶体在任何测试温度(室温到70℃)下形成，但铁溶液在加热到高于50℃时会变浑浊。
晶体包覆
将结晶反应产物与葡聚糖溶液组合，维持在高温(～85℃)下历时指定时间，然后冷却。它们是如上所述使用流动混合来组合，或通过添加到含葡聚糖溶液的容器中来组合。所述葡聚糖溶液是通过将平均分子量在5,000与110,000道尔顿之间的USP质量的葡聚糖溶解于用N2通气的去离子水中来制备，最终浓度在0.5％与20％重量/体积之间。葡聚糖溶液的体积是在步骤2中形成的混合物的体积的0.2到4倍范围内。
解聚
粒子初始是作为大聚集体呈现，直径在3-400μm范围内且群体平均直径在12与100μm之间。通过超声处理、微射流或挤压来解聚粒子。在超声处理的情况下，将粒子超声处理1到60分钟之间的特定时间，以实现期望的平均尺寸分布。在使用微射流的情况下，外部空气压缩机迫使粒子通过一个或多个含有指定尺寸通道的腔室。腔室设计与压力的组合决定最终粒子尺寸。挤压解聚是通过迫使粒子通过膜中指定尺寸的孔来实现。挤压是在气体压力下或通过正排量进行。当使用基于压力的挤压时，选择压缩N2气体。
洗涤
进行洗涤以去除未结合的葡聚糖、具有较低磁化强度的粒子和剩余的溶解铁，并降低悬浮液的pH到约7。洗涤以三种方法中的任一种进行。对于离心洗涤，在平均1000xg下离心悬浮液30分钟，去除上清液并再悬浮粒子。所述工序可视需要重复。对于磁性洗涤，在磁场中分离磁性物质，去除上清液并再悬浮粒子。所述工序可视需要重复。第三种方法涉及通过切向过滤来洗涤，其使用几倍于输入物质的体积以及具有0.05μm孔径大小和3100cm2表面积的膜。在所有情况下，洗涤都用去离子水进行。用于洗涤挤出粒子的最佳温度在17-25℃之间。较高温度不合需要，因为可能发生再聚集。每种洗涤方法在进行过程中体积都改变至少2次且有时改变超过5次。
实施例2-细胞分离
使用购自Stemcell Technologies公司的EasySep试剂，用实施例1中制备的粒子进行细胞分离。对于人类细胞的阳性筛选，用四聚体抗体复合物(TAC)标记单细胞悬浮液，TAC是由连接于抗葡聚糖抗体的针对细胞表面标志物的抗体组成。对于阴性筛选，用靶向不想要细胞的TAC的混合液标记细胞。在温育细胞和TAC之后，将磁性粒子添加到细胞悬浮液中并进行温育，以允许粒子经由TAC上的抗葡聚糖抗体与细胞结合。
然后将细胞悬浮液稀释到指定体积并放在磁体中。用粒子标记的细胞因为磁场梯度而移动到管的侧壁。未经标记的细胞连同上清液一起移除。一旦移走磁场就收集被靶向的经标记细胞。粒子可用于阳性或阴性地筛选各种细胞来源的人类细胞类型。
通过使用光密度(OD)或测量粒子干质量来测量粒子浓度。OD是用作粒子浓度的替代度量。储备粒子OD是从已知稀释液的OD计算而来，所述稀释液的OD在0.3与2.0之间，如使用分光光度计所测量。用于细胞分离的OD是基于样品中的有效最终OD，其基于样品中储备液的稀释度。对于使用如实施例1中制备的粒子的阳性筛选实验，典型的粒子浓度在OD 0.5到OD 6的范围内。对于阴性筛选，典型的粒子浓度在OD 1到OD 24的范围内。干质量是用作粒子浓度的度量。用于细胞分离的干质量是基于在稀释储备样品后测量的干质量。对于使用如实施例1中制备的粒子的阳性筛选实验，典型的粒子浓度在0.05到0.6mg的范围内。对于阴性筛选，典型的粒子浓度在0.1到2.4mg的范围内。
从外周血单核细胞(PBMC)阳性筛选的人类细胞类型包括CD3+(STEMCELL Technologies，目录号18051)、CD4+(目录号18052)、CD33+(目录号18527)、CD19+(18054)和CD34+(目录号18056)。从全血阳性筛选的人类细胞类型包括CD3+(目录号18081)、CD15+(目录号18681)、CD19+(目录号18084)和CD33+(目录号18287)。从PBMC阴性筛选的人类细胞类型包括CD3+T细胞(目录号19051)、CD4+T细胞(目录号19052)、CD4+纯真T细胞(目录号19155)、CD4+记忆T细胞(目录号19157)、CD8+T细胞(目录号19053)、CD19+B细胞(目录号19054和19154)、CD56+NK细胞(目录号19055)、CD14+CD16-单核细胞(目录号19059)、CD14+CD16+单核细胞(目录号19058)、pan树突细胞(目录号19251)、嗜酸性粒细胞(目录号19256)、嗜碱性粒细胞(目录号19069)、嗜中性粒细胞(目录号19257)、CD34+造血祖细胞(目录号19056和19057)。从用HetaSepTM处理的全血阴性筛选的人类细胞类型包括CD3+和CD19+总淋巴细胞(目录号19961HLA)、CD3+T细胞(目录号19951HLA)和CD19+B细胞(目录号19054HLA)。
首先用结合抗体，然后用TAC，最后用包覆有葡聚糖的粒子标记小鼠脾细胞或骨髓细胞，TAC是由针对连接于抗葡聚糖抗体的结合物的抗体组成。在本实施例中，使用生物素作为结合物。从脾细胞制剂阴性筛选的小鼠细胞类型包括CD3+T细胞(目录号19751)、CD4+T细胞(目录号19752和19772)、CD8+T细胞(目录号19753)和B细胞(目录号19754)。CD34+造血祖细胞(目录号19756)是从骨髓制剂阴性筛选，且间质祖细胞(目录号19771)是从密质骨制剂阴性筛选。
当从人类和小鼠细胞来源(通过阳性或阴性筛选)筛选造血祖细胞时，群落形成细胞分析(Stemcell Technologies)显示，与使用纳米粒子(目录号18150)筛选的细胞相比和与未进行免疫磁性筛选的细胞相比用本文描述的粒子筛选的细胞具有健康且典型的形态。
通过流式细胞术，使用适用于想要细胞类型的荧光标记细胞确定想要细胞的纯度。从起始和被富集样品中存在的想要类型的细胞数量计算想要细胞的回收率。回收率是以被富集样品中想要细胞的数量除以起始样品中想要细胞的数量计算。起始和被富集样品中想要细胞的数量是通过样品中细胞的总数(从样品体积和细胞浓度确定)乘以想要细胞浓度(通过流式细胞术确定)来确定。细胞浓度是使用血细胞计数器确定。
实施例3-粒子尺寸和形态
使用多角度光散射器(Horiba LA-950仪器)，遵循制造商推荐的样品制备程序评估如实施例1所述形成的粒子的粒子尺寸。通常测量到0.2到30μm平均直径的粒子尺寸。
通过亮视野显微法检查粒子的形态特征。在挤压之前对粒子的显微观察显示被葡聚糖基质围绕的结晶磁性物质的不规则聚集体。在挤压后，粒子呈现球状或杆状。
实施例4-方法变量对粒子形成的影响
铁溶液浓度是以Fe(II)比Fe(III)的1∶2摩尔比用氯化铁(II)四水合物和氯化铁(III)六水合物制成的溶液中的总可溶铁浓度报导。[例如32mM溶液是10.7mMFe(II)和21.3mM Fe(III)]。测试8mM与385mM之间的铁溶液浓度。用低于8mM的铁溶液制造的粒子并不持久：基于溶液颜色从褐色变为黑色的粒子形成证据只是短暂的，溶液在1分钟内会变回淡褐色。使用1mM的铁浓度不会形成可见粒子。高于约150mM的铁溶液浓度产生非常大的粘性聚集体，其实际上无法使用。
评估1％到30％的NH4OH溶液浓度。基于pH研究显示晶体形成在低于10.5的pH值下会受损，碱/铁混合物的目标最小pH是10.5。使用32mM铁溶液和流动混合装置中的1∶1铁∶碱体积流量比，通过使用6％碱溶液浓度获得所述目标pH。3％的碱溶液浓度略低于所述目标pH，而1％则太低。高于6％的碱浓度不会显著促进粒子形成。
用流动混合方法以不同的体积比组合铁(32mM)和碱溶液(6％到30％NH4OH)。5∶1、3∶1、2∶1和1∶1的铁溶液：NH4OH比率所产生的粒子在细胞分离中表现相等，只要最终pH大于10。操控流量比与操控溶液浓度具有类似的作用。
在0秒到几小时(分批混合)范围内评估温育时间对铁和碱溶液混合物的影响(在添加葡聚糖之前)。停留时间可通过改变管道长度(使用1到30cm长度)和改变管道直径(使用0.3到2cm直径)来改变。对于分批温育，使用伴有或不伴有搅动的独立储罐(1mL到30mL体积)。混合后的短停留时间(≤5秒)被发现是最理想的。延长的停留时间(30-180秒)产生较大的粒子聚集体(高达20微米直径)，其不适合用于细胞分离但可用于稠密粒子应用。
在组合磁性晶体与葡聚糖之后，进行挤压步骤以解聚粒子并确保均匀的尺寸分布。用于挤压的最佳温度被发现是约室温(约20-25℃)。较高温度(＞40℃)不合需要，因为可能发生再聚集。测试低至0.01mL/min/cm2和高达50mL/min/cm2的通量率。用于挤压的最佳通量率是约0.5mL/min/cm2。较低的通量率导致处理时间较长。较高的通量率导致平均粒子尺寸较小且细胞分离性能较差。
通过微射流法解聚粒子是成功的，但缺乏适当控制，无法令过程像挤压一样稳定。为了实现期望粒子尺寸，微射流机(microfluidizer)以压力范围的下限工作。
实施例5-细胞分离：合成期间铁和碱溶液浓度的影响
在结晶步骤中，使用NH4OH或NaOH如实施例1所述制备粒子。将32mM铁溶液与NH4OH或NaOH流动混合，并将获得的晶体在～85℃下添加到15％w/vT-40葡聚糖溶液中。研究1％、6％和30％NH4OH溶液与0.2M和1.0M NaOH溶液。
表1显示使用所得粒子分离CD19+细胞的结果。用1∶1混合的30％NH4OH和1∶1混合的0.2MNaOH合成的粒子皆具有类似的＞11的最终pH，但用NaOH制得的粒子在细胞分离后产生较低的CD19+细胞回收率。这表明两种碱之间的性能差异不是因为最终pH的差异(先前实验证明使用NH4OH在＞pH10下的粒子合成很稳定)，而是因为粒子形成方式的一些其它差异。
表1-在细胞分离中碱类型对于粒子性能的影响
从先前冷冻的PBMC阳性筛选CD19+细胞。
实施例6-细胞分离：Fe(II)∶Fe(III)比率的影响
通过在如实施例1所述的结晶步骤中使用分批方法和流动细胞方法制造粒子，然后如实施例2所述从人类PBMC进行阴性筛选NK来测试Fe(II)∶Fe(III)的影响。表2中的结果显示分批合成方法产生的粒子对于细胞分离的适用性不如流动混合方法。此外，结果显示将每种铁组分的量增多25％或100％仍会导致形成粒子，但添加增多量的Fe(II)或Fe(III)会导致粒子产率较低和粒子在细胞分离应用中的性能较差。
表2-铁浓度对于细胞分离性能的影响
从先前冷冻的PBMC阴性筛选NK细胞。和CD56+CD3-一样分析纯度。使用血细胞计数器从细胞计数计算回收率。
实施例7-细胞分离：葡聚糖溶液浓度和pH的影响
如实施例1所述在水中制备浓度为0.5％到20％的葡聚糖溶液。大于20％w/v葡聚糖的溶液不实用，因为这会增加葡聚糖溶解的难度。使用NH4OH将葡聚糖溶液的pH调节到pH 5与pH 11之间。使用这些葡聚糖溶液制造的粒子如实施例2所述用于细胞分离中。表3关于CD19+筛选的数据显示在粒子合成期间使用较高pH的葡聚糖溶液会产生在细胞分离中使用时提供较高纯度和回收率的粒子。葡聚糖溶液的pH为10.6似乎好于pH 11.3。表4显示使用以不同葡聚糖浓度和pH的葡聚糖溶液制造的粒子的NK细胞阴性筛选的结果，其中在包覆步骤中伴有和不伴有通气。此表中的数据证实高pH葡聚糖溶液对于纯度和回收率很重要，且包覆步骤中的氮气通气导致纯度较低，与葡聚糖浓度无关。对于使用pH 10到10.6的15％w/v葡聚糖溶液制造的粒子获得了最好的细胞分离结果。用低于3％w/v的葡聚糖制备的磁性粒子导致粒子聚集不受控制，其中平均粒子尺寸大于5μm。在包覆过程中使用较少葡聚糖的这些较大聚集体也导致细胞分离性能较差。归因于所述结果，认为葡聚糖是钝化粒子表面、防止粒子聚集和改良细胞分离性能所必需的。
表3-吸附pH对于细胞分离性能的影响
从先前冷冻的PBMC阳性筛选CD19+细胞。
  葡聚糖％   吸附pH   纯度％   回收率％
  15   5   19   0.02
  15   9.8   96   33
  15   10.6   99   71
  15   11.3   99   59
表4-吸附期间葡聚糖％、吸附pH和搅动对于细胞分离性能的影响
从先前冷冻的PBMC阴性筛选NK细胞。使用流式细胞术和CD56+CD3-一样分析纯度。
  葡聚糖％   吸附pH   N2通气   纯度％   回收率％
  15   10   有   60   73
  0.5   10   有   11   100
  15   10   无   89   94
  0.5   10   无   24   82
  15   8   有   9   46
  0.5   8   无   17   65
  5   10.6   无   75   89
  10   10.6   无   83   89
  15   10.6   无   97   72
  20   10.6   无   73   102
实施例8-细胞分离：葡聚糖溶液温度和温育时间的影响
实施例1中使用的葡聚糖溶液的温度在20℃与90℃之间变化。然后如实施例2所述在CD19+细胞分离中测试制造的粒子。如表5中所见，在使用以70℃葡聚糖溶液制造的粒子的情况下，阳性筛选中被靶向细胞群体的回收率显著高于20℃葡聚糖溶液的情况。这可能是因为在较高温度下发生了葡聚糖与晶体表面的优良结合(Bautista，Bomati-Miguel等人)。对于用10kDa和40kDa葡聚糖制造的葡聚糖溶液皆观察到了回收率的所述提高。表6显示在组合晶体与多糖溶液的步骤中将温育时间从2小时增加到7小时对10kDa和40kDa葡聚糖的细胞分离结果不具有显著影响。未发现低至1小时的加热吸附时间对细胞分离性能具有不利影响。
表5-吸附温度对于细胞分离性能的影响
从先前冷冻的PBMC阳性筛选CD19+细胞。
  葡聚糖类型   吸附条件   纯度％   回收率％
  10kDa   2h～20℃   99   19
  10kDa   2h＞70℃   99   42
  40kDa   2h～20℃   98   26
  40kDa   2h＞70℃   99   40
表6-吸附时间对于细胞分离性能的影响
从先前冷冻的PBMC阳性筛选CD19+细胞。
  葡聚糖类型   吸附条件   纯度％   回收率％
  10kDa   2h＞70℃   97   27
  10kDa   7h＞70℃   99   31
  40kDa   2h＞70℃   99   36
  40kDa   7h＞70℃   99   26
实施例9-细胞分离：添加剂的影响
研究在吸附过程中添加各种赋形剂(包括5M NaCl、85％乙醇、10％Tween-20表面活性剂)的影响。吸附期间20％的最终体积是由添加剂溶液组成。如表7中所见，对于在不添加这些赋形剂中任一种的情况下吸附的粒子观察到最好的细胞分离性能。
将不同的赋形剂添加到葡聚糖溶液中，包括盐(5M NaCl)、醇(85％乙醇)和表面活性剂(10％Tween-20)。20％的最终体积是由添加剂溶液组成。表7的数据显示，在从先前冷冻的人类PBMC阴性筛选NK细胞的过程中，使用体积对照物(volume control)代替赋形剂制备的粒子的性能比用赋形剂制备的粒子有所提高。
表7-吸附期间添加的赋形剂对于细胞分离性能的影响
从先前冷冻的PBMC阴性筛选NK细胞。
  添加剂   纯度％   回收率％
  体积对照物   87   100
  5M NaCl   53   100
  85％EtOH   44   27
  Tween-20   83   67
实施例10-细胞分离：粒子尺寸和用于确定粒子浓度的方法的影响
通过实施例1所述的方法使用挤出膜解聚粒子获得～1.8微米-～18微米的粒子尺寸范围。粒子尺寸是用Horiba LA-950测量，其使用多角度光散射器和两个不同的激光器来确定粒子尺寸。挤压粒子通过如表8所示具有5微米、3微米和2微米孔径大小的制造的聚碳酸酯径迹蚀刻膜(polycarbonate track etchmembrane)的不同组合。粒子在添加到细胞悬浮液之后的最终OD(粒子浓度)是6.0。表8显示使用OD测量粒子浓度的情况下的细胞分离性能(NK阴性筛选)与粒子尺寸无关。较大的粒子容易快速沉淀，因此优选直径是～2微米。
通过实施例1所述的使用挤出膜解聚粒子的方法获得～1.0微米-～3.1微米的粒子尺寸范围。粒子尺寸是用Horiba LA-950测量。挤压粒子通过具有5微米、3微米和2微米孔径大小的聚碳酸酯径迹蚀刻膜。将干质量0.6mg的粒子添加到每个1.0ml细胞悬浮液(0.6mg/ml)中以确保粒子的量是一致的。表9显示细胞分离性能(NK阴性筛选)依赖于粒子尺寸，其中较大的平均粒子直径产生较低纯度。较低纯度可通过在细胞分离中再添加50％粒子(即0.9mg/ml)来弥补。这些数据表明细胞分离性能依赖于细胞分离中供TAC连接的粒子表面积。因为在所有细胞分离物中添加相同浓度的粒子，所以较大粒子供TAC连接的表面积较低，导致细胞纯度较低。添加更多粒子是通过增加所存在的总表面积并导致较大粒子在较低浓度下也具有与较小粒子相同的性能来补救此问题。直径低于约1微米的粒子导致细胞回收率较低，其中0.6微米直径的粒子获得低于40％的回收率。这表明在较小直径下表面积的增加也会增加与细胞的非特异性结合。因此，在1.0与2.5μm之间的平均粒子直径似乎是最好的，此时在细胞分离中获得最高的纯度和回收率。
测量少数不同样品的干质量和OD以确定用于细胞分离的浓度的这两个度量之间是否有直接关联。从表10看出，这两个度量之间有松散的关联。然而，具有最高干质量的粒子并不对应于具有最高OD的粒子。这可能是因为不同样品之间尺寸的差异。根据米氏理论(Mie theory)，较大粒子(均值＝3μm)与较小粒子(均值＝1μm)相比将具有较大量的前向散射光，与在相同干质量浓度的较小粒子相比，这将导致较高水平的透射光和较低的吸光度或OD值。这解释了表9中使用OD作为粒子浓度度量未发现细胞分离性能差异的数据。这是因为较大粒子(均值＝18μm)物理上要求溶液中存在更多的粒子以实现相同OD，且更多的粒子会提高细胞分离性能，而所述性能受较大粒子尺寸不利影响。
表8-粒子尺寸对于细胞分离性能(OD)的影响
从先前冷冻的PBMC阴性筛选NK细胞。
表9-粒子尺寸对于细胞分离性能(干质量)的影响
从先前冷冻的PBMC阴性筛选NK细胞。
表10-OD与干质量之间的关系
  OD   干质量(mg/ml)   平均直径(微米)
  58.2   5.8   1.10
  56.3   6.4   2.59
  57.9   6.7   3.07
  60.6   6.3   2.82
  59.1   5.9   1.48
  60.1   6.7   2.35
  60.7   5.8   1.11
实施例11-细胞分离：比较微米粒子和纳米粒子-在流式细胞术中粒子对于光散射的影响
如实施例1所述制造的粒子用于新鲜血液的CD3阳性筛选。作为对照，用微米粒子(目录号19250)筛选CD3细胞。本文描述的粒子的平均直径是1.1μm，而微米粒子的平均直径是约1.0μm。图1显示被富集细胞的流式细胞术的图示。图A和B显示用本文描述的粒子筛选的细胞的CD3+细胞纯度与用微米粒子筛选的细胞类似。CD3+细胞的回收率也类似。然而，用本文描述的磁性粒子筛选的细胞的侧向散射信号(图D)显著低于用微米粒子筛选的细胞(图C)。实际上，用本文描述的粒子筛选的细胞的光散射信号基本上和未筛选细胞的信号相同。这显示本文描述的粒子在阳性筛选中与微米粒子相比具有显著优势，因为被筛选细胞的流式细胞术中的光散射信号基本上和想要细胞在筛选前的信号相等。
使用本文描述的粒子阳性筛选的细胞在FACS分析后不展现显著的侧向散射变化。相比之下，用类似尺寸的微米粒子筛选的细胞展现侧向散射特征的变化。来自其它供应商的类似直径的粒子也引起显著的侧向散射变化。使用本文描述的粒子连同微米粒子、包覆有葡聚糖的Dynal和Merck微米粒子、和纳米粒子从新鲜全血阳性筛选CD3。表11显示粒子直径，以及阳性筛选的细胞的纯度，和在流式细胞术分析期间获得的阳性细胞的平均前向和侧向散射信号。结果显示虽然在细胞分离后靶标细胞的纯度是类似的，但对侧向散射(SSC)的影响却和所用粒子类型强烈相关。用本文描述的粒子筛选的CD3+细胞具有65的平均SSC信号。使用类似直径(在1.1到2.5μm范围内)的其它粒子筛选的细胞具有约130与200之间的平均SSC信号。
表11-各种粒子类型的侧向散射变化
使用本文描述的粒子分离的细胞在多种粒子尺寸下都没有被观察到侧向散射变化。各种粒子尺寸是通过挤压获得，且所得粒子用于从新鲜全血阳性筛选CD4+群体。在流式细胞术中检测的CD4+T细胞群体是CD45+CD14-CD4+，且检测的CD4+单细胞群体是CD45+CD14+。两种群体在微米粒子的情况下皆显示显著的SSC变化，但在本文描述的粒子的情况下不显示SSC变化，与粒子直径无关。这些实验的结果总结在表12中。
表12-各种粒子尺寸的侧向散射变化
还研究在本文描述的粒子的制备中使用的葡聚糖的浓度和分子量的影响。如实施例1所述制造的粒子用于冷冻PBMC的CD3阳性筛选中。作为对照，用纳米粒子(目录号19250)筛选CD3细胞。根据实施例1，使用不同的葡聚糖溶液浓度和葡聚糖分子量制备粒子。表13的数据显示相对于与使用纳米粒子分离的细胞的SSC变化使用本文描述的粒子分离的细胞的侧向散射(SSC)变化[(SSC粒子-SSC纳米粒子)/SSC纳米粒子]与合成期间的葡聚糖浓度无关。这可能是因为葡聚糖在低至5w/v％的浓度下已经是过量的。也测试更低浓度的葡聚糖(3和1w/v％)，但合成的粒子形成大的结块，表明没有存在足够的葡聚糖以钝化粒子表面和防止聚集。
使用不同分子量的葡聚糖来研究对粒子中的葡聚糖量的影响。前提是用类似数量的葡聚糖分子包覆粒子，但较低分子量会导致被包覆粒子中葡聚糖的重量％较低。粒子中较低重量％的葡聚糖会导致有效折射率较低且根据米氏理论的侧向散射较少。相比40KDa样品，在5kDa葡聚糖样品中观察到这种现象(表13)，其中较低重量百分比的葡聚糖产生较高的侧向散射变化。在使用110kDa粒子的情况下，侧向散射变化％没有降低。一种可能的解释是较高分子量的葡聚糖分子具有防止围绕粒子包覆的位阻效应，从而导致葡聚糖的质量％与40kDa样品类似，且因此产生类似的侧向散射特征。
表13-作为葡聚糖浓度和葡聚糖分子量函数的侧向散射变化
葡聚糖分子量的变化对制备的平均粒子尺寸具有影响。用5kDa葡聚糖合成的样品E(表13)在挤压前具有最小的平均粒子直径，其中通过光散射测量的尺寸是2.0微米。增加葡聚糖的分子量会增加粒子尺寸。当在合成后立即测量时，用分子量为40和110kDa的葡聚糖合成的粒子分别具有6.3微米和21.5微米的平均直径。粒子尺寸对粒子产率具有影响。因为用5kDa葡聚糖制造的粒子大部分都较小，所以它们磁性较弱且在磁性洗涤步骤中被去除。用110kDa葡聚糖制造的粒子要大得多，且含有大群集体，其在挤压期间被过滤掉。40kDa粒子具有最适合挤压的尺寸，并且也导致最佳产率。
将本文描述的粒子用于如实施例2所述的使用全血(被洗涤的血沉棕黄层(buffy coat))的CD14阳性筛选方案中。使用本文描述的粒子的CD14+细胞的回收率(65％)显著高于用纳米粒子分离的对照样品(12％)。在使用纳米粒子筛选细胞的情况下，被富集样品的纯度较高。这可能是因为高粒子浓度引起本文描述的粒子发生非特异性结合。虽然粒子浓度很可能过量，但用本文描述的粒子筛选的细胞的SSC信号与用纳米粒子筛选的细胞的SSC信号相等。这显示于图2中。
将本文描述的粒子、EasySep微米粒子和EasySep纳米粒子用于如实施例2所述的使用新鲜血液(被洗涤的白细胞层)的CD4阳性筛选方案中。使用多谱段成像流式细胞仪(Amnis ImageStream)分析用三种不同粒子回收的CD4+细胞，所述多谱段成像流式细胞仪允许组合流式细胞术观察多个单细胞(显微分析)。使用亮视野影像分析本文公开的粒子在细胞表面的可见性显著小于EasySep微米粒子，即使两种粒子在尺寸上类似(直径≈1微米)。本文描述的粒子在细胞表面的可见性与尺寸小得多的EasySep纳米粒子(～250nm)类似。此外，使用本文描述的粒子阳性筛选的细胞与其它两种粒子相比展现最小的侧向散射特征。
实施例12-替代性粒子表面
用温和氧化剂(如乙酸钠缓冲液中的仲高碘酸钠)氧化粒子上的葡聚糖包覆层。这导致碳水化合物部分氧化成醛基。延长反应会导致醛基氧化成羧基。
如实施例1所述制备粒子并将其再悬浮于pH 7.2的0.1M磷酸钠缓冲液中。在pH 5.5的0.1M乙酸钠缓冲液中制备20mM仲高碘酸钠。将等体积的粒子悬浮液和仲高碘酸钠溶液于在光保护的容器中在2-8℃下混合30分钟。将粒子混合物在0.1M磷酸钠缓冲液中磁性洗涤一次，并以初始粒子悬浮液体积再悬浮于0.1M磷酸钠缓冲液中。
将几种表面结合物中的一种添加到被洗涤的粒子中。添加的结合物包括2mg/mL的生物素LC酰肼(Pierce；Fisher目录号PI-21340)、1mg/mL的抗生物素抗体(Clone C6D5.1.1，StemCell Technologies)、0.25mg/mL的抗生蛋白链菌素(Pierce；Fisher目录号PI-21120)和0.25mg/mL的抗生蛋白链菌素酰肼(Pierce；Fisher目录号PI-21122)。混合物然后在倾斜摇床(tilt-rotator)上室温温育2小时。在表面结合物是抗生蛋白链菌素或抗生蛋白链菌素酰肼的情况下，在最初2小时温育后将样品一分为二，并将等体积的10％Tween-20(BioRad目录号170-6531)的dH2O溶液添加到一个体积中，并在倾斜摇床上室温温育另外30分钟。温育后，所有样品用蒸馏水磁性洗涤3次，并以初始体积再悬浮于dH2O中。
如实施例2所述在小鼠CD4T细胞阴性筛选中测试结合粒子。用针对细胞表面标志物的生物素化抗体标记不想要的细胞。被标记后，用适用于粒子表面化学的各种方法筛选细胞，并将其与典型的包覆葡聚糖的粒子策略相比较。表14总结筛选策略和细胞分离结果。在测试的四种表面结合物中，抗生蛋白链菌素酰肼产生最理想的细胞分离。进一步优化氧化和结合程序以及细胞分离条件很可能提高其它结合物的性能。即使在未优化的条件下，测试的所有细胞分离策略都显示靶标群体的富集。使用流式细胞术分析测量的期望群体是CD3+CD4+。本实施例显示粒子包覆层可被官能化处理。
表14-使用替代性筛选策略的小鼠CD4T细胞的阴性筛选
也在小鼠CD4+T细胞(目录号18752和18556)的阳性筛选中测试结合粒子。用生物素化抗CD4抗体标记想要细胞，然后用适用于粒子表面化学的各种方法筛选。结果总结于表15中。虽然在这些粒子的情况下靶标细胞的纯度和回收率很低，但用这些粒子筛选的细胞在FACS分析期间不展现SSC信号的显著变化。
表15-使用各种筛选策略的小鼠CD4T细胞的阳性筛选
实施例13-测量物理特征
使用Hitachi H-7600显微镜对本文描述的粒子的多个样品进行透射电子显微分析(TEM)。TEM显示～1μm直径的粒子是由群集在一起的5-50nm直径的球形Fe3O4晶体构成(图3)，其中平均晶体尺寸是15-20nm。不同的合成条件似乎不会对Fe3O4晶体的尺寸具有显著影响。TEM还显示存在葡聚糖作为钝化层，其围绕Fe3O4晶体的群集体(图3b)。葡聚糖似乎将Fe3O4晶体维持在一起以形成～1μm直径的粒子，所述直径是如实施例3所述使用Horiba仪器通过光学显微法测量。
使用配备有EX STAR 6000温度控制平台的Seiko SII-6300进行热重分析(TGA)以确定粒子中葡聚糖的质量％，并使用Quantum Design的SP-550超导量子干涉装置(SQUID)确定1T下的磁矩。所述粒子具有约17％与25％之间的葡聚糖质量％。表16显示在不同条件下合成且具有17％到20％的葡聚糖％范围的粒子的TGA结果。具有17％与25％之间的葡聚糖质量％的粒子在CD3阳性筛选中的性能一样好，且所述粒子显示相对低的侧向散射(实施例10)。
粒子的SQUID测量值显示磁化强度在45与60emu/g之间变化。磁化强度的变化对通过阴性或阳性筛选磁性分离被标记细胞所必需的时间不具有显著影响。
表16-用不同条件合成的粒子的葡聚糖质量％和磁化强度

Claims (30)

1.一种磁性粒子，其包含：
a.多糖基质；和
b.分散于所述基质中的多个包含过渡金属氧化物的磁性晶体，其中所述磁性晶体占所述粒子的75到83wt%。
2.根据权利要求1所述的磁性粒子，其中所述磁性粒子的粒子直径在0.5微米与10微米之间。
3.根据权利要求1所述的磁性粒子，其中所述磁性粒子的直径在0.9微米与2.5微米之间。
4.根据权利要求1所述的磁性粒子，其中所述过渡金属氧化物是氧化铁。
5.根据权利要求1所述的磁性粒子，其中所述过渡金属氧化物包含Fe2O3和Fe3O4中的至少一种。
6.根据权利要求1到5中任一权利要求所述的磁性粒子，其中所述磁性晶体的晶体直径在5nm与50nm之间。
7.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的磁性粒子，其中所述多糖是葡聚糖。
8.根据权利要求1到3中任一权利要求所述的磁性粒子，其中所述磁性晶体均匀地分散在所述基质中。
9.一种制造磁性粒子的方法，其包含：
a.组合碱性溶液与金属离子溶液，并使所述金属离子氧化形成包含过渡金属氧化物的磁性晶体；
b.组合所述磁性晶体与多糖溶液并使所述磁性粒子形成，其中所述磁性晶体占所述粒子的75到83wt%。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述磁性粒子包含分散于多糖基质中的磁性晶体。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述碱性溶液的pH是至少9.5。
12.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的方法，其中所述碱性溶液和所述金属离子溶液以1:1与5:1之间的体积比组合。
13.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的方法，其中所述碱性溶液和所述金属离子溶液组合形成pH为至少9.5的混合物。
14.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的方法，其中所述碱性溶液和所述金属离子溶液通过流动混合来组合。
15.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的方法，其进一步包括通过解聚作用将所述磁性粒子的平均直径减小到0.5微米与10微米之间。
16.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的方法，其进一步包括通过解聚作用将所述磁性粒子的平均直径减小到0.9微米与2.5微米之间。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述磁性粒子的平均直径通过膜挤压法和均质化法中的一种来减小。
18.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的方法，其中所述碱性溶液是氢氧化铵。
19.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的方法，其中所述金属离子溶液包含下列的至少一种：钴、锰、镍和铁离子。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述金属离子溶液是铁溶液。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述铁溶液包含1份Fe2+：2份Fe3+。
22.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的方法，其中步骤（a）包括使所述碱性溶液和金属离子溶液流到一起持续一段时间。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述一段时间大于0.1秒且小于180秒。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述一段时间大于0.1秒且小于5秒。
25.根据权利要求9到11中任一权利要求所述的方法，其中所述多糖溶液包含淀粉、葡聚糖、羟乙基淀粉、纤维素和部分或完全取代氨基-葡聚糖中的至少一种。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述多糖溶液包含葡聚糖。
27.一种根据权利要求9到26中任一权利要求所述的方法制备的磁性粒子。
28.一种分离悬浮于流体中的第一细胞群体与第二细胞群体的方法，所述方法包括：
a.使多个根据权利要求1到8中任一权利要求所述的磁性粒子连接于所述第一细胞群体；
b.将所述第一和第二细胞群体放在磁场中；和
c.回收所述第一或第二细胞群体中的一种。
29.根据权利要求28所述的方法，其中使用四聚体抗体复合物将所述磁性粒子连接于所述第一细胞群体。
30.根据权利要求29所述的方法，其进一步包括：
d.通过荧光活化细胞分选分析所述第一细胞群体，其中在结合于所述磁性粒子时所述第一细胞群体的侧向散射信号的变化小于100%。
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