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CN108254346B - 以dna为模板的磁性荧光共聚物纳米探针及应用 - Google Patents

以dna为模板的磁性荧光共聚物纳米探针及应用 Download PDF

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CN108254346B
CN108254346B CN201810054708.3A CN201810054708A CN108254346B CN 108254346 B CN108254346 B CN 108254346B CN 201810054708 A CN201810054708 A CN 201810054708A CN 108254346 B CN108254346 B CN 108254346B
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Abstract

本发明涉及一种以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针，包括线性的模板DNA链，所述模板DNA链上依靠识别DNA序列分别与具有超顺磁性质的磁纳米颗粒、具有荧光性质的量子点纳米颗粒以及能够特异性识别肿瘤细胞的DNA或RNA适配体相连接，且所述磁纳米颗粒或量子点纳米颗粒与DNA或RNA适配体交替连接在所述模板DNA链上。本发明还公开了上述磁性荧光共聚物纳米探针作为识别循环肿瘤细胞制剂中的应用。本发明的纳米探针能够放大磁信号、荧光信号，对肿瘤细胞具有较高的特异性选择，对正常血细胞有较低的非特异性吸附。

Description

以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针及应用
技术领域
本发明涉及纳米生物材料技术领域，尤其涉及一种以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针及应用。
背景技术
循环肿瘤细胞(CTC)在肿瘤转移中居于重要地位，而90％的肿瘤引起的死亡是由于肿瘤转移导致的。因此，早期诊断和治疗以防止原发性肿瘤的扩散转移，在减少死亡率上起着重要的作用。循环肿瘤细胞在癌症早期阶段就存在患者外周血中，因此它可以作为癌症的诊断和治疗的重要生物指标。然而，目前存在的最大的困难是与血液中的正常细胞相比循环肿瘤细胞的数量极其稀少，通常肿瘤患者的血液中循环肿瘤细胞的浓度只有1-3000个/毫升，而红细胞的浓度109个/毫升，白细胞的浓度107个/毫升。为了捕获循环肿瘤细胞，已经发展了一系列的分离富集技术，主要可以分为两大类：第一类物理分离方法，如利用肿瘤细胞与正常血细胞的尺寸差异，密度差异，形态差异等实现细胞的分离富集；第二类，亲和力方法，如利用抗体或适配体特异性捕获肿瘤细胞，实现细胞的分离富集。
在以上方法中，免疫磁分离技术因为操作简单，细胞捕获效率高而得到广泛应用。传统的免疫磁分离技术在尺寸较大的磁珠表面修饰抗体，对循环肿瘤细胞进行捕获。但是大尺寸的磁珠在血液中会团聚或沉淀，从而影响分离效率。Wang等(Biomaterials 2011,32,9758)报道了一种利用尺寸为30nm的磁纳米颗粒，表面修饰抗体，实现了对肿瘤细胞高效率的分离。但是该方法使用抗体来捕获循环肿瘤细胞，所以检测成本很高。Kim等(small2015,11,2536)先在量子点表面修饰抗体对肿瘤细胞进行识别，然后加入二抗修饰的磁纳米，结合到量子点表面，与直接使用抗体修饰的磁纳米相比，大大提高了肿瘤细胞的捕获效率。但是该方法使用抗体来捕获循环肿瘤细胞，所以检测成本高，而且该方法捕获纯度较低，只有18％-23％。CellSearch系统是美国食品药品监督管理局(FDA)唯一批准的循环肿瘤细胞检测系统，利用在磁纳米核心周围的聚合物层上涂覆有针对EpCAM的抗体，来捕获血液中所有表达EpCAM抗原的细胞。在免疫磁体完成了捕获并富集之后，对细胞进行通透，添加荧光试剂以识别并计数循环肿瘤细胞。CellSearch系统虽然具有较高的捕获效率及较好的重复性，但是也存在一些缺点：仪器设备价格昂贵；因为使用抗体来捕获循环肿瘤细胞，所以检测成本高；循环肿瘤细胞的捕获纯度非常低；检测需要对细胞进行通透，使得捕获细胞失去活性。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针及应用，本发明的纳米探针磁信号、荧光信号强，同时对肿瘤细胞具有较高的特异性选择，对正常血细胞有较低的非特异性吸附。
在一方面，本发明提供了一种以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针，包括线性的模板DNA链，模板DNA链上依靠识别DNA序列分别与具有超顺磁性质的磁纳米颗粒、具有荧光性质的量子点纳米颗粒以及能够特异性识别肿瘤细胞的DNA或RNA适配体相连接，且磁纳米颗粒或量子点纳米颗粒与DNA或RNA适配体交替连接在模板DNA链上。
进一步地，模板DNA链具有三种重复单元的识别DNA序列且三种识别DNA序列交替出现。
进一步地，磁纳米颗粒、量子点纳米颗粒和DNA或RNA适配体上均连接有与所述识别DNA序列互补的碱基序列。
进一步地，量子点纳米颗粒由Ⅱ-Ⅵ族、Ⅳ-Ⅵ族、Ⅰ-Ⅵ族、Ⅱ-Ⅴ族、Ⅲ-Ⅴ族元素组成。
进一步地，量子点为二元量子点或三元量子点。二元量子点如碲化镉、硒化镉、硫化镉、硫化铅、硒化铅、硫化银、硒化银、硫化锌、硒化锌、碲化锌、磷化镉、砷化镉、磷化铟和砷化铟中的一种或几种。三元量子点如镉汞碲、镉汞硒、镉汞硫、锌汞碲、锌汞硒、锌汞硫、锌镉碲、锌镉硒、锌镉硫，锌碲硒，锌碲硫、锌硒硫、镉碲硒、镉碲硫、镉硒硫、锌铜硒、锌锰硒、铜铟硫和铜铟硒中的一种或几种。
进一步地，磁性纳米颗粒的材质为Fe3O4、γ-Fe2O3、CoFe2O4、NiFe2O4和MnFe2O4中的一种或几种。
进一步地，磁性纳米颗粒的粒径为5-100nm。
进一步地，磁性荧光共聚物纳米探针的制备方法包括以下步骤：
将线性的模板DNA链、量子点纳米颗粒、磁纳米颗粒和特异性识别肿瘤细胞的DNA或RNA适配体混合后进行反应，得到所述磁性荧光共聚物纳米探针，所述模板DNA链上带有识别DNA序列，所述量子点纳米颗粒、磁纳米颗粒和DNA或RNA适配体上分别连接有与识别DNA序列互补的碱基序列。
进一步地，线性的模板DNA链、磁纳米颗粒、量子点纳米颗粒和特异性识别肿瘤细胞的DNA或RNA适配体的摩尔比为1:1-10:2-40:2-50。优选地，摩尔比为1:7:3:10。
在本发明一具体实施例中，磁性荧光共聚物纳米探针的制备方法包括以下步骤：
(1)将C1DNA序列与量子点连接起来，形成DNA-量子点；
(2)将C2DNA序列与磁性纳米颗粒连接起来，形成DNA-磁纳米，磁性纳米颗粒表面进行官能团化，C2DNA序列的3’端修饰有与磁性纳米颗粒表面的基团相互反应的基团；优选地，磁性纳米颗粒表面进行羧基官能团化；
(3)制备线性的DNA链，各所述DNA链中包括与所述DNA-量子点中的C1DNA序列中部分碱基互补的第一碱基序列、与所述DNA-磁纳米中的C2DNA序列中部分碱基互补的第二碱基序列以及第三序列；
(4)将线性的DNA链、DNA-量子点、DNA-磁纳米和特异性识别肿瘤细胞的DNA或RNA适配体混合后进行反应，得到所述磁性荧光共聚物纳米探针(以下简称MQAP)，其中第三序列与特异性识别肿瘤细胞的DNA或RNA适配体的部分碱基互补。
进一步地，在步骤(3)中，制备方法为杂交链式反应，滚环扩增反应或常用PCR聚合反应。
进一步地，在步骤(3)和步骤(4)中，反应均在DNA缓冲液中进行，所述DNA缓冲液的pH为6.5-9.5，包括氯化钠、磷酸氢二钠和水。
进一步地，在步骤(3)和步骤(4)中，反应均在15-37℃下进行。
具体地，在步骤(1)中，C1DNA序列的5’端包括一段硫代修饰的碱基序列N1，序列N1还连接有序列N2，N1序列长度为5-20bp。具体地，C1DNA序列中的N1和N2序列通过6个碱基A连接，其可替换为任意数量的碱基A或碱基T序列。N1为10个硫代修饰的碱基G序列，其可以替换为5-20任意数量硫代修饰的任一碱基序列。优选地，N2序列如SEQ ID No.1所示。
具体地，在步骤(2)中，C2DNA序列的3’端修饰有氨基、巯基、亲和素和生物素等。
具体地，在步骤(2)中，C2DNA序列为5’-N13-(A)10-NH2-3’，其中的(A)10表示10个碱基A，其可替换为任意数量的碱基A或碱基T序列。NH2可替换为巯基、亲和素和生物素等。N13与序列N7碱基互补，优选地，N13如SEQ ID No.2所示。
进一步地，在步骤(3)中，将具有发卡结构的H1序列与LH1DNA序列杂交，得到组装结构M1序列(图1)，然后将M1序列与具有发卡结构的H1序列、具有发卡结构的H2序列在启动子I序列的作用下进行杂交链式反应，形成线性的DNA链；
其中，H1序列包括序列N3、N4和N5，序列N5与DNA-量子点中的C1DNA序列的所述N2序列碱基互补，LH1DNA序列包括一段与H1序列中的N3序列互补的序列N6，以及一段与所述DNA-磁纳米中的C2DNA序列的部分碱基互补的序列N7，H2序列包括与H1序列中的N4序列互补的序列N8以及一段与I序列相同的序列N9，所述序列N9还连接有一段序列N10。
具体地，在步骤(3)中，启动子I序列、M1序列、H1序列和H2序列的摩尔比为1:3:7:10。
具体地，在步骤(3)中，H1序列中的N4和N5之间通过5个碱基A连接，H1序列的核苷酸序列如SEQ ID No.3-SEQ ID No.5任一所示。H2序列的核苷酸序列如SEQ ID No.6-SEQID No.8任一所示。启动子I序列的核苷酸序列如SEQ ID No.9-SEQ ID No.11任一所示。
具体地，在步骤(4)中，特异性识别肿瘤细胞的DNA或RNA适配体为SH2DNA序列，包括特异性识别肿瘤细胞的DNA序列或RNA序列N11以及一段与H2序列中的序列N10碱基互补的序列N12。具体地，SH2DNA序列中的N11序列和N12序列通过6个碱基A连接，其可替换为任意数量的碱基A或碱基T序列。N11序列如SEQ ID No.12-SEQ ID No.27任一所示。N12序列如SEQ ID No.28所示。本发明中，序列表中的所有序列顺序均为自5’端至3’端。
具体地，在步骤(4)中，DNA-量子点、DNA-磁纳米和SH2DNA序列与步骤(3)中的启动子I序列的摩尔比为7:3:10:1。
如图2所示，I序列是一段与H1序列a、b部分互补的序列，H1序列、H2序列是一段具有发卡结构的DNA，三段DNA混合在一起可以发生杂交链式反应。a、b、c、a’、b’、c’应用于杂交链式反应，H1序列的3’端由s、d构成，s是随机数量的A或T，作为空间间隔，d是一段随机序列用于同C1DNA序列的部分碱基杂交；H2序列的5’端由s，e构成，s是随机数量的A或T，作为空间间隔，e是一段随机序列用于同C2中的部分序列杂交。在步骤(3)中，启动子I序列通过立足点介导的链置换反应对发卡结构H1序列进行开链，释放出另外一段单链，而这段单链又能够利用相同的方式对发卡结构H2序列进行开链，释放出另外一段与启动因子I序列相同的单链，再一次对H1序列进行开链，往复循环，组装成线性的一维DNA聚合物。当步骤(3)得到的线性的DNA链、DNA-量子点、DNA-磁纳米和SH2DNA序列混合后，通过碱基之间的互补配对相互连接，DNA-量子点、DNA-磁纳米和SH2DNA序列连接到线性的DNA链上，使得最终合成的纳米探针具有磁性和荧光特性，并且能够特异性识别循环肿瘤细胞(图3)。
在另一方面，本发明还要求保护上述制备方法所制备的磁性荧光共聚物纳米探针作为识别循环肿瘤细胞制剂中的应用。
进一步地，循环肿瘤细胞为CCRF-CEM细胞、MCF-7细胞、MDA-MB-231细胞、SKBR-3细胞、LNCap细胞、PC3细胞、SKOV3细胞、OVCAR-3细胞、A549细胞、HepG2细胞、Kato III细胞、HT-29细胞、DU145DLD-1细胞、HCT 116细胞、SW480细胞和A-431细胞中的一种或几种。
进一步地，应用时，磁性荧光共聚物纳米探针的浓度为2.5-50nmol/L，优选地，浓度为15-50nmol/L。
进一步地，应用时，循环肿瘤细胞的细胞密度为25个/mL以上。优选地，细胞密度为50个/mL-1000个/mL。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明的制备方法，以多种DNA序列为模板，将磁纳米颗粒、具有荧光性质的半导体量子点以及特异性识别肿瘤细胞的DNA适配体进行共聚组装，原料选择具有多样性。
本发明的纳米探针使用DNA适配体取代抗体来识别肿瘤细胞，能够降低检测成本。同时，使用DNA适配体来识别肿瘤细胞，肿瘤细胞捕获后可以使用与适配体反义的DNA或DNA酶来释放探针，进一步降低磁纳米对肿瘤细胞活性的影响。捕获的细胞可以继续步培养，用于后续分析。
本发明的纳米探针能够对磁信号、荧光信号进行放大，同时对肿瘤细胞具有较高的特异性选择，对正常血细胞有较低的非特异性吸附，能够实现较高的捕获效率与捕获纯度。
本发明的纳米探针具有荧光性质，不需要对捕获细胞进行固定染色，并且磁纳米被封装在DNA聚合物内部，降低磁纳米的毒性，可以保证细胞被探针捕获后能够被识别，且具有较高活性。
本发明的纳米探针可作为识别循环肿瘤细胞制剂，在循环肿瘤细胞的检测应用中，本发明的纳米探针不需要用到抗体，成本较低；细胞捕获纯度较高，减少了后续分析的复杂程度；同时捕获的细胞具有活性，而且捕获纯度高，可用于后续基因分析。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
附图说明
图1是H1序列与LH1DNA序列杂交形成M1序列的制备路线示意图；
图2是杂交链式反应的原理示意图；
图3是磁性荧光共聚物纳米探针的制备路线示意图；
图4是磁性荧光共聚物纳米探针的紫外吸收与荧光光谱表征结果；
图5是磁性荧光共聚物纳米探针的透射电镜表征结果；
图6是实施例2中磁性荧光共聚物纳米探针对CCRF-CEM细胞和Ramos细胞作用后，激光共聚焦荧光成像表征图；
图7是实施例3中细胞分离装置的结构示意图；
图8是实施例3中CCRF-CEM细胞的从溶液中分离出来的荧光成像图；
图9是实施例4中激光共聚焦表征CCRF-CEM细胞从CCRF-CEM与Ramos细胞混合体系中分离出来的荧光成像图；
图10是实施例4中不同浓度磁性荧光共聚物纳米探针与CCRF-CEM细胞作用后的细胞活性表征结构；
图11是实施例5中细胞分离示意图；
图12是实施例5中CCRF-CEM细胞从血液中分离出来的荧光成像图；
附图标记说明：
1-培养皿，2-磁铁。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
(一)DNA-量子点的合成
本实施例中，所使用的C1DNA序列如下：
5’-GGGGGGGGGGAAAAAACGTCCGTGCTCAC-3’，其中，碱基G进行了硫代修饰。
所使用的C2DNA序列如下：
5’-TACGCGTCTAGGATCAAAAAAAAAA-NH2-3’。
所使用的H1序列如下：
5’-TTAACCCACGCCGAATCCTAGACTCAAAGTAGTCTAGGATTCGGCGTGAAAAAGTGAGCACGGA CG-3’，其为发卡结构，悬垂部分为下划线处。
所使用的H2序列如下：
5’-GACGTGCAGGCTGTTTAAAGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAACACGCCGAATCCTAGACTACTTTG-3’，其为发卡结构，悬垂部分为下划线处。
所使用的启动子I序列如下：
5’-AGTCTAGGATTCGGCGTGGGTTAA-3’。
所使用的LH1DNA序列如下：
5’-GATCCTAGACGCGTAAAAAAACGTCCGTGCTCAC-3’。
所使用的SH2序列如下：
5’-CAGCCTGCACGTC(A)6ATCTAACTGCTGCGCCGCCGGGAAAATACTGTACGGTTAGA-3’，下划线处的碱基序列与H2序列的下划线处碱基互补。
(1)称取0.02g碲粉(Te)与0.0125g硼氢化钠(NaBH4)到1.5mL的离心管内，加入0.5mL超纯水，在60℃条件下反应40分钟，生成碲氢化钠(NaHTe)。
(2)DNA-CdTe量子点的合成：取0.5mL pH为9的金属离子前驱液1，前驱液1中氯化镉(CdCl2)浓度为1.25mM，谷胱甘肽(GSH)浓度为1.05mM，向前驱液1中加入碱基数为120nmol碱基的C1DNA序列，在100℃下加热，合成DNA-CdTe量子点，用30K超滤管在12500转/分钟条件下离心3分钟纯化合成的DNA-CdTe量子点。
(3)将DNA-CdTe量子点重新溶于0.5mLpH 10.5的NaOH溶液中，向其中加入7μL pH为11的金属离子前驱液2，前驱液2中CdCl2的浓度为30mM，GSH的浓度为75mM，硫脲(thiourea)浓度为25mM，在95℃下加热30min，再加入10μL前驱液2，95℃下继续加热30min得到DNA-CdTe/CdS量子点，本发明中命名为DNA-量子点。
(二)DNA-磁纳米的制备
将0.1mL5mg/mL(1.35μM)羧基官能化的Fe3O4磁纳米溶于1mL浓度为10mM的硼酸缓冲液(pH 5.5)，然后加入100μL 1mg/mL EDC和50μL 1mg/mL NHS，在冰水中超声20min，再加入9mL含15.625nmol碱基C2DNA序列的1×PBS溶液，冰水中继续超声40min后4℃下避光静置12h，13500r/min离心纯化，得到修饰了DNA的Fe3O4。本发明中命名为DNA-磁纳米。
(三)磁性荧光共聚物纳米探针的制备
如图3所示，首先将等量的H1序列与LH1DNA序列在1×DNA缓冲溶液中杂交1小时,得到组装结构M1序列，然后将M1、H1、H2、I序列混合在2.5×DNA缓冲液中反应，混合液在室温条件下避光静置12小时后(溶液中I、M1、H1、H2序列的摩尔浓度比为1：3：7：10)，向其中加入DNA-量子点，DNA-磁纳米以及SH2DNA序列继续反应1h。最后通过磁分离纯化得到磁性荧光共聚物纳米探针(以下简称MQAP)。其中，1×DNA缓冲溶液、2.5×DNA缓冲液是指将pH为6.5-7.5，氯化钠(NaCl)1000mM，磷酸氢二钠(Na2HPO4)100mM的10×DNA缓冲溶液分别稀释10倍和4倍。且I序列、SH2序列、DNA-磁纳米、DNA-量子点浓度比为1：10：3：7。
纯化后的MQAP探针的紫外吸收与荧光光谱表征结果如附图4所示，探针在700nm前有连续的紫外吸收峰，在639nm处有最大荧光发射峰。
本发明所制备的MQAP探针对磁铁有响应，磁分离前，探针稳定存在于试管内的溶液中，在外加一个磁场后，探针被迅速从溶液中分离，吸附在试管壁上。
MQAP探针的TEM、HRTEM表征结果如附图5所示，图5表明，多个磁纳米颗粒被紧密封装在近乎线性的DNA聚合物内部，周围围绕很多的量子点。
实施例2 MQAP探针用于特异性识别循环肿瘤细胞
(1)细胞株的培养
培养待检测肿瘤细胞人急性淋巴白血病细胞(CCRF-CEM)与对照细胞人B淋巴细胞瘤细胞(Ramos)。CCRF-CEM与Ramos细胞均在25cm2的培养瓶内培养，培养基为含1％双抗(青霉素、链霉素)，10％胎牛血清(FBS)的RPMI 1640培养液。培养环境为37℃，含5％CO2的细胞培养箱。
(2)MQAP探针对CCRF-CEM细胞的特异性识别实验
将上述培养的200μLCCRF-CEM或Ramos细胞(2×106个/mL)首先分别用钙黄绿素-AM(Calcein-AM，10μM)或4,6-联脒-2-苯基吲哚(DAPI，10μg/mL)在37℃水浴锅中进行预染色30min，加入500μL细胞清洗缓冲液清洗三遍后与200μL实施例1制备的MQAP探针在细胞结合缓冲液4℃下作用1h，用细胞清洗缓冲液清洗三遍后再加入200μL细胞结合缓冲液，转移到8孔腔室玻片，利用激光共聚焦显微镜进行荧光成像。细胞清洗缓冲溶液是指含有葡萄糖4.5g/L，氯化镁(MgCl2)5mM的1×DPBS溶液，细胞结合缓冲溶液是指含有酵母tRNA(yeasttRNA)0.1mg/mL的细胞清洗缓冲溶液。
成像结果如附图6所示，图6表明，MQAP探针能够特异性识别CCRF-CEM细胞，所以在量子点信号收集区能够得到很强的荧光信号(图6A、6B)；探针不能够特异性识别Ramos细胞，所以在量子点信号收集区只能够得到非常微弱的荧光信号(图6C、6D)，这是由于Ramos细胞对探针的非特异性吸附引起的。
实施例3 MQAP探针用于单独分离富集CCRF-CEM细胞
(1)按照实施例2中步骤(2)的方法，将不同浓度的MQAP探针与CCRF-CEM细胞相互作用，然后取100μL(2×102个/mL)与不同浓度的MQAP探针作用的CCRF-CEM细胞加入24孔板，在孔板边缘放置磁铁进行磁分离15min，然后通过荧光显微镜对捕获的肿瘤细胞进行计数。细胞分离装置如附图7所示(图7a为分离装置的结构示意图，图7b为图a中圈A的放大图，图中箭头处为血液加入位置)，肿瘤细胞捕获的荧光成像表征结果如附图8所示，图8A为明场，图8B为量子点，图中箭头所指处为CCRF-CEM细胞，在磁场作用下，与探针作用的CCRF-CEM细胞移动到溶液的边缘区域。肿瘤细胞的捕获效率如表1所示，随着探针浓度的增加，探针对CCRF-CEM细胞的捕获效率升高，当探针浓度达到15nM(以磁纳米计)后，探针对CCRF-CEM细胞的捕获效率为88％，增加探针浓度，捕获效率提高不明显。
表1 CCRF-CEM细胞的捕获效率与探针浓度对应关系
探针浓度 肿瘤细胞捕获效率
2.5nM 14.2％
5nM 43.7％
7.5nM 62.3％
15nM 88％
30nM 88％
50nM 91.8％
(2)MQAP探针对不同密度CCRF-CEM细胞的捕获效率测试：CCRF-CEM细胞首先与浓度15nM的MQAP探针作用，作用过程参照2中步骤(2)的方法。取100μL含与不同浓度的CCRF-CEM细胞加入24孔板，进行磁分离，分离过程参照本实施例以上方法，捕获结果如表2所示，在较低的细胞密度下，依然能够保证较高的捕获效率，探针对CCRF-CEM细胞的捕获效率为58.3％-90.1％。
表2 CCRF-CEM细胞的捕获效率与细胞密度对应关系
肿瘤细胞密度 肿瘤细胞捕获效率
25个/mL 58.3％
50个/mL 81％
100个/mL 88.3％
200个/mL 88％
500个/mL 89.3％
1000个/mL 90.1％
实施例4 MQAP探针用于分离CCRF-CEM、Ramos细胞混合液中的CCRF-CEM细胞(1)将CCRF-CEM或Ramos细胞首先进行预染色，然后与MQAP探针作用，作用过程参照实施例2步骤(2)。
(2)取100μL含有2×102个/mL的CCRF-CEM、不同浓度的Ramos细胞的混合液加入24孔板，进行磁分离，分离过程参照实施例3步骤(1)，统计捕获的CCRF-CEM细胞与Ramos细胞，计数标准，CCRF-CEM为同时表达绿色和红色荧光的细胞，Ramos细胞为表达蓝色荧光信号的细胞。根据统计结果计算捕获效率与捕获纯度。捕获效率与捕获纯度的计算方法如下：
Figure BDA0001553407290000101
Figure BDA0001553407290000102
捕获结果如表3所示，即使Ramos细胞的浓度为106个/mL时，CCRF-CEM的捕获效率和捕获纯度仍然保持在较高的数值。对于双细胞混合体系，探针对CCRF-CEM细胞捕获效率为76.2％-86.3％，捕获纯度为78.7％-100％。
表3 CCRF-CEM细胞的捕获效率、捕获纯度与背景细胞Ramos细胞浓度对应的关系
Ramos细胞密度 肿瘤细胞捕获效率 肿瘤细胞捕获纯度
2×10<sup>6</sup>个/mL 76.2％ 78.7％
2×10<sup>5</sup>个/mL 78.1％ 81.2％
2×10<sup>4</sup>个/mL 83.1％ 88.1％
2×10<sup>3</sup>个/mL 86.4％ 93.4％
2×10<sup>2</sup>个/mL 88.6％ 98.6％
2×10<sup>1</sup>个/mL 86.3％ 100％
(3)取100μL含有2×102个/mL的CCRF-CEM、104个/mL的Ramos细胞的混合液滴入到8孔腔室玻片孔板，进行磁分离，分离过程参照实施例3步骤(1)。磁分离后，使用激光共聚焦显微镜进行荧光成像表征。实验结果如附图9所示，图9A为明场，图9B为荧光叠加图，上方箭头所指为对照细胞，下方箭头所指为CCRF-CEM肿瘤细胞，大部分的CCRF-CEM在磁场作用下移动到边缘区域，而只有极少数的Ramos细胞可以移动到边缘区域，表明探针对CCRF-CEM细胞较高的捕获效率与捕获纯度，在该条件下捕获效率为83.1％，捕获纯度为88.1％。
(4)将不同浓度的MQAP探针加入到200μL含5×104个CCRF-CEM细胞的细胞培养基，在细胞培养箱(37℃含5％CO2)中作用1h，离心去除未反应的探针，重新加入100μL新鲜的RPMI 1640培养基与10μL的CCK-8试剂液，转移到96孔板，并在细胞培养箱内继续孵育4h，然后使用酶标仪测量450nm处的吸收值。实验结果如图10，在探针浓度为15nM时，与细胞作用后，细胞活性在95％以上，表明探针对细胞较弱的毒性。
实施例5 MQAP探针用于分离富集血液中的CCRF-CEM细胞
(1)CCRF-CEM细胞用钙黄绿素-AM(Calcein-AM)进行预染色，方法参照实例2步骤(2)。将预染色的CCRF-CEM细胞稀释到2×104个/mL，取10μL滴加到24孔板上进行计数，然后将液滴转移到1mL血液中，24孔板相同位置再次进行计数，确定残留在孔板上的CCRF-CEM细胞数，两次计数的差值即为加入血液中的细胞数。
(2)将实施例1制备的MQAP探针加入1mL含确定CCRF-CEM细胞数的血液中，探针终浓度为15nM，4℃下作用1h。
(3)MQAP探针与血液作用后，向血液中加入3mL红细胞裂解液，放置在冰袋上15min裂解红细胞，然后在4℃450×g条件下离心10min，弃去上清液，加入1mL细胞结合缓冲液重悬沉淀。
(4)将重悬液转移到24孔板外侧孔内进行磁分离，分离过程参照实例4步骤(2)。细胞分离示意图如图11所示，分离结果如附图12所示，图12A为明场，图12B为叠加图，可以看到CCRF-CEM细胞(箭头所指的肿瘤细胞)在磁场作用下被移动到边缘区域，而只有极少数的白细胞可以移动到边缘区域，展现出探针较高的捕获纯度。数据统计结果MQAP探针对血液中CCRF-CEM肿瘤细胞的捕获效率为78％，捕获纯度为83.9％。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
Figure BDA0001553407290000121
Figure BDA0001553407290000131
Figure BDA0001553407290000141
Figure BDA0001553407290000151
Figure BDA0001553407290000161
Figure BDA0001553407290000171
Figure BDA0001553407290000181
序列表
<110> 苏州大学
<120> 以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针及应用
<141> 2018-01-19
<160> 28
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 1
cgtccgtgct cac 13
<210> 2
<211> 15
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 2
tacgcgtcta ggatc 15
<210> 3
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
ttaacccacg ccgaatccta gactcaaagt agtctaggat tcggcgtgaa aaagtgagca 60
cggacg 66
<210> 4
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
ggaacagctt tgaggtgcca tctcgcacct caaagctgtt ccactgtgaa aaagtgagca 60
cggacg 66
<210> 5
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
ctggctcctg tgattgtgct ctagacatcg ctagagcaca atcacaggaa aaagtgagca 60
cggacg 66
<210> 6
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 6
gacgtgcagg ctgtttaaag tctaggattc ggcgtgggtt aacacgccga atcctagact 60
actttg 66
<210> 7
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 7
gacgtgcagg ctgtttaaga gatggcacct caaagctgtt cccacagtgg aacagctttg 60
aggtgc 66
<210> 8
<211> 66
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 8
gacgtgcagg ctgtttaact agagcacaat cacaggagcc agcctgtgat tgtgctctag 60
cgatgt 66
<210> 9
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 9
agtctaggat tcggcgtggg ttaa 24
<210> 10
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 10
cacagtggaa cagctttgag gtgc 24
<210> 11
<211> 24
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 11
ctagagcaca atcacaggag ccag 24
<210> 12
<211> 41
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 12
atctaactgc tgcgccgccg ggaaaatact gtacggttag a 41
<210> 13
<211> 25
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 13
gcagttgatc ctttggatac cctgg 25
<210> 14
<211> 48
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 14
cactacagag gttgcgtctg tcccacgttg tcatgggggg ttggcctg 48
<210> 15
<211> 47
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 15
aacaccggga ggatagttcg gtggctgttc agggtctcct cccggtg 47
<210> 16
<211> 28
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 16
ttggtggtgg tggttgtggt ggtggtgg 28
<210> 17
<211> 57
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 17
tggatgggga gatccgttga gtaagcgggc gtgtctctct gccgccttgc tatgggg 57
<210> 18
<211> 69
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 18
ggctgttgtg agcctcctcc cagagggaag actttaggtt cggttcacgt cccgcttatt 60
cttactccc 69
<210> 19
<211> 51
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 19
taactcaata agctaggtgg gtgggggaca ctacccgggg ggtggttggg t 51
<210> 20
<211> 45
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 20
tctctagtta ttgagttttc ttttatgggt gggtgggggg ttttt 45
<210> 21
<211> 56
<212> RNA
<213> （人工序列）
<400> 21
gggaggacga ugcggaucag ccauguuuac gucacuccuu gucaauccuc aucggc 56
<210> 22
<211> 58
<212> RNA
<213> （人工序列）
<400> 22
gggaggacga ugcggaccga aaaagaccug acuucuauac uaagucuacg uucccaga 58
<210> 23
<211> 18
<212> RNA
<213> （人工序列）
<400> 23
gcgacugguu cccggucg 18
<210> 24
<211> 41
<212> RNA
<213> （人工序列）
<400> 24
aagugacguc cugaucgauu gugcauucgg ugugacgauc u 41
<210> 25
<211> 34
<212> RNA
<213> （人工序列）
<400> 25
accaagaccu gacuucuaac uaagucuacg uucc 34
<210> 26
<211> 35
<212> RNA
<213> （人工序列）
<400> 26
ggaggacgcu cgccguaaug gauguuuugc uccug 35
<210> 27
<211> 71
<212> RNA
<213> （人工序列）
<400> 27
gggaggacga ugcggugccc acuaugcgug ccgaaaaaca uuucccccuc uaccccagac 60
gacucgcgcg a 71
<210> 28
<211> 13
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 28
cagcctgcac gtc 13

Claims (9)

1.一种以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针，其特征在于：包括线性的模板DNA链，所述模板DNA链上依靠识别DNA序列分别与具有超顺磁性质的磁纳米颗粒、具有荧光性质的量子点纳米颗粒以及能够特异性识别肿瘤细胞的DNA或RNA适配体相连接，且所述磁纳米颗粒或量子点纳米颗粒与DNA或RNA适配体交替连接在所述模板DNA链上；所述磁纳米颗粒、量子点纳米颗粒和DNA或RNA适配体上均连接有与所述识别DNA序列互补的碱基序列。
2.根据权利要求1所述的以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针，其特征在于：所述模板DNA链具有三种重复单元的识别DNA序列且三种识别DNA序列交替出现。
3.根据权利要求1所述的以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针，其特征在于：所述量子点纳米颗粒由Ⅱ-Ⅵ族、Ⅳ-Ⅵ族、Ⅰ-Ⅵ族、Ⅱ-Ⅴ族、Ⅲ-Ⅴ族元素组成。
4.根据权利要求3所述的以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针，其特征在于：所述量子点纳米颗粒为二元量子点或三元量子点。
5.根据权利要求1所述的以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针，其特征在于：所述具有超顺磁性质的磁纳米颗粒的材质为Fe3O4、γ-Fe2O3、CoFe2O4、NiFe2O4和MnFe2O4中的一种或几种。
6.根据权利要求1所述的以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针，其特征在于：磁纳米颗粒的粒径为5-100nm。
7.根据权利要求1-6中任一项所述的以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针，其特征在于，其制备方法包括以下步骤：
将线性的模板DNA链、量子点纳米颗粒、磁纳米颗粒和特异性识别肿瘤细胞的DNA或RNA适配体混合后进行反应，得到所述磁性荧光共聚物纳米探针，所述模板DNA链上带有识别DNA序列，所述量子点纳米颗粒、磁纳米颗粒和DNA或RNA适配体分别连接有与识别DNA序列互补的碱基序列。
8.根据权利要求7所述的以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针，其特征在于：线性的模板DNA链、磁纳米颗粒、量子点纳米颗粒和特异性识别肿瘤细胞的DNA或RNA适配体的摩尔比为1:1-10:2-40:2-50。
9.权利要求1-6中任一项所述的以DNA为模板的磁性荧光共聚物纳米探针作为识别循环肿瘤细胞制剂中的应用。
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