CN104374764B - 一种分析探针、其制备方法和用途 - Google Patents
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- Investigating Or Analysing Materials By The Use Of Chemical Reactions (AREA)
Abstract
本发明涉及一种分析探针、其制备方法和用途。具体涉及一种分析探针，其包含双功能化贵金属纳米材料和探测分子，所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子直接相连、或通过结合对或连接基团间接相连，其中所述双功能化贵金属纳米材料包含贵金属纳米粒子；源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段；和源自含巯基或氨基的配位金属离子螯合物的发光增强片段；所述源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段和源自含巯基或氨基的配位金属离子螯合物的发光增强片段连接在所述贵金属纳米粒子的表面：式中，A表示C6‑C14芳基；R1和R2可独立地表示氢、端基被氨基取代或未取代的直链或支链（C1‑C30）烷基，前提条件是该NR1R2具有至少一个NH2端基。通式(I)。
Description
技术领域
本发明涉及一种含化学发光片段和发光增强片段的双功能化贵金属纳米材料。本发明还涉及该双功能化贵金属纳米材料的制备和应用。
背景技术
贵金属纳米材料具有独特的光学性质、催化活性和生物相容性等，这些特性使得贵金属纳米材料在化学发光分析领域被广泛应用。对已有的贵金属纳米材料进行表面修饰使其表面具有发光分子，即制备发光功能化的贵金属纳米材料引起了人们的广泛关注。
例如，现有技术已知直接利用鲁米诺还原氯金酸，一步合成得到了鲁米诺功能化的金纳米材料(Cui,H.；Wang,W.；Duan,C.F.；Dong,Y.P.；Guo,J.Z.Chem.Eur.J.2007,13,6975)，将该鲁米诺功能化的金纳米材料组装到金电极的表面，可以构建一个H2O2化学发光传感器。现有技术还提到通过晶种生长法利用N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺还原氯金酸得到N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺功能化的金材料(Tian,D.；Zhang,H.；Chai,Y.；Cui,H.Chem.Commun.2011,47,4959)，该纳米材料与鲁米诺功能化金纳米材料相比，发光性能更好，因此将该纳米材料成功用于发展高灵敏的化学发光免疫传感器和核酸传感器。
CN101900723A公开鲁米诺直接键合的纳米金在免疫分析中的应用，它涉及鲁米诺直接键合的纳米金免疫分析探针，该分析探针由鲁米诺直接键合的纳米金标记的抗体所组成，其中，鲁米诺直接键合的纳米金是由鲁米诺一步还原氯金酸得到的；它还涉及基于该鲁米诺直接键合的纳米金免疫分析探针的化学发光免疫分析方法。据该文献报道，该化学发光免疫分析方法具有灵敏度高、线性范围宽、重现性好、操作简单、成本低廉等优点。
WO2011/107003公开N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金及其制备方法和应用,所述功能化纳米金包含金纳米粒子和连接在该金纳米粒子表面上的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺。该功能化纳米金与选自下组的探测分子相连后用于形成例如分析探针：(a)对目标分析物具有结合特异性的结合分子；或(b)与目标分析物竞争结合捕获探针的竞争性分子。据该文献报道，其 分析探针具有高分析灵敏度。
虽然现有技术已经提供了基于N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金的分析探针，它具有较高的分析灵敏度，但是其灵敏度还具有提高的余地。
过渡金属或稀土元素金属的离子或含有过渡金属或稀土元素金属的物质(如，Co(II)-EDTA螯合物、Fe(CN)6 3-，含铁卟啉等)对化学发光体系具有很强的催化作用，能够极大地提高鲁米诺类化学发光体系的化学发光强度。例如有文献报道，Co(II)-EDTA螯合物可以增强鲁米诺-H2O2的化学发光。然而，发现将这种催化物质加入现有的发光功能化纳米材料中，其发光强度仍未能提高至满足要求的程度。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种包含双功能化贵金属纳米材料的分析探针，该分析探针可用于各种生物分析。
本发明的另一个目的在于提供一种制备本发明的分析探针的方法及其用途。
因此，本发明的一个方面提供一种分析探针，其包含双功能化贵金属纳米材料和探测分子，所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子直接相连、或通过结合对或连接基团间接相连，其中所述双功能化贵金属纳米材料包含：
贵金属纳米粒子；
源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段；和
源自含巯基或氨基的配位金属离子螯合物的发光增强片段；
所述源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段和源自含巯基或氨基的配位金属离子螯合物的发光增强片段连接在所述贵金属纳米粒子的表面：
式中，
A表示C6-C14芳基；
R1和R2可独立地表示氢、端基被氨基取代或未取代的直链或支链(C1-C30)烷基，前提条件是该NR1R2具有至少一个NH2端基。
本发明的第二方面提供一种制备本发明分析探针的方法，所述方法包括将所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子直接相连、或通过结合对或连接基团间接相连获得分析探针的步骤。
本发明的第三方面提供采用本发明分析探针的分析方法，所述方法包括使目标分析物与所述分析探针通过生物学特异性反应形成分析探针-目标分析物的复合物，再通过检测所得复合物的发光来确定样品中目标分析物的含量。
与现有技术相比，本发明具有如下的优点：
首次将双功能化贵金属纳米材料用于制备分析探针，尤其使其作为免疫分析探针和核酸分析探针，进一步发展了新的分析方法(如免疫和核酸分析方法)，该方法的灵敏度高、灵敏度高、重现性好、可靠性强；该分析探针可用于以下各种领域样品的检测和分析：生物样品、食品或饮料样品、药物样品、环境样品、化学样品。
因此，本发明的双功能化贵金属纳米材料在临床分析、食品安全、环境检测和药物分析等领域具有巨大的应用潜力和良好的应用前景。
下面结合附图对本发明作进一步说明。
附图说明
图1是巯基化二亚乙基三胺五乙酸的ES－MS谱图。
图2是(a)二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和(b)巯基化二亚乙基三胺五乙酸的FT-IR谱图。
图3是巯基化二亚乙基三胺五乙酸的1H NMR谱图(300MHz,D2O,298K)。
图4显示本发明的一个优选例的合成方法示意图。
图5多种功能化金纳米材料的电镜照片。
图6是本发明一个优选例的热重分析和差热分析曲线。
图7是本发明的一个优选例的紫外-可见吸收谱图。
图8是本发明的一个优选例的X射线光电子能谱。
图9是含不同金属离子螯合物的双功能金纳米材料的化学发光效果的比较。
图10是比较本发明的一个优选例与其它化学发光功能化金纳米材料的化学发光强度的图。
图11是本发明免疫传感器制备过程中各步骤的电化学阻抗谱。
图12是本发明免疫传感器制备过程中各步骤的电致化学发光信号图。
图13显示各种实验条件对本发明免疫传感器的电致化学发光信号的影响。
图14显示了电致化学发光信号强度随hIgG浓度对数的拟合曲线。
图15显示了在不同干扰物质存在下，本发明免疫传感器的电致化学发光信号变化。
图16显示了免疫分析传感器的构建流程图。
具体实施方式
下面对本发明的双功能化贵金属纳米材料及其制备方法、基于该双功能化贵金属纳米材料的分析探针以及基于该分析探针的分析方法的具体实施方式进行详细描述。
A.双功能化贵金属纳米材料
本发明提供了一种双功能化贵金属纳米材料，其包含贵金属纳米粒子、附着在该贵金属纳米粒子上源自鲁米诺类化学发光试剂的发光片段、和同样附着在该贵金属纳米粒子上源自含巯基或氨基的配位金属离子螯合物的发光增强片段。
1.贵金属纳米粒子
本发明贵金属纳米粒子无特别的限制，可以是本领域已知的任何贵金属纳米粒子。本领域的普通技术人员根据实际需要可容易地选择适用的金属纳米粒子。在本发明的一个实例中，所述金属纳米粒子选自：金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子或它们的合金纳米粒子，以及它们的组合。在本发明的另一个实例中，上述金属纳米粒子选自：金纳米粒子、银纳米粒子和/或铂纳米粒子各自与贱金属形成的合金，条件是合金中贵金属的量占50重量％或以上，例如占50-98重量％，宜占60-95重量％，较好占70-93重量％，更好占80-90重量％，优选85-88重量％。
在一个优选的实施方式中，所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子。
在一个实施方式中，所述贵金属纳米粒子的形貌呈单分散球状，其粒径为1-100纳米，较好5-80纳米，更好10-50纳米。
本发明贵金属纳米粒子可从市场上购得，还可以通过原位还原得到。在本发明的一个实例中，使贵金属前体化合物(例如氯金酸、氯铂酸、硝酸银或其混合物)与还原剂(例如本发明具有还原性的鲁米诺类化学发光试剂)反应，原位形成粒径为1-100纳米的贵金属纳米粒子。
2.鲁米诺类化学发光试剂
适用于本发明的鲁米诺类化学发光试剂具有下列通式I：
式中，A表示C6-C14芳基，较好C6-C10芳基，更好具有6个碳原子的芳基。在本发明中术语“A表示C6-C14芳基”是指具有包括两个邻环碳原子在内的碳原子的芳基，例如它可以是苯基、萘基和蒽基。
R1和R2可独立地表示氢、端基被氨基取代或未取代的直链或支链C1-C30、较好C1-C20、更好C1-C10、最好C1-C8、优选C1-C6烷基，前提条件是该NR1R2具有至少一个NH2端基。
在本发明中，术语“NR1R2具有至少一个NH2端基”是指NR1R2本身是NH2，或者R1、R2中至少有一个带有NH2端基的烷基。
在本发明的一个实例中，R1和R2可各自选自甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、己基、氨基甲基、氨基乙基、1-氨基丙基、2-甲基-氨基乙基、1-氨基丁基、2-甲基-氨基丙基等。
在本发明的一个实例中，所述鲁米诺类化学发光试剂选自：
其中，R1和R2如上所限定。
在本发明的一个较好实例中，上述通式(II)的鲁米诺类化学发光试剂选自：
其中，R1和R2如上所限定。
本发明鲁米诺类化学发光试剂至少有一个氨基(NH2)端基，利用该基团可将该类化学发光试剂通过共价键连接到本发明贵金属纳米粒子的表面。另一方面，由于该类发光试剂属于酰肼类化合物，其酰肼基团具有还原性，可作为还原剂原位还原贵金属纳米粒子的前体化合物。
在本发明中，术语“通过共价键连接”是指氨基或巯基中的孤对电子与金属的空轨道相互作用形成的键合。
在一个实施方式中，代表性通式(II)的鲁米诺类化学发光试剂选自下组，但 不限于此：
在另一个实施方式中，所述通式(III)的鲁米诺类化学发光试剂为N-(4-氨基丁基)-N-乙基萘酰肼；
在一个实施方式中，本发明鲁米诺类化学发光试剂通过氨基与贵金属纳米粒子相互作用形成共价键，从而连接在所述贵金属纳米粒子的表面，例如，所述共价键包括Au-N键、Pt-N键或Ag-N键。
3.含巯基或氨基的金属离子螯合物
本发明含巯基或氨基的配位金属离子螯合物包含金属离子和含巯基或氨基的螯合剂。事实上，本发明金属离子螯合物无特别的限制，只要它具有发光增强作用并且含巯基或氨基使之能与金属纳米粒子表面共价连接即可。
在本发明的一个实例中，所述金属离子选自第VIII族、IB族、IIB族、VIB族过渡金属离子、稀土元素离子、IVA族金属或其组合。在本发明的一个实例中，所述过渡金属离子选自：Co2+、Cu2+、Ni2+、Hg2+、Cr3+、Pd2+、Pt2+、Fe2+、Fe3+、Ru2+；所述稀土元素离子选自Eu3+，La3+、Gd3+、Sm3+、Er3+、Dy3+、Ce4+、Ce3+；所述IVA族金属是Pb2+。
所述螯合剂具有选自巯基、氨基或其组合(较好为巯基)的第一活性基团和第二活性基团，其中所述第一活性基团用于与所述贵金属纳米粒子发生连接，所述第二活性基团用于与所述金属离子发生络合。
如上所述，本发明包含了两类金属，其中一类金属是用于形成纳米粒子的金属，另一类是配位金属离子螯合物中所包含的能够起到增强发光作用的金属。为清楚起见，在本文中，使用术语“贵金属”表示本发明用于形成纳米粒子的金属，例如它可以是Au、Ag和Pt；使用术语“配位金属”表示本发明用于形成金属离子螯合物的金属，其包括过渡金属离子和稀土元素离子等。
在一个实施方式中，所述螯合剂的第一活性基团和第二活性基团可以相同或彼此不同。在另一个实施方式中，所述螯合剂的第二活性基团包括含O、N、S的具有络合能力的活性基团，如羧基、羟基、仲氨基、叔氨基或其组合。
在本发明的一个实施例中，第一活性基团所含的巯基或氨基位于螯合剂的端基位置。
所述螯合剂的非限制性例子有，例如：巯基化螯合剂，如巯基化乙二胺四乙酸、巯基化二亚乙基三胺五乙酸、巯基化1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸、巯基化二亚乙三胺四乙酸；氨基化螯合剂，如氨基化乙二胺四乙酸、氨基化二亚乙基三胺五乙酸、氨基化1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸、氨基化二亚乙三胺四乙酸，或者上述螯合剂中的两种或更多种的组合。
在另一个实施方式中，所述含巯基或氨基的配位金属离子螯合物通过巯基或氨基与贵金属纳米粒子相互作用，形成共价键而连接在所述贵金属纳米粒子的表面。
在另一个实施方式中，所述共价键包括Au-N键、Au-S键、Pt-N键、Pt-S键、Ag-N键或Ag-S键；优选Au-S键、Pt-S键或Ag-S键。
在本文中，除非另有说明，化学发光的“发光增强片段”与“发光催化片段”可互换使用，都指的是在化学发光反应中，加入到化学发光反应体系中能够使化学发光强度大大增强的片段。
本发明双功能化贵金属纳米材料中源自鲁米诺类化学发光试剂的发光片段与源自含巯基或氨基的配位金属离子螯合物的发光增强片段的相对量无特别的限制，只要该发光增强片段足以提高发光片段的发光强度即可。在本发明的一个实施方式中，所述发光增强片段与发光片段的摩尔比为1000:1至1:1000，宜为500：1-1：500，更好为100：1-1：100，较好为50：1-1：50，最好为30：1-1：30，优选10：1-1：10。
本发明双功能化贵金属纳米材料通过与氧化剂反应产生化学发光。适用的氧化剂无特别的限制，可以是本领域已知的任何氧化剂。在本发明的一个实例中，所述氧化剂包括但不限于H2O2、O2、ClO-、I2、IO4 -、MnO4。在本发明的一个实例中，所述化学发光反应的条件为：将10-1000微升0.1M H2O2溶液注入到10-1000微升的经纯化的双功能化贵金属纳米材料水溶液中，产生化学发光。
在一个优选实例中，所述双功能化贵金属纳米材料为双功能化金纳米材料，其化学发光片段源自N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，其发光增强片段源 自含巯基的配位金属离子螯合物，N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺通过Au-N键连接于金纳米粒子的表面，所述含巯基的配位金属离子螯合物通过Au-S连接在金纳米粒子的表面。
与现有的仅包含化学发光片段的发光功能化纳米材料相比，本发明的双功能化贵金属纳米材料除了在贵金属纳米粒子的表面包被了一个或多个发光片段之外，还包被一个或多个配位金属离子螯合物片段，该配位金属离子螯合物片段对鲁米诺类化学发光体系的化学发光具有增强或催化作用，因而使得本发明的双功能化贵金属纳米材料在发光性能方面得到极大提高，具有卓越的发光特性。在发光试剂种类及用量、氯金酸用量和发光实验条件等同的情况下，本发明的双功能化贵金属纳米材料比现有的发光试剂单功能化贵金属纳米材料的发光效率至少高三个数量级。
如本文所用，术语“发光功能化”、“发光试剂功能化”或“化学发光功能化”等可互换使用，均是指由于包含发光试剂而使得纳米材料具有化学发光特性。
B.双功能化贵金属纳米材料的制备方法
本发明还提供简便、快速地制备本发明双功能化的贵金属纳米材料的方法，它包括以下步骤：
1.提供含巯基或氨基的配位金属离子螯合物
所述含巯基或氨基的配位金属离子螯合物如上文所定义，其包含配位金属离子和螯合剂，其中所述螯合剂可通过对本领域已知的不含巯基或氨基的螯合剂进行巯基化或氨基化制得。这种螯合剂的巯基化或氨基化是已知的，例如可参见：Christophe Alric,Jacqueline Taleb,Géraldine Le Duc,Céline Mandon,Claire Billotey,Alice LeMeur-Herland,Thierry Brochard,Francis Vocanson,Marc Janier,Pascal Perriat,Stéphane Roux,and Olivier Tillement.J.Am.Chem.Soc.2008,130,5908–5915。
此外，可通过本领域已知的常规方法使本发明所述的配位金属离子与螯合剂发生络合，得到所需的含巯基或氨基的配位金属离子螯合物。
在本发明的一个具体实施方式中，以巯基化二亚乙基三胺五乙酸为例，所述含巯基或氨基的配位金属离子螯合物通过以下方法获得：将所述巯基化二亚乙基三胺五乙酸配制成1-20mM的水溶液，然后与1-20mM的所述配位金属离子水溶液以5：1至1：5的体积比进行混合，得到含巯基或氨基的配位金属离子螯合物的水溶液。
2.鲁米诺类化学发光试剂和水性贵金属前体化合物发生反应
本发明通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂和水性贵金属前体化合物的反应较好在搅拌的条件下进行。反应的条件无特别的限制，可以是常温常压。在本文中，术语“贵金属前体化合物”旨在表示能形成贵金属纳米粒子的任何水性化合物，其非限制性例子有氯金酸、氯铂酸、硝酸银或其混合物。
如上文所述，由于符合上述结构式的通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂具有酰肼基团，因而其具有还原性，使得该类发光试剂在本发明的方法中可作为还原剂还原贵金属前体化合物，形成贵金属纳米粒子。
在一个实施方式中，在反应中加入的通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂与水性贵金属前体化合物的摩尔比为0.4-5，优选0.5-3。
另外，在该反应过程中(例如反应完成一半之前)或者在该反应完成之后，向反应体系中加入所述含巯基或氨基的配位金属离子螯合物，得到双功能化贵金属纳米材料。
通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂与含巯基或氨基的配位离子螯合物的加入量无特别的限制，只要能增强最终产品的发光强度即可。在本发明的一个实例中，所述鲁米诺类化学发光试剂与含巯基或氨基的配位离子螯合物的加入摩尔比为1000:1至1:1000，宜为500：1-1：500，更好为100：1-1：100，较好为50：1-1：50，最好为30：1-1：30，优选10：1-1：10。
由于本发明通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂具有至少一个氨基端基，并且本发明含巯基或氨基的配位金属离子螯合物包含巯基或氨基，因此它们在贵金属纳米粒子的形成过程中都可作为纳米粒子保护试剂，防止纳米颗粒发生团聚，最终获得所述双功能化贵金属纳米材料。
本发明中，双功能化贵金属纳米材料可采用下列制备方法中的任何一种制得：
(i)首先用本发明鲁米诺类化学发光试剂还原贵金属前体化合物并包被还原得到的纳米金属，获得初级发光试剂功能化的贵金属纳米材料，然后向反应体系中原位加入含巯基或氨基的配位金属离子螯合物，使其利用巯基或氨基与贵金属纳米粒子的相互作用而连接到所得的初级发光功能化贵金属纳米材料上，获得最终的双功能化贵金属纳米材料；或者
(ii)将本发明鲁米诺类化学发光试剂、贵金属前体化合物、含巯基或氨基的配位金属离子螯合物同时加入反应体系中进行氧化还原反应，在反应过程 中，鲁米诺类化学发光试剂的作用为还原剂和保护试剂(包被试剂)，含巯基或氨基的发光增强剂作为共保护试剂(共包被试剂)参与贵金属纳米粒子的形成。
上述两种制备方法中，各反应原料的用量以及反应条件可以都基本相同，区别仅在于含巯基或氨基的配位金属离子螯合物加入的时间。两种方法所获得的双功能化贵金属纳米材料的性质相同。
本发明的发明人发现，就现有的包被鲁米诺发光剂的贵金属纳米颗粒(例如WO2011/107003公开的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化纳米金)而言，向其中加入具有发光增强功能的无包被能力(即无巯基或氨基)的配位金属离子螯合物(相当于单功能贵金属纳米颗粒+发光增强剂)有助于提高溶液的发光强度。但是，当加入有包被能力(含巯基或氨基)的配位金属离子螯合物时，与加入无包被能力的配位金属离子螯合物相比，发现溶液的化学发光强度有进一步明显提高，证明所述含巯基或氨基的配位离子螯合物与贵金属纳米粒子之间的共价键对本发明的双功能化纳米材料的化学发光也有催化作用。
本发明的上述反应可以在加热或超声的条件下进行。
在本发明的一个实施方式中，所述反应体系中还可包含其它有机溶剂，例如乙醇、乙醚、丙酮等。
当本发明鲁米诺类化学发光试剂的量足以使贵金属前体化合物还原形成贵金属纳米粒子时，本发明的方法中无需加入额外的还原剂。但本发明方法也可以加入额外的还原剂来确保贵金属纳米粒子的形成，所述还原剂的非限定性例子有，例如硼氢化钠、柠檬酸盐、抗坏血酸、水合肼、氨基酸、聚乙烯吡咯烷酮等。加入额外还原剂的目的在于辅助还原贵金属前体化合物，以形成贵金属纳米粒子，但这不是必需的。
在本发明的一个实施方式中，所述方法还包括对所得的双功能化贵金属纳米材料进行纯化的步骤，所述纯化是包括例如离心、透析或它们的组合，优选通过离心进行纯化。在另一个优选例中，所述纯化是通过将得到的纳米材料在12500*g下离心10-50分钟，优选10-20分钟。
本发明双官能化纳米材料及其制备方法还可参见由申请人同日提交的代理人案卷号为133858的中国专利申请，该文以引用的方式插入本文作为本发明的一部分。
C.基于本发明的双功能化贵金属纳米材料的分析探针
本发明的双功能化贵金属纳米材料因具有卓越的发光性能，因而可用作各 种分析探针中的发光信号源，从而进一步用于检测领域。
如本发明所用，术语“分析探针”或“本发明的分析探针”是指包含本发明的双功能化贵金属纳米材料和探测分子的一类具有识别功能的复合体，其中双功能化贵金属纳米材料在合适的发光条件下可产生化学发光信号，所述探测分子可与目标分析物产生特异性结合，所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子直接相连、或通过结合对或连接基团间接相连。该类分析探针可用于各种分析检测领域。
在本文中，术语“结合对”指的是可以通过彼此间的高度亲合力发生特异性结合的生物分子，或者通过两个相反电荷的离子依靠库仑力而发生结合的离子对。所述结合对包括第一结合对成员和第二结合对成员。在本文中，“第一结合对成员”和“第二结合对成员”表示互补的结合对成员之一，这两个成员之间通过高度亲合力或库仑力作用而发生结合，形成结合对。本文所用的“第一”和“第二”并无主次之分，仅用于区别的目的。
在本发明的另一个实施方式中，所述结合对选自：生物素-链霉亲和素、生物素-亲和素、生物素-中性亲和素、凝集素与糖类、葡萄球菌A蛋白与IgG、抗原与抗体、阳离子与阴离子、或激素维生素和脂质与受体等。
所述连接基团选自：巯基或氨基。
如本文所用，术语“探测分子”是分析探针中与产生发光信号的双功能化贵金属纳米材料相连的分子，并且探测分析能够与目标分析物产生特异性结合。本领域普通技术人员可根据所用的分析方法和目标分析物的种类，对探测分子进行选择，并可基于所选定探测分子的具体结构对其与双功能化贵金属纳米材料的连接方式进行选择。
在本发明的一个实施方式中，所述目标分析物选自：蛋白质或多肽(抗原、抗体、多肽)、核酸(DNA、RNA、适配体)、微生物(如病毒、细菌、真菌)、脂肪酸、维生素、药物、金属离子、有机物、氨基酸、生物毒素、化学毒素或细胞。
在本发明的另一个实施方式中，所述特异性结合选自：抗体与抗原之间的特异性结合、适配体与抗原之间的特异性结合或核酸分子之间的杂交；所述核酸分子包括DNA和RNA分子。在本文中，术语“抗原”旨在表示能够刺激机体产生(特异性)免疫应答，并能与免疫应答产物抗体和致敏淋巴细胞在体内外结合，发生免疫效应(特异性反应)的物质。在本文中，术语“抗体”旨在包括 能与相应抗原发生特异性结合的免疫球蛋白，以及对该类免疫球蛋白进一步进行修饰使其包含上述结合对成员的物质，例如生物素化的抗体。术语“适配体”是指能与相应抗原发生特异性结合的RNA或DNA片段。
本发明的示例性分析探针根据探测分子的不同可分为免疫分析探针、核酸分析探针等类型，其使用方法可例如参见WO2011/107003，该文全文以引用的方式插入本文作为本发明的一部分。
i.免疫分析探针
如本文所用，“免疫分析探针”是指可用于免疫分析中的、包含本发明双功能化贵金属纳米材料的分析探针，其可用于通过高特异性的免疫反应对各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等物质进行分析。其中的探测分子可为例如抗体、抗原或半抗原、或它们的活性片段(如Fab、(Fab')2等)。
在一个优选的实施方式中，当所述分析探针为免疫分析探针时，所述探测分子与本发明的双功能化金纳米材料直接连接。
在另一个优选的实施方式中，当所述分析探针为免疫分析探针时，所述探测分子通过结合对与本发明的双功能化金纳米材料连接。
ii.核酸分析探针
如本文所用，术语“核酸分析探针”或“核酸探针”可互换使用，是指连接有本发明的双功能化贵金属纳米材料的核酸单链，如单链DNA、单链RNA或适配体单链(相应称为DNA探针、RNA探针和适配体探针)等，其可用于DNA、RNA、金属离子、有机物、氨基酸、肽等目标分析物的分析。
对核酸探针中核酸单链的序列和碱基数并无特殊限制，只要其能与目标分析物特异性结合或与目标分析物竞争性结合捕获分子即可。优选的核酸单链序列可为与目标分析物互补的核酸序列(特异性结合)、与目标分析物具有相同序列的核酸序列(竞争性结合)、或目标分析物的适配体核酸序列。本领域技术人员可根据现有技术中已知的设计针对目标分析物的适配体的方法(例如参见Bing,T.et al.,Biosens Bioelectron,2010,25,1487)设计用于本发明的适配体，或可通过市售获得适配体分子。优选本发明核酸探针中核酸单链的碱基数为5-500bp，更优选10-200bp。
本发明核酸分析探针中的核酸分子可与双功能化贵金属纳米材料通过结 合对或连接基团间接相连。所述结合对和连接基团如上文所定义。
在另一个实施方式中，所述分析探针是化学发光分析探针。
在另一个实施方式中，所述分析探针是电致化学发光分析探针。
在本发明的一个实施方式中，所述探测分子包括生物分子和小分子。所述生物分子选自蛋白质、适配体或核酸等。
在本发明的另一个实施方式中，所述结合对包括第一结合对成员和第二结合对成员，所述结合对选自：生物素-链霉亲和素、生物素-亲和素、生物素-中性亲和素、凝集素与糖类、葡萄球菌A蛋白与IgG、抗原与抗体、阳离子与阴离子、或激素维生素和脂质与受体等；所述连接基团选自：巯基或氨基。
在本发明的另一个实施方式中，所述分析探针为免疫分析探针，其中所述探测分子选自抗体、抗原或半抗原、或它们的活性片段。
在本发明的另一个实施方式中，所述分析探针为核酸分析探针，其中所述探测分子为核酸分子。
在本发明的另一个实施方式中，其特征在于，所述分析探针是化学发光分析探针。
D.分析探针的制备方法
本发明的分析探针的制备方法包括：将所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子直接相连、或通过结合对或连接基团间接相连。
在本发明的一个实施方式中，所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子是通过结合对间接相连的，所述方法包括：
1)在所述探测分子的一端修饰第一结合对成员，得到连接有第一结合对成员的探测分子；
2)将第二结合对成员连接到所述双功能化贵金属纳米材料上，得到连接有第二结合对成员的双功能化贵金属纳米材料；
3)使所述连接有第一结合对成员的探测分子与所述连接有第二结合对成员的双功能化贵金属纳米材料相互作用形成结合对，获得分析探针。
在本文中，上述步骤1)中在探测分子的一端修饰第一结合对成员的方法以及步骤2)中将第二结合对成员连接到所述双功能化贵金属纳米材料上的方法为本领域已知的任意方法。
在一个具体的实施方式中，选择生物素-链霉亲和素作为结合对，制备本发 明的免疫分析探针的示例性过程如下：
A)将本发明所得到的双功能化贵金属纳米材料的溶胶中加入链霉亲和素，使其终浓度为25μg/mL。混合均匀后在室温下培育30分钟，再把5％(w/w)的牛血清白蛋白加到溶液中不断搅拌5分钟，使其最终浓度为1％。最后在17120*g下离心20分钟，以除去未反应试剂和双功能化贵金属纳米材料表面弱结合的保护分子(即通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂和含巯基或氨基的配位金属离子螯合物)，然后将沉淀用含有1％(w/w)的牛血清白蛋白的0.1mol/L pH＝7.4磷酸盐缓冲液溶解，得到连接链霉亲和素的双功能化贵金属纳米材料；
B)在步骤A)中所得的连接链霉亲和素的双功能化贵金属纳米材料中加入端基经生物素修饰的抗体溶液，在37℃下孵育30分钟，在17120*g下离心30分钟，将所得沉淀分散于250μL含有1％(w/w)的牛血清白蛋白的0.1mol/L pH＝7.4磷酸盐缓冲液溶解，即得到本发明的免疫分析探针。
在一个具体的实施方式中，选择生物素-链霉亲和素作为结合对，制备本发明的核酸分析探针的示例性过程如下：
q1)在本发明的双功能化贵金属纳米材料的溶胶中加入链霉亲和素，使链霉亲和素终浓度为25μg/mL。混合均匀后在室温下培育30分钟，再把5％(w/w)的牛血清白蛋白加到溶液中不断搅拌5分钟，使牛血清白蛋白最终浓度为1％。最后在17120*g下离心20分钟，然后将沉淀用含有0.3mol/L的氯化钠的0.05mol/L pH＝8.0Tris-HCl缓冲液分散，得到连接链霉亲和素的双功能化贵金属纳米材料；
q2)在步骤q1)中所得的连接链霉亲和素的双功能化贵金属纳米材料中加入端基经生物素修饰的核酸溶液，在37℃下孵育1小时，在17120*g下离心10分钟，将所得沉淀分散于250μL含有0.3mol/L的氯化钠的0.05mol/L pH＝8.0Tris-HCl缓冲液，即得到本发明的核酸分析探针。
在本发明的另一个实施方式中，所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子是通过连接基团间接相连的，所述方法包括：
1)在所述探测分子的一端修饰连接基团，得到连有连接基团的探测分子；
2)通过所述连接基团将所述连有连接基团的探测分子连接到所述双功能化贵金属纳米材料上，得到分析探针。
在本文中，上述步骤1)中在探测分子的一端修饰连接基团的方法为本领域已知的任意方法。
在另一个具体的实施方式中，选择巯基作为连接基团，制备本发明的核酸分析探针的示例性过程如下：将双功能化贵金属纳米材料中加入端基经巯基修饰的核酸分子的水溶液，再慢慢加入含有1mol/L氯化钠的0.1mol/L pH＝7.4磷酸盐缓冲液继续反应40小时。然后在室温下孵育24小时，在17120*g下离心20分钟，以将所得沉淀分散于0.3mol/L的氯化钠的0.05mol/L pH＝8.0Tris-HCl缓冲液，即得到本发明的核酸分析探针。
在另一个实施方式中，所述分析探针为免疫分析探针，所述方法包括将所述探测分子与双功能化贵金属纳米粒子直接连接的步骤。
在另一个具体的实施方式中，所述探测分子与本发明的双功能化贵金属纳米材料直接连接的示例性制备方法如下：将0.5mL的1.0mg/mL抗体分子加到用0.1mol/L的氢氧化钠将pH调至8.0的本发明双功能化贵金属纳米材料的溶液中，在室温培育30分钟后，再把5％(w/w)的牛血清白蛋白加到溶液中不断搅拌5分钟，使牛血清白蛋白最终浓度为1％(w/w)。最后在17120*g下离心30分钟，然后将沉淀用含有1％(w/w)的牛血清白蛋白的0.1mol/LpH＝7.4磷酸盐缓冲液溶解，即得到本发明的免疫分析探针。
以上仅是制备本发明分析探针的示例性方法，在具体制备时所能采用的方法并不局限于此，而可包括任何能使贵金属纳米粒子与探测分子连接的方法，例如以下文献所报道的方法：Zhou,X.M.et al.,Anal.Chem.2009,81,255；Li,B.L.et al.,Anal.Chem.2009,81,255；Hazarika,P.et al.,Angew.Chem.Int.Ed.2004,43,6469；Li,M.et al.,J.Mater.Chem.2004,14,2260；Steel,A.B.et al.,Anal.Chem.1998,70,4670；Zhang,J.etal.,Nature Protocols 2007,2,2888；Fan,A.P.et al.,Analyst 2008,133,219。
在本发明中，纯化步骤可通过离心、透析或它们的组合进行的，优选通过离心进行纯化。在一个优选例中，所述纯化是通过将所述金溶胶在17120*g下离心30-60分钟，优选45分钟进行的。
E.基于本发明分析探针的分析方法
在本发明中还提供了采用本发明分析探针进行样品分析的方法，该方法包括使目标分析物与所述分析探针通过生物学特异性反应形成分析探针-目标分析物的复合物，再通过检测所得复合物的发光来确定样品中目标分析物的含量。应理解，在获得了本发明的双功能化贵金属纳米材料或分析探针之后，本 领域普通技术人员可根据具体的需要和本领域中的常识，将该双功能化贵金属纳米材料或分析探针灵活应用于各种分析方法中。
本发明的分析方法可广泛应用于各种领域和各种样品的检测和分析，包括(但不限于)生物样品、食品或饮料样品、药物样品、环境样品、化学样品的检测和分析。生物样品可包括例如血液、血浆、血清、尿液、粪便、痰液、分泌物(如汗液、泪液等)、培养物等；所述环境样品可为空气样品、水样、土壤样品；所述化学样品可包括中间物、终产物等等。
本发明分析方法所针对的目标分析物包括但不限于：微生物(如病毒、细菌、真菌)、蛋白质或多肽(如抗原、半抗原、抗体、肽类激素、酶)、核酸(如DNA、RNA片段)、脂肪酸、维生素、药物等。本发明中示例性的目标分析物包括：蛋白质或多肽(如心肌肌钙蛋白、人血小板源生长因子)、特定序列的核酸序列(如结核分支杆菌的特异插入序列IS6110的基因保守序列)。优选本发明的分析方法所针对的目标分析物为疾病特异性标志物，从而可在临床上用于疾病的诊断、分型和疗效评估等。
在本发明的另一个实施方式中，所述分析方法包括但不限于免疫分析方法、核酸分析方法和适配体分析方法。
在本发明的另一个实施方式中，所述方法还包括在所述目标分析物与所述分析探针形成复合物之前，将所述目标分析物固载在固相载体上的步骤。
在本发明的另一个实施方式中，所述方法还包括在所述目标分析物与所述分析探针形成复合物之前，将所述分析探针固载在固相载体上的步骤。
在本文中，术语“固相载体”旨在表示能够通过本文所述的特异性结合、化学键、库仑力或物理性吸附等使目标分析物或分析探针固载在其上的一种固相物质。
在另一个实施方式中，所述固相载体选自：电极、磁微珠、微孔板、尼龙或玻璃等，但不限于此。所述电极包括玻炭电极、金电极、铂电极或氧化铟锡电极等。
在另一个实施方式中，任选地，所述固相载体还可进行进一步的修饰，所述修饰包括在固相载体上添加一层或多层功能层，所述功能层的目的在于增大比表面积、提高电子传递速率或提供可用于目标分析物或分析探针固载的官能团。所述功能层可包含小分子(分子量小于500)、聚合物分子、纳米粒子、生物分子或其组合。当所述固相载体用于固载目标分析物时，所述固相载体中包含 的官能团选自：能与目标分析物发生特异性结合的抗体、适配体或核酸分子。当所述固相载体用于固载分析探针时，所述官能团选自：任意上述结合对成员之一以及任意上述连接基团。
在另一个实施方式中，所述方法还包括对所述复合物进行分离的步骤，优选采用色谱法(如HPLC)、电泳(如CE)、离心(如密度梯度离心)、透析、磁场分离等方式分离。
在另一个实施方式中，所述分析方法是化学发光分析方法，更优选电致化学发光分析方法。
在另一个实施方式中，所述方法还包括提供表明发光强度与样品中目标分析物含量相关性的标准曲线。
在另一个实施方式中，所述化学发光检测包括：将包含待测复合物的体系放入化学发光池中，加入底液，产生化学发光，并用发光检测仪进行检测。
在另一个实施方式中，所述化学发光池为电致化学发光池，在加入底液和施加电压的条件下产生化学发光。
在一个优选例中，所施加的电压为脉冲电压、循环伏安或线性伏安，所述脉冲电压优选为双阶脉冲电压。
在另一个实施方式中，所述底液为氧化剂或其溶液。
在一个优选例中，所述氧化剂选自：H2O2、O2、ClO–、I2、IO4 –或MnO4 –。
在另一个实施方式中，所述底液为含有过氧化氢的碳酸盐缓冲液，优选所述碳酸盐由碳酸钠和碳酸氢钠所组成，优选所述过氧化氢浓度为0.1-50mmol/L，优选1-10mmol/L，更优选1.5-5mmol/L；所述碳酸盐缓冲液的浓度为2-200mmol/L，优选为10-100mmol/L，更优选为20-50mmol/L，所述含有过氧化氢的碳酸盐缓冲液的pH为7-12，优选8.94-11.37，更优选9.37-10.64。
在另一个实施方式中，所述双阶脉冲电压的条件如下：起始电压为-0.5至0.5V，脉冲电压为0.4至1.2V，脉冲时间为0.001-1s，脉冲周期为1-100s。
在另一个实施方式中，在发光检测前，还包括用洗液洗去未结合的分析探针的步骤。
在一个优选例中，所述分析方法为免疫分析方法，所述洗液为磷酸盐缓冲液，所述磷酸盐缓冲液的组成为磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、氯化钠和氯化钾，优选所述磷酸盐缓冲液浓度为0.02mol/L，其中磷酸二氢钾浓度为0.2g/L、磷酸氢二钠浓度为2.9g/L、氯化钠浓度为0.8g/L、氯化钾浓度为0.2g/L。
在另一个优选例中，所述分析方法为核酸分析方法，所述洗液为含有氯化钠的Tris-HCl缓冲液，该缓冲液是由三羟甲基氨基甲烷、盐酸和氯化钠所组成，优选所述含氯化钠的Tris-HCl缓冲液的浓度为0.01mol/L，pH为7.4-8.5，如7.4，其中三羟甲基氨基甲烷浓度为1.21g/L、盐酸浓度为0.36g/L、氯化钠浓度为5.85g/L。
在一个实施方式中，本发明的分析方法包括以下步骤：
1)提供链霉亲和素化金纳米粒子修饰的金电极，即固相载体；
2)提供本发明的分析探针，所述分析探针包含本发明的双功能化贵金属纳米材料和生物素化的抗体；
3)将所述分析探针通过生物素与链霉亲和素之间的特异性结合固载到所述固相载体上，形成分析探针-固相载体复合物；
4)在步骤3)中所得的分析探针-固相载体上，使样品与固载在固相载体上的分析探针发生特异性结合，形成目标分析物-分析探针-固相载体复合物；
5)对4)得到的目标分析物-分析探针-固相载体复合物进行电致化学发光检测。
在一个具体的实施方式中，以生物素化羊抗人免疫球蛋白为生物素化抗体、使用N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和含巯基或氨基的发光增强剂的双功能化金纳米材料，本发明的分析方法包括如下步骤：
1)提供链霉亲和素化金纳米粒子修饰的金电极，即固相载体；
用柠檬酸钠还原氯金酸得到粒径16nm的金纳米粒子，1mLpH调节到7的金纳米粒子溶液加入25μL 1.0mg·mL-1的链霉亲和素中，室温孵育0.5h，再加入250μL 5％的牛血清蛋白孵育5min。所得溶液在12 500rpm转速下离心15min，去除上清液后，用200μL含1％牛血清蛋白的0.01M pH7.4的磷酸缓冲分散，4℃储存备用。裸金电极(Φ-5.0mm)分别用粒径1.0、0.3、0.05μm的Al2O3打磨光滑，再分别用超纯水、乙醇和超纯水超声清洗。金电极用循环伏安法在0.5M H2SO4以100mV·s-1扫速清洗(相对SCE电压0-1.6V,CHI760B电化学工作站)，直至得到重复的循环伏安图。再在含[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-均1mM的0.1M pH7.4的磷酸缓冲中以100mV·s-1扫速测循环伏安曲线(相对SCE电压-0.2-0.6V)直到得到峰形良好的峰电位相差74mV的曲线。之后清洗干净的金电极浸没于5mM的1,3-丙二硫醇/乙醇溶液中，室温孵育20h。金电极表面的硫醇被乙醇和 水清洗掉后，滴上60μL链霉亲和素化金纳米粒子溶液，在4℃孵育5h，用超纯水清洗后备用；
2)提供本发明的分析探针，即生物素化羊抗人免疫球蛋白-N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和含巯基或氨基的发光增强剂双功能化金纳米材料复合物；
将0.5mL 1.0mg mL-1的生物素化羊抗人免疫球蛋白加入20mLpH调节到7.0的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和含巯基或氨基的发光增强剂双功能化金纳米材料的溶液中，室温孵育0.5h，再加入5mL 5％的牛血清蛋白孵育5min。所得溶液在12 500rpm转速下离心15min，去除上清液后，用4mL含1％牛血清蛋白的0.01M pH7.4的磷酸缓冲分散，4℃储存备用；
3)形成分析探针-固相载体复合物，即生物素化羊抗人免疫球蛋白-双功能化金纳米材料-链霉亲和素化金纳米粒子修饰的金电极复合物；
将60mL步骤B)得到的分析探针的水溶液滴加到A)步骤得到的链霉亲和素化金纳米粒子修饰的金电极上，37℃条件下孵育1h。之后修饰好的金电极用含有0.05％吐温的0.01M pH7.4磷酸缓冲清洗，去除掉物理吸附的免疫复合物；
4)检测目标物，形成目标分析物-分析探针-固相载体复合物，即人免疫球蛋白-生物素化羊抗人免疫球蛋白-双功能化金纳米材料-链霉亲和素化金纳米粒子修饰的金电极复合物；
最后将50μL含有不同浓度的人免疫球蛋白0.01M pH7.4的磷酸缓冲(0.1ng·mL-1，0.5ng·mL-1，ng·mL-1，5ng·mL-1，10ng·mL-1，50ng·mL-1，100ng·mL-1)滴加到步骤C)得到的分析探针-固相载体复合物上，37℃条件下孵育40min。最后用上述洗液清洗，即得到人免疫球蛋白-生物素化羊抗人免疫球蛋白-双功能化金纳米材料-链霉亲和素化金纳米粒子修饰的金电极复合物；
5)电致化学发光检测人免疫球蛋白；
我们使用的为自制三电极系统，以修饰好的金电极为工作电极，铂丝为对电极，银丝为参比电极。在工作电极一侧加入3mL含有5mM H2O2的0.02M pH9.78的碳酸缓冲，另一侧不加H2O2。优化的其他条件为起始电压0V，脉冲电压0.8V，脉冲周期30s，脉冲时间0.1s。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例
实施例I：双功能化贵金属纳米材料的制备
测试方法：
(1)透射电镜；
测试方法：透射电子显微镜(TEM,JEOL Ltd,JEOL-2010,日本)。将制得的试样进行离心，12500*g 15min后除去上清液。将所得沉淀分散在无水乙醇溶液后，进行透射电镜分析。
(2)热重分析和差热分析；
测试方法：(TGA/DTG,Q5000 V3.15)将制得的试样进行离心，12500*g15min后除去上清液。将所得沉淀在真空条件下烘干，进行热重分析和差热分析。
(3)紫外可见光谱；
测试方法：(Agilent 8453紫外可见光谱仪)将制得的试样进行离心，12500*g15min后除去上清液。将所得沉淀分散在pH＝12NaOH溶液中，进行紫外可见吸收光谱测定。
(4)X射线光电子能谱；
测试方法：(ESCALABMKⅡelectron spectrograph，VG Scientific,UK)将制得的试样进行离心，12500*g 15min后除去上清液。将所得沉淀在真空条件下烘干，进行X射线光电子能谱分析。
(5)化学发光特性：
采用Centro LB 960型微孔板发光检测仪(Berthold，Germany)对双功能化金纳米材料的化学发光特性进行研究。在微孔板的小孔中注入90μL双功能化金纳米材料溶液(溶解于pH＝12NaOH溶液中)，然后通过微孔板发光检测仪的注射口加入50μL 0.1M H2O2溶液。由微孔板发光检测仪对化学发光强度进行检测，同时记录下化学发光的动力学曲线。
合成例1：制备巯基化二亚乙基三胺五乙酸(螯合剂1)
将1g二亚乙基三胺五乙酸二酸酐溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺中，加热至70℃得到溶液A。将0.55g 2-氨基乙硫醇溶于15mL N,N-二甲基甲酰胺中，并加入0.87mL的三乙胺，加热至70℃得到溶液B。将溶液B加入溶液A中，70℃加热搅拌过夜。在反应过程中，溶液由无色逐渐变为淡黄色，说明二亚乙基三胺五乙酸二酸酐和2-氨基乙硫醇发生了酰胺化反应，生成了具有巯基的螯合剂。溶液冷却至室温后，再进行冰浴，过滤掉白色沉淀。所得滤液旋蒸浓缩，加入氯仿后得到白色沉淀。所得白色沉淀过滤后并用氯仿洗涤，最后真空干燥即得到巯基化二亚乙基三胺五乙酸白色粉末(螯合剂1)。
反应方案1
对螯合剂1进行ES-MS、FT-IR以及1H NMR测试，结果如图1-3所示。
图1是螯合剂1的ES－MS谱图。从图中可以清楚的看到分子离子峰[巯基化二亚乙基三胺五乙酸+H]+(m/z＝512)。
图2是(a)二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)和(b)螯合剂1的FT-IR谱图。在图2的(a)中，3432cm-1对应于–COOH中–OH的振动吸收峰，2932cm-1对应于-CH-的振动吸收峰，1672cm-1对应于–COOH中＝CO的振动吸收峰。在图2的(b)中，3429cm-1对应于–COOH中–OH的振动吸收峰，与图2的(a)相比，峰面积的减小是由于二亚乙基三胺五乙酸二酸酐和2-氨基乙硫醇形成了酰胺键，螯合剂1相比于二亚乙基三胺五乙酸的–COOH含量变少；3016cm-1对应于-CH-的振动吸收峰，2530cm-1对应于–SH的振动吸收峰，1735cm-1对应于–COOH中＝CO的振动吸收峰。另外，1696cm-1对应于RCONR′R″中＝CO的振动吸收峰，1634cm-1对 应于RCONHR′中＝CO的振动吸收峰。通过比较分析，显然螯合剂1比二亚乙基三胺五乙酸多了2530cm-1处的–SH振动吸收峰。
图3是螯合剂1的1H NMR谱图(300MHz,D2O,298K)。通过该1H NMR(300MHz,D2O,298K)谱图，可以肯定具有规定组成的螯合剂1的成功合成。下面是对1H NMR峰的指认和解释：δ3.64(s,4H,-N-CH2-CO-N-),3.61(s,4H,-N-CH2-COOH),3.39(s,2H,-N-CH2-COOH),3.23–3.14(m,12H,-N-CH2-CH2-SH,-N-CH2-CH2-N),2.50(t,4H,N-CH2-CH2-SH)。
以上结果充分证实，已成功合成了螯合剂1。
进一步对螯合剂1进行热重分析和差热分析，结果如图6(b)所示。对螯合剂1进行紫外可见光谱测试，结果如图7中曲线a所示。
合成例2：制备巯基化1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(螯合剂2)
将1g的1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸溶于20mL二氯亚砜溶液中，逐滴加入3mL二甲基甲酰胺加热回流24h，将所得溶液经旋转蒸发仪浓缩并真空干燥后得到1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四酰氯固体。所得产物溶解在乙腈溶液中，而后加入0.5mL 2-氨基乙硫醇溶液，在氮气氛围下50℃搅拌回流48h后即得巯基化1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸，所得产物经旋转蒸发仪浓缩并真空干燥，即得到巯基化1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸(螯合剂2)。
红外光谱的表征结果为，1730cm-1对应于–COOH中＝CO的振动吸收峰，2509cm-1对应于–SH的振动吸收峰。另外，1650cm-1处对应于酰胺键((-C(O)NH-)的伸缩振动吸收峰。
合成例3：制备氨基化二亚乙基三胺五乙酸(螯合剂3)
将1g二亚乙基三胺五乙酸二酸酐溶于20mL N,N-二甲基甲酰胺中，加热至70℃至溶解。将2.5mL乙二胺加入上述溶液后70℃加热搅拌过夜。溶液冷却至室温后，再进行冰浴，过滤掉白色沉淀。所得滤液旋蒸浓缩，加入氯仿后得到白色沉淀。所得白色沉淀过滤后并用氯仿洗涤，最后真空干燥即得到氨基化二亚乙基三胺五乙酸白色粉末(螯合剂3)。
红外光谱的表征结果为，与氨基化反应之前相比，3429cm-1处对应于–COOH中–OH的振动吸收峰的峰面积减小，这是由于二亚乙基三胺五乙酸二酸酐和乙二胺形成了酰胺键，螯合剂3相比于二亚乙基三胺五乙酸的–COOH 含量变少；1715cm-1对应于–COOH中＝CO的振动吸收，3360cm-1和3440cm-1对应于N-H的伸缩振动吸收峰。
合成例4：制备(巯基化二亚乙基三胺五乙酸)合钴(II)(螯合物1)
将螯合剂1配制成6mM的水溶液，然后和6mM的CoCl2水溶液以1：1的体积比混合得到3Mm(巯基化二亚乙基三胺五乙酸)合钴(II)(螯合物1)水溶液。对螯合物1进行紫外可见光谱测试，结果如图7中曲线c所示。
合成例5：制备(巯基化1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸)合钴(II)
(螯合物2)
将螯合剂2配制成6mM的水溶液，然后和6mM的CoCl2水溶液以1：1的体积比混合得到3Mm(巯基化1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸)合钴(II)(螯合物2)水溶液。
实施例I.1：制备双功能化贵金属纳米材料1(材料1)
在本实施例中，含巯基的配位金属离子螯合物为巯基化二亚乙基三胺五乙酸(螯合剂1)和Co2+形成的螯合物(螯合物1)，鲁米诺类化学发光试剂为N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺，贵金属纳米粒子为金纳米粒子。制备方法如下并如图4所示：
(a)在室温下，将7mL 6mM的氯金酸溶液和45mL纯水混合，剧烈搅拌的条件下迅速加入5mL 4mM N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺溶液，室温搅拌2h后，再加入6mL 6mM的氯金酸溶液。室温搅拌2h后即得到酒红色初级N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺功能化金纳米材料的溶胶。
(b)将螯合剂1配制成6mM的水溶液，然后和6mM的CoCl2水溶液以1：1的体积比混合得到3Mm(巯基化二亚乙基三胺五乙酸)合钴(II)(螯合物1)水溶液。将4mL 3mM螯合物1溶液加入到20mL初级金纳米粒子溶胶中，剧烈搅拌过夜后得到紫色溶液。所得溶液在12500rpm转速下离心15min。去除上清液后，用24mL水或NaOH溶液超声分散沉淀即得到N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和含巯基的配位金属离子螯合物双功能化贵金属纳米材料1(材料1)的溶胶。该溶胶可在4℃条件下稳定保存。
对材料1进行透射电镜、热重分析和差热分析、紫外可见光谱、X射线光电子能谱测试，结果分别如图5(b)、图6(c)、图7中曲线e和图8所示。根据上述测 试方法(5)测定材料1的发光强度，结果见图9左图中的曲线a和表2。
以下实施例I.2-19分别采用下表1中所列的原料，制备双功能化贵金属纳米材料2-20(下文记作“材料2-20”)。
实施例I.2：制备双功能化贵金属纳米材料2(材料2)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用CuCl2·2H2O代替CoCl2，得到材料2。用透射电镜进行测试，结果如图5(c)所示。根据图5(c)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料2的发光强度，结果见图9左图中的曲线b。
实施例I.3：制备双功能化贵金属纳米材料3(材料3)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用Pb(NO3)2代替CoCl2，得到材料3。用透射电镜进行测试，结果如图5(d)所示。根据图5(d)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料3的发光强度，结果见图9左图中的曲线c。
实施例I.4：制备双功能化贵金属纳米材料4(材料4)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用NiCl2代替CoCl2，得到材料4。用透射电镜进行测试，结果如图5(e)所示。根据图5(e)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料4的发光强度，结果见图9左图中的曲线d。
实施例I.5：制备双功能化贵金属纳米材料5(材料5)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用HgCl2代替CoCl2，得到材料5。根据图5(f)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。用透射电镜进行测试，结果如图5(f)所示。根据图5(f)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料5的发光强度，结果见图9左图中的曲线e。
实施例I.6：制备双功能化贵金属纳米材料6(材料6)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用CrCl3代替CoCl2，得到材料6。用透射电镜进行测试，结果如图5(g)所示。根据图5(g)的 电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料6的发光强度，结果见图9左图中的曲线f。
实施例I.7：制备双功能化贵金属纳米材料7(材料7)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用EuCl3代替CoCl2，得到材料7。用透射电镜进行测试，结果如图5(h)所示。根据图5(h)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料7的发光强度，结果见图9右图中的曲线h。
实施例I.8：制备双功能化贵金属纳米材料8(材料8)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用La(NO3)3代替CoCl2，得到材料8。用透射电镜进行测试，结果如图5(i)所示。根据图5(i)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料8的发光强度，结果见图9右图中的曲线j。
实施例I.9：制备双功能化贵金属纳米材料9(材料9)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用GdCl3代替CoCl2，得到材料9。用透射电镜进行测试，结果如图5(j)所示。根据图5(j)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料9的发光强度，结果见图9右图中的曲线i。
实施例I.10：制备双功能化贵金属纳米材料10(材料10)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用SmCl3代替CoCl2，得到材料10。根据图5(k)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。用透射电镜进行测试，结果如图5(k)所示。根据图5(k)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料10的发光强度，结果见图9右图中的曲线k。
实施例I.11：制备双功能化贵金属纳米材料11(材料11)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用ErCl3代替CoCl2，得到材料11。根据图5(l)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。用透射电镜进行测试，结果如图5(l)所示。根据图5(l)的电镜照 片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料11的发光强度，结果见图9右图中的曲线l。
实施例I.12：制备双功能化贵金属纳米材料12(材料12)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用DyCl3代替CoCl2，得到材料12。根据图5(m)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。用透射电镜进行测试，结果如图5(m)所示。根据图5(m)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料12的发光强度，结果见图9右图中的曲线m。
实施例I.13：制备双功能化贵金属纳米材料13(材料13)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用Ce(SO4)2·4H2O代替CoCl2，得到材料13。根据图5(n)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。用透射电镜进行测试，结果如图5(n)所示。根据图5(n)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料13的发光强度，结果见图9右图中的曲线n。
实施例I.14：制备双功能化贵金属纳米材料14(材料14)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用Ce2(SO4)3·8H2O代替CoCl2，得到材料14。根据图5(o)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。用透射电镜进行测试，结果如图5(o)所示。根据图5(o)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料14的发光强度，结果见图9右图中的曲线o。
实施例I.15：制备双功能化贵金属纳米材料15(材料15)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用Pd(NO3)2代替CoCl2，得到材料15。根据图5(p)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。用透射电镜进行测试，结果如图5(p)所示。根据图5(p)的电镜照片可以看出，它是一种具有良好分散性的纳米颗粒。根据上述测试方法(5)测定材料8的发光强度，结果见图9左图中的曲线g。
实施例I.16：制备双功能化贵金属纳米材料16(材料16)
根据实施例I.1中制备材料1的相同方法，不同之处在于，使用螯合剂2代替螯合剂1，得到材料16。
实施例I.17：制备双功能化贵金属纳米材料17(材料17)
(a)在加热回流条件下，将5mL 6mM的氯金酸溶液和95mL超纯水混合，加热至沸腾。剧烈搅拌的条件下迅速加入1.6mL 10mM鲁米诺溶液，回流2h后至颜色稳定。关闭加热后继续搅拌30min后即得到酒红色初级鲁米诺功能化金纳米材料的溶胶。
(b)将螯合剂1配制成6mM的水溶液，然后和6mM的CoCl2水溶液以1：1的体积比混合得到3Mm(巯基化二亚乙基三胺五乙酸)合钴(II)(螯合物1)水溶液。将4mL 3mM螯合物1溶液加入到200mL初级金纳米粒子溶胶中，剧烈搅拌过夜后得到所需溶液。所得溶液在12500rpm转速下离心15min。去除上清液后，用24mL水或NaOH溶液超声分散沉淀即得到鲁米诺和含巯基的配位金属离子螯合物双功能化贵金属纳米材料17(材料17)的溶胶。该溶胶可在4℃条件下稳定保存。
实施例I.18：制备双功能化贵金属纳米材料18(材料18)
(a)在室温条件下下，将2mL 6mM的氯金酸溶液和10mL纯水混合，剧烈搅拌的条件下迅速加入1mL 10mM异鲁米诺溶液，室温搅拌2h后，再加入1mL6mM的氯金酸溶液。室温搅拌2h后即得到酒红色初级异鲁米诺功能化金纳米材料的溶胶。
(b)将螯合剂1配制成6mM的水溶液，然后和6mM的CoCl2水溶液以1：1的体积比混合得到3Mm(巯基化二亚乙基三胺五乙酸)合钴(II)(螯合物1)水溶液。将4mL 3mM螯合物1溶液加入到200mL初级金纳米粒子溶胶中，剧烈搅拌过夜后得到所需溶液。所得溶液在12500rpm转速下离心15min。去除上清液后，用24mL水或NaOH溶液超声分散沉淀即得到异鲁米诺和含巯基的配位金属离子螯合物双功能化贵金属纳米材料18(材料18)的溶胶。该溶胶可在4℃条件下稳定保存。
实施例I.19：制备双功能化贵金属纳米材料19(材料19)
(a)将5mL氯铂酸(4mM)加入到45mL水中,加热回流。磁力搅拌条件下,加入2mL鲁米诺(10mM),继续搅拌至溶液颜色稳定。停止加热后继续搅拌30min 可制得棕色初级鲁米诺功能化铂纳米材料的溶胶。
(b)将螯合剂1配制成6mM的水溶液，然后和6mM的CoCl2水溶液以1：1的体积比混合得到3Mm(巯基化二亚乙基三胺五乙酸)合钴(II)(螯合物1)水溶液。将4mL 3mM螯合物1溶液加入到20mL初级铂纳米粒子溶胶中，剧烈搅拌过夜后得到所需溶液。所得溶液在12500rpm转速下离心15min。去除上清液后，用24mL水或NaOH溶液超声分散沉淀即得到鲁米诺和含巯基的配位金属离子螯合物双功能化贵金属纳米材料19(材料19)的溶胶。该溶胶可在4℃条件下稳定保存。
实施例I.20：制备双功能化贵金属纳米材料20(材料20)
(a)将10mL 1.0mM硝酸银水溶液、9mL无水乙醇及5mL超纯水(电阻率为18.2MΩ*cm)在25℃搅拌下混合，搅拌条件下加入0.5mL 0.01mol/L鲁米诺，继续搅拌2小时后，即得到稳定的初级鲁米诺发光功能化的纳米银溶胶。
(b)将螯合剂1配制成6mM的水溶液，然后和6mM的CoCl2水溶液以1：1的体积比混合得到3Mm(巯基化二亚乙基三胺五乙酸)合钴(II)(螯合物1)水溶液。将4mL 3mM螯合物1溶液加入到20mL初级银纳米粒子溶胶中，剧烈搅拌过夜后得到所需溶液。所得溶液在12500rpm转速下离心15min。去除上清液后，用24mL水或NaOH溶液超声分散沉淀即得到鲁米诺和含巯基的配位金属离子螯合物双功能化贵金属纳米材料20(材料20)的溶胶。该溶胶可在4℃条件下稳定保存。
表1制备双功能化贵金属纳米材料2-20的原料
比较例I.1：制备单功能N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化金纳米材料
(比较材料1)
将7mL 6mM的氯金酸溶液和45mL超纯水混合，剧烈搅拌的条件下迅速加入5mL 4mMN-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺溶液，室温搅拌2h后，再加入6mL 6mM的氯金酸溶液。室温搅拌2h后，得到N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化金纳米材料(比较材料1)。用透射电镜进行测试，结果如图5(a)所示。根据上述测试方法(5)测定比较材料1的发光强度，结果见图10(c)中曲线F和表2。
比较例I.2：制备单功能鲁米诺发光功能化金纳米材料(比较材料2)
在加热回流条件下，将5mL 6mM的氯金酸溶液和95mL超纯水混合，加热至沸腾。剧烈搅拌的条件下迅速加入1.6mL 10mM鲁米诺溶液，回流2h后至颜色稳定。关闭加热后继续搅拌30min后即得到酒红色鲁米诺功能化金纳米材料的溶胶。根据上述测试方法(5)测定比 较材料2的发光强度，结果见图10(c)中曲线H和表2。
比较例I.3：制备比较材料1和(二亚乙基三胺五乙酸)合钴(II)的混合物(比较材
料3)
向比较例I.1的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化金纳米材料水溶液中加入1.5mM(二亚乙基三胺五乙酸)合钴(II)，得到该螯合物与发光功能化金纳米材料的混合物(比较材料3)的水溶液。由于该螯合物缺乏可以与发光功能化金纳米材料相连的第一活性基团，因而不能连接到发光功能化金纳米粒子的表面，而仅能独立地存在于溶液中作为发光增强剂增强发光功能化金纳米材料水溶液的发光。根据上述测试方法(5)测定比较材料3的发光强度，结果见 图10(c)中曲线D和表2。
比较例I.4：制备比较材料1与Co
2+
的混合物(比较材料4)
向比较例I.1的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化金纳米材料水溶液中加入3mM Co2+，得到Co2+与发光功能化金纳米材料的混合物(比较材料4)的水溶液。根据上述测试方法(5)测定比较材料4的发光强度，结果见图10(c)中曲线E和表2。
比较例I.5：制备N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺与螯合剂1的双功能化金纳米
材料(比较材料5)
向比较例1的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光功能化金纳米材料水溶液中加入3mM螯合剂1，得到N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺与螯合剂1双功能化的金纳米材料(比较材料5)。根据上述测试方法(5)测定比较材料5的发光强度，结果见图10(b)中曲线B和表2。
比较例I.6：制备N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺与硫辛酸功能化金纳米材料
(比较材料6)
将1mL 4mM的ABEI与2mL 4mM的硫辛酸混合，然后加入3.5mL 6mM的氯金酸，室温搅拌24h,即可制得簇状N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺与硫辛酸功能化金纳米材料(比较材料6)。根据上述测试方法(5)测定比较材料6的发光强度，结果见图10(b)中曲线C和表2。
图5是材料1-15与比较材料1的透射电镜照片。其中：(a)对应比较材料1；(b)-(p)分别对应本发明的材料1-15。从图中可以看出，材料1-15不但没有聚集，与比较材料1相比反而有更好的分散性，这是由于螯合物1带有负电荷，增加了金纳米粒子彼此之间的静电排斥力。
图6是N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺(如图6(a)所示)、螯合剂1(如图6(b)所示)以及材料1(如图6(c)所示)的热重分析和差热分析曲线。如图6(c)所示，由于螯合剂1与Co2+络合并且以Au-S共价键与金纳米粒子连接，热分解温度由260℃升高到330℃。
图7以下物质的紫外-可见吸收光谱结果。其中，a对应60mM螯合剂1的水溶液；b对应60mM Co2+水溶液；c对应30mM螯合物1的水溶液；d对应 0.5mM N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺水溶液；e对应本发明材料1的水溶液。曲线b可以看出，Co2+在510nm左右有个吸收峰，而螯合剂1没有吸收(曲线a)。螯合物1在503nm处的吸收峰表明螯合物1的成功形成，蓝移是由螯合原子N和O的强电负性引起的(曲线c)。材料1(曲线e)同时具有N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺在292nm处的特征吸收峰(曲线d)和螯合物1在529nm处的吸收峰(曲线c)。因此表明该材料1中的金纳米粒子同时包被有N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和螯合物1。
图8是材料1的X射线光电子能谱结果。其中，图(a)为总谱；图(b)对应Au 4f；图(c)对应N 1s；图(d)对应C 1s；图(e)对应Co 2p；图(f)对应S 2p。从全谱(a)可以看到Au，N，C，O，S和Co存在于材料1的表面。其中Au，N和C的能谱与文献(Tian,D.；Zhang,H.；Chai,Y.；Cui,H.Chem.Commun.2011,47,4959)相同，表明N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和其氧化产物同时存在于金纳米粒子的表面。Co2+被N和O两种原子所螯合，所以Co 2p 1/2和Co 2p3/2均有两组分裂，CoN位于801.2和785.8eV处,CoO位于796.7和781.0eV处，Co 2p 1/2和2p3/2裂分距离为15eV，这些全部都和标准能谱相符合。S 2p位于162.4eV，表明螯合物1以Au-S共价键连接到金纳米粒子的表面。
以上表征数据表明，成功合成了连接有N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和螯合物1的双功能化金纳米材料，即材料1。
采用相同的表征手段，对材料2-20进行表征，结果均能证明成功制备出各种双功能化贵金属纳米材料。
化学发光特性
图9是含不同配位金属离子螯合物的双功能化金纳米材料(材料1-15)的化学发光曲线。其中，a对应Co2+，b对应Cu2+，c对应Pb2+，d对应Ni2+，e对应Hg2+，f对应Cr3+；g对应Pd2+；h对应Eu3+；i对应Gd3+；j对应La3+；k对应Sm3+；l对应Er3+；m对应Dy3+；n对应Ce4+；o对应Ce3+。可以看出，这些材料均具有卓越的化学发光特性，该特性应归功于各配位金属离子对N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺发光体系良好的催化效果。由于Co2+的催化效果最好(曲线a)，因此在后续实验中，选择Co2+作为示例，进行各种测试。我们知道，稀土元素还有其他光学性质(如上转换荧光和Gd3+有增大核磁共振弛豫率的性质)，因此我们双功能化的金纳米粒子为多模态技术提供了一种可能。
为了验证本发明的双功能化贵金属纳米材料在发光性能上比现有发光功 能化纳米材料具有显著提高，进行以下对照实验。比较了如下表2中各种材料水溶液的化学发光，结果如图10所示。所述化学发光测试在相同的发光条件下进行。
表2
| 分析对象 | 最大发光强度(A.U.) |
| (A)本发明的材料1 | 1,200,000 |
| (B)比较材料5 | 56,200 |
| (C)比较材料6 | 15,000 |
| (D)比较材料3 | 7,300 |
| (E)比较材料4 | 2,400 |
| (F)比较材料1 | 900 |
| (G)对(D)进行离心再分散后的溶液 | 1,700 |
| (H)比较材料2 | 520 |
可以看出，与比较材料1(曲线F)和2(曲线H)相比，本发明材料1(曲线A)的化学发光强度至少高103。由于比较材料6(曲线C)本身具有簇状形貌，在其它条件相同的情况下，该特殊形貌能够使其化学发光性能优于球状纳米材料(如比较材料1)，这一点从比较材料6的发光强度高于比较材料1的发光强度可以看出。但是本发明的材料1虽也为球形，其发光强度仍高于比较材料6的发光强度达80倍。比较材料4(曲线B)是N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺与螯合剂1的双功能化金纳米材料，其中螯合剂1本身通过Au-S键与金纳米粒子相连，这对化学发光也有很强的催化能力，因此与比较材料1相比，比较材料4的化学发光强度更强。在(G)中，由于(二亚乙基三胺五乙酸)合钴(II)无包被能力而被离心除去，因此经离心后溶液的化学发光强度与N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺功能化金纳米粒子相当。从曲线D和E可以看出，如果分别直接向比较材料1中加入1.5mM(二亚乙基三胺五乙酸)合钴(II)或3mM Co2+作为催化剂，化学发光强度分别从900增高到7,300和2,400，但其发光强度也以远低于本发明的材料1的发光强度，这说明当配位金属离子螯合物包被在发光功能化贵金属纳米粒子表面时，比配位金属离子仅存在于水溶液中时对化学发光有更好的催化效果。因此，本发明的双功能化贵金属纳米材料具有卓越的发光特性，与现有技术相比，发光性能得到极大提高，取得了意想不到的技术效果。
实施例II：免疫分析探针的制备
实验条件：
裸金电极的预处理：裸金电极(Φ-5.0mm)分别用粒径1.0、0.3、0.05μm的Al2O3打磨光滑，再分别用超纯水、乙醇和超纯水超声清洗。金电极用循环伏安法在0.5M H2SO4以100mV·s-1扫速清洗(相对SCE电压0-1.6V,CHI760B电化学工作站)，直至得到重复的循环伏安图。再在含[Fe(CN)6]3-和[Fe(CN)6]4-均1mM的0.1M pH7.4的磷酸缓冲中以100mV·s-1扫速测循环伏安曲线(相对SCE电压-0.2-0.6V)直到得到峰形良好的峰电位相差74mV的曲线。
修饰和孵育反应在PST-60HL plus型恒温振荡器(Biosan,Latvia)中进行，孵育温度为37℃，振荡频率为250rpm。实验中离心操作均在Universal 320型高速离心机(Hettich,Germany)上完成。
电致化学发光检测是在实验室自主研制的电致化学发光系统上完成。该系统由电化学工作站(上海辰华,CHI760B型)、超微弱化学发光仪(西安瑞迈，RFL-1型)、自制H-型电化学池、光电倍增管(北京滨松,CR-105型)和一台微型计算机组成。在实验中，用含有5mM过氧化氢的0.02M的碳酸盐缓冲液(未特殊说明pH 9.78)作为工作溶液。工作电极为上述经过多步修饰后用于电致化学发光检测的金电极，准参比电极为银丝，对电极为铂丝。实验时在工作腔和辅助腔中分别加入6.0ml和2.0ml工作溶液，辅助腔需用黑胶带缠绕，以免对电极的发光信号影响实验结果。设置电化学工作站和超微弱发光仪的参数，当工作电极电位合适时，超微弱发光仪会检测到发光信号，并记录下来。
实施例II.1：制备生物素化羊抗人IgG和材料1的复合物(免疫分析探针1)
将0.5mL 1.0mg mL-1的生物素化羊抗人IgG加入20mL pH调节到7.0的材料1溶液中，室温孵育0.5h，再加入5mL 5％的BSA孵育5min。所得溶液在12 500rpm转速下离心15min，去除上清液后，用4mL含1％BSA的0.01M pH7.4的磷酸缓冲分散，得到生物素化羊抗人IgG-材料1的复合物(即免疫分析探针1)，4℃储存备用。
实施例II.2：基于分析探针1的免疫分析方法及该方法构建的免疫传感器1
按照以下方法的步骤进行免疫分析，该方法的步骤如图16所示：
(i)将经预处理的金电极浸没于5mM的1,3-丙二硫醇/乙醇溶液中，室温孵 育20h，用乙醇和水对该金电极表面进行洗涤，除去未结合的硫醇分子。
(ii)用柠檬酸钠还原氯金酸得到粒径16nm的金纳米粒子，1mL pH调节到7的金纳米粒子溶液加入25μL 1.0mg·mL-1的链霉亲和素，室温孵育0.5h，再加入250μL 5％的BSA孵育5min。所得溶液在12500rpm转速下离心15min，去除上清液后，用200μL含1％BSA的0.01MpH 7.4的磷酸缓冲分散。将步骤(i)所得的电极上滴上60μL链霉亲和素化金纳米粒子溶液，在4℃孵育5h，用超纯水清洗后备用。即得到链霉亲和素化金纳米粒子修饰的金电极(即固相载体)。
(iii)将60mL实施例II.1得到的免疫分析探针1的水溶液滴加到实施例步骤(ii)得到的固相载体上，37℃条件下孵育1h。之后用含有0.05％吐温的0.01M pH 7.4磷酸缓冲清洗该经进一步修饰的固相载体，去除掉物理吸附的免疫复合物，得到生物素化羊抗人IgG-材料1-链霉亲和素化金纳米粒子修饰的金电极，即免疫分析探针1-固相载体的复合物。
(iv)最后将50μL含有不同浓度的hIgG的0.01M pH 7.4的磷酸缓冲(0.1ng·mL-1，0.5ng·mL-1，1ng·mL-1，5ng·mL-1，10ng·mL-1，50ng·mL-1，100ng·mL-1)滴加到上述步骤(iv)所得的免疫分析探针1-固相载体的复合物上，37℃条件下孵育40min。最后用上述洗液清洗，即得到hIgG-生物素化羊抗人IgG-材料1-链霉亲和素化金纳米粒子修饰的金电极，即目标分析物-免疫分析探针1-固相载体的复合物，该复合物即为一种免疫分析传感器。
上述基于材料1的免疫分析方法所构建的免疫传感器1既作为携带有抗体的平台，也作为抗体与抗原特异性识别的平台。首先，1,3-丙二硫醇通过自组装在金电极的表面形成单分子层。然后，链霉亲和素化的金纳米粒子通过和1,3-丙二硫醇形成Au-S共价键被固定在金电极上。被固载的金纳米粒子基质能够起到信号放大的作用。分析探针1随后通过生物素与链霉亲和素的结合，被组装到金电极的表面，构建起传感平台。分析探针1起到三种作用：一、使电极表面被功能化数以千计的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺分子从而产生电致化学发光(ECL)信号；二、携带有很多生物素化羊抗人IgG，能够与链霉亲和素化金纳米粒子修饰的金电极相连接；三、表面带有抗体羊抗人IgG，能够和目标分析物IgG特异性识别并结合。在没有hIgG存在时的正电压条件下，能够观察到很强的ECL信号。这种情况是由于，N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺阳离子和HO2 -在碱性溶液中发生电致氧化还原反应，在金纳米粒子的催化下 生成N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺自由基(L-)和O2 -自由基。之后L-和O2 -在金纳米粒子的表面反应产生激发态的N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺氧化产物，当其回到基态时能量以光的形式释放出来。存在目标分析物hIgG时，hIgG被分析探针1捕获并发生抗原抗体免疫结合，从而导致ECL强度的下降。很明显，N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和H2O2的电致化学发光是电子传递的过程。我们知道蛋白质不具备良好的导电性，因此能够阻碍界面上的电子传递，并不利于电化学活性物质的扩散。因此当抗体羊抗人IgG和抗原hIgG发生反应后，形成了导电性差的免疫复合物，电极上N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺的ECL强度下降。ECL信号强度的下降和hIgG的浓度相关，因此能够用于hIgG的定量分析，构建免疫传感器1。
免疫传感器1的表征
我们利用电化学阻抗谱和电致化学发光方法对实施例II.2中的每一步组装步骤进行了表征。
图11为修饰电极在制备过程中不同步骤的电化学阻抗谱。从电化学阻抗谱中可以看出，电化学阻抗响应的高频部分显示为半圆而低频部分则为直线响应，表明所得修饰电极的电极反应过程在高频端由电子转移控制而低频端由扩散控制。高频部分半圆的直径越大说明电极表面电子转移阻抗越大。从图中我们可以看出，1,3-丙二硫醇自组装分子层的修饰是电极表面电子转移阻抗比裸金电极(曲线a)显著增大(曲线b)。而链霉亲和素包裹的金纳米粒子的修饰(曲线c)又使电子转移阻抗减小，这是由于金纳米粒子有利于电极表面电荷传递的原因。而分析探针1(曲线d)又使阻抗增大，这是由于本发明材料1所带有的负电荷会阻碍电子的转移过程所致。当hIgG与羊抗人IgG结合产生免疫复合物后，阻抗又有所增大(曲线e)。电化学阻抗谱的表征结果表明，如我们期望的一样，通过桥连分子1,3-丙二硫醇可将链霉亲和素的金纳米粒子组装在金电极上，再通过生物素-链霉亲和素的相互作用，可将分析探针1组装在金电极上，从而成功制备了免疫传感器1。
还通过检测每一步的电致化学发光来表征传感器的构建过程。图12为双阶脉冲电压下，构建传感器的每一步的电致化学发光图。从图可以看出裸的金电极(曲线a)、1,3-丙二硫醇修饰的金电极、链霉亲和素化金纳米粒子/1,3-丙二硫醇修饰的金电极(曲线c)，在工作溶液中是不会产生电致化学发光的； 而当分析探针1修饰到金电极表面后，产生了很强的化学发光(曲线e)，这是分析探针1本身就具有化学发光特性，修饰到金电极上后依然能在适当条件下产生电致化学发光；当最后和抗原hIgG发生免疫反应产生免疫复合物后，阻碍了电子的传递，所以化学发光信号明显下降(曲线f)。而不同浓度的抗原结合上去后，引起不同程度的化学发光强度的减弱，形成了对抗原浓度进行定量分析的根据。
为了使得我们构建的基于分析探针1的免疫传感器1更加稳定、性能更加优良，我们对实验条件进行了优化。
首先，我们分别研究了在双阶脉冲电压和循环伏安电化学条件下，该免疫传感器1的化学发光性能。采用循环伏安法时，扫描电位为0～1.0V，工作溶液是含有0.5mM过氧化氢的0.02M pH＝9.78碳酸盐缓冲溶液。可以明显看出，随着扫描次数的增加，其化学发光强度也随之下降。这可能是因为每扫描一次对发光分子的消耗远大于电极表面扩散层的恢复。而在双阶脉冲电压条件中的连续10个脉冲电压下，该免疫传感器1的化学发光信号很稳定，没有显著变化，相较于循环伏安法更加稳定。所以之后的实验中我们都在双阶脉冲电压条件下进行，选择稳定的7次脉冲时(第4到第10次脉冲)ECL强度的平均值作为检测hIgG浓度的信号值。
为了得到最强的ECL信号，我们对双阶脉冲的起始电压、脉冲电压、脉冲时间、脉冲周期、工作溶液的pH值和H2O2浓度都进行了优化(图13)。当起始电压在-0.3V～0.3V之间时，我们发现在0V时，电致化学发光的信号最强(图13a)。在考察脉冲电位对电致化学发光的影响时(图13b)，由于较高脉冲电位有利于N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺的电氧化，所以电致化学发光强度随脉冲电位的增大而增强，考虑到脉冲电位太高会使得某些条件下发光强度超出量程，所以实验中我们都选取0.8V作为脉冲电压。对于脉冲时间对电致化学发光的影响(图13c)，我们在0.025～0.125s内进行了考察，发现电致化学发光信号会随脉冲时间的增长而加强，但超过0.1s后发光信号就会不稳定，所以我们在实验室中都选择0.1s作为脉冲时间。脉冲周期在10～60s内变化时，电致化学发光会随脉冲时间增长而增强(图13d)，综合考虑分析时间和信号强度，我们在实验中都选择30s作为脉冲周期。在工作溶液的pH值为9.16～10.83范围内，我们对传感器的电致化学发光进行了检测(图13e)，得到最大电致化学发光强度出现在工作溶液的pH值为9.78的时候。电致化学发光强度 随着H2O2浓度的增大而升高(图13f)，但是当较大的H2O2浓度时ECL信号的背景也随之变高，考虑到最优的信噪比，我们选择含有0.5mM的H2O2CBS作为工作液。
总之优化后的实验条件为：起始电压：0V、脉冲电压：0.8V、脉冲时间：0.1s、脉冲周期：30s、pH值：9.78和H2O2浓度：0.5mM。
免疫传感器1的分析性能
用基于分析探针1的免疫传感器1定量分析hIgG，实验条件为上述优化后的条件，得到电致化学发光强度随hIgG浓度的变化规律如图14所示，电致化学发光强度与hIgG浓度的对数值在0.1–100ng·mL-1的hIgG浓度范围内呈线性关系，回归方程为I＝-8506-1788·log C(I为ECL信号强度/A.U.，C为hIgG浓度/g·mL-1)。在信噪比为3的条件下，对hIgG的检测限为0.04ng·mL-1，比临床常用的ELISA测试结果4.3ng·mL-1要优越。本方法的精密度实验结果为，分析物的日标准偏差(intra-day precision,n＝5)为5.12％，日间标准偏差(inter-day precision,n＝5)小于10.13％。上述结果表明该免疫分析方法具有令人满意的重现性，可以用于对hIgG的测定。该方法还具有简单、快速、省力等优点，对于临床诊断也具有很高的灵敏度，因此我们的应用策略适合发展廉价且迅速的医疗测试。
免疫传感器1的选择性
我们还研究了上述免疫传感器1的选择性，在免疫分析体系中采用了不同种类的干扰物质，如肌红蛋白(Mb)、BSA、生物素和凝血酶。如图15所示，空白溶液具有很高的ECL信号，而在单独的hIgG和存在其他蛋白的hIgG溶液中，ECL信号明显减弱。免疫传感器1对于Mb，凝血酶，BSA和生物素的响应同空白溶液相差不大。hIgG的信号可以明显地从Mb、凝血酶、BSA和生物素区别出来，因此我们的基于本发明分析探针1的免疫传感器1具有很好的选择性，可以用于免疫分析中。
Claims (19)
1.一种分析探针，其包含双功能化贵金属纳米材料和探测分子，所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子相连，其中所述双功能化贵金属纳米材料包含：
贵金属纳米粒子；
源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段；和
源自含巯基或氨基的配位金属离子螯合物的发光增强片段；
所述源自通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂的发光片段和源自含巯基或氨基的配位金属离子螯合物的发光增强片段连接在所述贵金属纳米粒子的表面：
式中，
A表示C6-C14芳基；
R1和R2独立地表示氢、端基被氨基取代或未取代的直链或支链C1-C30烷基，前提条件是-NR1R2具有至少一个NH2端基。
2.如权利要求1所述的分析探针，其特征在于，
所述贵金属纳米粒子选自金纳米粒子、银纳米粒子、铂纳米粒子、它们的合金纳米粒子，以及它们的组合；
所述通式(I)的鲁米诺类化学发光试剂选自通式(II)和(III)的鲁米诺类化学发光试剂：
其中，R1和R2如上所限定
所述含巯基或氨基的配位金属离子螯合物中，金属离子选自第VIII族、IB族、IIB族、VIB族过渡金属离子、稀土元素离子、IVA族金属或其组合；
所述螯合物的螯合剂具有选自巯基、氨基或其组合的第一活性基团和第二活性基团，其中所述第一活性基团用于与所述贵金属纳米粒子发生连接，所述第二活性基团用于与所述金属离子发生络合；
所述过渡金属离子选自：Co2+、Cu2+、Ni2+、Hg2+、Cr3+、Pd2+、Pt2+、Fe2+、Fe3+、Ru2+；
所述IVA族金属是Pb2+；
所述稀土元素离子选自Eu3+，La3+、Gd3+、Sm3+、Er3+、Dy3+、Ce4+、Ce3+；
所述螯合剂的第一活性基团选自巯基；
所述第二活性基团包括含O、N、S的具有络合能力的活性基团；
所述金属离子螯合物的螯合剂选自：巯基化螯合剂；氨基化螯合剂；或它们的组合。
3.如权利要求2所述的分析探针，其特征在于，所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子或银纳米粒子。
4.如权利要求3所述的分析探针，其特征在于，所述贵金属纳米粒子为金纳米粒子。
5.如权利要求2所述的分析探针，其特征在于，所述通式(II)的鲁米诺类化学发光试剂选自：
其中，R1和R2如上所限定。
6.如权利要求2所述的分析探针，其特征在于，所述通式(II)的鲁米诺类化学发光试剂选自：鲁米诺、异鲁米诺、N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺和N-(4-氨基己基)-N-乙基异鲁米诺。
7.如权利要求6所述的分析探针，其特征在于，所述通式(II)的鲁米诺类化学发光试剂为N-(4-氨基丁基)-N-乙基异鲁米诺。
8.如权利要求2所述的分析探针，其特征在于，所述通式(III)的鲁米诺类化学发光试剂为N-(4-氨基丁基)-N-乙基萘酰肼。
9.如权利要求2所述的分析探针，其特征在于，所述第二活性基团所包括的含O、N、S的具有络合能力的活性基团选自：羧基、羟基、仲氨基、叔氨基或其组合。
10.如权利要求2所述的分析探针，其特征在于，所述巯基化螯合剂选自：巯基化乙二胺四乙酸、巯基化二亚乙基三胺五乙酸、巯基化1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸、巯基化二亚乙三胺四乙酸。
11.如权利要求2所述的分析探针，其特征在于，所述氨基化螯合剂选自：氨基化乙二胺四乙酸、氨基化二亚乙基三胺五乙酸、氨基化1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四羧酸、氨基化二亚乙三胺四乙酸。
12.如权利要求1-11中任一项所述的分析探针，其特征在于，所述探测分子包括生物分子和小分子；所述生物分子选自蛋白质、适配体或核酸。
13.如权利要求1-11中任一项所述的分析探针，其特征在于，所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子通过结合对或连接基团间接相连，所述结合对包括第一结合对成员和第二结合对成员，所述结合对选自：生物素-链霉亲和素、生物素-亲和素、生物素-中性亲和素、凝集素与糖类、葡萄球菌A蛋白与IgG、抗原与抗体、阳离子与阴离子、或激素维生素和脂质与受体；
所述连接基团选自：巯基或氨基。
14.如权利要求1-11中任一项所述的分析探针，其特征在于，所述分析探针为免疫分析探针，其中所述探测分子选自抗体、抗原或半抗原、或它们的活性片段。
15.如权利要求1-11中任一项所述的分析探针，其特征在于，所述分析探针为核酸分析探针，其中所述探测分子为核酸分子。
16.一种制备如权利要求1-15中任一项所述的分析探针的方法，所述方法包括将所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子相连获得分析探针的步骤。
17.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子是通过结合对间接相连的，所述方法包括：
1)在所述探测分子的一端修饰第一结合对成员，得到连接有第一结合对成员的探测分子；
2)将第二结合对成员连接到所述双功能化贵金属纳米材料上，得到连接有第二结合对成员的双功能化贵金属纳米材料；
3)使所述连接有第一结合对成员的探测分子与所述连接有第二结合对成员的双功能化贵金属纳米材料相互作用形成结合对，获得分析探针。
18.如权利要求16所述的方法，其特征在于，所述双功能化贵金属纳米材料与所述探测分子是通过连接基团间接相连的，所述方法包括:
1)在所述探测分子的一端修饰连接基团，得到连有连接基团的探测分子；
2)通过所述连接基团将所述连有连接基团的探测分子连接到所述双功能化贵金属纳米材料上，得到分析探针。
19.一种采用如权利要求1-15中任一项所述的分析探针的分析方法，所述方法包括使目标分析物与所述分析探针通过生物学特异性反应形成分析探针-目标分析物的复合物，再通过检测所得复合物的发光来确定样品中目标分析物的含量。
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