CN102333860A

CN102333860A - 细胞分离技术

Info

Publication number: CN102333860A
Application number: CN2009801573794A
Authority: CN
Inventors: 克里斯托夫·格雷戈里; 约翰·庞德
Original assignee: Immunosolv Ltd
Current assignee: Immunosolv Ltd
Priority date: 2008-12-24
Filing date: 2009-12-23
Publication date: 2012-01-25
Also published as: WO2010073014A1; JP2016000043A; EP2367930A1; JP6134920B2; JP2012513748A; US9435790B2; US20110256581A1; GB0823553D0

Abstract

第一方面，本发明提供了从细胞群体中去除非存活细胞的方法，所述方法包括在适于使化合物和细胞培养物中存在的非存活细胞连接的条件下，使细胞群体与化合物相接触，并从所述细胞群体中去除至少部分化合物，本发明进一步提供适合在这些方法中使用的组合物，还提供了这样的组合物以及多种其他系统和试剂盒的用途。

Description

细胞分离技术

发明领域

本发明涉及从细胞群体，如细胞培养物中去除非存活细胞的方法，适合在这些方法中使用的组合物，还涉及这样的组合物以及多种其他系统和试剂盒的用途。

背景技术

细胞会由于多种原因死亡，包括控制所有组织中细胞数量的正常生理过程。细胞死亡可以通过自然生理过程(最著名的是细胞凋亡)发生，也可以通过细胞培养中的，例如由培养容器中的剪应力引起的意外损伤(坏死)发生。在我们体内，死亡的细胞被吞噬细胞，如巨噬细胞有效的清除，否则它们可能引起组织损伤而且会促进疾病的进展。如果这些细胞保持未被清除的状态(如通常发生在细胞培养中的)，凋亡的细胞进一步坏死(有时被称为“继发性坏死”)。这种进展以细胞质膜完整性的失去为特征。

现有的细胞存活率检验方法多种多样，或简单或复杂。例如，最简单的检验方法，如活细胞拒染，检测被存活细胞排除的染料进入死细胞的能力。常用的这样的染料例子是台盼蓝、碘化丙啶和溴化乙锭。更复杂的检验方法包括大分子的释放，如乳酸脱氢酶(LDH)，其活性可以通过其在适合的显色底物上的活性来检测。然而，这些检验方法局限于检测细胞死亡的坏死阶段，因为其均需要细胞质膜完整性的失去来获得阳性结果。给定时间细胞群体真实存活率的完整评价需要同时检测正在死亡(凋亡)和死亡(坏死)的细胞。给定时间细胞群体真实存活率的完整评价需要同时检测正在死亡(凋亡)和死亡(坏死)的细胞。正在死亡、凋亡细胞的检验通常是复杂的，需要多个步骤(例如TUNEL-type法检验或半胱天冬酶活化检验)，而这些步骤可能引起如假阳性的技术问题。一种常用的方法利用了凋亡的特征，细胞质膜磷脂不对称性的早期改变。磷脂结合蛋白，膜联蛋白V，在胞外Ca²⁺浓度相对高的情况下与在细胞质膜完整性失去之前快速暴露于凋亡细胞表面的磷脂、磷脂酰丝氨酸(PS)结合。抗体介导的PS检测，例如通过Immunosolv的imab6单克隆抗体，避免了对胞外Ca²⁺的需求。目前，可实现从细胞培养物中选择性去除正在死亡的/死亡的细胞的方法和试剂盒范围有限。其包括，例如，Miltenyi试剂盒和Immunosolv生产的imab6连接Dead-Cert^TM纳米粒子。

尽管可以使用这些试剂和试剂盒，仍然需要新的改进的技术，因为尽管像台盼蓝的染料能够用于准确检测或标记死亡细胞，但其不能够突出正在死亡的细胞。此外，膜联蛋白V是依赖Ca²⁺的，因而其不方便在生物生产里常用的悬浮培养中可能出现的低Ca²⁺的环境中进行检测。

除上述之外，还需要控制非存活细胞，改进细胞培养物和细胞储存和运输的存活率的额外方法。也需要细胞系建立和生产的改进的方法。降低死细胞引起的本底存活率以及改进转染效率的方法也是对先前技术的显著改进。

还需要控制处于凋亡晚期的细胞的方法，因为产生生长因子，如乳铁蛋白的早期的凋亡细胞可对其周围环境有积极的影响[Bournazou，208#3517]。

发明简述

本发明基于发现在细胞死亡中某些细胞组分数量会增加(或其与某些外源化合物的可接触性增加)。此外，发明人发现这些细胞组分能够与某些化合物结合，特别是，例如，非蛋白化合物。因此，由于正在死亡的和/或死亡的细胞拥有比存活细胞更多的此类结合部位，本发明提供了适合用于从存活细胞中分离正在死亡的，和/或坏死/死亡的细胞的方法和组合物。

第一方面，本发明提供了一种从细胞群体中去除非存活细胞的方法，所述的方法包括在适于使化合物和细胞培养物中存在的非存活细胞连接的条件下，使细胞群体与化合物接触的步骤，以及从所述细胞群体中去除至少部分化合物的步骤，其中的化合物不是蛋白性质的化合物。

术语“蛋白性质的”化合物是指包括蛋白、多肽、氨基酸和/或抗体/抗体片段。因此，应当理解本发明第一方面提供的化合物不是蛋白、多肽、氨基酸或抗体/抗体片段。

本领域技术人员能理解细胞群体可能包括存活的、正在死亡的、和/或坏死(死亡)的细胞，而且应理解正在死亡的，坏死或死亡的细胞以下统称为“非存活的细胞”。

此外，术语“细胞群体”包括含有例如，真核细胞如哺乳动物，尤其是人细胞的细胞培养物。这方面，本发明可以提供了适用于这些细胞类型群体和/或在专门细胞类型，例如，干细胞(成人和/或胚胎干细胞)、心脏细胞、上皮细胞、内皮细胞、皮肤(真皮)细胞、神经细胞、肌肉细胞、循环(即血液)系统细胞和/或其他细胞类型，例如，淋巴细胞、骨细胞和/或软骨细胞培养物的方法和组合物。例子示于表1。

表1：已经成功展示了使用本发明去除非存活细胞的细胞类型实例。

细胞	物种	细胞系或原代细胞
			NSO骨髓瘤	鼠	细胞系
杂交瘤	鼠	细胞系组
			Burkitt淋巴瘤	人	细胞系组
Lambda-MYC淋巴瘤	鼠	细胞系组
			Lambda-MYC淋巴瘤	鼠	原代细胞
嗜中性粒细胞	人	原代细胞
			胸腺细胞	鼠	原代细胞
巨噬细胞	鼠	原代细胞
			THP-1单核细胞/巨噬细胞	人	细胞系
RAW-264单核细胞/巨噬细胞	鼠	细胞系
			J774单核细胞/巨噬细胞	鼠	细胞系
膀胱癌	人	原代细胞
			胎儿肝脏	鼠	原代细胞
A549肺癌	人	细胞系
			胚胎干细胞系	鼠	细胞系组
胚胎干细胞系	人	细胞系组
			Burkitt淋巴瘤异种移植	鼠中的人	原代细胞
CHO	仓鼠	细胞系组
			U937单核细胞白血病	人	细胞系
L929成纤维细胞	鼠	细胞系
			树突细胞	鼠	原代细胞
HL60白血病	人	细胞系
			Monomac6白血病	人	细胞系
H345肺癌	人	细胞系

此外，本发明的组合物和方法可以被用于从包含杂交瘤细胞的细胞培养物中去除死细胞以生产单克隆抗体。

此外，术语“细胞群体”可包括原代细胞群体，例如从骨髓中获得(为移植)的细胞，试管受精技术中使用的细胞(如卵母细胞，精子和受精卵等)。细胞群体也可包括，例如包含全血或其组分(例如白细胞)的血液样品或捐献品。同样的，“细胞群体”可以包括从脐带中获得的血液。

很容易理解，有许多不同的方法可以培养细胞，而确切的培养条件和/或营养需求会依据培养的细胞的确切类型而不同。然而，不论细胞类型或者培养细胞的确切条件，最好能从细胞培养物中去除非存活细胞以保持存活细胞的高水平和/或改进细胞培养生产。

细胞群体，如细胞培养物中存活细胞和非存活细胞的比例随着，例如细胞培养物的年龄、培养物的保存条件和/或营养物质的可用性而改变。通常来说，细胞群体越老，细胞生长所需的一种或多种营养物质可用性越低，可能存在的非存活细胞越多。存在于细胞群体中的非存活细胞总数对存在的活细胞总数可能有负面影响，因此最好能去除细胞群体，如细胞培养物中的非存活细胞。细胞群体中的细胞死亡可能由于多种其他原因发生，例如使用能杀死缺乏药物选择标记的细胞的药物的结果-像稳定转染的选择中所使用的，或例如，物理压力，如某些生物反应器中的剪应力的结果，或处理过程的结果或冻结/解冻创伤的结果。

鉴于上述情况，应当理解，在适于与细胞培养物中存在的任何非存活细胞连接的条件下，去除与细胞群体，如细胞培养物接触的化合物，有从细胞培养物中去除非存活细胞的效果。

本发明提供的方法可以连续使用，以确保细胞群体中的非存活细胞数量被保持在最小。另外，本发明描述的方法也可以定期或不定期使用。

从细胞群体中去除非存活细胞的更多效果是可以增加细胞培养物中存活细胞的比例和/或改进细胞培养生产。

应当理解，术语“存活”细胞包含任何没有死亡或者未进入不可逆死亡的细胞。存活细胞能够在生理环境中行使例如蛋白质的转录和翻译的细胞功能，以及维持代谢的动态平衡。非存活细胞包括死亡的或进入不可逆转的死亡的细胞，如正经历程序性细胞死亡的细胞。

短语“改进的细胞培养生产”或“改进的存活率”，涉及特定细胞群体中存活细胞比例的增加。举例来说，典型的细胞培养物包括占细胞总数-培养物中存在的存活、死亡，和正在死亡的细胞不超过30％或更少的存活细胞群体。通过使用本发明描述的化合物和方法，至少可以去除细胞培养物中一部分的非存活细胞，从而增加存活细胞的比例。可以预计通过使用本发明的方法化合物和/或方法从细胞培养物中去除非存活细胞，存活细胞的比例可以从大约，例如总细胞群体的30％，提高到大约，例如40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％，在某些实施方案中提高到总细胞群体的约99％。在其他的实施方案中，细胞培养物中存活细胞的比例可以提高到约100％。

由于本发明提供的化合物能够选择性的和/或优先与非存活细胞结合，它们在细胞培养领域，和/或需要高水平的细胞生产以产生足够的细胞产量或所述细胞表达的特定产物的方法或过程中特别有用。此外，本发明描述的方法可以被用于改进细胞生产的产品质量，例如核酸、蛋白质等。在一个实施方案中，本发明提供的化合物和方法在单克隆抗体的生产和/或重组蛋白的生产过程中特别有用，这些过程经常包括培养大量的细胞。在这些过程中，细胞培养物中存活细胞的数量或比例与产品产量正相关。负面影响细胞存活率和/或细胞培养生产的非存活细胞，也会对产品产量造成负面影响。

在一个实施方案中，化合物是能够与存在于非存活细胞上或非存活细胞中的细胞组分结合的化合物。在其他实施方案中，化合物不是蛋白质。如前所述，在细胞死亡时，这些细胞组分的数量和/或可接触性增加，因而死亡的细胞比存活的细胞拥有更多的此类结合部位。因此，在进一步的实施方案中，化合物可以是能够与在细胞死亡时，数量和/或可接触性增加的细胞组分相结合的化合物。术语“化合物”可以包括，例如天然或合成聚合物，尤其是非蛋白聚合物，如多糖。

适合的多糖可以包括，例如，复杂的分支葡萄糖分子。本领域技术人员很容易理解这些分子可以以多种形式存在，而且应当理解众多不同大小和形式的多糖都可以包括在本发明的范围内。

举例来说，本发明描述的化合物，例如多糖，大小可以在约10到约150kDa，尽管适合用于本发明的化合物的确切结构高度多变，分子量小于或大于上述范围的化合物也可能适用。事实上如果化合物能够与在细胞死亡时，数量/可接触性增加的细胞组分相结合，其就可以在本发明中应用。

在一个实施方案中，化合物是多糖葡聚糖。葡聚糖包括α-1，6糖苷键连接葡萄糖分子的链，适用于本发明描述的方法和组合物的葡聚糖化合物可以包括两个以上的α-1，6糖苷键连接葡萄糖分子。此外，葡聚糖可以进一步包含通过α-1，4，α-1，2和/或α-1，3连接从α-1，6糖苷键连接葡萄糖分子链延伸出去的分支基团。

因此，适用于本发明的葡聚糖化合物，可以包括两个以上的α-1，6糖苷键连接葡萄糖分子以及一个以上α-1，4，α-1，2和/或α-1，3连接的分支基团。

多糖葡聚糖在细胞生物学中有多种应用，包括红细胞的沉淀(低剪应力条件下的聚合)，通透性评估(见例如[Wakamoto，2008#3520；[Graziadei，1991#3514]，吞噬细胞追踪[Pawelczyk，2008#3521]，神经通路追踪[Reiner，2000#3523]以及作为内吞作用的标记[Allavena，1998#2948]。在巨噬细胞中，葡聚糖主要在结合了甘露糖受体后进入内吞囊泡[Allavena，1998#2948]。葡聚糖也可以用于临床在没有血液或血液制品时治疗休克或即将休克的血容量扩充剂。葡聚糖也可以应用于预防血栓形成。

此外，经修饰的葡聚糖化合物(另外被称为葡聚糖类似物)也可以被使用。举例来说，羧化和/或氨基葡聚糖化合物可能特别有用。

非蛋白质化合物，例如，多糖(包括葡聚糖)在细胞、细胞培养物和或从中得到的产物(如核酸，蛋白质和/或重组蛋白)有临床或治疗用途时特别有用。特别是，本发明描述的方法、组合物和用途可以是不涉及蛋白质的因而避免了使用异种蛋白质如抗体(单克隆、人源化抗体或类似物)。

此外，葡聚糖是可溶的，因而可以被简单的制成水溶液以便加入，例如，细胞培养物。葡聚糖还特别稳定，可以在使用前长时间储存。

除上述之外，多糖如葡聚糖具有更多的优点，能够用于多种温度下以及能防止细胞聚集，改善细胞分离的无二价阳离子环境。

细胞群体可以以多种方式与本发明描述的化合物接触。在一个实施方案中，在适于使化合物和细胞培养物中存在的非存活细胞连接的条件下，将化合物直接加入细胞群体中。在其他的实施方案中，化合物可以被制备为或者配制成能加入细胞群体的水溶液。

在进一步的实施方案中，化合物可以被包装进细胞群体要加入的柱内。在这种方式中，在重力的作用下和/或借助泵的帮助，细胞群体能够穿过化合物，于是细胞群体中的非存活细胞与化合物结合。

在进一步的实施方案中，化合物与储存和/或浸没在细胞悬液或细胞培养物中的支架材料粘附、连接、固定和/或其他方式相联系。有利地，特定用途的支架材料可以是可渗透的或多孔的，以使细胞可以穿过材料。通过将包含固定的本发明的化合物的支架材料置入细胞群体，并在适于使支架的化合物和细胞培养物中存在的非存活细胞连接的条件下温育带着群体的支架，当支架被去除时其上连接的非存活细胞也就被去除。

在本发明的一个实施方案中，化合物以颗粒的形式提供，例如微粒子或纳米粒子。在某些的实施方案中，适于在本发明中使用的微粒子或纳米粒子可以采用直径10-500nm的小珠子或微球的形式。在其他实施方案中，微粒子或纳米粒子可以是约50-450nm、约100-400nm、约150-350nm或约200-300nm。在一个实施方案中，微粒子或纳米粒子直径可以是约250nm。

如前所述，微粒子或纳米粒子包括本发明描述的化合物或由本发明描述的化合物组成。例如，微粒子或纳米粒子可以包括多糖或由多糖组成，如葡聚糖。

在一个实施方案中，微粒子或纳米粒子可以包括由本发明提供的化合物包裹的核心材料。

在进一步的实施方案中，微粒子或纳米粒子可以进一步包括磁性材料。在某些实施方式中，磁性材料可以组成微粒子或纳米粒子的核心区域，或者包裹核心材料包衣成分。在其他实施方案中，微粒子或纳米粒子可以包括被本发明的化合物包裹的磁性核心。

这样的颗粒被称为磁性、顺磁性或超顺磁性颗粒。有利地，适用于本发明的超顺磁性颗粒可以包括由多糖，如葡聚糖包裹(或有由多糖，如葡聚糖壳环绕)的磁性核心。

葡聚糖包裹的超顺磁性纳米颗粒目前在MRI中应用，因此使用这些颗粒的疗法的低污染对监管者来说风险低。例如，

是一种器官特异性的MRI造影剂，特别是被用于检测和表征肝脏的轻微局灶性病变。它们也被认为适合用于通过诱导出的，随后被代谢高度活跃的肿瘤细胞吸收的热量来杀死肿瘤细胞(磁流体热疗)(见[Minamimura，2000#3518；Ito，2003#3519])。

化合物可以被以某些方式标签或标记。例如，化合物，无论是否是微粒子或纳米粒子的形式，可以包括蛋白标签和/或荧光标记。在某些实施方式中，蛋白标签可以采用抗体或蛋白或短肽的形式，例如，组氨酸标签或GST标签。本领域已知适合的荧光分子包括，例如，荧光基团，如FITC、罗丹明或德克萨斯红。其他可以使用的分子类型包括绿色荧光蛋白(GFP)，放射性标记的基团等。

除上述之外，从细胞群体如细胞培养物中去除至少一部分化合物的方法可以随着化合物的确切性质和形式而改变，可包括如过滤、密度分离、流式细胞仪/细胞分选和/或亲和层析技术。因此，任何形式的，能够从如细胞培养物中选择性去除的化合物或颗粒均适合使用，这样形式的化合物和/或颗粒(包括上面讨论的微粒子或纳米粒子以及磁性颗粒)以下被称为“可回收颗粒”。

当可回收颗粒采用磁性或超顺磁性颗粒的形式时，通过使用磁场(用磁铁、电磁铁或类似物)可以很容易的将其从细胞群体，如细胞培养物中回收或去除。简要的说，通过使用磁场固定或收集颗粒，可以例如从收集的磁性颗粒中吸出或者倒出培养物。这样，被吸出或倒出去除的培养物包括大量存活的细胞，保留的非存活的细胞连接在由磁场约束的磁性颗粒化合物上。

当化合物以细胞群体要加入的柱的形式提供时，从柱中收集到的洗脱液(即通过柱的物质)可以大幅度地包含存活的细胞，而连接在化合物上的非存活细胞則被保留在柱上。

当化合物以被标签或标记的化合物的形式提供时，可以使用流式细胞仪或亲和层析技术从细胞群体中去除化合物。例如，当化合物被修饰上组氨酸或GST标签时，适合的亲和基质(如镍/钴离子柱和/或谷胱苷肽琼脂糖凝胶)可以被用于从细胞中分离化合物。当蛋白标签或标记是抗体时，任何包括固定的相关抗原的亲和基质均可以使用。

在化合物包括荧光标记的实施方式中，可以使用基于特定荧光标签的存在来分离成分的流式细胞仪或细胞分选技术。

其他的从例如细胞培养物中分离可回收颗粒的方法包括使用离心技术。使用这样的技术可以从溶液中沉淀可回收颗粒而留下包含，例如，大量的存活细胞的上清-而非存活细胞被连接在沉淀出的颗粒上。

本发明已经确定当本发明描述的化合物选择性或优先结合非存活细胞时，存活细胞也展示出一些与本发明描述的化合物连接的细胞表面组分表达。由于活细胞与早期凋亡、晚期凋亡和/或坏死的细胞相比，其上的结合部位数量不同(存活＜早期凋亡＜晚期凋亡/坏死)，本发明允许设计缓冲剂，其能够阻断本发明描述的化合物与存活细胞连接以增强对非存活细胞，即正在死亡的和死亡的细胞的特异靶向性。

在一个实施方案中，本发明提供的方法可选择包括一个步骤，例如第一步骤，其中细胞群体如细胞培养物与包括一种以上的阻断分子的阻断缓冲剂相接触。阻断分子可以是防止，抑制本发明描述的非蛋白性质的化合物或与本发明描述的非蛋白性质的化合物竞争的各种分子。存活细胞可能包括多种不同的能够结合本发明提供的非蛋白性质化合物的基团(例如细胞表面组分)，某些此类基团也存在于非存活细胞中。在某些情况下，某些形式的能够结合本发明提供的非蛋白性质化合物的基团不存在于非存活细胞中。

在一个实施方案中，阻断分子是可以干扰、抑制多糖如葡聚糖或与多糖如葡聚糖竞争结合存活细胞的可溶分子。因此，阻断分子可以与存在于存活细胞上的结合多糖的基团，例如结合葡聚糖的基团相连接。这些，或其他多糖结合(例如葡聚糖或经修饰的葡聚糖)的基团也可能存在于非存活细胞上，但数量更大。

通过防止本发明提供的非蛋白性质的化合物(例如葡聚糖或经修饰的葡聚糖)与存活细胞结合，可以减少执行本发明描述的方法时从细胞群体中去除的存活细胞数量。

术语“阻断分子”可以涉及任何本发明提供的非蛋白性质化合物，其浓度被制成能够阻断全部(或基本上全部)存在于存活细胞上的，能结合所述非蛋白化合物的细胞表面组分，但留下一定数量的存在于非存活细胞上或非存活细胞中的非蛋白性质化合物结合部位暴露或非封闭。

通过使用阻断缓冲剂，当本发明的非蛋白性质化合物被加入细胞培养物中时，仅带有暴露的(或非封闭的)，能连接化合物的细胞组分的非存活细胞与化合物连接。通过向培养物中以本发明描述的可回收颗粒的形式加入非蛋白性质化合物，可以减少去除的存活细胞数量-因为阻断缓冲剂防止了化合物与之结合。

应当理解，阻断缓冲剂或阻断分子可以与任何本发明提供的非蛋白性质化合物共同加入细胞群体中。此外，或可选择地，阻断缓冲剂或分子可以在加入本发明描述的非蛋白性质化合物之前，或之后单独添加。因此，在一个实施方案中，本发明提供的从细胞群体中去除非存活细胞的方法包括在适于使非蛋白性质化合物和细胞培养物中存在的非存活细胞连接的条件下，使细胞群体与包含一种以上阻断分子和本发明描述的非蛋白性质化合物的组合物接触的步骤，以及从所述细胞群体中去除至少部分非蛋白性质化合物的步骤。在其他的实施方案中，本发明提供的方法包括一个在使细胞群体与本发明描述的非蛋白性质化合物接触之前或之后执行的单独的步骤，所述单独的步骤包括使细胞群体与阻断缓冲剂或阻断分子接触。在一个实施方案中，在适于使(阻断剂中的)阻断分子和包含能结合所述阻断分子基团的存活细胞连接的条件下，使阻断剂或阻断分子与细胞群体相接触。

在一个实施方案中，本发明的阻断剂包含0-50％、0-40％、0-30％或0-20％的本发明描述的葡聚糖。在进一步的实施方案中，阻断剂包含0-10％的葡聚糖，例如，0％、1％、2％、4％、6％、8％或10％。应当理解，术语“葡聚糖”包括本发明描述的所有形式的葡聚糖(包括经修饰的形式)。

此外，或可选的，阻断缓冲剂可以包括蛋白性质的成分或化合物，例如血清或血清白蛋白。在一个实施方案中，阻断缓冲剂可以包括牛血清白蛋白(BSA)。本发明提供的阻断缓冲剂可以包括0-50％的血清或血清白蛋白。在一个实施方案中，阻断缓冲剂可以包含0-45％、0-40％、0-35％、0-30％或0-25％的血清或血清白蛋白。在某些实施方案中，阻断缓冲剂可以包含0-10％的血清或血清白蛋白(例如BSA)。例如阻断缓冲剂可以包含0％、1％、2％、4％、6％、8％或10％的血清白蛋白(例如BSA)。

在进一步的实施方案中，阻断缓冲剂可以包含血清，例如，胎牛血清(FCS)。血清可以被加入本发明描述的阻断缓冲剂至终浓度，例如，0-50％、0-40％、0-30％或0-20％。在某些实施方案中，阻断缓冲剂被用血清补充至终浓度0-10％。在某些实施方案中，阻断缓冲剂可以包括0％、0.25％、0.5％、1％、2％、4％、6％、8％或10％的血清。

在其他实施方案中，本发明描述的阻断缓冲剂可以额外或可选择的包括葡萄糖。在某事实施方式中，阻断缓冲剂可以包括0-50％、0-40％、0-30％、0-20％或0-10％的葡萄糖。例如，阻断缓冲剂可以包括0％、0.25％、05％、1％、5％或10％葡萄糖。

在一个实施方案中，阻断缓冲剂包含BSA或葡萄糖。

通过改变阻断缓冲剂中阻断分子的确切浓度，不仅可以将存活细胞的去除排除或者最小化，而且可以将正在死亡的(包括例如凋亡)细胞的去除排除最小化。本领域技术人员会理解，制备的阻断本发明的非蛋白性质化合物与存活细胞结合的缓冲剂可以包括与制备的阻止化合物与存活的和正在死亡的细胞(其相比存活的细胞表达更多的能与非蛋白性质化合物结合的细胞表面组分，但表达的比死亡或坏死的细胞要少)连接的缓冲剂相比，浓度较低的，能连接非存活细胞的非蛋白性质化合物。

此外，本发明提供的方法可以做进一步修改，以包括调节细胞群体的环境的步骤。例如，本发明描述的方法可以包括调节环境条件的步骤，如温度、pH值、渗透压、一种以上因子(例如有机小分子或类似物、蛋白、肽和、或氨基酸)和/或细胞群体总电荷的可用度。举例来说，为了调节电荷，可以向细胞群体中加入更多蛋白。应当理解，通过调节环境条件，例如，细胞环境的净电荷，可以影响存活细胞上和非存活细胞上能够与本发明描述的化合物结合的细胞组分的数量。因此，这样的调节提供了改变执行本发明描述的方法之后，保存在细胞群体中的存活细胞数量的更多方法。

例如，本发明提供的方法可以在低或酸性pH下进行以增强对非存活细胞的选择性。在一个实施方案中，该方法在约pH7.4、约pH7或约pH6.6的条件下进行。

应当理解，仅从细胞培养物中去除死亡的细胞(而不是正在死亡的细胞)的方法比之前的技术提供更大的优势。如前所述，细胞群体如细胞培养物可能包括正在死亡的细胞以及正在经历程序性细胞死亡过程的，凋亡形式的细胞。已知处于凋亡早期的细胞产生包括乳铁蛋白在内的多种生长因子，这些因子对周围的存活细胞有积极作用。将正在死亡的细胞保留在细胞培养物中以使存活细胞从生长因子中获益的方法具有独特的优势。

此外，为提供便利从细胞培养物等中去除非存活细胞的方法，本发明以及特别是非存活细胞有更多能结合本发明描述的化合物的细胞组分的发现，有着大量用途。

特别的，本发明第二方面提供了本发明描述的化合物用于从细胞群体，如细胞培养物中去除非存活细胞的的用途。

在一个实施方案中，用于本发明第二方面的化合物不是蛋白质。

此外，本发明描述的方法和用途在建立细胞系的方法中有特别的用途。细胞培养领域的技术人员可以理解在试图建立细胞系时，从包括大量非存活细胞的混合群体中选择性的增殖特定细胞类型是困难的。此外，多次传代的细胞长时间和持续培养经常会导致消极影响细胞培养的存活率和生产的非存活细胞大量积累。通过使用本发明描述的方法补充产生或建立细胞系的方法并开发本发明化合物从细胞培养物中去除非存活细胞的用途，可以便利特定细胞系的建立。

除上述之外，本发明描述的聚合物和方法可以在细胞储存和/或运输方法中找到更多用途。可以理解，储存的细胞容易死亡，尤其是长时间储存或经受冻/融循环的细胞。储存的细胞培养物中非存活细胞的积累会降低储存的细胞培养物的总存活率，因此最好能去除非存活细胞。同样的，运输中的细胞会死亡，特别是当在冷(即4℃)而非冷冻(-20℃或-80℃)的条件下长时间运输时。在这些条件下，用化合物去除非存活细胞的用途以及去除非存活细胞的方法特别有利。

建立原代细胞培养物-即直接从组织样品、移植物和/或活检中获得的细胞培养物的方法，也可以从本发明描述的方法和/或用途中受益。特别是，通过从生长的原代培养物中去除非存活细胞，可以改善原代细胞培养物建立的总效率以获得包括高比例存活细胞的培养物。

已知，基于细胞的检测的成功率、效率或准确性经常受到此类检测中存在的非存活细胞本底水平的影响。有利地，可以进一步开发本发明提供的方法和用途以从基于细胞的检测系统中去除非存活细胞，并减少、降低或消除存在的非存活细胞的本底活性和/或水平或数量。

鉴于上述情况，容易理解可以进一步开发本发明提供的方法和用途作为提高转染技术，如电穿孔、热休克和或化学转染效率的途径。由于只有存活细胞可以摄入核酸，通过增加细胞培养物中存在的存活细胞比例，任何给定转染技术的效率都可以被极大的改进。基于此可以使用本发明描述的方法或本发明提供的化合物的用途来进一步补充这样的转染方法，以改进或增加转染效率(即执行转染方案后成功转染的细胞数量)。

除上述以外，通过去除非存活细胞，目的在于产生或生产细胞产品，如蛋白(特别是重组蛋白)和/或核酸(例如RNA或DNA)的方法可以被极大的改进，而且，细胞产品的质量也可以被改善。事实上，通过使用本发明描述的方法和/或用途补充，例如RNA提取方法，可以获得能得到完全完整的RNA(10的RNA完整值)制备品的方案。

由于发现本发明描述的化合物可以选择性的或优先与非存活细胞结合，其可以被很容易的开发作为识别、标记或标签正在死亡的或死亡细胞的方法。

因此在第三方面，本发明提供了本发明描述的化合物用于标记或标签非存活细胞的用途。

在一个实施方案中，可以进一步修饰本发明描述的化合物以包含某些形式的可检测标签。举例来说，化合物可以与能通过色度或化学发光反应来报告水平的酶偶联或连接(或其他方式联系)。这样被偶联的酶包括但不限于辣根过氧化物酶(HRP)和碱性磷酸酶(AlkP)。此外，或可选择地，聚合物化合物可以与荧光分子，例如荧光集团，如FITC、罗丹明或德克萨斯红偶联。可以被偶联到本发明化合物的其他分子类型包括，例如，绿色荧光蛋白(GFP)、放射性标记的基团等。本发明描述的化合物也可以用造影剂标记以适用于离体、体内或医学成像技术。

为了标记或标签非存活细胞，标签或标记的化合物可以在适于使标签或标记的化合物和细胞培养物中存在的非存活细胞连接的条件下，简单的加入细胞群体如细胞培养物。

因此，在第四方面，这里提供了标记、标签和/或识别非存活细胞的方法，所述方法包括步骤：

(a)在适于使化合物和细胞培养物中存在的非存活细胞连接的条件下，使细胞群体如细胞培养物与本发明描述的选择修饰(即标签或标记)的化合物相接触；

(b)去除未连接的化合物；和

(c)检测连接化合物的细胞；

其中，连接化合物的细胞包括非存活细胞。

本领域技术人员应当理解，对于用本发明提供的修饰过的化合物标签或标记过的非存活细胞，技术如荧光显微镜可以用于检测连接到死亡和/或正在死亡的细胞上的修饰过的(即标签或标记的)化合物。

未连接的化合物可以用多种方法去除。首先，可以通过用缓冲溶液反复清洗去除未连接的化合物。其他去除未连接化合物的方法包括，例如使用过滤(即利用连接到细胞的化合物比未连接的大的性质)和/或密度分离技术如离心。

由于发明人发现存在于细胞上和/或细胞中的化合物结合部位的数量随细胞死亡而增加，与存活的或正在死亡的细胞也可能发生一定程度的连接，为降低被标记、标签或识别的存活和/或正在死亡的细胞数量，采用如上描述的细胞培养物先与阻断缓冲剂接触的额外第一步骤是有益的。这样，当使用上本发明第四方面提供的方法时，仅有死亡的细胞(而非正在死亡的细胞)可以被标记、标签和/或识别。

本领域技术人员会懂得，由于凋亡的细胞相比存活的细胞会表达能多的能结合本发明描述的化合物的细胞表面组分(但少于死亡的细胞)，可以进一步修改本发明第四方面提供的方法以确保凋亡细胞，以及死亡细胞被标记、标签和/或识别。举例来说，通过将细胞群体与阻断缓冲剂相接触，其中制成的阻断缓冲剂中化合物浓度可以有效的阻断所有(或基本上所有)存活细胞上能够结合本发明化合物的细胞表面组分，但留下正在死亡的、凋亡的和/或死亡细胞上的结合部位暴露或非封闭，这样可以提供将凋亡的细胞也标签、标记和/或识别的方法。

本发明描述的化合物，特别是修饰的(标签或标记的)化合物，可以用于体内和/或体外成像技术以检测或查看非存活细胞。举例来说，可以修饰本发明提供的化合物以包含某些形式的可通过离体成像方法(MRI、CAT扫描、X射线或类似方式)检测的造影剂以及可以施用给病人或样品的其衍生物。通过使用合适的设备观察病人或样品，可以得到非存活细胞的图像。这样的图像可以被用于多种疾病的诊断中。

除上述以外，观察到的能结合本发明化合物的细胞表面组分在细胞死亡(包括凋亡)中增加的现象，可以被开发作将特定化合物定位到死亡或正在死亡的细胞上的方式。这种方式的的应用在细胞增殖和/或分化紊乱，例如癌症的治疗中特别有用。

因此，本发明第五方面提供了本发明的化合物和/或修饰过的化合物在治疗细胞增殖和/或分化紊乱中的用途。

第六方面，本发明提供了本发明的化合物和/或修饰过的化合物在制备治疗细胞增殖和/或分化紊乱的药物中的用途。

第七方面，本发明提供了治疗细胞增殖和/或分化紊乱的方法，所述方法包括施用治疗有效量的本发明的化合物和/或修饰过的化合物给需要其的病人的步骤。

应当理解术语“化合物”或“修饰过的化合物”用于上面第五、六、七方面时包括任何能够结合非存活细胞的，本发明描述的化合物(标签或标记的)。在一个实施方案中，本发明描述的用途、药物和方法可以使用多糖，例如葡聚糖(或羧化/氨基葡聚糖和/或修饰过的葡聚糖)化合物。

第八方面，本发明提供了药物组合物，其包含本发明的化合物和/或修饰过的化合物以及药学上有效的辅料或稀释剂。

第五、第六和第八方面提供的药物和/或组合物可以被制备成包含药学上可接受的载体或辅料药物组合物(优选无菌的药物组合物)，这样的载体或辅料本领域技术人员公知，包括，例如，水、盐水、磷酸盐缓冲盐水、葡萄糖、甘油、乙醇、离子交换树脂、氧化铝、硬脂酸铝、卵磷脂、血清蛋白、如血清白蛋白、缓冲物质、如甘氨酸、磷酸盐、山梨酸、山梨酸钾、饱和植物油脂肪酸、盐类或电解质水、如硫酸鱼精蛋白、磷酸氢二钠、磷酸氢钾、氯化钠、锌盐、硅胶、三硅酸镁、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素物质、聚乙二醇、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸、蜡、聚乙烯-聚丙烯嵌段聚合物、聚乙二醇和羊毛脂肪等、或者其组合。

本领域技术人员可以理解本发明描述的药物和组合物可以被制备成口服、注射、皮下、肌肉和/或肿瘤内施用。

在一个实施方案中，本发明第五到第八方面提供的用途、组合物、药物和/或方法可以包括本发明描述的化合物/修饰过的化合物的剂型以把修饰过的化合物于肿瘤内施用。

第九方面，本发明提供了将本发明的化合物靶向非存活细胞的体外方法，所述方法包括在适于使修饰过化合物和细胞群体中存在的非存活细胞连接的条件下，使细胞群体与修饰过的化合物(即修饰以包括被靶向到非存活细胞的更多化合物)相接触的步骤。

术语“细胞群体”应当被理解为包括细胞培养物和/或从组织样品、活检和或移植物中获得或存在于组织样品、活检和或移植物中的细胞。

举例来说，本发明第五、第六、第七、第八和第九方面中涉及的修饰过的化合物包括药物、毒素、蛋白质(如抗体或类似物)和/或核酸(例如反义核酸、微RNA、siRNA、iRNA等)。更具体的，通过提供连接或偶联到，例如抗癌、抗肿瘤和/或细胞毒性化合物上的修饰过的化合物，可以直接将这些化合物输送到存在于，例如肿瘤中的非存活细胞上。本领域技术人员可以理解，通过靶向位于，例如肿瘤中的非存活细胞，临近的存活和异常增殖的肿瘤细胞可以成为偶联或连接修饰过的化合物上(例如细胞毒性、抗肿瘤或抗癌化合物)的化合物的第二靶标。

在实施方案中，在化合物采用可回收颗粒形式(即包裹有聚合物化合物的含铁的微粒子或纳米粒子)时，化合物(选择修饰以进一步包括，例如蛋白质、核酸、药物、毒素或抗癌或抗肿瘤化合物)向肿瘤细胞中的非存活细胞的靶向性可以被开发，作为通过磁场中的热量产生来杀死或摧毁临近肿瘤细胞的一种方式。此外，非存活细胞与这样的颗粒的联合可能导致吞噬细胞对这些细胞的反应的变化。在肿瘤环境中，这可以是巨噬细胞反应从促肿瘤到抗肿瘤的变化。而且，连接了化合物(按照本发明选择修饰的)非存活细胞的吞噬可以允许细胞毒性药物传递到支持肿瘤的巨噬细胞或者可以允许巨噬细胞中热量的靶向生成以杀死它们并诱导肿瘤的回归。

此外，本发明第五到第九方面描述的用途和方法可以用阻断缓冲剂的用途进一步补充，其中阻断缓冲剂阻断存在与细胞上(例如存活细胞上)的能结合本发明化合物的细胞表面组分不被修饰过的化合物靶向。

第十方面，本发明提供了从细胞群体如细胞培养物中去除非存活细胞的试剂盒，所述试剂盒包括本发明提供的化合物以及使用的指示。试剂盒可选的包括用于本发明描述的方法的缓冲剂和试剂，包括，例如被制成提供特定浓度化合物以防止或最小化细胞培养物中存活和/或正在死亡的细胞的去除的阻断缓冲剂。

发明详述

本发明将以下面的附图被详细描述：

图1：流式细胞直方图显示葡聚糖-FITC与存活的和死亡的(坏死)细胞连接，但与死亡细胞连接程度更强。这是通过带有葡聚糖-FITC(连接了异硫氰酸荧光素的葡聚糖)的存活的和死亡的细胞的荧光标记来显示。坏死(死亡)的细胞通过热处理产生(56℃，1小时；见[Devitt，1998#872])。点划线：本底荧光；短划线：1mg/ml葡聚糖-FITC；实线：0.1mg/ml葡聚糖-FITC。A＝％阳性细胞(1mg/ml葡聚糖FITC)；B＝％强阳性细胞(1mg/ml葡聚糖-FITC)。

图2：如上所述，显示了葡聚糖-FITC与存活的和死亡的(坏死)细胞连接，但与死亡细胞连接程度更强。黑色直方图：存活区域细胞；灰色直方图：死亡区域细胞。

图3A：显示了葡聚糖-FITC检测凋亡以及继发性(凋亡后)坏死的证据。黑色直方图：碘化丙啶(PI)阴性细胞，0小时；灰色直方图：PI阴性细胞，1或4小时；空心直方图：PI阳性细胞，0小时。3B：连接到正在死亡的成纤维细胞表面的氨基葡聚糖纳米粒子扫描电子显微镜图像。L929成纤维细胞在盖玻片上培养直至汇合然后转移到含星形孢菌素(1微摩尔)的无血清培养基中3小时以诱导凋亡，而后其被暴露在250nm的氨基葡聚糖纳米粒子下。随后用PBS冲洗盖玻片以去除未连接的纳米粒子，并在冰箱里3％的戊二醛中固定过夜。它们在针尖上固定并用锇溅射涂膜之前在EMS临界点干燥机中以乙醇脱水。样品进行了检验，图像使用Phenom^TM桌面型扫描电子显微镜记录(FEI公司)。可以清楚的观察到纳米粒子连接到细胞表面的离散位点及其扩展。

图4：显原发坏死作为毒性处理或伤害后细胞失去其质膜完整性的但没有进入凋亡的结果而发生。

图5：详述使用羧化葡聚糖包裹的磁性颗粒带来的杂交瘤细胞存活率的改善。

图6：与图5一样，也显示了使用羧化葡聚糖包裹的磁性颗粒带来的杂交瘤细胞存活率的改善。

图7：显示了多种条件下，从约2∶1的坏死：存活细胞混合物中去除坏死(按上面的描述热处理)的人B淋巴瘤细胞。

图8：显示多种条件下，从约2∶1的坏死：存活细胞混合物中去除坏死(按上面的描述热处理)的人B淋巴瘤细胞的更多数据。

图9A：G-25颗粒未能显著提高细胞存活率。尝试从约2∶1的坏死：存活细胞混合物中去除坏死(按前面的描述热处理)的人B淋巴瘤细胞。尝试使用2ml压积洗过的交联葡聚糖G-25颗粒(85-260μm，GEHealthcare)在完全培养基中(RPMI+10％FCS)进行分离。简单的说，细胞与G-25(使用完全培养基平衡)在37℃温育90分钟。随后，在完全培养基中重新悬浮细胞+颗粒，在快速1g颗粒沉降从颗粒中回收细胞。在分离后，对台盼蓝染色的细胞进行三次血球计数并以平均％存活细胞+SEM(黑色和蓝色条)的方式表示。模拟＝投入细胞(不包含颗粒)。9B：葡聚糖颗粒的化学修饰促进了选择性连接到非存活细胞。使用图4中描述的方法以超顺磁性纳米粒子对低温损伤的中国仓鼠卵巢细胞进行分离。纳米粒子使用普通葡聚糖或以所示的化学基团修饰过的葡聚糖包裹。对照＝投入细胞；分离的＝产出细胞。使用Neubauer血球计数器和台盼蓝拒染来进行存活率计数。灰色条是存活细胞计数；空心条是非存活细胞计数。所有的分离在4℃下，含有10％胎牛血清的(FCS)的RPMI培养基中进行。结果显示-COOH-和-NH₂-修饰的颗粒在选择性结合非存活细胞时都很优越。然而，后者在这个例子中被证明更为有效，其提供了存活细胞最好产量，且只有低水平的非存活细胞污染。这些结果体现了葡聚糖的修饰促进非存活细胞的选择性靶向。

图10：通过改变纳米粒子浓度和可溶性糖或蛋白浓度来控制葡聚糖纳米粒子与非存活细胞的选择性结合。灰色条是存活细胞计数；空心条是非存活细胞计数。A-在含有不同浓度的牛血清白蛋白(BSA0-10％)的磷酸盐缓冲液中，使用不同剂量的纳米粒子(2或6μL储备物)从非存活细胞中分离存活细胞。在BSA存在的情况下，存活细胞的产量在大量的纳米粒子存在下显著提高。在低纳米粒子浓度下，蛋白的存在减弱了效率。这个例子说明葡聚糖包裹的纳米粒子与非存活细胞的选择性结合可以通过调节颗粒数量和蛋白浓度来控制。B-与10A非常相似的例子，除了使用不同浓度(％)的葡聚糖(分子量7000)以抑制包裹葡聚糖的纳米粒子与存活细胞的选择性结合。C-增加的颗粒/细胞比率改进死亡细胞去除效率，但降低存活细胞产量。这个例子中投入细胞的存活率为51％；给出的产出样品存活率(产出条上较高的百分率)在％存活细胞产率(产出条上较低的百分率)之上。产出产率以存活细胞投入数量的百分数表示。调节颗粒数量是确定分离最佳效率和由此得到的存活细胞产率的方式。投入＝没有纳米粒子存在的模拟分离，产出＝存在所示浓度的来自储备物的纳米粒子时的分离。D-增加的葡萄糖浓度选择性抑制纳米粒子与存活细胞结合，但在最高浓度开始抑制纳米粒子与非存活细胞的结合。％显示了分离时PBS中存在的葡萄糖百分数。0％是单独的PBS。投入＝没有纳米粒子存在的模拟分离，Nano＝纳米粒子存在下的分离。E-增加的血清浓度选择性抑制纳米粒子与存活细胞结合。％显示了分离时PBS中存在的胎牛血清百分数。0％是单独的PBS。投入＝没有纳米粒子存在的模拟分离，Nano＝纳米粒子存在下的分离。在所有情况下，分离按照对图4的描述进行，除了葡聚糖颗粒被加入的氨基基团修饰。在每种情况下，“投入”等同于“模拟”分离，即没有纳米粒子存在下对细胞群体的处理。

图11：改变pH以控制纳米粒子与非存活细胞的选择性连接。使用被加入的氨基基团修饰的超顺磁性葡聚糖颗粒对CHO细胞进行分离(产出)或模拟分离(投入)。非存活细胞通过冷冻损伤产生。分离(模拟/投入＝没有纳米粒子存在下“分离”)在含有10％BSA的PBS中，所示的pH下进行。发现降低的pH促进非存活细胞的选择性去除，同时减少存活细胞的损失(即相对与存活细胞的结合，颗粒与非存活细胞的结合)。灰色条是存活细胞计数；空心条是非存活细胞计数。这个例子说明了pH的控制可以被用于选择性靶向非存活细胞以通过氨基葡聚糖颗粒将其去除。

图12：在通过氨基葡聚糖超顺磁性纳米粒子去除死亡的和正在死亡的细胞后的生物反应器培养物中的，改进的杂交瘤细胞，O4的生产。杂交瘤细胞产生IgM类抗少突细胞标记O4抗体。Sommer，I.and Schachner，M.，Monoclonal antibodies(O 1to O4)to oligodendrocyte cell surfaces：animmunocytological study in the central nervous system，Dev.Biol.，83，311-127(1981)。杂交瘤细胞从冷冻的储备物中复苏并在包含10％胎牛血清和谷氨酰胺的Dulbecco’s Modified Eagle’s培养基中培养24小时。基于台盼蓝渗透性判断，在这个阶段细胞中仅有2％是存活的。分开培养物，五分之一使用氨基葡聚糖超顺磁性纳米粒子分级。经过去除的细胞的存活率改善了7.5倍达到15％。经过去除的和未处理的细胞按上面描述的方法再培养3周，而后在补充了谷氨酰胺和胆固醇的无蛋白CD杂交瘤细胞培养基(InVitrogen Ltd)中再培养7天。每份培养物中等量的存活细胞被转移到Celline CL350生物反应器中(Integra Bioscience AG)。对照和经过去除的细胞的存活率分别为69％和73％，5天后收集细胞上清并测量IgM的浓度。每份培养中每个细胞的IgM产量在图中给出，其在经过去除的培养物中是在未处理(对照)的培养物中的约300％。这些结果说明了死亡的细胞抑制产生抗体的细胞的生产，去除结合了葡聚糖的死亡的细胞(尽管对于这样的低存活率，死亡细胞的去除仅是部分)有效去除了死亡细胞群体这一抑制群体。

图13：通过氨基葡聚糖纳米粒子调节体内肿瘤生长。SCID鼠被皮下注射10×10⁶人淋巴瘤细胞(BL2)，并记录检测到肿瘤后肿瘤直径达到14mm(最大允许尺寸)之前的天数。左条：平均±SEM，BL2未处理(n＝14肿瘤)。中间条：检测3天后，以50μL(1mg/ml)氨基葡聚糖粒子瘤内注射的BL2肿瘤。右条：检测3天后，以50μL(0.1mg/ml)氨基葡聚糖粒子瘤内注射的BL2肿瘤。未处理的肿瘤组织学外观上是典型的“星空”状，显示高水平的凋亡和巨噬细胞浸入。这些结果说明了纳米粒子的瘤内注射能够显著减慢肿瘤生长，这与将葡聚糖纳米粒子连接到正在死亡的和死亡的细胞上改变了肿瘤中先天免疫反应(巨噬细胞清除活性)的性质的观点一致。

实施例1

葡聚糖连接到存活和死亡(坏死)的细胞，但与死亡细胞连接程度更强(死亡细胞上有更多的葡聚糖结合部位)。

整个群体经过热处理以诱导坏死的人B-淋巴瘤细胞(所有细胞台盼蓝阳性)，与存活的淋巴瘤细胞以约1∶1的比率混合。随后细胞被以所示的葡聚糖-FITC(分子量4000，Sigma)剂量标记、清洗、甲醛固定，随后使用EPICS细胞仪(Beckman-Coulter)进行流式细胞仪分析。横坐标：Log荧光，葡聚糖-FITC。使用光散射参数区分“存活区”和“死亡区”细胞群体(见[Dive，1992#350])。数据在图1中显示。注意，在0.1mg/ml，存活细胞中实际上没有观察到在本底荧光之上的葡聚糖-FITC荧光，在此浓度下死亡区域内只发现小的荧光位移。相比之下，在1mg/ml，大于90％的存活和死亡细胞为阳性(A框)。其中，实际上所有死亡区域的细胞是强葡聚糖-FITC阳性(B框)，而在这样的条件下，实际上没有存活区的细胞是强阳性的。

葡聚糖-FITC连接存活的和死亡(坏死)细胞但但与死亡细胞连接程度更强：保留更长时间的死亡细胞上额外的结合部位。

按图1中的描述热处理人B淋巴瘤细胞以诱导坏死；死亡细胞热处理后立即或37℃进一步温育4天后与存活细胞等百分比混合。随后细胞混合物用1mg/ml的葡聚糖-FITC标记，固定，如之前一样通过流式细胞仪分析。如之前图1所显示的，相比存活的细胞，新鲜死亡细胞上找到更多葡聚糖结合部位可用(图2左栏)，且观察到的荧光有大约Log的改变。在生理条件下培养4天后，死亡的细胞继续展现由实际上整个的死亡细胞群体中观察到的较强的荧光水平所示的，更多数量的葡聚糖分子结合部位(图2右栏)。然而，应当注意，死亡后4天存活和死亡细胞群体间荧光的差别低于坏死刚开始后。

这些结果展示了基于显示出的可用葡聚糖结合部位的差别，在坏死死亡后随着时间推移，死亡细胞可以与存活细胞区分开来。

实施例2：凋亡开始后葡聚糖结合部位快速增长，随着时间推移达到坏死细胞展示出得水平。

为研究凋亡对葡聚糖结合部位的效应，使用蛋白激酶抑制剂，星形孢菌素，这一行之有效的凋亡触发方式诱导细胞经历凋亡。以检测正在死亡的和死亡细胞表面磷脂变化的抗磷脂抗体Dead-Cert^TMimab6免疫染色细胞后通过流式细胞仪器监控细胞的死亡(更多的信息见www.immunosolv.com/Apo-Technology.htmland(国家申请GB0723797.7)。使用碘化丙啶(PI)进一步区分正在死亡的细胞(凋亡)与死亡(凋亡后的，继发性坏死的)的细胞，碘化丙啶在坏死(细胞质膜完整性失去)开始前被排除在细胞外。

通过使用1μM星形孢菌素处理诱导人B淋巴瘤细胞经历凋亡，处理后1到5小时取样品。在所示的时间，细胞按照之前所述使用葡聚糖-FITC标记，并在通过流式细胞仪分析未固定的样品前用PI(2μg/ml)立即染色。同时，样品使用Dead-Cert^TMimab6(Immunosolv)免疫染色并使用次级羊抗鼠Ig-FITC(Sigma)可视化。Imab6标记的细胞在流式细胞仪之前也使用PI染色。绿色(FITC)荧光直方图由框中的PI阳性和PI阴性细胞群体产生。在PI-阴性(非坏死)细胞群体中，评估“总”和“高”的葡聚糖或imab6标记水平。数据被示于图3中。

如左上直方图栏所示(图3)，在凋亡诱导后的第一小时，在PI阴性，凋亡的细胞(比较绿色和蓝色直方图)中观察到葡聚糖-FITC荧光右移。同时伴有这些细胞的imab6荧光的实质位移(图3：左下栏)。参考表的总结(表2)所示，在这个时间，45％PI阴性细胞与葡聚糖连接，相比之下68％结合imab6。

表2：通过流式细胞仪测量的荧光葡聚糖标记的淋巴瘤细胞百分数

在暴露于凋亡诱导剂星形孢菌素所示时间后标记细胞。所有被分析的细胞是碘化丙啶阴性，因此由于其细胞质膜没有被透化，葡聚糖被连接到凋亡(正在死亡的)细胞表面。比较连接了荧光葡聚糖的细胞和连接凋亡细胞的单克隆抗体Imab6。总＝所有阳性细胞(本底荧光之上)；High＝强荧光细胞。流式细胞仪直方图的例子在图3A中给出。

实质上，在1小时时间点上没有PI阴性细胞高度结合葡聚糖或imab6(见图3：左栏和图3：表1)。然而，到4小时，发现大量PI阴性，凋亡细胞显示高水平葡聚糖荧光(图3：右上直方图和表)，可以与观察到的imab6标记的高水平相比(图3：右下直方图和表)。这样高水平荧光也可以与PI阳性细胞中发现的水平相比(与红色直方图相比-注意PI阳性细胞中绿色荧光水平在所有时间几乎相同-没有显示)。参考表，注意，在PI阴性群体中，葡聚糖阳性和imab6阳性细胞的总百分比在研究的5小时内升高、达到顶峰并下降。相比之下显示每一种这些标签高荧光的细胞百分比在总荧光的百分比顶峰时刻外继续上升，有力的说明了初始显示相对低荧光标记的细胞，在质膜完整性失去之前，随凋亡过程进入强葡聚糖和imab6标记阶段。

这些结果说明了葡聚糖可以被用于区分存活的、正在死亡(凋亡)的和死亡(坏死)的细胞。而且，葡聚糖结合的水平可以被用作凋亡阶段的指示：在质膜完整性失去之前和之后，中等结合水平指示凋亡过程的早期阶段，而强结合水平指示晚期阶段。

实施例3：葡聚糖包裹的颗粒可以被用于体外去除死亡细胞的多种应用。

去除死亡细胞对多种应用很重要，包括改进培养物中细胞的生产、降低基于细胞的检测中的本底噪音和细胞系的建立、改进生物化学用RNA和蛋白的质量，以及在递送给病人的过程中延长细胞(例如治疗细胞)的储存期。由于葡聚糖可以被用于区分存活的、凋亡的和死亡的细胞，这种聚合物有很大的潜力被用作一种无蛋白工具(因此容易被GMP应用接受)，用于从存活细胞中分离死亡细胞以产生有多种用途的高纯度存活细胞。而且葡聚糖有潜力被用在被设计用于“余下”早期凋亡细胞的分离方法中，因为葡聚糖结合部位，如上所述，直到凋亡过程中相对晚的阶段才达到高水平。这在某些应用中特别重要，因为早期凋亡细胞具有有益的属性，包括生长因子，如乳铁蛋白的产生。

为研究增强的葡聚糖与非存活细胞的结合是否可以被用于细胞分离，在多种条件下测试了由葡聚糖外壳包围的核心磁石组成的超顺磁性颗粒。在这些例子中，使用了250nm的颗粒并使用简单的磁铁对其进行了分离。

葡聚糖颗粒可以被用于显著改进含有原发坏死得来的死细胞的细胞悬浮液的存活率。

原发坏死因毒性处理或伤害后细胞失去其质膜完整性的但没有进入凋亡的结果而发生。

整个群体经过热处理以诱导坏死的人B-淋巴瘤细胞(所有细胞台盼蓝阳性)，与存活的淋巴瘤细胞以约1∶1的比率混合。细胞(2.5×10⁶)与由250nm葡聚糖包裹的超顺磁性颗粒(10μg，Micromod，“裸”颗粒(即未修饰的)或制造商已经添加COOH基团的颗粒)在eppendorf管中200μL完全培养基里37℃温育55分钟。温育之后，向管中加入0.8ml培养基随后将细胞和颗粒重悬浮在1ml中。模拟分离的细胞被同样的处理，除了不包含磁性颗粒。模拟分离细胞的存活率计数与未处理(投入)细胞相同。包含颗粒+细胞的管被置于简单磁铁(Immunosolv，DC-M1)上3分钟，在此之后没有颗粒的细胞悬浮液被移除，台盼蓝染色细胞群体的存活率计数使用Neubauer血球计数器进行。进行3次计数并以平均％存活细胞+SEM(黑色和蓝色条)表示。分离的存活细胞产率以投入(模拟分离)存活细胞绝对数百分比表示。数据示于图4中。

图4显示了可以通过磁性葡聚糖颗粒与死亡细胞的简单连接以及随后连接和未连接颗粒的快速磁性分离来实现坏死细胞的有效去除。在这个实施例中，尽管使用羧化颗粒的存活细胞产率较低，但羧化(COOH)颗粒比“裸”颗粒更有效(存活率的改进从约50％到几乎100％)。

葡聚糖颗粒可以被用于改进含有凋亡得来的死细胞的细胞悬浮液的存活率。

细胞死亡作为凋亡的结果导致凋亡后的坏死-凋亡后质膜破裂，这一过程通常被称为继发性坏死。由于能在质膜完整性失去之前有效去除凋亡细胞的吞噬细胞活力，这样的细胞通常不会持久存在于体内。

通过忽略(无营养/生长因子条件下细胞经历凋亡)获得的非常低存活率的鼠杂交瘤细胞悬液并使用磁性颗粒依照修改的上述条件分离：细胞和颗粒的温育在环境温度下(约20℃)下进行45分钟。未修饰的颗粒(裸)与羧化(COOH)颗粒和共价连接imab6的颗粒进行比较。在磁性分离之后，进行3次血球计数并以平均％存活细胞+SEM表示。分离的存活细胞产率以投入(模拟分离)存活细胞绝对数百分比表示。数据示于图5中。

在这个实施例(见图5)中，使用被证明比裸颗粒或连接imab6的颗粒更为有效的羧化颗粒，杂交瘤细胞培养物非常低的存活率被改善了超过2倍。

如图6所示，人淋巴瘤细胞通过用嘌呤霉素(2μg/ml)或星形孢菌素(1μM)处理18小时诱导经历凋亡，在此之后药物诱导的凋亡细胞被清洗并与存活细胞大约等百分比混合。使用能改善包含嘌呤或星形孢菌素处理过的细胞的群体存活率的葡聚糖包裹的磁性颗粒进行分离。羧化颗粒被证明最有效(图6)。

葡聚糖颗粒能在低温和无血清、蛋白和二价阳离子的条件下高效率去除死亡细胞。

为体现葡聚糖对死亡细胞去除的通用性，在不同条件下：在4℃、37℃，在无血清和无蛋白环境中以及无Ca²⁺和Mg²⁺时进行分离(基因表达研究中细胞制备优选低温分离；柔弱的细胞对应生理条件；治疗应用对应无血清或无蛋白条件；Ca²⁺和Mg²⁺可引起众所周知显著影响细胞分离效率的细胞聚集)。

不同条件下，从约2∶1的坏死：存活细胞混合物中去除坏死(按上述热处理的)的人B淋巴细胞。按照有修改的早先描述使用羧化葡聚糖包裹的超顺磁性颗粒进行分离：分离在完全培养基(RPMI+10％FCS)中或无Ca²⁺和Mg²⁺的磷酸盐缓冲液(PBS)中在4℃或37℃下进行。数据示于图7中。

在磁性分离之后，对台盼蓝染色的细胞进行三次血球计数器计数并以平均％存活细胞+SEM表示(图7：黑色和蓝色条)。分离的存活细胞产率以投入(模拟分离)存活细胞绝对数百分比表示。本实施例(图7)显示了高效率的死亡细胞去除-以至于存活率可以从＜30％提高到几乎100％-可以在冷或生理温度下，在完全培养基(左栏)或简单缓冲液如无Ca²⁺和无Mg²⁺的PBS(图7：右栏)中进行。在这个实施例中，任一温度下存活细胞纯化的最高效率是使用PBS获得，最佳产率在使用完全培养基时被观察到。

不同条件下，从约2∶1的坏死：存活细胞混合物中去除坏死(按上述热处理的)的人B淋巴细胞。按照有修改的早先描述使用羧化葡聚糖包裹的超顺磁性颗粒进行分离：分离在完全培养基(RPMI+10％FCS)中或无血清的X-Vivo20培养基(Lonza；含有人血清白蛋白，HSA)，或化学限定杂交瘤细胞培养基(Invitrogen)中，在4℃或37℃下进行。在这个实施例中，在所有条件下都实现了的死亡细胞去除，在完全培养基和无血清的X-Vivo培养基中观察到高效率的去除；使用后者时得到了最低的存活细胞产率。数据示于图8中。

这些结果说明，葡聚糖包裹的颗粒在广泛条件下的死亡细胞去除中是有效和通用的。而且，其显示了可以修改结合和分离环境以调节效率和产率。

Claims

1.一种从细胞群体中去除非存活细胞的方法，所述方法包括在适于使化合物和细胞培养物中存在的非存活细胞连接的条件下，使细胞群体与化合物相接触的步骤，以及从所述细胞群体中去除至少部分化合物的步骤，其中的化合物不是蛋白性质的化合物。

2.权利要求1的方法，其中细胞群体是细胞培养物。

3.前面任意权利要求的方法，其中化合物是能够与存在于非存活细胞上或非存活细胞中的细胞组分结合的化合物。

4.前面任意权利要求的方法，其中化合物能与细胞死亡时数量和/或可接触性增加的细胞组分相结合。

5.前面任意权利要求的方法，其中化合物是多糖。

6.前面任意权利要求的方法，其中化合物是葡聚糖或其类似物、变体或衍生物。

7.前面任意权利要求的方法，其中化合物是包括羧化和/或氨基葡聚糖的化合物。

8.权利要求1-7的方法，其中化合物被包装进细胞群体可加入的柱或者在细胞群体可加入的柱中提供。

9.权利要求1-7的方法，其中化合物与加入细胞群体的支架材料粘附、连接、固定和/或其他方式相联系。

10.权利要求1-9的方法，其中化合物以颗粒的形式提供，例如微粒子或纳米粒子。

11.权利要求10的方法，其中微粒子或纳米粒子采用直径10-500nm的小珠子或微球的形式。

12.权利要求11的方法，其中微粒子或纳米粒子包括多糖或由多糖组成。

13.权利要求12的方法，其中微粒子或纳米粒子包括葡聚糖或由葡聚糖组成。

14.权利要求10-13的方法，其中微粒子或纳米粒子进一步包括磁性材料。

15.权利要求14的方法，其中微粒子或纳米粒子包括葡聚糖包裹的磁性核心。

16.前述任意权利要求的方法，其中化合物被标签或标记过。

17.前述任意权利要求的方法，其中至少部分化合物通过过滤、密度分离、流式细胞仪/细胞分选和/或亲和层析技术被从细胞群体中去除。

18.权利要求14-16的方法，其中至少部分化合物通过使用磁场被从细胞群体中去除。

19.前述任意权利要求的方法，方法包括第一步骤，其中细胞群体与阻断缓冲剂相接触，阻断缓冲剂含有能够连接存在于非存活细胞上或非存活细胞中的细胞组分的化合物，化合物的浓度被制成能阻断全部(或基本上全部)存在于存活细胞和/或正在死亡的细胞上的所述细胞组分，但留下许多存在于非存活细胞和/或正在死亡的细胞上或非存活细胞和/或正在死亡的细胞中的所述细胞组分暴露或非封闭。

20.非蛋白化合物用于从细胞群体中去除非存活细胞的用途。

21.权利要求20的用途，其中细胞群体选自细胞系；储存或运输的细胞群体以及原代细胞制备品或培养物组成的组。

22.权利要求20的用途，其中细胞群体被用于基于细胞的检验或被转染。

23.权利要求20的用途，其中细胞群体用于产生或生产细胞产品。

24.葡聚糖在标记或标签非存活细胞中的用途。

25.权利要求24的用途，其中葡聚糖被进一步修饰以包含可检测的标签。

26.标记、标签和/或识别非存活细胞的方法，所述方法包括步骤：

(d)在适于使葡聚糖分子和细胞群体中存在的非存活细胞连接的条件下，使细胞群体与可选择修饰(即标签或标记)的葡聚糖分子相接触；

(e)去除未连接的葡聚糖分子；和

(f)检测连接了葡聚糖分子的细胞；

其中，连接葡聚糖分子的细胞包括非存活细胞。

27.葡聚糖分子和/或经修饰包含了一个以上的额外化合物的葡聚糖分子在将所述额外化合物定位到死亡或正在死亡的细胞中的用途。

28.权利要求27的用途，其中额外的化合物选自由药物；毒素；蛋白(如抗体或类似物)和核酸(例如反义核酸，微RNA，siRNA，iRNA等)组成的组。

29.葡聚糖和/或修饰的葡聚糖分子在治疗细胞增殖和/或分化紊乱中的用途。

30.将化合物定位到非存活细胞的体外方法，所述方法包括在适于使修饰的葡聚糖分子和细胞群体中存在的非存活细胞连接的条件下，使细胞群体与经过修饰包含一个以上要被定位到非存活细胞的额外化合物的葡聚糖分子接触的步骤。

31.从细胞群体中去除非存活细胞的试剂盒，所述试剂盒包括非蛋白化合物，使用的指示和/或其他缓冲剂和试剂。