CN101914149A - 一种具有抑菌活性的抗脂多糖因子的制备及应用 - Google Patents
一种具有抑菌活性的抗脂多糖因子的制备及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN101914149A CN101914149A CN2010100114964A CN201010011496A CN101914149A CN 101914149 A CN101914149 A CN 101914149A CN 2010100114964 A CN2010100114964 A CN 2010100114964A CN 201010011496 A CN201010011496 A CN 201010011496A CN 101914149 A CN101914149 A CN 101914149A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- esalf
- mitten crab
- coagulogen
- recombinant protein
- lipopolysaccharide factor
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 4
- 101710099705 Anti-lipopolysaccharide factor Proteins 0.000 title abstract description 13
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 title description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 23
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 23
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 4
- 238000004153 renaturation Methods 0.000 claims description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 2
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 2
- 108010045487 coagulogen Proteins 0.000 claims 5
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 206010061217 Infestation Diseases 0.000 claims 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 claims 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 claims 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 claims 1
- 229960001438 immunostimulant agent Drugs 0.000 claims 1
- 239000003022 immunostimulating agent Substances 0.000 claims 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 claims 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims 1
- 239000002831 pharmacologic agent Substances 0.000 claims 1
- 241000371997 Eriocheir sinensis Species 0.000 abstract description 19
- 241000544286 Vibrio anguillarum Species 0.000 abstract description 13
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 abstract description 12
- 230000012010 growth Effects 0.000 abstract description 8
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 6
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 abstract description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 abstract description 5
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 abstract description 5
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 11
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 8
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 8
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 7
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N imidazole Natural products C1=CNC=N1 RAXXELZNTBOGNW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000007124 immune defense Effects 0.000 description 6
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 description 4
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 4
- 241000238557 Decapoda Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229940124350 antibacterial drug Drugs 0.000 description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 3
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 3
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 3
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 241001529572 Chaceon affinis Species 0.000 description 2
- 241000238424 Crustacea Species 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 238000013461 design Methods 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 2
- 210000005007 innate immune system Anatomy 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 2
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 2
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000007222 ypd medium Substances 0.000 description 2
- RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N Ala-Ala-Gly Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O RLMISHABBKUNFO-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 1
- COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N Arg-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O COXMUHNBYCVVRG-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- XLZCLJRGGMBKLR-PCBIJLKTSA-N Asn-Ile-Phe Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 XLZCLJRGGMBKLR-PCBIJLKTSA-N 0.000 description 1
- WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N Asp-Ala-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O WSWYMRLTJVKRCE-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- TVVYVAUGRHNTGT-UGYAYLCHSA-N Asp-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O TVVYVAUGRHNTGT-UGYAYLCHSA-N 0.000 description 1
- 241000238017 Astacoidea Species 0.000 description 1
- UUERSUCTHOZPMG-SRVKXCTJSA-N Cys-Asn-Tyr Chemical compound SC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UUERSUCTHOZPMG-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- YUZPQIQWXLRFBW-ACZMJKKPSA-N Cys-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YUZPQIQWXLRFBW-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 1
- 108010090461 DFG peptide Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N Glu-Asp-Phe Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PAQUJCSYVIBPLC-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 description 1
- 108010053070 Glutathione Disulfide Proteins 0.000 description 1
- XRTDOIOIBMAXCT-NKWVEPMBSA-N Gly-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)CN)C(=O)O XRTDOIOIBMAXCT-NKWVEPMBSA-N 0.000 description 1
- QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N Gly-Glu-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QSVCIFZPGLOZGH-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- OQQKUTVULYLCDG-ONGXEEELSA-N Gly-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CN)C(O)=O OQQKUTVULYLCDG-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- ASCFJMSGKUIRDU-ZPFDUUQYSA-N Ile-Arg-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O ASCFJMSGKUIRDU-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- IDMNOFVUXYYZPF-DKIMLUQUSA-N Ile-Lys-Phe Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N IDMNOFVUXYYZPF-DKIMLUQUSA-N 0.000 description 1
- BKPPWVSPSIUXHZ-OSUNSFLBSA-N Ile-Met-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N BKPPWVSPSIUXHZ-OSUNSFLBSA-N 0.000 description 1
- SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N Leu-Ser-Pro Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(CO)C(=O)N1CCCC1C(O)=O SBANPBVRHYIMRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N ZDJQVSIPFLMNOX-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N Leu-Tyr-Phe Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(O)=O RDFIVFHPOSOXMW-ACRUOGEOSA-N 0.000 description 1
- CGHXMODRYJISSK-NHCYSSNCSA-N Leu-Val-Asp Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O CGHXMODRYJISSK-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N Lys-Ala-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN IRNSXVOWSXSULE-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N Phe-Gly-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QPVFUAUFEBPIPT-CDMKHQONSA-N 0.000 description 1
- 241000235648 Pichia Species 0.000 description 1
- VCYJKOLZYPYGJV-AVGNSLFASA-N Pro-Arg-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O VCYJKOLZYPYGJV-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- FFSLAIOXRMOFIZ-GJZGRUSLSA-N Pro-Gly-Trp Chemical compound N([C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)O)C(=O)CNC(=O)[C@@H]1CCCN1 FFSLAIOXRMOFIZ-GJZGRUSLSA-N 0.000 description 1
- XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N Pro-Leu-Leu Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O XYSXOCIWCPFOCG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N Ser-Arg-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O OYEDZGNMSBZCIM-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- GKMYGVQDGVYCPC-IUKAMOBKSA-N Thr-Asp-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)N GKMYGVQDGVYCPC-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- XOTBWOCSLMBGMF-SUSMZKCASA-N Thr-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O XOTBWOCSLMBGMF-SUSMZKCASA-N 0.000 description 1
- NYQIZWROIMIQSL-VEVYYDQMSA-N Thr-Pro-Asn Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O NYQIZWROIMIQSL-VEVYYDQMSA-N 0.000 description 1
- NHQVWACSJZJCGJ-FLBSBUHZSA-N Thr-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NHQVWACSJZJCGJ-FLBSBUHZSA-N 0.000 description 1
- URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N Val-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)C(C)C URIRWLJVWHYLET-ONGXEEELSA-N 0.000 description 1
- RSEIVHMDTNNEOW-JYJNAYRXSA-N Val-Trp-Cys Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)N RSEIVHMDTNNEOW-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N Val-Val-Asn Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)N DFQZDQPLWBSFEJ-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 230000003044 adaptive effect Effects 0.000 description 1
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 1
- 238000003975 animal breeding Methods 0.000 description 1
- 239000003674 animal food additive Substances 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 108010018691 arginyl-threonyl-arginine Proteins 0.000 description 1
- 108010093581 aspartyl-proline Proteins 0.000 description 1
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 238000010523 cascade reaction Methods 0.000 description 1
- 230000007969 cellular immunity Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 1
- 108010060199 cysteinylproline Proteins 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 238000009313 farming Methods 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 230000009422 growth inhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004727 humoral immunity Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 108010053037 kyotorphin Proteins 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 108010074082 phenylalanyl-alanyl-lysine Proteins 0.000 description 1
- 238000012257 pre-denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000004853 protein function Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 238000013207 serial dilution Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003911 water pollution Methods 0.000 description 1
Images
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明涉及中华绒螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)基因的体外重组表达技术及其功能鉴定。中华绒螯蟹抗脂多糖因子具有序列SEQ ID NO.1中氨基酸序列。本发明利用体外重组表达技术获得了中华绒螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)，该重组蛋白具有广谱性的抑菌效果，对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、革兰氏阴性菌鳗弧菌(Listonella anguillarum)和真菌毕赤酵母(Pichia pastoris)的生长都具有明显的抑制效果，对它们起抑制作用的最小蛋白浓度分别为：150μg mL-1，75μg mL-1和18.75μg mL-1。
Description
技术领域：
本发明属于分子生物学技术领域，涉及中华绒螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)基因编码区的体外重组表达技术，活性重组蛋白的分离纯化，以及重组蛋白对枯草芽孢杆菌、鳗弧菌和毕赤酵母的抑菌作用研究；还涉及到该重组蛋白作为一种新型抑菌药物，免疫增强剂和饲料添加剂生产中的应用价值。
背景技术：
中华绒螯蟹是东南亚重要的水产品养殖品种之一。然而，随着中华绒螯蟹养殖面积的不断扩大，由细菌，真菌和病毒引起的多种疾病在蟹的养殖群体中不断爆发，造成了巨大的经济损失。先前的研究已经表明，生物体死亡率的增加与其对外界病原微生物免疫防御能力低下有密不可分的关系。因此，对水产动物开展免疫防御系统的相关研究将有助于人类对其病害进行有效防控和治疗。
中华绒螯蟹是一种无脊椎动物，缺乏适应性免疫防御系统，只依赖固有免疫系统实现对外界病原微生物的免疫防御。固有免疫系统包括由血细胞引起的细胞免疫及由抗菌肽等组成的体液免疫来执行对外界病原微生物的免疫防御。在水产动物养殖过程中，抗生素的滥用不仅造成水体污染，而且因此带来抗药性微生物的产生。这个问题激发了我们对于生物体本身抗菌分子的研究，以期将其作为模板设计免疫防治的药物。并且，对于生物体内抗菌分子进行研究，将使我们进一步了解中华绒螯蟹免疫防御机制，从而更好地制定免疫防治的对策。
抗脂多糖因子(ALF)是一种可以结合脂多糖(LPS)的小蛋白，它可以调节细胞的脱颗粒作用，并引起细胞内的一系列级联反应。ALF最先在鲎中被发现，它分子量为11.8kDa，对于R-型革兰氏阴性菌有明显的抑制生长的效果。从晶体结构上看，鲎的ALF的结构中有两个高度保守的半胱氨酸结构，他们所限制的结构域为LPS结合域。体外合成鲎的ALF的LPS结合域，证明其确实可以与LPS结合。随后，从对虾，蟹，螯虾等甲壳动物中也纯化或克隆获得了一些抗脂多糖因子。
本发明中的中华绒螯蟹抗脂多糖因子，其重组产物对枯草芽孢杆菌、鳗弧菌和毕赤酵母的生长都具有抑制的功能。目前，抗脂多糖因子的结构和功能在虾中已得到一定程度的研究，但在中华绒螯蟹的研究还很少。ALFs在中华绒螯蟹中的研究，有利于更好的揭示固有免疫作用的途径及其机制，并且对开发广谱抗菌药物和筛选免疫增强剂提供指导。
发明内容：
中华绒螯蟹作为甲壳动物的代表，在进化上比较原始，研究其效应分子的作用在理论和实际中都具有重要的意义。本发明对中华绒螯蟹抗脂多糖因子(EsALF-2)基因编码区进行原核重组，旨在确认其蛋白功能，以深入研究EsALF-2的抑菌活性，为抗菌药物和免疫增强剂的筛选提供指导。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：在EsALF-2基因编码区(信号肽除外)的两端分别设计含有限制性酶切位点的引物，通过PCR技术，扩增编码区基因并将其克隆到pET-32a表达载体中，随后转入宿主细胞BL21(DE3)plysS中实现原核体外重组表达。重组产物经镍琼脂糖凝胶柱纯化，并且透析复性后，表现出以下活性：
1、EsALF-2重组蛋白对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌、革兰氏阴性菌鳗弧菌和真菌毕赤酵母有抑制生长作用。当EsALF-2重组蛋白为最大浓度(600μg mL-1)时，该蛋白与枯草芽孢杆菌37℃孵育3小时后，再加LB培养基孵育过夜，O.D.600值为0.18±0.019(平均值±标准误)，显著低于对照组(Tris-HCl)的O.D.600值(0.38±0.013)；该蛋白与鳗弧菌28℃孵育3小时后，再加2216E培养基孵育过夜，O.D.600值为0.06±0.002，显著低于对照组(Tris-HCl)的O.D.600值(0.16±0.012)；该蛋白与毕赤酵母30℃孵育3小时后，再加YPD培养基孵育过夜，O.D.560值为0.90±0.006，显著低于对照组(Tris-HCl)的O.D.600值(0.97±0.043)。
2、EsALF-2重组蛋白对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌、革兰氏阴性菌鳗弧菌和真菌毕赤酵母的最小抑制浓度分别为：150μg mL-1，75μg mL-1和18.75μg mL-1。
附图说明：
图1：中华绒螯蟹重组蛋白EsALF-2对枯草芽孢杆菌、鳗弧菌和毕赤酵母生长的影响
图2：不同浓度梯度的中华绒螯蟹重组蛋白EsALF-2对枯草芽孢杆菌、鳗弧菌和毕赤酵母生长的影响
具体实施方式：
下面的实验例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
实施实验1：
本发明的中华绒螯蟹重组蛋白EsALF-2基因编码区(信号肽除外)体外原核重组表达，包括下列步骤：
1、重组载体的构建
通过PCR技术，使用5’末端分别添加了BamH I和Xho I特定酶切位点的基因特异性引物P1(5’-GGATCCAACATTTTTGACGATATTTTCG-3’)和P2(5’-CTCGAGTCAAGCATTCAGCAAAGGGTC-3’)扩增中华绒螯蟹重组蛋白EsALF-2的编码区片段。反应条件为：首先94℃预变性5分钟，然后进入下列循环：94℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共进行35个循环，最后72℃延伸10分钟。将扩增片段纯化回收，与pMD18-T载体连接。转化后筛选阳性克隆，提取质粒；使用BamH I和Xho I两个酶酶切质粒，用胶回收纯化试剂盒(大连宝生物工程有限公司)对酶切产生的目的片段纯化回收；回收目的片段与经BamH I和Xho I两个酶酶切的表达载体pET-32a连接，完成载体的构建。上述实验操作的具体方法请参照《分子克隆第三版》。
2、重组蛋白EsALF-2的表达
将构建好的重组载体转化表达宿主菌BL21(DE3)-plysS中，并筛选阳性克隆，测序确认表达框的正确性。挑取单克隆，接种于200mL的LB液体培养基中，220rpm，37℃培养至O.D.600＝0.5-0.7。加入IPTG，使终浓度达到1mmol L-1，继续培养4小时。4℃，5000rpm，离心10分钟，收集菌体，于-20℃冻存备用。取1mL菌液离心，弃去上清后，加入80μL水和20μL的5倍的蛋白上样缓冲液，100℃煮沸2分钟，稍离心，SDS-PAGE检测表达产物。
3、重组蛋白EsALF-2的纯化与复性
本发明中重组蛋白采用北京韦氏博慧色谱科技有限公司的镍琼脂糖凝胶柱纯化。变性状态下的具体操作步骤如下：首先用缓冲液I(50mmol L-1磷酸缓冲液，pH＝7.4，0.5molL-1氯化钠，8mol L-1尿素)平衡镍琼脂糖凝胶柱2-5个柱床体积，流速为2mL min-1。经IPTG诱导表达的细胞，用缓冲液I重悬，150瓦超声破碎30分钟，12000转，离心30分钟，上清液用0.45μm滤膜过滤后，过柱，流速为1mL min-1。再次用缓冲液I再洗2-5个柱床体积，流速为2mL min-1，然后用有50mmol L-1咪唑的缓冲液I再洗2-5个柱床体积，流速为2mL min-1。最后，用400mmol L-1咪唑的缓冲液I洗脱目的蛋白，收集。
重组蛋白的复性采用尿素逐级稀释的方法，通过透析除去尿素，使蛋白重新正确折叠，恢复正确构象。本发明中采用的复性透析液为：50mmol L-1Tris-HCl，pH 7.4，50mmolL-1氯化钠，2mmol L-1还原型谷胱苷肽，0.2mmol L-1氧化型谷胱苷肽，10％甘油，1％甘氨酸，1mmol L-1EDTA，6-0mol L-1逐级稀释的尿素。最后，重组蛋白的透析缓冲液为50mmol L-1 Tris-HCl，pH 7.4。
实施实验2：
本发明的中华绒螯蟹重组蛋白EsALF-2的抑菌活性检测具体步骤如下：
1、微生物的培养及制备
枯草芽孢杆菌用LB培养基37℃，鳗弧菌用2216E培养基28℃，毕赤酵母用YPD培养基30℃，同时用摇床每分钟220转数培养到菌浓度达到对数生长期时，用Tris-HCl(50mmol L-1，pH＝8.0)稀释菌体，使其每毫升菌液中的菌落数约为1×103。
2、重组蛋白EsALF-2抑菌活性测定
重组蛋白EsALF-2成倍稀释，分别加50μL的EsALF-2在无菌的96孔板中，50μLTris-HCl(50mmol L-1，pH＝8.0)设为对照，然后再加入50μL的稀释好的菌液，并且混匀。只加入50μL菌液的孔为空白孔。96孔板在菌液的培养温度下孵育3小时后，加入相应培养基150μL，空白孔加入培养基200μL，孵育过夜。加枯草芽孢杆菌和鳗弧菌的96孔板在波长为600nm的可见光下读数，加毕赤酵母的96孔板在波长为560nm的可见光下读数。实验组与对照组进行显著分析，正如图1所示，实验组重组蛋白EsALF-2(600μg mL-1)对鳗弧菌，枯草芽孢杆菌和毕赤酵母生长与对照组Tris-HCl组相比均具有明显的抑制效果(星号*：差异显著；两个星号**：差异极显著)。以重组蛋白EsALF-2最小浓度抑制菌生长的浓度定义为此菌的最小抑制浓度，正如图2所示，随着重组蛋白EsALF-2浓度的降低，抑菌活性逐渐减弱，重组蛋白EsALF-2对革兰氏阳性菌枯草芽孢杆菌、革兰氏阴性菌鳗弧菌和真菌毕赤酵母有抑制生长作用，且最小抑制浓度分别为150μg mL-1，75μgmL-1和18.75μg mL-1。
序列表
<110>中国科学院海洋研究所
<120>一种具有抑菌活性的抗脂多糖因子的制备及应用
<140>
<160>1
<170>PatentIn version 3.5
<210>1
<211>120
<212>PRT
<213>中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)
<220>
<400>1
Met Ala Arg Leu Ser Leu Phe Leu Val Ala Val Ala Val Ala Val Phe
1 5 10 15
Thr Pro Asn Ile Arg Gln Cys Glu Ala Asn Ile Phe Asp Asp Ile Phe
20 25 30
Gly Lys Val Thr Glu Thr Leu Val Asp Phe Gly Thr Thr Asp Ile Ala
35 40 45
Gly Asn Pro Cys Asn Tyr Arg Leu Ser Pro Arg Leu Ile Lys Phe Glu
50 55 60
Leu Tyr Phe Val Gly Leu Val Trp Cys Pro Gly Trp Thr Thr Ile Gln
65 70 75 80
Gly Glu Ser Leu Thr Arg Ser Arg Thr Arg Val Val Asn Lys Ala Val
85 90 95
Glu Asp Phe Ala Lys Lys Ala Val Ala Ala Gly Ile Met Thr Gln Glu
100 105 110
Asp Ala Asp Pro Leu Leu Asn Ala
115 120
Claims (3)
1.一种中华绒螯蟹抗脂多糖因子EsALF-2基因编码蛋白，其特征在于：含有序列表SEQ ID NO.1中氨基酸序列。
2.一种根据权利要求1所述的中华绒螯蟹抗脂多糖因子EsALF-2的制备方法，其特征在于：(1)利用带有限制性酶切位点的引物P1和P2扩增中华绒螯蟹EsALF-2基因编码区片段；(2)将pET32a载体与PCR扩增产物经BamH I和Xho I双酶切，连接后转化表达菌株BL21(DE3)plysS；(3)测序鉴定重组子并进行诱导培养，超声波破碎处理菌体收获重组蛋白，经镍柱纯化、复性后得到具有活性的抗脂多糖因子EsALF-2。
3.一种权利要求1所述的中华绒螯蟹抗脂多糖因子EsALF-2的应用。其特征在于：中华绒螯蟹抗脂多糖因子EsALF-2可作为广谱抗菌类药物治疗细菌、真菌感染，或用于免疫增强剂、保健品、饲料添加剂的生产。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010100114964A CN101914149B (zh) | 2010-01-16 | 2010-01-16 | 一种具有抑菌活性的抗脂多糖因子的制备及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2010100114964A CN101914149B (zh) | 2010-01-16 | 2010-01-16 | 一种具有抑菌活性的抗脂多糖因子的制备及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN101914149A true CN101914149A (zh) | 2010-12-15 |
| CN101914149B CN101914149B (zh) | 2013-04-03 |
Family
ID=43321814
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2010100114964A Expired - Fee Related CN101914149B (zh) | 2010-01-16 | 2010-01-16 | 一种具有抑菌活性的抗脂多糖因子的制备及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN101914149B (zh) |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102212124A (zh) * | 2011-05-17 | 2011-10-12 | 厦门大学 | 拟穴青蟹抗脂多糖因子及其制备方法与应用 |
| CN102329803A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-01-25 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因及其编码蛋白和应用 |
| CN102329802A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-01-25 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因及其编码蛋白和应用 |
| CN102329801A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-01-25 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-1基因及其编码蛋白和应用 |
| CN102337273A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-02-01 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-5基因及其编码蛋白和应用 |
| CN102337271A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-02-01 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因及其编码蛋白和应用 |
| CN102337272A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-02-01 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因及其编码蛋白和应用 |
| CN103724412A (zh) * | 2013-09-29 | 2014-04-16 | 中国科学院海洋研究所 | 中国明对虾抗脂多糖因子及其制备和应用 |
| CN105255750A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-01-20 | 江南大学 | 一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的酿酒酵母工程菌 |
| CN110747136A (zh) * | 2019-11-25 | 2020-02-04 | 天津师范大学 | 巴斯德毕赤酵母菌菌株km71及用途 |
-
2010
- 2010-01-16 CN CN2010100114964A patent/CN101914149B/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102212124A (zh) * | 2011-05-17 | 2011-10-12 | 厦门大学 | 拟穴青蟹抗脂多糖因子及其制备方法与应用 |
| CN102212124B (zh) * | 2011-05-17 | 2012-07-18 | 厦门大学 | 拟穴青蟹抗脂多糖因子及其制备方法与应用 |
| CN102329803A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-01-25 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-6基因及其编码蛋白和应用 |
| CN102329802A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-01-25 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-4基因及其编码蛋白和应用 |
| CN102329801A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-01-25 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-1基因及其编码蛋白和应用 |
| CN102337273A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-02-01 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-5基因及其编码蛋白和应用 |
| CN102337271A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-02-01 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因及其编码蛋白和应用 |
| CN102337272A (zh) * | 2011-09-23 | 2012-02-01 | 中国科学院海洋研究所 | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-3基因及其编码蛋白和应用 |
| CN103724412A (zh) * | 2013-09-29 | 2014-04-16 | 中国科学院海洋研究所 | 中国明对虾抗脂多糖因子及其制备和应用 |
| CN105255750A (zh) * | 2015-11-17 | 2016-01-20 | 江南大学 | 一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的酿酒酵母工程菌 |
| CN110747136A (zh) * | 2019-11-25 | 2020-02-04 | 天津师范大学 | 巴斯德毕赤酵母菌菌株km71及用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN101914149B (zh) | 2013-04-03 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN101914149B (zh) | 一种具有抑菌活性的抗脂多糖因子的制备及应用 | |
| Arockiaraj et al. | Crustin, a WAP domain containing antimicrobial peptide from freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii: immune characterization | |
| CN111304181B (zh) | 一种基因工程改造后的副溶血性弧菌噬菌体裂解酶及其制备方法和应用 | |
| Ko et al. | Molecular characterization, transcriptional profiling, and antibacterial potential of G-type lysozyme from seahorse (Hippocampus abdominalis) | |
| CN101619102A (zh) | 一种具杀菌活性的栉孔扇贝肽聚糖识别蛋白的制备及应用 | |
| CN110982822B (zh) | 一种克氏原螯虾抗脂多糖因子gALF1基因、其编码的gALF1蛋白及其应用 | |
| Oh et al. | Isolation of an invertebrate-type lysozyme from the nephridia of the echiura, Urechis unicinctus, and its recombinant production and activities | |
| Suthianthong et al. | A double WAP domain-containing protein PmDWD from the black tiger shrimp Penaeus monodon is involved in the controlling of proteinase activities in lymphoid organ | |
| WO2004020461A1 (fr) | Groupe de nouveaux peptides antibiotiques de synthese | |
| CN104448004A (zh) | 一种融合抗菌肽及其制备方法 | |
| CN104474557B (zh) | 一种具有抑菌活性的长牡蛎C型凝集素‑2(CgCLec‑2)重组蛋白的应用 | |
| CN108003233A (zh) | 长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-2、制备方法及应用 | |
| CN102643342A (zh) | 一种泥蚶血红蛋白Tg-HbIIA及其应用 | |
| CN104117059B (zh) | 三疣梭子蟹丝氨酸蛋白酶基因的应用 | |
| CN100485036C (zh) | 一种中国明对虾抗菌蛋白基因及重组表达和应用 | |
| CN107936106B (zh) | 长牡蛎含DM9结构域蛋白CgDM9CP-4、制备方法及应用 | |
| CN101942473A (zh) | 克氏原螯虾i型溶菌酶基因及其编码的溶菌酶与应用 | |
| CN102061303A (zh) | 两种海洋动物抗菌肽基因的融合表达产物及其制备方法 | |
| Chen et al. | Identification of a chitinase from the hepatopancreas of Chinese black sleeper (Bostrychus sinensis) | |
| CN104789513B (zh) | 一种制备活性短肽的大肠杆菌菌株 | |
| CN102337273A (zh) | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-5基因及其编码蛋白和应用 | |
| CN101955523B (zh) | 一种具抑菌活性的中华绒螯蟹乳清酸蛋白的制备及应用 | |
| CN109385436B (zh) | 一种拟穴青蟹c-型溶菌酶基因及其用途 | |
| CN102337271A (zh) | 三疣梭子蟹抗脂多糖因子PtALF-2基因及其编码蛋白和应用 | |
| CN108048475B (zh) | 缢蛏i型溶菌酶-2基因、编码蛋白及重组缢蛏i型溶菌酶-2基因工程菌的构建方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20130403 Termination date: 20190116 |