CN105255750A - 一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的酿酒酵母工程菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的酿酒酵母工程菌，属于生物技术领域。本发明通过将中华绒螯蟹抗脂多糖因子ALF的cDNA克隆至载体质粒pHAC181上，克隆成功的阳性转化子经过测序验证后，再利用同源重组的方法，将目的基因整合于酿酒酵母菌株中GAL1启动子下游，在半乳糖的诱导下，将目的蛋白EsALF高效表达。

Description

一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的酿酒酵母工程菌

技术领域

本发明涉及一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的酿酒酵母工程菌，属于生物技术领域。

背景技术

水产养殖业是我国经济出口创汇的重要产业之一，渔业在我国已成为农业经济的增长点。近年来甲壳类动物病害日趋严重，给我国水产养殖业带来巨大的经济损失。

甲壳类动物缺乏后天获得的特异性免疫功能，但是它们有比较完善的先天性非特异性免疫系统，能够迅速识别和有效清除入侵的微生物。甲壳类动物的非特异性免疫机制包括甲壳和粘液的屏障作用、网状内皮系统的吞噬作用以及非特异性体液分子。(1)模式识别蛋白(Patternrecognitionproteins,PRPs)，包括LGBP(lipopolysaccharideandβ-1,3-glucan-bindingprotein,LGBP)与抗脂多糖因子(Anti-Lipopolysaccharidefactor，ALF)等，它们能与外来病原表面的脂多糖β-1,3-葡聚糖和肽聚糖等结合并等识别病原体相关的分子模式(pathogen-associatedmolecularpatterns，PAMPs)，继而激活酚氧化酶原(pro-phenoloxidase，proPO)系统；(2)酚氧化酶激活系统。甲壳动物酚氧化酶酶原在血细胞中合成后释放到血浆中。酚氧化酶酶原通过酚氧化酶酶原激活酶的水解转化成有活性的酚氧化酶，催化单酚化合物氧化成邻二酚产物(o-diphenols)，再氧化成邻二醌(o-quinones)，邻二醌抑制病原体胞外蛋白酶和几丁质酶的活性，从而抑制甚至杀死病原体。

目前，中华绒螯蟹ALF基因的EST序列被测定，ALF全长的基因也被克隆(Li，2008)。有研究学者将中华绒螯蟹ALF基因在大肠杆菌中进行原核表达，但大肠杆菌表达体系常会导致蛋白聚集形成不溶的无活性的包涵体，复性过程繁琐，产出率低等因素大大提高工业生产的成本，且蛋白表达量不高。目前也没有中华绒螯蟹ALF在真核宿主中的表达。众所周知，基因的异源表达受到宿主、载体、启动元件等多种因素的影响。因此，如何实现甲壳类动物来源的ALF的异源表达、活性表达、高效表达是目前亟需解决的问题。

发明内容

为了克服上述问题，本发明利用酿酒酵母构建真核表达载体，实现了中华绒螯蟹重要免疫因子ALF进行高效活性表达。本发明构建的酿酒酵母真核表达工程菌株必将在水产养殖上发挥重要作用。

本发明的第一个目的是提供一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的酿酒酵母工程菌，所述基因工程菌的构建方法是将中华绒螯蟹抗脂多糖因子EsALF的cDNA克隆至表达质粒pHAC181上得到测序验证正确的重组质粒pHAC181-EsALF，然后设计同源重组引物，利用同源重组技术将目的基因EsALF整合至酿酒酵母宿主菌株的GAL1启动子下游。该工程菌在半乳糖的诱导下，可高效表达目的蛋白。

在本发明的一种实施方式中，所述EsALF的cDNA的CDS(codingsequence)区域翻译后的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

在本发明的一种实施方式中，所述EsALF的cDNA的CDS区域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

在本发明的一种实施方式中，所述表达质粒pHAC181是在商业化质粒YCplac181的SphI和EcoRV位点插入3个组氨酸标签得到的，详见文献：AnalysesoftheeffectsofRck2pmutantsonPbs2p^DD-inducedtoxicityinSaccharomycescervisiaeidentifyaMAPkinasedockingmotif,andunexpectedfunctionalinactivationduetoacidicsubstitutionofT379,MolGenGenomics,2004,271:208–219.

在本发明的一种实施方式中，所述宿主菌株为酿酒酵母GAL1-ScRCH1，是将酿酒酵母BY4741(Sc04153268_s1)菌株里的ScRCH1基因的启动子替换成GAL1启动子。

在本发明的一种实施方式中，所述酿酒酵母工程菌是按照如下方法构建得到的：(1)以中华绒螯蟹组织的cDNA为模板PCR扩增或者直接化学合成，得到核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的EsALF基因片段；(2)将EsALF基因片段克隆到表达质粒pHAC181上，得到重组表达质粒pHAC181-EsALF；(3)设计同源重组引物，对质粒pHAC181-EsALF进行扩增，得到含有EsALF基因的核苷酸片段，使用同源重组的方法，将该核苷酸片段整合至酿酒酵母菌株中GAL1启动子下游，并使用引物进行PCR检测，有EsALF基因片段扩增出的转化子即为同源重组成功的菌株Gal-pHAC181-EsALF。

在本发明的一种实施方式中，所述步骤(3)，还包括将菌株在YPG培养基中诱导培养6h后，提取菌株蛋白，用于做WESTERNBLOT检测，目的蛋白表达的菌株则为构建成功的酵母工程菌。

本发明的第二个目的是提供一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的方法，所述方法是使用所述酿酒酵母工程菌为生产菌株。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将酿酒酵母工程菌活化后，接种于YPG培养基中，在半乳糖的诱导下培养6h；所述YPG培养基含有D-半乳糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L。

本发明还要求保护所述酿酒酵母工程菌生产得到的抗脂多糖因子，以及其在水产养殖及水产动物免疫饲料添加剂方面的应用。

本发明的有益效果：

(1)本发明构建的酿酒酵母工程菌，可以实现中华绒螯蟹重要免疫因子EsALF进行高效表达、活性表达；本发明的酿酒酵母工程菌得到的EsALF具有活力，诱导培养6h后每mL发酵液可得蛋白0.06mg。

(2)本发明的工程菌为酿酒酵母工程菌，表达真核来源的EsALF，可以分泌经正确折叠和加工的蛋白质；而且酿酒酵母具有在简单培养基中快速生长等优点；

(3)本发明以pHAC181为载体、GAL1-ScRCH1为宿主构建酿酒酵母工程菌，实现了中华绒螯蟹重要免疫因子EsALF的高效表达，以期增强甲壳类动物对各种主要疾病和环境变化的抵抗力，有效促进其健康生长。目前新型饲料蛋白源与饲料添加剂的研制与开发己成为促进现代水产养殖业健康发展的关键技术，本发明的酵母工程菌不仅可以更进一步对甲壳类动物重要免疫基因的蛋白功能进行研究，也将为开发新型免疫增强型饲料添加剂提供科学依据及新方法。

附图说明

图1：中华绒螯蟹抗脂多糖因子EsALFcDNA扩增条带(360bp)；

图2：将中华绒螯蟹cDNA克隆至载体pHAC181上时，菌落PCR验证阳性转化子(Line4，7，9，10，11为正确的转化子)；

图3：将中华绒螯蟹cDNA克隆至载体pHAC181上时，阳性转化子的酶切验证(Line5为正确的转化子)；

图4：高保真酶PrimeSTARGXL酶对重组质粒pHAC181-EsALF进行扩增(4742bp)；

图5：检测引物检测pHAC181-EsALF与含GAL1启动子的菌株同源重组(同源重组成功的条带为634bp，Line1，3，6，7为正确的转化子)；

图6：WESTERNBLOT检测到Gal-pHAC181-EsALF蛋白表达，目的蛋白为20KD。

具体实施方式

在本发明中，首先采用基因克隆技术，具体为：将中华绒螯蟹RNA提取后，用反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。利用高保真PCR酶将目的基因片段EsALF进行扩增。扩增得到的基因片段与载体pHAC181连接，转入大肠杆菌感受态细胞transT1中，涂布于LA平板上37℃过夜培养。LA平板上得到的阳性转化子进行酶切验证及测序验证。其次，利用同源重组技术将带有目的基因EsALF的质粒pHAC181整合至酿酒酵母菌株GAL1-ScRCH1菌株中GAL1启动子下游，整合成功的菌株在YPG培养基中诱导培养6h后，提取蛋白，用于WESTERNBLOT检测。目的蛋白表达成功的菌株则为构建成功的酵母工程菌。

LA培养基的组成：蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、NaCl10g/L、琼脂12g/L，调PH为7.0，Amp抗生素100mg/ml(120℃，20min)。

SD-Leu培养基的组成：含有酵母氮源(无AA)1.7g/L、硫酸铵5g/L、葡萄糖20g/L、10xAAmix(-ura，-leu，-his)100ml，100xUra10ml，100xHis10ml，琼脂20g/L(120℃，20min)。

YPG培养基的组成：D-半乳糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L(115℃，20min)。

实施例1：酿酒酵母基因工程菌的构建(基因克隆)

通过构建高表达质粒pHAC181-EsALF，具体方法为提取中华绒螯蟹组织RNA，反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。利用高保真酶将目的基因片段EsALF进行PCR扩增，EsALF基因片段(CDS区域，不包含终止密码子，共360bp)，然后将这个片段克隆到高表达质粒pHAC181多克隆位点上，最后对正确的重组子进行DNA测序，验证序列没有发生突变，得到重组高表达质粒pHAC181-EsALF。

实施例2：酿酒酵母基因工程菌的构建(同源重组)

根据构建好的重组高表达质粒pHAC181-EsALF设计同源重组引物，利用高保真PrimeSTARGXL酶对质粒pHAC181-EsALF进行扩增，扩增成功的长片段整合至酿酒酵母菌株中GAL1启动子下游。

同源重组引物为F1、R1，序列如SEQIDNO.3、SEQIDNO.4所示：

F1：caaatgtaataaaagtatcaacaaaaaattgttaatatacctctatactttaacgtcaaggagaaaaaacccggatctcaaa

ATGGCACGCCTGTCGCTG

R1：tatggacgaggtaataaggaaactcagaaccagaatagtggcatgagctctccaatttaacatatttgccattagtgacc

CGATGATAAGCTGTCAAACATG

基因同源重组(整合)的具体步骤为：

1.挑活化的GAL1-ScRCH1菌株单菌落，接种到3mlYPD培养基，30℃220rpm培养过夜。

2.取300ul过夜培养物接种到4.7ml2*YPD中，30℃培养4～5h(达到OD600＝0.6-1.0)；

3.将5ml菌液分3管，室温离心4000rpm，1min，弃上清，再用1ml水重悬合并到1个EP管中，3000rpm离心1min，弃上清。

4.加100ul的0.1MLiAc溶液，吹吸混匀，12000rpm离心10s，弃上清。

5.重复步骤4。

6.依次加入下列物质，加入后温和混匀：

7.混匀，30℃水浴中温育30min；

9.42℃水浴中温育30min(热激)；

10.3000rpm离心除去上清，用1ml的无菌水重悬菌体，3000rpm离心1min弃上清，预留100ul菌液铺在选择平板(SD-LEU)上，30℃培养3～5天。

11.将长出的转化子在SD-LEU平板上进行划线纯化。单菌落接种于YPD培养基中过夜培养，提取转化子基因组，用检测引物进行PCR检测，有目的片段扩增出的转化子即为同源重组成功的菌株Gal-pHAC181-EsALF。

检测引物为DF、DR，序列如SEQIDNO.5、SEQIDNO.6所示：

DF:CCTGGCCCCACAAACCTTC

DR:GGCATTCAGCAAAGGGTTAG

实施例3：工程菌株蛋白表达与WESTERNBLOT检测

将同源重组成功的Gal-pHAC181-EsALF菌株单菌落接种于SD-LEU培养基5ml中过夜培养，培养物第二天转接于45mLYPG培养基中，经半乳糖诱导培养6h(OD检测为1.2-1.5)后，提取菌株蛋白。提取的蛋白用于WESTERNBLOT检测。

具体步骤为：

(一)细胞中总蛋白的提取

1、挑取单菌落于所需液体培养基中30℃过夜培养至饱和；

2、取5mL过夜培养的菌液加入45mL新鲜的液体培养基并且在30℃摇床里振荡培养约6h(OD＝1.2-1.5)(转速为220rmp)；

3、以8000rpm1min收集菌体，去掉上层的液体；

4、用预冷双蒸水重悬菌体，并于离心后去掉上清液；

5、加入与菌体等量并预冷的PEB(ProteinExtractionBuffer)，PEB中加入100×PMSF；

6、加入与菌体等体积的酸洗玻璃珠；

7、在振荡混合器上振荡EP管10×30s，每次振荡后放冰上1min；

8、12000rpm离心10min，吸取上清液于冰上保存，弃去沉淀；

9、用考马斯亮蓝法检测浓度(OD595)，将样品浓度调整一致；

10、加入5×SB95℃煮5min

(二)考马斯亮蓝法检测蛋白浓度

1、标准蛋白溶液的制备：称量BSA固体10mg溶解于1mL的水中，得到10mg/mL的溶液作为标准贮液。用标准贮液配制系列稀释的标准蛋白溶液，其浓度分别为1.2mg/ml、1.0mg/ml、0.8mg/ml、0.6mg/ml、0.4mg/ml、0.2mg/ml、0.1mg/ml。

2、待测蛋白溶液的制备：将待测样品稀释至浓度在0.1mg/ml—1.2mg/ml之间。(根据经验稀释15倍)

3、4μl染液+200μl蛋白溶液，混匀，静置3min。按照核酸蛋白分析仪的“protein”程序测定蛋白浓度。

在本实验中，测得的蛋白浓度为15ug/ul。换算可得到蛋白浓度为0.06mg/ml，即每mL发酵液得到0.06mg蛋白。

将目的蛋白稀释为8ug/ul，用于后续实验。

(三)SDS-PAGE

1.装置组装

注意：(1)玻璃板，橡胶带，梳子，要洗净晾干

(2)要密封好，防止漏胶

2.制胶

注意：(1)灌胶要迅速

(2)分离胶的灌注距短玻璃板顶端约2cm

(3)注意是否有气泡

(4)在胶液界面加入薄层水，平齐分离胶面，15-30min聚合完好

3.蛋白样品制备

蛋白样品+SampleBuffer,沸水浴煮沸5min，冰上冷却5min。

4、上样，必须点预染Marker，电泳。

浓缩胶80V，分离胶100V。

(四)转印(浸渍法)

1、在冰盒里装上水，冻实

2、将转移缓冲液冷却至4℃

3、在浅的托盘中倒入转移缓冲液

4、将与胶尺寸大小相等的PVDF膜，用铅笔标记好，在甲醇里浸泡约3min，再转移至转移缓冲液浸湿平衡，直到没有气泡

5、将4张与胶大小相符的Whatmman滤纸放置转移缓冲液中充分浸湿

6、将吸水棉在转移缓冲液中充分浸湿

7、电泳后，带上手套，切取有用部分的胶将其迅速的在转移缓冲液中洗涤

8、打开转槽胶板，依次放入：浸湿吸水棉—2层Whatmman滤纸—胶—PVDF膜--2层Whatmman滤纸—浸湿吸水棉，注意不要有气泡。

9、小心合上转移槽的胶板，立即放入转移槽中，注意正负极方向

10、在转移槽中加入磁棒，倒入转移缓冲液，使其浸没转印胶板，将转移槽放在磁力搅拌器上，放入冷却冰盒

11、插入电极，注意再检查一下正负极方向，打开开关，转移电泳100V1h

12、转移结束后，断开电源并拔下槽上插头，从上到下拆卸转移各层，取出PVDF膜。

(五)封闭

加入封闭液封闭，用摇床轻轻摇动1h-4h

(六)加入一抗

1、轻轻转移掉封闭液

2、加入一抗杂交液，室温2h或4℃过夜

(七)加入二抗

1、轻轻转移掉一抗杂交液(可重复使用)，用TBST洗3次，每次10min

2、加入二抗杂交液，室温轻摇2h

3、用TBST洗膜3次，每次10min

(八)反应

1、用不同的tip头分别取100ul底物溶液1和100ul底物溶液2在1.5ml管中混匀，然后将这200ul混合液转滴于保鲜膜上。将洗好的膜，让它滴干多余的洗液，覆盖于显色底物上，反应5min。

2、用滤纸吸掉膜上的底物明流。

(九)曝光显影——暗光下操作

1、将膜用适当大小的保鲜膜包好，压上X光片,曝光，计时；

2、将显影液，定影液分别倒入浅的托盘中

3、取出X光片，放入显影液5min

4、自来水迅速冲洗

5、立即放入定影液5min

6、大量自来水冲洗

7、悬挂晾干

显影后，依据蛋白MARKER相比，检测到有Gal-pHAC181-EsALF目的蛋白表达(20KD)的则为成功构建的酿酒酵母EsALF免疫蛋白工程菌株。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (9)

1.一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述基因工程菌的构建方法是将中华绒螯蟹抗脂多糖因子EsALF的cDNA克隆至表达质粒pHAC181上得到测序验证正确的重组质粒pHAC181-EsALF，然后设计同源重组引物，利用同源重组技术将目的基因EsALF整合至酿酒酵母宿主菌株的GAL1启动子下游。

2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述EsALF的cDNA的CDS区域翻译后的氨基酸序列如SEQIDNO.2所示。

3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述EsALF的cDNA的CDS区域的核苷酸序列如SEQIDNO.1所示。

4.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述pHAC181是在YCplac181的SphI和EcoRV位点插入3个组氨酸标签得到的。

5.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌，其特征在于，所述酿酒酵母工程菌是按照如下方法构建得到的：(1)以中华绒螯蟹组织的cDNA为模板PCR扩增或者直接化学合成，得到核苷酸序列如SEQIDNO.1所示的EsALF基因片段；(2)将EsALF基因片段克隆到表达质粒pHAC181上，得到重组表达质粒pHAC181-EsALF；(3)设计同源重组引物，对质粒pHAC181-EsALF进行扩增，得到含有EsALF基因的核苷酸片段，使用同源重组的方法，将该核苷酸片段整合至酿酒酵母菌株中GAL1启动子下游。

6.一种高效表达中华绒螯蟹抗脂多糖因子的方法，其特征在于，所述方法是使用权利要1-5任一所述酿酒酵母工程菌为生产菌株。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述方法是将酿酒酵母工程菌活化后，接种于YPG培养基中，在半乳糖的诱导下培养6h；所述YPG培养基含有D-半乳糖20g/L、蛋白胨20g/L、酵母提取物10g/L。

8.权利要求1-5任一所述酿酒酵母工程菌生产得到的抗脂多糖因子。

9.权利要求1-5任一所述酿酒酵母工程菌在水产养殖或水产免疫饲料添加剂方面的应用。