CN100485036C - 一种中国明对虾抗菌蛋白基因及重组表达和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种中国明对虾抗菌蛋白基因及重组表达和应用。它具有序列表中SEQID No.1碱基序列及SEQ ID No.2所示的氨基酸序列；筛选出了利用原核表达系统进行体外重组表达抗菌蛋白的载体pCRT7/NT TOPOTA及宿主菌BL21(DE3)pLysS，可以高效表达重组蛋白；针对重组蛋白含有多个二硫键的特征，在分离纯化及重组蛋白复性过程中使用了由氧化型谷胱甘肽与还原型谷胱甘肽组成的氧化还原体系，获得了有抗菌活性的重组蛋白。本发明可以实现该蛋白的高效表达及重组蛋白的复性，经对其生物学功能进行体外验证，证实该重组蛋白对革兰氏阳性菌的生长具有很强的抑制作用，对革兰氏阴性菌也有一定的抑制作用。
Description
技术领域
本发明涉及基因工程领域中抗菌蛋白(crustin)基因的表达，具体地说是一种中国明对虾抗菌蛋白基因及重组表达和应用。
背景技术
对虾养殖是海水养殖的支柱产业之一，随着市场对优质水产品需求量的不断增长，虾类养殖在水产养殖中占据越来越重要的地位。二十世纪九十年代以来，疾病的大规模爆发使海水养殖业蒙受了巨大的损失，抗生素的滥用与环境的恶化使得海水养殖动物的病害难以从根本上得到控制。
海水养殖品种生活于富含各种微生物的水环境中，长期的环境压力使其形成了有效的防御功能。抗菌肽(蛋白)被认为是鱼、虾、贝等防御系统的主要成分之一。通过研究海水养殖品种的抗菌肽基因的结构和功能，进而通过基因工程技术在体外进行重组表达，将有希望成为能够替代抗生素的新型药物。
免疫防御体系是动物病力的基础，特别是低等无脊椎动物，它们的免疫反应要比高等动物简单得多，主要依赖于内源的非特异性免疫反应。近几年的研究表明，低等无脊椎动物在保护自身免受外源有害微生物(如细菌、真菌或病毒)伤害时，其机体中的非特异性抗菌因子如抗菌肽(蛋白)、溶菌酶、转铁蛋白等起到非常重要的作用。其中，抗菌肽(蛋白)是由动物和植物细胞特定基因编产生的一类小分子多肽(蛋白)，具有抗菌活性。20世纪70年代中期，瑞典科学家Boman等在用E.coli诱导惜古比天蚕(Hyatophora cecropia)时分离得到了世界上第一种抗菌肽一天蚕素(cecropin)。此后，人们相继在其它昆虫、两栖动物、哺乳动物、人、植物、甲壳动物、软体动物等生物体内都发现存在类似具有抗菌活性的多肽(蛋白)。crustin是最早由Relf等从滨蟹(Carcinusmaenas)体内分离纯化得到的一种具有很强抑制革兰氏阳性菌活性的小分子蛋白，其自身不易失活，甚至在被煮沸后仍能保持很高活性(J.M.Relf，J.R.S.Chisholm，G.D.Kemp and V.J.Smith，Purification and characterization of acysteine-rich 11.5-kDa antibacterial protein from the granular haemocytes ofthe shore crab，Carcinus maenas Eur.J.Biochem.1999；264(2)：350-357)。此后，人们先后从凡纳滨对虾、白滨对虾、日本囊对虾和斑节对虾等虾类中发现了crustin或抗菌蛋白类似物(crustin-like)基因的存在。
crustin的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生耐药性。目前，许多病原菌对现有抗生素逐步产生耐药性，而新型抗生素的发现又极其困难，因此，crustin的研究为开发新型抗菌药物开辟了广阔的前景。
总之，crustin以及其他型抗菌肽(蛋白)的研究不仅具有重要的理论意义，在实践上也具有巨大的应用潜力，因此，它已成为当前生物医药研究的热点之一。
发明内容
目的在于提供一种中国明对虾抗菌蛋白基因及其高效重组表达和应用。
本发明技术方案如下：
中国明对虾抗菌蛋白基因：具有特列表SEQ ID No.1中的碱基序列及SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。
所述中国明对虾抗菌蛋白基因的重组表达：从中国明对虾cDNA文库中克隆到一种抗菌蛋白基因，利用其成熟肽基因构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达中国明对虾抗菌蛋白基因的重组表达体系，获得含二硫键的原核表达重组蛋白高效复性的缓冲液系统，从而获得有活性的重组抗菌蛋白；具体为：
1.基因克隆
根据中国明对虾EST的能提示，利用RACE技术，从血细胞cDNA文库中克隆目的基因；
2.重组表达载体及宿主菌的选择
确定以包含体形式进行重组表达的表达载体
T7/NT 
TA及能够缓解目的基因表达产物毒性的宿主菌BL21(DE3)pLysS；
3.重组表达载体的构建
利用表达载体为T载体的特征，采用一对特异性引物克隆成熟肽基因，PCR产物回收后直接与表达进行连接，构建重组表达载体；
4.转化与筛选
将构建得到的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，筛选工程菌并进行诱导表达；
5.表达产物的分离纯化
采用诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达工程菌，超声波破碎细胞，利用金属螯合柱层析的方法纯化抗菌蛋白，蛋白复性，融合标签切除，获得有活性的重组抗菌蛋白；
所述蛋白复性采用含二硫键的原核表达重组蛋白高效复性的缓冲液系统，在复性缓冲溶液中添加氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽；其浓度比：复性缓冲溶液(PBS)：氧化型谷胱甘肽：还原型谷胱甘肽＝50：1：10；复性缓冲溶液pH值为7.2~7.4；
所述一对特异性引物为：
CD-F：5’CAG AAT AAA GAC GAT ACT CG 3’；
CD-R：5’CTA TCC CTC AGA ACC CAG 3’。
所述中国明对虾抗菌蛋白基因对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的生长均具有抑制作用。
本发明有如下优点：
1.本发明确定了一种中国明对虾抗菌蛋白基因的全部编码序列和非编码序列，从而也弄清了它所编码的氨基酸序及其信号肽切割位点，利用所推导的成熟肽氨基酸序列对该基因进行重组表达。
2.本发明筛选出能有效地进行抗菌蛋白重组表达的载体及宿主菌，对研究其他具有抗菌功能蛋白的重组表达提供了依据。
3.本发明对含有二硫键的重组蛋白的分离纯化及蛋白质复性提供了一个合适的氧化还原体系，可以有效的保证重组蛋白中二硫键的正确形成。
4.意义深远。通过本发明可开发有效的对虾细菌性疾病的防治药物。同时，对其他具有抗菌活性蛋白的重组表达及易于氧化的重组蛋白的分离纯化的研究提供了新的思路。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例
一种克隆的中国明对虾抗菌蛋白基因，具有如下序列：
(1)SEQ ID No 1的信息(参见序列表)
(a)序列特征：
*长度：523碱基对
*类型：核酸
*链型：双链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：cDNA
(c)假设：否
(d)反义：否
(e)最初来源：中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)
序列描述：SEQ ID No.1
GAGTCCGTTCATCGCACAGCCGAGAGAAACACTATCAAGATGTTGAAGTTTGTAGTATTATCCGTTGTCGCCGTG
GCTGTGGTACACGCCCAGAATAAAGACGATACTCGCTTCCTTGGCGGAGTTCCTGGGGTTGGGGGTGGCTTCGTT
CCAGGGGTTCCTGGGCATGGCGGCGTTGCTCCTGTAGGCGGTGGCCTTGTCCCTGGCGGCGGTGCCTTATCCCT
GGAGGTGGATTCGAGTGCAATTACTGCAGAACGAGGTACGGATACGTATGCTGCAAGCCCGGCAGGTGTCCACCG
GTTCGCGACGTCTGCCCAGGCCTCAGGCAGGCAGGCTGTCCCGATCTGCCGTCAGGACACCGACTGTCGGCTCCGAC
AAATGCTGCTACGACGTCTGCTTGAACGACACCGTCTGCAAACCCATCGTGCTGGGTTCTGAGGGATAGGCCTGC
ATGTTTAACCCTTCAATTCTACTTTATTAAATAAATACTATAACTGTTAATTGCTTAAAAAAAAAAAAAAAAA
(2)SEQ ID No.2的信息(参见序列表)
(a)序列特征
*长度：134氨基酸
*类型：氨基酸
*链型：单链
*拓扑结构：线性
(b)分子类型：蛋白
序列描述：SEQ ID No.2
MLKFVVLSVVAVAVVHAQNKDDTRFLGGVPGVGGGFVPGVPGHGGVAPVGGGLVPGGGGLIPGGGFECN
YCRTRYGYVCCKPGRCPPVRDVCPGLRQGVPICRQDTDCFGSDKCCYDVCLNDTVCKPIVLGSEG
中国明对虾基因的体外重组表达、分离纯化及生物活性分析：
从中国明对虾cDNA文库中筛选到一种抗菌蛋白(crustin)基因，利用其成熟肽基因构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达中国明对虾抗菌蛋白基因的重组表达体系，找到了一种用于含二硫键的原核表达重组蛋白高效复性的缓冲液系统，获得了有活性的重组抗菌蛋白。具体如下：
1)基因克隆
根据中国明对虾EST的提示，利用RACE技术，从血细胞cDNA文库中克隆目的基因；
2)重组表达载体及宿主菌的选择
由于目的基因的重组表达产物具有较强的抑菌活性，本发明对目前几种商业化的表达载体及宿主菌进行筛选，并确定了以包含体形式进行重组表达的载体
T7/NT
TA及能够缓解目的基因表达产物毒性的宿主菌BL21(DE3)pLysS。
所述重组表达体系可以高效地表达抗菌蛋白，表达效率达845mg/L。
3)重组表达载体的构建
利用表达载体为T载体的特征，设计一对特异性引物(CD-F：5’CAG AAT AAA GACGAT ACT CG 3’；CD-R：5’CTA TCC CTC AGA ACC CAG 3’)克隆成熟肽基因，PCR产物回收后直接与表达进行连接，构建重组表达载体。
4)诱导表达及诱导产物的筛选
将重组表达载体转化表达宿主菌BL21(DE3)pLysS，在终浓度为100μg/mL的氨苄青霉素与34μg/mL氯霉素的LB培养基中培养菌体浓度至0D600为0.6左右(37℃，250r/min)，添加终浓度为1mmol/L IPTG进行诱导表达4h；然后采用诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(简称IPTG)筛选诱导表达工程菌。
5)分离纯化
诱导结束后，超声波破碎细胞，利用金属螯合柱层析的方法纯化抗菌蛋白，蛋白复性具体是：离心收集菌泥，称量湿重，按1∶10加入buffer A(50mmol/L磷酸钠，6mol/L盐酸胍，300mmol/L氯化钠，1mmol/L氧化型谷胱甘肽，10mmol/L还原型谷胱甘肽，pH7.2)，超声波破碎，4℃，12,000r/min下离心30min，收集上清。利用Co-NTA-Agarose在变性条件下进行分离纯化。分离纯化后的重组蛋白，依次在含有8mol/L、4mol/L、2mol/L、1mol/L及0.5mol/L尿素的50mmol/L PBS缓冲液(1mmol/L氧化型谷胱甘肽，10mmol/L还原型谷胱甘肽，pH7.4)中透析各8h，将裂解液中的盐酸胍替换出来，在50mmol/L pH7.4 PBS缓冲液平衡的Sephadex G-75层析柱去除尿素，收集洗脱液。
6)酶切去除融合标签
将洗脱液的蛋白浓度稀释至2mg/mL，利用Invitrogen公司的EKMaxTM试剂盒进行融合标签的切除(25℃，24h)。
7)抑菌实验
将去除融合标签后的蛋白浓缩至64μmol/L，同时以50mmol/L pH7.4的PBS为阴性对照。利用牛津杯琼脂扩散法检测其对革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureu)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)与革兰氏阴性菌大肠杆菌(Escherichia coli)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)的抑菌活性。即：将待检测菌株分别于37℃，200r/min下培养过夜；次日离心菌体并用灭菌的50mmol/L pH7.4的PBS洗涤菌体2次，并利用PBS稀释菌体至106cells/mL，取100μl均匀涂布于LB平板表面，于37℃培养箱中培养2h后，取出平板在琼脂表面等距离放置牛津杯，向牛津杯中添加不同浓度梯度的重组蛋白，同时以PBS作为阴性对照，37℃培养箱中继续培养22h，取出观察结果。
结果表明4μmol/L的重组蛋白能有效地抑制所检测的革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌与藤黄微球菌)的生长，16μmol/L的重组蛋白能有效地抑制所检测的革兰氏阴性菌(大肠杆菌与鳗弧菌)的生长。
该基因的成功克隆与重组蛋白生物活性的鉴定，在新型抗菌药物的开发上具有重要应用前景。
序列表
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院海洋研究所
<120>一种中国明对虾抗菌蛋白基因及重组表达和应用
<130>
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>523
<212>DNA
<213>中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)
<220>
<221>ORF
<222> (40)..(444)
<223>
<400>1
<210>2
<211>134
<212>PRT
<213>中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)
<400>2
Claims (5)
1.一种中国明对虾抗菌蛋白基因，其特征在于该基因的碱基序列是序列表中的SEQ ID No.1。
2.按权利要求1所述基因编码的中国明对虾抗菌蛋白，其特征在于该蛋白的氨基酸序列是序列表中的SEQ ID No.2。
3.一种重组表达按照权利要求1所述的中国明对虾抗菌蛋白基因的方法，其特征在于：从中国明对虾cDNA文库中克隆到一种抗菌蛋白基因，利用其成熟肽基因构建原核表达载体，筛选出一种用于高效表达中国明对虾抗菌蛋白基因的重组表达体系，获得含二硫键的原核表达重组蛋白高效复性的缓冲液系统，从而获得有活性的重组抗菌蛋白；具体为：
1)基因克隆：根据中国明对虾EST的提示，利用RACE技术，从血细胞cDNA文库中克隆目的基因；
2)重组表达载体及宿主菌的选择：确定以包含体形式进行重组表达的表达载体
T7/NT 
TA及能够缓解目的基因表达产物毒性的宿主菌BL21(DE3)pLysS；
3)重组表达载体的构建：利用表达载体为T载体的特征，采用一对特异性引物克隆成熟肽基因，PCR产物回收后直接与表达进行连接，构建重组表达载体；
4)转化与筛选：将构建得到的重组表达载体转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS，筛选工程菌并进行诱导表达；
5)表达产物的分离纯化：采用诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导表达工程菌，超声波破碎细胞，利用金属螯合柱层析的方法纯化抗菌蛋白，蛋白复性，融合标签切除，获得有活性的重组抗菌蛋白。
4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述蛋白复性采用含二硫键的原核表达重组蛋白高效复性的缓冲液系统，缓冲液系统为在PBS复性缓冲溶液中添加氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽；缓冲液系统中PBS、氧化型谷胱甘肽和还原型谷胱甘肽浓度比为50:1:10；PBS复性缓冲溶液pH值为7.2-7.4，浓度为50mmol/L。
5.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：所述一对特异性引物为：
CD-F：5’ CAG AAT AAA GAC GAT ACT CG3’；
CD-R：5’ CTA TCC CTC AGA ACC CAG3’。
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