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CN103724412A - 中国明对虾抗脂多糖因子及其制备和应用 - Google Patents

中国明对虾抗脂多糖因子及其制备和应用 Download PDF

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CN103724412A CN201310456658.9A CN201310456658A CN103724412A CN 103724412 A CN103724412 A CN 103724412A CN 201310456658 A CN201310456658 A CN 201310456658A CN 103724412 A CN103724412 A CN 103724412A
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张继泉
桂天书
王婧
相建海
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Abstract

本发明涉及基因工程，尤其是涉及一种中国明对虾抗脂多糖因子及其制备和应用。中国明对虾抗脂多糖因子FcALF基因为(a)由SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示的蛋白质，或者(b)在（a）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由（a）衍生的蛋白质。本发明选取毕赤酵母作为真核表达系统，对中国明对虾抗脂多糖因子（FcALF）进行重组表达。同时分析了其抗菌活性，为抗菌药物与免疫增强剂筛选提供了指导。具体的说本发明中国明对虾抗脂多糖因子重组蛋白对革兰氏阴性菌大肠杆菌具有明显抑制生长作用和杀菌作用。

Description

中国明对虾抗脂多糖因子及其制备和应用
技术领域
本发明涉及基因工程，尤其是涉及一种中国明对虾抗脂多糖因子及其制备和应用。
背景技术
进入21世纪，水产养殖业向多品种、高投入、高密度、集约式、工厂化的方向快速发展，但频繁暴发的传染性病害时刻威胁着该产业的健康可持续性发展。目前，水产养殖生物病害防治主要方法有药物防治、免疫防治和生态防治等，并逐步向高效、低毒、无残留和无公害的方向发展。而化学药物仍是目前水产动物病害防治最直接和最有效的一种手段。我国渔药产业基础薄弱、水产养殖生物病害防治技术滞后与养殖户用药知识匮乏等因素，导致大部分养殖户使用价格低廉、残留严重的农药及化工原料，造成了水体的严重污染。此外，抗生素、激素类等药物在水产养殖过程中的应用，虽然对病害控制起到一定作用，但在很大程度上破坏了水环境及动物体内的微生态平衡，使水产动物失去了正常的菌群屏障及生物拮抗作用，进而导致外源性效应菌和内源性致病菌大量增殖，由此造成了潜在的更大病害。滥用药物将导致致病菌株产生耐药性，变异出致病性更强、危害性更大、流行性更广的致病微生物,长期使用化学药品势必导致病原生物抗药性的增加。随着科技的发展和人类经济文化水平的提高，人们对食品安全和环境安全提出了更高的要求，化学药物正逐渐被生物制品所替代。
作为一种无脊椎动物，中国明对虾依靠其仅有的先天免疫系统实现对外界病原微生物的免疫。中国明对虾在海水这一复杂微生物环境中的正常生长、繁殖，说明其免疫系统能够有效抵御外界病原微生物的侵袭。抗脂多糖因子（anti-lipopolysaccharide factor，ALF）是一种脂多糖结合蛋白，是鲎、蟹虾类等甲壳动物体内中广泛存在的一类抗菌肽，通过结合脂多糖，调节细胞的脱颗粒作用，引起一系列级联反应，从而在甲壳动物的体液免疫中发挥着重要作用。在前期研究中，申请人所在项目组从中国明对虾血细胞中克隆到ALF全长cDNA序列（FcALF），研究发现在鳗弧菌等病原刺激下，FcALF在mRNA水平上的表达发生剧烈变化，提示FcALF在对虾应对外界病原感染过程中，发挥着重要作用（Liu,FS,等，MarineBiotechnology，2005,7（6）:600-608）。
发明内容
本发明目的在于提供一种中国明对虾抗脂多糖因子及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种中国明对虾抗脂多糖因子FcALF，中国明对虾抗脂多糖因子FcALF基因为
(a)由SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示的蛋白质，或者
(b)在（a）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由（a）衍生的蛋白质。
中国明对虾抗脂多糖因子FcALF重组蛋白的制备方法：
(a)构建中国明对虾抗脂多糖因子重组表达载体pPIC9k-FcALF；
(b)将步骤（a）所得重组表达载体经线性化后导入宿主细胞，结合抗生素G418和PCR的方法进行阳性克隆的筛选，并对获得的阳性克隆进行诱导表达，获得表达产物；
(c)分离纯化步骤（b）所得的表达产物，即获得重组的SEQ ID NO.1序列所示氨基酸的蛋白（即rFcALF）或SEQ ID NO.1序列所示的氨基酸中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由SEQID NO.1中氨基酸序列所示的衍生的蛋白质。
所述步骤（b）中宿主细胞为毕赤酵母。
中国明对虾抗脂多糖因子FcALF的应用：所述中国明对虾抗脂多糖因子FcALF可用于制备广谱抗菌类药物。
所述中国明对虾抗脂多糖因子FcALF可用于制备革兰氏阴性菌的抗菌类药物。
所述中国明对虾抗脂多糖因子FcALF可用于制备免疫增强剂、保健品或饲料添加剂。
本发明所具有的优点：本发明选取毕赤酵母作为真核表达系统，对中国明对虾抗脂多糖因子（FcALF）进行重组表达。同时分析了其抗菌活性，为抗菌药物与免疫增强剂筛选提供了指导。具体的说本发明中国明对虾抗脂多糖因子重组蛋白对革兰氏阴性菌大肠杆菌具有明显抑制生长作用和杀菌作用。本发明重组蛋白对大肠杆菌具有很强的抑制生长作用，最小抑制浓度为3.12μg/mL。
附图说明
图1为Sal I限制性酶切重组表达载体pPIC9k-FcALF与pPIC9k的实验结果。其中，M为DNA Marker；1为pPIC9k-FcALF经Sal I酶切结果；2为质粒pPIC9k-FcALF；3为pPIC9k经Sal I酶切结果；4为质粒pPIC9k。
图2为本发明实施例提供的诱导表达的重组蛋白rFcALF阳离子交换层析色谱图。其中，图中曲线1表示蛋白纯化过程中280nm下的紫外检测结果；图中曲线2表示蛋白纯化过程中电导率的变化规律；图中曲线3表示梯度洗脱过程中NaCl的浓度变化趋势。图中曲线1明显的吸收峰即为通过NaCl洗脱得到的rFcALF。
图3为本发明实施例提供的重组表达rFcALF分离纯化样品的16.5%的Tricine-SDS-PAGE分析结果图，其中M：蛋白标准分子量；1：阳离子交换上样前产物；2：NaCl洗脱峰上升阶段收集液；3：NaCl洗脱峰的收集液。
图4为重组蛋白rFcALF质谱鉴定结果图。
图5为本发明实施例提供的6个多拷贝克隆进行甲醇诱导表达后发酵上清液的SDS-PAGE分析结果图，其中M：蛋白标准分子量；1-6为6个多拷贝克隆。
图6为阳离子交换层析后的蛋白脱盐结果。
图7为用牛津杯法对重组蛋白rFcALF进行抗菌活性检测结果。G(-)为E.coli，其FcALF检测浓度为1mg/L；G(+）为Staphylococcus aureus，其rFcALF检测浓度50mg/L；C：20mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为对照组。
图8为不同浓度rFcALF对大肠杆菌生长的影响。其中20mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为对照组。
具体实施方式
下面的实施例中将对本发明作进一步的阐述，但本发明不限于此。
本发明采用的技术方案包括以下步骤：
1)构建中国明对虾抗脂多糖因子重组表达载体；
2)将步骤1)所得重组表达载体经Sal I线性化后，导入酵母宿主细胞，经阳性克隆筛选后，将宿主细胞进行诱导表达，获得表达产物；
3)分离纯化步骤2)所得到的重组蛋白，即中国明对虾抗脂多糖因子。
在步骤1)中，所述表达载体可选用pPIC9k、pPIC9、pPIC3.5K等。
在步骤2)中，所述宿主细胞可选用毕赤酵母KM71、GS115等。
在步骤3)中，所述分离纯化方法可为离子交换层析。
实施例1：
中国明对虾抗脂多糖因子成熟肽FcALF，如SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示，
QGWEAVAAAVAVKIVGLWRNEKTELLGHECKFTVKPYIKRFQLYYKGRMWCPGWTAIRGEAKTRSRSGVAGRTAKDFVRKAFQQGLISQQQANQWLNS
该基因的核苷酸序列如SEQ No.2所示，其5′端和3′端分别具有起始密码子（ATG）和终止密码子（TAG）。
ATGCGAGTTTCCGTGTTGGCAAGCCTGGTGCTGGTGGTGTCCCTGGTGGCACTCTTCGCCCCGCAGTGCCAGGCTCAAGGGTGGGAGGCTGTGGCAGCGGCCGTCGCCGTCAAGATTGTTGGGCTGTGGAGGAACGAGAAAACCGAACTCCTCGGCCACGAGTGCAAGTTCACCGTCAAGCCTTACATTAAGAGGTTCCAGTTGTACTACAAGGGGAGGATGTGGTGCCCAGGCTGGACGGCCATCAGAGGAGAAGCCAAAACACGCAGTCGGTCCGGGGTGGCTGGAAGGACAGCCAAAGACTTCGTCCGGAAAGCTTTCCAGCAAGGTCTCATCTCTCAACAGCAGGCTAACCAGTGGCTTAACTCATAG
（a）序列特征：
●长度：372bp，其中有效长度76-369bp
●类型：碱基序列
●链型：单链
●拓扑结构：线性
（b）分子类型：双链DNA
（c）假设：否
（d）反义：否
（e）最初来源：中国明对虾
（f）特异性名称：gene
实施例2
1）中国明对虾抗脂多糖因子FcALF重组表达载体的构建
依据中国明对虾ALF的cDNA序列（NCBI序列注册号：AY859500）编码成熟肽的序列信息和分泌型表达载体pPIC9k的多克隆位点特征，设计引物，上游引物PRI-A1含EcoR I酶切位点；下游引物PRI-A2含Not I酶切位点。
PRI-A1：
GCGAATTCCAAGGGTGGGAGGCTGTGGCA（下划线为EcoR I酶切位点）
PRI-A2：
TAG+GGCCGCCTATGAGTTAAGCCACTGG（下划线为Not I酶切位点）
PCR反应体系为20ul，如下：
Ex Taq buffer         2μl
dNTPs（10mM）         0.4μl
PRI-A1(10μM)         0.4μl
PRI-A2(10μM)         0.4μl
Ex Taq                0.2μl
中国明对虾血细胞cDNA  1μl
ddH2O                 15.6μl
PCR扩增程序：94℃预变性4min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。
将PCR产物利用琼脂糖凝胶纯化试剂盒回收，回收的PCR产物连接pMD19-T载体（按照使用说明书进行），16℃连接60min。将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，以M13-F/M13-R为引物对，利用PCR方法对LB平板上的单克隆进行检测，将PCR检测阳性克隆摇菌后进行DNA测序，由此筛选到重组质粒pMD19-FcALF（参见图1）。
然后从测定结果为阳性的克隆中抽提质粒pMD19-FcALF，并用EcoR I和Not I双酶切，回收的目的片段，与用EcoR I和Not I双酶切的pPIC9k片段，利用T4DNA连接酶在16℃连接过夜，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布含有100μg/mL氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养过夜，以5′AOX1/3′AOX1为引物对，利用PCR方法对LB平板上的单克隆进行检测，将PCR检测阳性克隆摇菌后进行DNA测序，从而构建酵母重组表达质粒pPIC9k-FcALF。
2）重组质粒pPIC9k-FcALF转化至毕赤酵母KM71
用Sal I将重组载体pPIC9k-FcALF酶切，进行质粒线性化处理，回收线性化质粒，利用PEG1000的方法将其转化至毕赤酵母KM71感受态中，用菌落PCR的方法筛选阳性克隆，并利用抗生素G418浓度梯度筛选高拷贝的阳性克隆，具体方法参考Invitrogen公司的说明书进行（Multi-CopyPichia Expression Kit，Version F），进而挑选6个多拷贝的克隆进行甲醇诱导表达实验，将诱导表达4天后的样品，各取1mL离心（8000r/min,10min），各取100uL然后加20uL6×SDS上样缓冲液后进行15%SDS-PAGE检验FcALF重组蛋白的表达情况，由图5可以看出，所选的6个克隆中2-4号克隆的表达量相对比较高，而3号表达量在同样条件下相对最高，选择将其用来进行放大实验，同时该重组菌株命名为FcALF-60。
3）阳离子交换层析纯化目的蛋白重组FcALF
（1）将上述筛选到的表达量最高的工程菌株（FcALF-60）进行大量诱导表达后，4℃，10000r/min离心15min，取上清液。
（2）利用5M NaOH溶液将获得的上清液调节至pH7.0。
（3）利用50mM的pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液平衡阳离子柱（HITRAP Q FF,5mL）5个柱体积。
（4）将上述获得的上清液上柱。
（5）利用50mM的pH7.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲溶液平衡5个柱体积。
（6）利用NaCl溶液（NaCl浓度为0-1.0M）进行梯度洗脱，收集在400mMNaCl洗脱的组分，即为纯化后的蛋白重组FcALF（即rFcALF）（参见图2），其中蛋白洗脱的检测采用280nM下的紫外检测器进行。
将上述收集洗脱峰，经16.5%的Tricine-SDS-PAGE电泳分析（参见图3），由图3可知，重组蛋白的分子量在11.5kD左右，将图3所示分离纯化的蛋白斑点切下，利用LC-ESI-MS/MS进行蛋白鉴定，鉴定方法参考文献（Zhang Jiquan等，Journal of Biotechnology,2006，125(2):173-184）。利用Bioworks软件与SEQUEST数据库进行比对后发现1个肽段（TAEDFVR）与重组的中国明对虾ALF蛋白完全匹配（表1和图4）。
表1质谱鉴定肽段信息
Scan(s Sequence MH+ Charg XC Delta Sp RS Ions
ALF 20.06 2(2000)
2411 -.TAEDFVR 837.9 2 1.2 0.00 441 1 2/3
2447 -.TAEDFVR. 837.9 2 1.2 0.00 299 1 2/3
4）重组蛋白脱盐
将阳离子交换层析纯化的含有重组FcALF目的蛋白的组分，利用HiPrep26/10脱盐柱在AKTA avant25上进行脱盐，脱盐结果如图6所示，由图6可以看出，目的蛋白和盐得到充分分离。
纯化后的重组FcALF蛋白经冷冻干燥机冻干，保存。取1mg冻干蛋白溶于1mL20mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液中，配制1g/L的重组蛋白母液。然后利用20mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液稀释成浓度为50mg/L的重组蛋白液。
实施例3重组蛋白rFcALF抗菌活性鉴定
（1）牛津杯法检测抑菌圈
将菌体浓度为108cell/mL的大肠杆菌（E.coli）和金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）分别均匀涂布在LB固体平板上，37℃培养箱放置30-60min，待平板表面完全干燥，放置牛津杯，然后向其中分别加入200μL上述纯化50mg/L的重组蛋白液，同时以相同体积20mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液作为阴性对照。然后置于37℃培养箱培养16-18小时观察结果，然后用游标卡尺测量抑菌圈大小（参见图7）,结果显示50mg/L的重组FcALF可以有效的抑制革兰氏阴性菌E.coli的生长。
（2）利用酶标仪测定测抑菌浓度
①挑取单克隆的大肠杆菌，接种至LB液体培养基中，在37℃摇床中培养10分钟；
②取上述50mg/L的重组蛋白液进行抑菌浓度测定；
③将步骤①中的培养的大肠杆菌分装至96孔板中，第一列各孔内加入140μL，其余每列孔中加入75μL；
④对rFcALF蛋白进行成倍稀释：取10μL浓度为50mg/L的重组蛋白液加入第一列的孔内，混匀后吸取75μL加入第二列中，如此依此取液混匀，达到对ALF梯度稀释的效果；对照组同上，仅将rFcALF蛋白换为等体积的20mM pH7.2的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液；
⑤梯度稀释完成后，在酶标仪内测定600nm时的起始吸光度，然后于37℃摇床中培养；过夜培养后，统计实验所得数据，分析其抑菌效果（参见图8）。
以重组蛋白rFcALF最小浓度抑制菌生长的浓度定义为此菌的最小抑菌浓度，结果如图8所示，随着重组蛋白rFcALF浓度的降低，抑菌活性逐渐减弱，重组蛋白rFcALF对大肠杆菌具有抑制生长作用，且最小抑制浓度为3.12μg/mL。
Figure IDA0000389755710000011
Figure IDA0000389755710000021

Claims (6)

1.一种中国明对虾抗脂多糖因子FcALF，其特征在于：中国明对虾抗脂多糖因子FcALF为
(a)由SEQ ID NO.1中氨基酸序列所示的蛋白质，或者
(b)在（a）限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由（a）衍生的蛋白质。
2.一种权利要求1所述的中国明对虾抗脂多糖因子FcALF的制备方法，其特征在于：
(a)构建中国明对虾抗脂多糖因子重组表达载体pPIC9k-FcALF；
(b)将步骤（a）所得重组表达载体经线性化后导入宿主细胞，结合抗生素G418和PCR的方法进行阳性克隆的筛选，并对获得的阳性克隆进行诱导表达，获得表达产物；
(c)分离纯化步骤（b）所得的表达产物，即获得重组的SEQ ID NO.1序列所示氨基酸的蛋白（即rFcALF）或SEQ ID NO.1序列所示的氨基酸中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有抗脂多糖因子活性的由SEQID NO.1中氨基酸序列所示的衍生的蛋白质。
3.按权利要求2所述的中国明对虾抗脂多糖因子FcALF的制备方法，其特征在于：所述步骤（b）中宿主细胞为毕赤酵母。
4.一种权利要求1所述的中国明对虾抗脂多糖因子FcALF的应用，其特征在于：所述中国明对虾抗脂多糖因子FcALF可用于制备广谱抗菌类药物。
5.按权利要求4所述的中国明对虾抗脂多糖因子FcALF的应用，其特征在于：所述中国明对虾抗脂多糖因子FcALF可用于制备革兰氏阴性菌的抗菌类药物。
6.一种权利要求1所述的中国明对虾抗脂多糖因子FcALF的应用，其特征在于：所述中国明对虾抗脂多糖因子FcALF可用于制备免疫增强剂、保健品或饲料添加剂。
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