CN101525603B - 固定化α-氨基酸酯水解酶及其制备与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一组以α-氨基酸酯水解酶为基础的非均相生物催化剂及其制备方法与合成氨基β-内酰胺类的用途；该催化剂合成酶活性2200U/g干重，蛋白质含量0.95g/g干重，由红纹黄单孢菌细胞生物量经低温效应，pH梯度下有机溶剂处理提取酶，沉淀酶聚集体，交联等步制得；它作为催化剂可在水中或水与有机溶剂混合介质中通过D-苯甘氨酸甲酯衍生物对β-内酰胺化合物的酰化作用合成氨基青霉素和氨基头孢菌素类药物。

Description

固定化α-氨基酸酯水解酶及其制备与应用

发明领域

本发明涉及酶法合成氨基头孢菌素和氨基青霉素的非均相生物催化剂的制备方法。 

技术背景

α-氨基酸酯水解酶(α-amino acid ester hydrolases，AEHs)是一类酶，它们能催化水解α-氨基酸酯和各种头孢菌素和青霉素的酰胺键，也能经α-氨基酸衍生物(酯或酰胺)对7-氨基头孢烷类和6-氨基青霉烷类进行N-酰化反应。相似的底物特点使得这类酶可用于侧链α-位含氨基的头孢菌素和青霉素类(即氨基头孢菌素类和氨基青霉素类)合成的生物催化剂(biocatalysts)。 

对α-氨基酸酯水解酶结构的研究表明，这类酶属于α/β-折叠水解酶，在活性位点上含有丝氨酸-组氨酸-天冬氨酸(Ser-His-Asp)三元催化组合。α-氨基酸酯水解酶在酶的结构、活性位点的组成、底物特点和催化性能方面均不同于β-内酰胺酰化酶(例如青霉素G酰化酶)。β-内酰胺酰化酶在结构上属于N-末端水解酶，β-链的N-末端是活性位点，在催化时扮演亲核剂的作用。 

关于假单胞菌属(Pseudomonadaceae family)菌种产生α-氨基酸酯水解酶类用于α-氨基β-内酰胺抗生素的合成的描述可参见如下文献：Pat.GB1382255(1975)；Takahashi T.，Kato K.，Yamazaki Y.，et al.Jpn.J.Antibiot Suppl.30S：230(1977)；Willner D.，Crast L.B.Pat.CA1044627(1978)；КocгopдC.Γ.，Beйтлaндy.Пaт.RU2136759(1999)；Geun C.T.Jun P.H Pat.KR20010069097(2001)。几种菌产生的α-氨基酸酯水解酶的生化、理化性质和催化性能如下：混浊醋杆菌(Acetobacter turbidans)参见(Ryu Y.W.，Ryu D.D.Y.Enzyme Microb.Technol.9：339(1987))；柑桔黄单孢菌(Xanthomonas citri)参见(Kato K.，Kawahara K.，Takahashi T.et al.Agric.Biol.Chem.44:1069(1980)；Kato K，Kakinuma A.Agric.Biol.Chem.44：1663(1980))；红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrilineans)参见(Кpecтьянoвa И.H.，Увapoв H.H.，PyдeнcкaЯ Γ.H.и дp.Биoxимия55(12)：2226(1990)；Blinkovsky A.M.，Markaryan A.N.Enzyme Microb.Technol.15:965(1993))；对黑色极毛杆菌(Pseudomonas melanogenum)的研究最为广泛(Kim D.J.，Byun S.M.BBA-Protein Struct.&Molecul.Enzymol.1040(1)：12(1990))。这些酶的亚结构已经得到证明。黑色极毛杆菌(Pseudomonas melanogenum)产生的酶由两个分子量为70000-72000的亚基组成，混浊醋杆菌、柑桔黄单孢菌和红纹黄单胞菌产生的酶则由四个具有类似分子质量的亚基构成。不同来源的α一氨基酸酯水解酶在生化和催化性能上是相似的。已经确定柑桔黄单孢菌和混浊醋杆菌产生的酶的晶体结构以及酶活性位点的组成，并已克隆出酶的基因：柑桔黄单孢菌见[Laan Van Der M.，Polderman-Tijmes JJ.，Barends T.R.M.Int.Pat.Appl.WO02086111(2002)；Barends T.R.M.，Polderman-Tijmes J.J.，Jekel P.A.et al.J.Biol.Chem.278：23076(2003)；Okubo A，Nagaoka T.，Yokota S.et al.Iht.Pat.Appl.WO02086127(2002)]；混浊醋杆菌见[Laan Van Der M.，Polderman-TijmesJ.J.，Barends T.R.M.Int.Pat.Appl.WO02086111(2002)；Polderman-TijmesJ.J.，Jekel PA.，Jeronimus-Stratingh C.M.et al.J.Biol.Chem.277：28474(2002)]。 

利用α-氨基酸酯水解酶进行抗生素酶法合成研究需要创立非均相生物催化剂技术，例如，需解决从细胞生物量中分离酶和制备固定化酶的方法。从α-氨基酸酯水解酶制备生物催化剂由三个主要步骤组成：(1)通过破碎细胞把酶从细胞生物量中分离出来，从水相中提取酶获得无细胞提取物；(2)制成一定纯度的酶样品；(3)把酶固定于载体上。 

破碎含α-氨基酸酯水解酶的细菌细胞的方法如下： 

变压破碎法(French Press)：〔нaпpимep，Blinkovsky A.M.，Markaryan A.N.Enzyme Microb.Technol.15：965(1993)；Hernandez-Justiz O.，Terreni M.，Pagani G.et al.Enzyme Microb.Technol.25：336(1999))；均浆破碎法(Manton-Gaul in)：见[Kim D.J.，Byun S.M.BBA-Protein Struct.&Molecul.Enzymol.1040(1)：12(1990)]。这两种方法都可完全破坏细胞结构，把目标酶从被破坏的细胞生物量中全部提取出来，所制取的无细胞提取物活性收率高(可达到100％)；但是蛋白质和其它水溶性物质也能从被完全破坏了的细胞中进入到水相中，因此获得的无细胞提取物含有很多的杂质，导致酶的比活性低。 

超声波破碎法：在有表面活性物质存在时利用超声波处理菌体来破碎细胞，见[Choi w.G.，Lee S.B.，Ryu D.D.Y.Biotechno1.Bioeng.23(2)：361(1981)]。本法 相当温和，细胞破坏不完全，缺点是酶提取收率有所降低，优点是能得到更高纯度的无细胞提取物。 

溶剂处理破碎法：通过与水不混溶的有机溶剂乙酸丁酯处理微生物菌体来破碎细胞，见[Кpeстья нoвaи.H.，увapовH.H.，РудeнскaяΓ.H.идp.БиoxимиЯ55(12)：2226(1990)；Zaslavskaya P.L.，Chekalina I.V.，Igans D.N.et al.Biotechnol.Appl.Biochem.18：299(1993)]。比较而言，本法选择性好，但酶活收率不高。 

表1.含α-氨基酸酯水解酶的黄单孢菌(Xanthomonas)类菌体破碎方法比较 

用不同破碎方法从黄单孢菌族(Xanthomonas family)细胞中提取α-氨基酸酯水解酶的比较见前述表1。无细胞提取物的酶活力采用与毫克蛋白重量相关的国际单位U来表示(国际单位(U)是指在选定条件下，1分钟内催化转化1μmole的底物或形成1μmole产物所需的酶量)。各例中，酶活性值为头孢氨苄合成试验中水解酶活性和合成酶活性的比值。 

文献报道，可从不同微生物的α-氨基酸酯水解酶的水溶性形式获得高纯度的酶样品，甚至可达到单一蛋白质，其制备方法参见[Ryu Y.w.，Ryu D.D.Y.Enzyme Microb.Technol.9：339(1987)；Kim D.J.，Byun S.M.BBA-Protein Struct.&Molecul.Enzymol.1040(1)：12(1990)；Кpeстъяновaи.H.，увapовH.H.，РудeнскaяΓ.H.идp.Биoxимия55(12)：2226(1990)；Blinkovsky A.M.，Markaryan A.N.Enzyme Microb.Technol.15：965(1993)]。这 些方法需使用不同吸附剂连续多次对酶进行层析纯化，整个提取劳动强度大，延续时间长，酶活较低，因此并不适用于工业制备。 

以下是非均相生物催化剂若干已知的制备方法：自混浊醋杆菌(Acetobacter turbidans)细胞生物量分离α-氨基酸酯水解酶，经部分纯化，再行固定化，从而制得非均相生物催化剂。α-氨基酸酯水解酶的分离步骤是：在压力下破坏菌体，酶提取进入水相，用链霉素处理水提取物使其部分纯化，接着进行透析，参见[Hernandez-Justiz O.，Terreni M.，Pagani G.etal.Enzyme Microb.Technol.25：336(1999)]。就流程的活性收率来讲，这一方法并无特色。所得到的初步纯化的α-氨基酸酯水解酶制剂比活性很低，其水解苄青霉素的比活性仅为0.06U/mg蛋白。部分纯化酶以戊二醛改性琼脂糖共价固定化，参见[Hemandez-Justiz O.，Terreni M.，Pagani G.et al.Enzyme Microb.Technol.25：336(1999)]。一个改进的固定化方法是用葡聚糖对固定在琼脂糖上的酶做进一步的修饰，参见[Fernandez-Lafuente R.，Hernandez-Justiz O.，Mateo C.et al.J.Mol.Catal.B:Enzym.11：633(2001)]。这样的固定化过程工作量大，并且还需要制备专用的载体。上述方法从固定化操作程序的活性收率以及就合成某种抗生素的绝对活性(合成酶活性)来讲，并无什么特别之处。此外，将来自混浊醋杆菌(Acetobacter turbidans)纯度更高的α-氨基酸酯水解酶用琼脂糖以共价固定化，再用葡聚糖进行固定化的方法也是已知的，见[Fernandez-Lafuente R.，Hernandez-Justiz O.，Mateo C.et al..Biomacro-molecules2(1):95(2001)]。相对于D-苯甘氨酸甲酯(methyl ester D-phenyl glicine，MEPhGl)的水解，水粗提取物酶活性仅为0.1U/mg蛋白，需要用CM-52和苯基琼脂糖进行两个步骤的层析纯化，相对于粗取物的纯化收率为62％，但生物量的总收率不详。通过以上步骤，α-氨基酸酯水解酶纯度与粗提物比较提高了420倍，比活性可达到42U/mg蛋白。但该法工作量大，效率不高，从活性收率和产品的合成酶活来看，此法并无特色。以上制取生物催化剂的已知方法需在固定化之前对酶进行深度的纯化程序，固定化过程复杂，需经历多个步骤，是劳动密集型的，效率低下。 

本发明方法制备的非均相生物催化剂源自黄单孢菌族(Xanthomonas generation)菌胞内α-氨基酸酯水解酶，与此最接近的文献制备方法则基于同族的柑桔黄单孢菌(Xanthomonas citri)产生的酶[Choi w.G.，Lee S.B.，Ryu D.D.Y.Biotechnol.Bioeng.23(2)：361(1981)]。这个类似于本发明的文献原型给出了一个从细胞生物量开始到非均相生物催化剂制备的完整操作程序(图1)。 

固定在高岭土上的柑桔黄单孢菌(Xanthomonas citri)α-氨基酸酯水解酶是非均相生物催化剂，其制备方法参见[Choi w.G.，Lee s.B.，Ryu D.D.Y.Biotechnol.Bioeng。23(2)：361(1981)]，以此作为相对于本发明制备方法的原型。该原型中基于黄单孢菌族(Xanthomonas generation)菌胞内α-氨基酸酯水解酶的生物催化剂的蛋白含量不大于0.8g/g(干重)，合成酶活性仅为510U/g(干重)。 

在来自柑桔黄单孢菌(Xanthomonas citri)α-氨基酸酯水解酶的生物催化剂影响下利用D-苯甘氨酸甲酯酰化7-氨基去乙酰氧基头孢菌素酸(7-ADCA)可合成头孢氨苄[Choi W.G.，Lee S.B.，Ryu D.D.Y.Biotechnol.Bioeng.23(2)：361(1981)]。把此法作为本发明酶合成氨基头孢菌素和氨基青霉素用途的原型。 

制备非均相生物催化剂的原型方法由以下几点构成：含头孢氨苄合成酶的细胞生物量在表面活性剂存在下对菌体悬浮液用超声波破碎，酶进入水相，无细胞提取物的比活为2U/mg蛋白(按合成头孢氨苄计算)。无细胞提取物生产阶段的酶活收率(η_提取)达到79％。无细胞提取物中的α-氨基酸酯水解酶用硫酸铵盐分次沉淀，沉淀物溶解后透析脱盐，再依次用纤维素(DEAE Cellulose)和凝胶(Cepharose4-B)层析纯化。在每一次层析完成之后，用冷冻干燥法制备酶。多步α-氨基酸酯水解酶浓缩纯化的合成酶活性收率(η_纯化)为28％，酶纯度提高30倍。这套适宜于固定化酶制剂生产过程的酶收率(η_制备)为22％，由提取酶活收率(η_提取)乘以纯化收率(η_纯化)而得。 

部分纯化的α-氨基酸酯水解酶制剂(按合成头孢氨苄计算，比活性为60U/mg蛋白)采用硅藻土或高岭土进行吸附固定化。固定过程的活性收率(η_固定)为71-92％，视载体不同有所变化。原型方法中相对于细胞生物量的非均相生物催化剂生产过程的总收率(η_总)为16-20％，完整生产过程耗时不少于70小时。 

按照原型制得的最好的生物催化剂是把α-氨基酸酯水解酶固定在高岭土上得到的，其蛋白含量不大于0.08g/g(干重)，相对于头孢氨苄的合成酶活性为510U/g(干重)。以低的初始浓度(4mg/ml)7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-AΜCA)合成头孢氨苄的实际操作结果揭示，生物催化剂循环使用10次的剩余活性是初始活性的85％。以操作稳定性对酶循环次数作图显示生物催化剂的失活不遵守一级动力学规律，酶失活速度在最初5次循环比随后5次循环要快4-5倍。这个事实说明在催化合成过程中，有部分固定化酶从载体上脱落下来，甚至在很低的初始底物浓度下也是如此。该生物催化剂30℃时经10次合成循环所估计的半衰期τ_1/2为42次，但把反应温度提升至35℃时，固定在高岭土上的α-氨基酸酯水解酶的操作稳定性会降低8倍(t_1/2＝5次循环)。 

氨基头孢菌素抗生素头孢氨苄原型合成方法：D-苯甘氨酸甲酯(MEPhGl)初始浓度4mg/ml，与7-ADCA发生酰化反应，MEPhGl和7-ADCA化合物的初始浓度之比为1～3。反应在水性介质中进行，35℃，pH6.2，反应时间2-3小时，非均相生物催化剂为固定于高岭土上的基于柑桔黄单孢菌(Xanthomonas citri)的α-氨基酸酯水解酶。头孢氨苄最佳收率为85％(按7-ADCA计)，MEPhG1和7-ADCA之比为3：1。原型未见任何其它的氨基头孢菌素和氨基青霉素的合成资料。 

非均相生物催化剂及其制备的原型方法的主要缺点是： 

1.酶的分离和纯化工艺复杂，程序繁多，造成酶活大量损失，总收率不高。 

2.由于使用的固定化载体为高岭土，生物催化剂的制剂蛋白含量低，不大于0.08mg/g(干重)。 

3.作为终产物的非均相生物催化剂活性低。 

4.由于采用吸附方式来固定酶，故生物催化剂操作稳定性水平低，不能保证酶与载体的结合是多位点的、牢固的和不可逆的，使得固定化酶的热稳定性差，在反应过程中易受底物(尤其对于高浓度底物)溶液的影响发生酶和其它蛋白的解吸附 

发明内容

本发明旨在解决下列问题： 

·简化制备工艺，增加酶(合成酶)活性收率，提高α-氨基酸酯水解酶非均相生物催化剂制备方法的效率； 

·增加所生产的生物催化剂的活性和稳定性； 

·利用生产的生物催化剂开发酶法合成氨基头孢菌素和氨基青霉素的方法。 

这些问题的解决归功于累积应用了许多技术，并进行了条件优选。α-氨基酸酯水解酶的细胞生物量分离自红纹黄单胞菌。含有酶的细胞在温和条件下分步破碎，开始用低温效应破坏细胞的完整性，接着用乙酸丁酯处理悬浮解冻细胞的水溶液，破碎细胞生物量进入水相，把酶分离出来，除去固体，得到的无细胞提取物，可无需任何纯化而用于酶的固定化。为着生成直接用于固定化的无细胞提取物，细胞生物量的破碎和酶的提取在温和的优化条件下进行，如采用悬浮生物量的浓度、乙酸丁酯浓度、温度、pH值和抽提时间。发酵液在开始提取酶时为自然pH，随后通过滴加氨水溶液来保持恒定的pH值，同时记录氨水液消耗量。根据滴加氨水溶液的消耗速度来决定何时终止酶提取反应。当滴定液体消耗速度相对于初始值降低至临界倍数时，即起始消 耗速度2.5±0.3倍时达到酶分离工艺的终点。可保障酶分离工艺的活性收率达(100±5)％，得到所需纯度的无细胞提取物制剂。滴定剂减少的最佳值K_opt取决于使用的柑桔黄单孢菌菌株以及生物合成的培养条件。K_opt从一系列初步实验测得(见例3之表2)。 

通过α-氨基酸酯水解酶的沉淀进行酶固定化反应，在能使目标酶完全沉淀的一定分子量的多聚乙二醇影响下无细胞提取物为酶聚集体形式，随后聚集体以戊二醛交叉连接，戊二醛最佳浓度根据无细胞提取物中的蛋白质含量来确定(见例4和表3之No.1～4)。保证固定化工艺的标准初始原料，优化各菌株的条件，制备无细胞提取物，比较见例4表3之No.2,3和No.5。 

本发明非均相生物催化剂的制备方法图示介绍见图1，其构成如下： 

将含有α-氨基酸酯水解酶的红纹黄单胞菌细胞生物量置于-25℃或-25℃以下的冷冻箱，最佳温度在-25℃到-30℃之间，保持适当时间至全部冻结。然后置室温下解冻，将其悬浮于0.05M pH7.8的Tris-HC1缓冲液中，细胞生物量浓度为20-100mg(干重))/ml，最好为40-50mg(干重))/ml。向前述悬液中添加乙酸丁酯，使乙酸丁酯终浓度为2-6％(V/V)，最好控制为4.5％。细胞生物量破碎及酶提取过程要强烈搅拌，温度控制为25℃-35℃，最好是30℃。酶抽提过程最初为自然pH，之后通过滴加氨水溶液维持提取液恒定pH值。从初始pH8.0降到pH6.8时，滴加氨水溶液维持反应液pH值恒定，同时纪录所消耗的氨水量。pH优化范围依使用的红纹黄单胞菌菌株和生物合成培养条件而决定，经一系列初步实验而测得。当氨水溶液的消耗速度降低至起始速度的K_opt倍数时，酶的提取反应即行停止。K_opt值是细胞生物量破碎和酶提取工艺的持续时间，是未被标准化的数据，其值3～7小时之间，取决于初始的细胞生物量的生化参数，以及工艺所选择的条件诸如温度、细胞生物量和乙酸丁酯的浓度。 

把破碎菌体与无细胞提取物分离的方法颇多，比如离心沉淀法，或用0.01mol/1，pH6.5含0.005mol/1乙酸钙的乙酸钠缓冲液洗涤等。缓冲液用量为初始细胞悬浮液体积的20％。弃去破碎的细胞生物量，洗液收集，并入先前制备的无细胞提取物，得到澄明的无细胞提取物，相对于头孢氨苄合成的比活性为2.5～4.5U/mg蛋白。 

相对于初始细胞生物量的活性而言，酶提取阶段的酶活性收率为(100±5)％，这是一个在实验误差范围以内定量收率。当氨溶液消耗的速度降至初始速度的K_opt时间点时酶提取程序即行终止，可以保障所选择的提取条件能制得的无细胞提取物酶比活性高，保障酶分离阶段酶活性总收率高(参见例3表2)。 

通过以上的简单纯化过程，所得的无细胞提取物无需再纯化，可直接用于酶聚集体生产和交联固定化。故本法适宜于固定化的酶制剂生产工艺的收率(η_制备)等于分离工艺的酶收率(η_提取)，即η_制备＝η_提取＝(100±5)％。 

对无细胞提取物中的酶进行聚集沉淀时需要添加分子质量为4000～10000道尔顿，最好是6000～8000道尔顿的聚乙二醇，其用量应以能完全沉淀目标酶为准，每毫升无细胞提取物使用0.25～0.30g聚乙二醇(视分子量而定)。该步骤在2-4℃温度条件下进行，同时搅拌15-30分钟，便于聚乙二醇完全溶解。随后向反应混合溶液中加入戊二醛使酶聚集体交联，其添加浓度为1x10^-2～5x10^-2mol/mg蛋白。蛋白质的修饰和交联在温和的条件下进行，在2～4℃下持续2小时。交联的酶聚集体形式的非均相生物催化剂经真空抽滤分出，在多孔滤器上用乙酸钠缓冲液(0.1mol/l，pH6.5，含0.005mol/l乙酸钙)洗涤至洗液澄明。 

α-氨基酸酯水解酶固定化程序的酶活性收率为48～70％。由于在酶的提取分离步骤中酶活性不受损失，因此本发明工艺方法制备非均相生物催化剂的总收率为48～70％，全过程持续时长为12～15小时。 

本发明生物催化剂的特性： 

非均相生物催化剂即固定化α-氨基酸酯水解酶，不含未结合酶的空白载体，它主要由蛋白质构成(干重蛋白质含量高达0.95g/g)。相对于干燥空白载体，固定化α-氨基酸酯水解酶活性为1300～2200U/g(干重)(以头孢氨苄合成计)。反应混合物中进行酶聚集体交联的戊二醛相对浓度范围为1x10^-2～5x10^-2mol/mg蛋白，能使固定化酶制剂的合成酶活性水平与操作稳定性结合起来，其特征是该固定化酶完成10次头孢氨苄合成循环后仍保留有95％的初始酶活力(参见例4之表3)。 

在30℃、7-ADCA的初始浓度为20mg/ml条件下，采用头孢氨苄合成工艺进行了多次连续操作的生物催化剂的试验，结果显示固定化酶的失活遵循一级动力学规律。这就证实了α-氨基酸酯水解酶不会从固定化酶上流失，即使在使用较高的底物浓度时(比原型方法高出5倍)。根据生物催化剂固定化酶35次循环合成头孢氨苄的实验结果推算出此此固定化酶半衰期为τ_1/2＝200个循环(参见例10和图2)。 

氨基头孢菌素和氨基青霉素合成的本发明方法一般如下构成： 

利用制得的生物催化剂来合成不同的氨基青霉素(如氨苄青霉素、阿莫西林)和氨基头孢菌素(如头孢氨苄、头孢羟氨苄、头孢克洛、头孢拉定和头孢来星)。合成方法包括使用D-苯甘氨酸衍生物进行关键β-内酰胺化合物在浓度5～40mg/ml时的酰 化反应。衍生物可以是D-苯甘氨酸甲酯、D-对羟基苯甘氨酸甲酯和D-2,5二羟基苯甘氨酸甲酯，摩尔过量1.5～4.0倍。反应进行的条件：pH6.0～6.2，温度1～40℃，水性介质或者水与聚乙二醇的混合物，初始混合物聚乙二醇的含量为30～50％。反应混合物中非均相生物催化剂的含量在5～10u/ml之间变化，反应的条件取值应满足反应过程持续的时间不超过3小时为限。 

本发明的优点： 

与文献原型方法(参见图1)比较，本发明方法具有如下的优越性： 

1.本发明方法以最简便可行的方案(见图1)来制备非均相生物催化剂，包括从细胞生物量分离酶和直接用无细胞提取物进行酶固定化数步构成，制备周期缩短至12-15小时；而原型方法纯化酶的制备步骤多，制备周期至少需要70小时。 

2.采用本发明方法制备的生物催化剂时，总酶活性收率达到48-70％，比原型方法提高3倍多；原型方法仅为16-20％。 

3.无载体生物催化剂的制备，它主要由蛋白质构成(本发明催化剂蛋白含量高达0.95g/g(干重)，但原型的蛋白含量不大于0.08g/g(干重) 

4.提高生物催化剂合成酶活性(相对于头孢氨苄合成)3.3-4.3倍：本发明方法固定化酶的活性为1300～2200U/g(干重)，原型方法固定化酶活性仅为390-510U/g(干重)。 

5.提高生物催化剂操作稳定性至少5倍：本发明方法30℃时酶的半衰期τ_1/2为200次循环；原型酶30℃时的半衰期τ_1/2则不超过42次循环。 

6.在超过原型试验使用的初始底物浓度5倍时，本生物催化剂上的酶也不会流失。 

7.氨基青霉素和氨基头孢菌素酶法合成的生物催化剂应用可能性：本酶使用的温度和底物浓度的范围宽，能在水性介质或者水与聚乙二醇混合介质中使用，可获得比原型法收率更高的目标化合物(收率高达98％，见例6)。 

附图说明

图1来自α-氨基酸酯水解酶的非均相生物催化剂的制备方法 

图2头孢氨苄合成中生物催化剂的操作稳定性(按表4中数据绘制) 

具体实施方式

非均相生物催化剂的制备过程用以下的实例和酶产品的用法来具体说明。在下述实例中，酶制剂的活性相对于头孢氨苄合成来计算。目标产品形成的初速度在如下条件下测定：pH6.0-6.2，40±1℃，7-ADCA浓度0.040±0.002mole/l，苯甘氨酸甲酯(Methyl Ester Phenyl Glycine，MEPhGl)0.080±0.004mole/1。 

制剂中含有的干物质的量是将制剂在105±1℃干燥至恒重后测定的。 

实施例1.以红纹黄单胞菌菌株VKPM B-9915制备生物催化剂方法 

本发明采用的同一菌株先后分别向《中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)》和《全俄工业微生物保藏部(VKPM)》提交保藏，获得了CGMCC和VKPM分别给与的菌种编号CGMCC№.2339和VKPM B-9915，建议的分类命名分别为红纹黄单胞菌Xanthomonas rubrilineans和Xanthomonas rubrilineans K40。 

取273g(湿重)红纹黄单胞菌菌株VKPMB-9915细胞生物量作为非均相生物催化剂的起始物，其含量为18.5％(干重)，合成酶活性83.3U/g(湿重)，450U/g(干重)。 

将细胞生物量放入塑料容器内，在-28℃温度下进行冷冻3小时，取出冻结的塑料容器，令细胞生物量在室温下解冻，然后解冻的细胞生物量移至2.5升反应器中，反应器具有夹套、自动控温、pH在线检测和机械搅拌等配套装置。 

用乙酸丁酯处理细胞把酶提取到水相的过程在反应器中进行，其条件为：悬浮液中生物量的浓度40mg(干重)/ml，乙酸丁酯的浓度4.5％(v/v)，30℃，pH梯度，连续搅拌。解冻的细胞生物量用0.05M pH7.8的Tris-HC1缓冲液配制成适宜浓度的悬浮液，Tris-HC1缓冲液的用量要考虑到湿细胞生物量中的水分。本例用1040ml缓冲液制得1260ml悬浮液。在把解冻的细胞生物量悬浮于缓冲液中时的温度不高于20℃，加入150μl硫基乙醇来稳定酶，然后加入57ml乙酸丁酯，此时视作开始提取过程。将反应器加热到30℃，开始时需控制pH不超过8.0，随着反应的继续，提取液的pH自然下降，当反应液pH值降至pH6.8时，向反应混合液中滴加12.5％浓度的氨水溶液来保持pH值恒定为6.8±0.1，记录整个进程中滴加氨水溶液的数量。当氨溶液消耗速度下降至初始速度的2.5倍时酶提取过程即终止。 

将反应混合液迅速降温至15-20℃，用絮凝剂处理破碎细胞生物量以除掉菌丝体。絮凝剂是含有季铵碱基的水溶性多聚阴离子，比如Flocaton PPS-400。离心分离，破碎 的细胞生物量用250m10.1M，pH6.5，含乙酸钙0.005M的乙酸钠缓冲液洗涤，洗涤液并入无细胞提取物，控制至pH6.8-7.2。 

经前述处理，得1440ml无细胞提取物的透明溶液，合成酶活性为16.0U/ml，蛋白含量为4.2mg/ml，比活性为3.8U/mg蛋白。从细胞生物量提取分离的酶活性收率η_提取＝101％。 

酶固定化过程是在带有机械搅拌冰浴装置的2L反应器中进行的。将1440ml无细胞提取物移入反应器中，降温至2-4℃，添加403g分子质量为6000的聚乙二醇(相当于每毫升无细胞提取物加入0.28g聚乙二醇)以确保能完全沉淀目标酶。反应混合物搅拌15分钟至沉淀全部溶解，再加入25％戊二醛水溶液84.7ml(3.5x10^-2mmol/mg蛋白)，在2-4℃下缓慢搅拌孵化2小时。固体颗粒物用玻砂漏斗过滤分离，先用水洗至无色，再用0.1M1500ml乙酸钠缓冲液(pH6.5，每升内含0.005M乙酸钙)洗涤。 

至此，得固定化α-氨基酸酯水解酶交联酶聚集体形式的生物催化剂38.6g(湿重)，其干重含量20.4％，合成酶活性370U/g(湿重)，或1680U/g(干重)。α-氨基酸酯水解酶固定化收率为η_固定59.1％，相对于细胞生物量而言的非均相生物催化剂制剂的总活性收率为η_总59.8％。在头孢氨苄合成中循环使用35次测得的非均相生物催化剂的半衰期τ_1/2＝200次循环(参见例10)。 

实施例2.以红纹黄单胞菌菌株CGMCC№.2339制备生物催化剂的方法 

取91.2g(湿重)红纹黄单胞菌菌株CGMCC №.2339细胞生物量作为非均相生物催化剂的起始物，其干重含量19.5％，合成酶活性70.2U/g(湿重)，360U/g(干重)。 

细胞生物量按照例1程序处理，在-30℃下保持5小时。 

乙酸丁酯处理细胞、把酶提取到水相的过程按照例1方法进行，条件为：悬浮的细胞生物量浓度50mg(干重)/ml，乙酸丁酯浓度4.0％以体积计)，28℃，pH梯度，连续搅拌。所使用的试剂量：缓冲液50ml，巯基乙醇50ml，乙酸丁酯14ml，混合得悬浮液355ml。酶提取过程需时6小时10分钟，氨溶液消耗速度与初始值比较下降2.8倍时酶提取过程即终止。 

按例1方法制备无细胞提取物：反应混合物用絮凝剂处理，得澄明无细胞提取物420ml。其特征为：酶活性157u/ml，蛋白含量3.5mg/ml，比活性4.5u/mg蛋白。从细胞生物量起分离的酶活性收率η_提取＝103％。 

酶固定化工艺按例1方法进行，区别仅在于：无细胞提取物420ml，分子量8000的聚乙二醇105g(即每毫升无细胞提取物投聚乙二醇0.25g)，25％戊二醛水溶液8.8ml(1.5X10^-5mmol/mg蛋白)。 

制得a-氨基酸酯水解酶交联聚集体形式的非均相生物催化剂11.1g，它具有如下特性：干重含量20.2％，合成酶活性380U/g(湿重)或1880u/g(干重)。α-氨基酸酯水解酶固定化工艺的活性总收率(从细胞生物量起计算)η_总＝65％。生物催化剂在头孢氨苄合成中循环使用10次后相对剩余活性为96.3％(参见例10)。 

实施例3.酶提取过程的终止点变化时的方法 

使用红纹黄单胞菌菌株VKPMB-9915获得的数据见表2之1-3试验。细胞生物量的低温效应过程，用乙酸丁酯处理和酶提取进入水相的过程均按例1方法进行，差别只在于与氨溶液消耗的速度相关的酶提取终止点有变化。制备的无细胞提取液参照例1的方法进行酶的固定化。 

进入水相诸过程均按例1方法进行，差别只在于与氨溶液消耗的速度相关的酶提取终止点有变化。制备的无细胞提取液参照例1的方法进行酶的固定化。 

表2.酶的提取时间对无细胞提取物和非均相生物催化剂性能以及提取效率的影响 

以上结果说明酶提取终止点影响到无细胞提取物和生物催化剂的性质，也影响到酶的分离和固定化的效率。例2中从红纹黄单胞菌菌株CGMCC №.2339细胞生物量制备生物催化剂的数据与所用菌株最佳酶提取终止点间有依从关系，详见表2之4号试验。 

实施例4.在不同戊二醛浓度下本发明方法的实施 

使用全俄工业微生物保藏部之红纹黄单胞菌菌株VKPM B-9915获得的数据见表2之1-4号试验。细胞生物量的低温效应过程和用乙酸丁酯处理把酶提取进入水相的过程均在例1中指定菌株的最佳条件下进行。参照例1的方法对制得的无细胞提取液进行酶固定化，差别只在于反应混合物中酶聚集体交联用的乙二醛的相对浓度的变化。 

把生物催化剂经头孢氨苄合成的10次循环后相对的酶活性(实施见例10)作为在不同条件下固化化酶的稳定性比较的判据。所获得的结果证明反应混合物中戊二醛浓度影响生物催化剂的性质和酶固定化工艺的效率。 

表3.反应混合物中戊二醛相对浓度对非均相生物催化剂性能和固定工艺效率的影响 

例2中，从红纹黄单胞菌菌株CGMCC №.2339细胞生物量生成的生物催化剂的特征列入表3之5号试验。按照例2方法，以对该菌株而言的最佳条件来制备无细胞提取物，接着沉淀得到酶聚集体，再在VKPM B-9915菌株交联时使用的最佳戊二醛浓度范围内进行交联，从而最终得到特征相似的生物催化剂。 

实施例5.水性介质中酶法合成头孢氨苄(Cephalexin) 

头孢氨苄酶合成在装有温控装置、机械搅拌、pH仪和pH状态系统仪的100ml有夹层的玻璃反应器中进行，工艺条件如下：水性介质，2℃，pH6.0-6.2，酶含量25±1U/ml，7-ADCA的初始浓度为25mg/ml；苯甘氨酸甲酯(MEPhGl)与7-ADCA的摩尔比为3.0：1。初始反应混合物中反应物浓度要计算生物催化剂和水的体积。 

底物溶液制备：将1.25g(5.84mmo1)7-ADCA和40ml蒸馏水加入100ml装有磁力搅拌的玻璃烧杯中制成悬浮液，搅拌下加入12.5％氨水使7-ADCA溶解，控制pH不大于8.2。再将3.53g(17.52mmol)苯甘氨酸甲酯盐酸盐搅拌下分次加入，并加入12.5％的氨水防止pH小于6。在苯甘氨酸甲酯溶解后溶液定量地转移至量筒，用水调节体积至50ml。 

将以上底物溶液转移至反应器，调节到2℃，强烈搅拌，加入例1法生产的生物催化剂，其活性370U/g(湿重)，干物质含量20.4％。生物催化剂的加入之时合成反应的开始。这个过程在2℃、pH6.0-6.2时需70分钟，用自动滴定系统滴加12.5％的氨水溶液维持pH稳定。反应完成后，生物催化剂用真空过滤从反应混合物中分出，10ml水洗涤， 洗液并入滤液。合并液中头孢氨苄的含量用HPLC法测定。以7-ADCA计，头孢氨苄的收率为85.7％。 

实施例6.在水与乙二醇混合物中酶法合成头孢氨苄(Cephalexin) 

在反应器中进行的头孢氨苄酶法合成见例5描述，工艺条件为：乙二醇在初始反应混合物的浓度50％(v/v)，5℃，pH6.0-6.2，酶含量40±1U/ml，7-ADCA初始浓度30mg/ml，初始反应混合物中苯甘氨酸甲酯与7-ADCA摩尔比为2.5：1。 

将1.50g(7.01mmol)7-ADCA和3.53g(17.52mmol)苯甘氨酸甲酯盐酸按例5描述的方法制成底物溶液，不同的是把溶解7-ADCA的40ml蒸馏水换成15ml蒸馏水和25ml乙二醇。 

按照例5方法进行头孢氨苄合成的另一些不同之处是在5℃下反应180分钟，使用按照例1法生产的生物催化剂5.41g，酶活性370U/g(湿重)，干物质含量20.4％。从7-ADCA计，头孢氨苄的收率为98.3％。 

实施例7.头孢克洛(Cefaclor)的酶法合成 

在反应器中进行的头孢克洛酶法合成工艺见例5描述，条件为：乙二醇在初始反应混合物的浓度45％(v/v)，10℃，pH6.0-6.2，酶含量40±1U/ml，初始反应混合物中3-氯-7-氨基头孢菌素酸(7-ACCA)浓度15mg/ml，苯甘氨酸甲酯与7-ACCA摩尔比为4：1 

将0.75g(3.20mmol)7-ACCA和2.58g(12.80mmol)苯甘氨酸甲酯盐酸按例5描述的方法制成底物溶液，不同的是把溶解7-ADCA的40ml蒸馏水换成17.5ml蒸馏水和22.5ml乙二醇。 

按照例5方法进行头孢克洛合成，但温度和时间略异，即在10℃下反应100分钟，使用按照例1法生产的生物催化剂5.41g，酶活性370U/g(湿重)，干物质含量20.4％。从7-ACCA计，头孢克洛收率为92.4％。 

实施例8.氨苄西林(Ampicillin)的酶法合成 

在反应器中进行的氨苄西林酶法合成工艺见例5描述，条件为：乙二醇在初始反应混合物的浓度30％(v/v)，20℃，pH6.0-6.2，酶含量30±1U/ml，初始反应混合物中6-氨基青霉素酸(6-APA)浓度40mg/ml，苯甘氨酸甲酯与6-APA摩尔比为3：1。 

将2.00g(9.26mmol)7-APA和5.60g(27.7mmol)苯甘氨酸甲酯盐酸按例5描述的方法制成底物溶液，不同的是把溶解7-APA的40ml蒸馏水换成25ml蒸馏水和15ml乙二醇，pH不超过7.5。 

按照例5方法进行氨苄西林合成，但温度和时间略异，即在20℃下反应75分钟，使用例1方法生产的生物催化剂3.97g，酶活性370U/g(湿重)，干物质含量20.4％。以6-APA计，氨苄西林的收率为88.6％。 

实施例9.阿莫西林(Amoxicillin)的酶法合成 

在反应器中进行的阿莫西林酶法合成工艺见例5描述，条件为：水性介质，40℃，pH6.0-6.2，酶含量6.5±0.5U/ml，初始反应混合物中6-APA浓度10mg/ml，D-对羟基苯甘氨酸甲酯(MEHPhGl)与6-APA摩尔比为1.7：1。 

在磁力搅拌的100ml烧杯中加入0.72g(3.97mmol)MEHPhG1和40ml蒸馏水制成底物溶液，搅拌下向其中加入20％盐酸使MEHPhGl溶解，以12.5％氨水溶液调节至pH6，立即加入0.5g(2.34mmol)6-APA，搅拌下向悬浮液中加入12.5％氨水溶液控制pH至6-APA溶解，在此过程中pH须不大于6.5。在6-APA溶解后把溶液定量转移至量筒，用水把体积调节到50ml。 

按照例5方法进行阿莫西林合成，但温度和时间略异，即在40℃下反应60分钟，使用例2方法生产的生物催化剂0.86g，酶活性380U/g(湿重)，干物质含量20.2％。以6-APA计，阿莫西林的收率为72.8％。 

实施例10.在30℃下合成头孢氨苄的固定化酶的操作稳定性 

利用同一非均相生物催化剂合成头孢氨苄的多次连续循环来研究固定化酶的操作稳定性，其工艺条件如下：初始反应混合物中乙二醇浓度40％(v/v)，反应温度30℃，pH6.0-6.2，酶初始浓度15±1U/ml，7-ADCA初始浓度20mg/ml；MEPhG1与7-ADCA的摩尔比为2.5：1。 

头孢氨苄合成的第一次循环按例5的方法进行，反应温度为30℃，反应混合物体积为100ml。待反应完全后，真空过滤，收集固定化酶用10ml水洗涤，并将此酶用于下一个合成反应。洗液和滤液合并，用HPLC法检测并计算7-ADCA的转化率。 

头孢氨苄合成的第二次循环以类似的方法进行。在5次循环之后测定酶的剩余活性及其干物质的含量。由于生物催化剂活性随循环使用次数增加而下降，同时每次取样分析的损耗使得酶重量减少，为了让选定的生物催化剂浓度和循环反应混合物体积等标准工艺条件有可重复性，需要根据具体情况对标准工艺条件进行修正。业已完成必要数量的连续循环的头孢氨苄合成研究。 

利用例1方法产生的生物催化剂的试验结果见表4所列。 

表4试验数据说明头孢氨苄合成中生物催化剂的失活符合一级动力学规律，半衰期τ_1/2＝200个循环(见图2)。 

表4.按例1法生产的生物催化剂于30℃下在头孢氨苄合成时的操作稳定性 

^#：Log A_相对是指剩余活性百分数的对数函数值。 

Claims (3)

1.一种把红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrilineans)胞内α-氨基酸酯水解酶制成非均相生物催化剂的制备方法，其步骤由破裂红纹黄单胞菌的细胞生物量，分步法破碎细胞，即先用低温效应，将细胞生物量冷冻至-25℃～-30℃破坏细胞的完整性，再用乙酸丁酯处理解冻细胞的水悬浮溶液，水性悬浮液的浓度为20～100mg(干重)/ml，乙酸丁酯浓度为2～6％(v/v)；细胞悬浮液的加热处理的温度范围为25～35℃，先在自发pH梯度再在恒定pH下进行；恒定pH靠加入滴定溶液来维持，滴定溶液消耗速度的变化水平是选择滴定终止点的判据；分离掉破碎的细胞生物量的无细胞提取液无需任何纯化，经由聚乙二醇以酶聚集体形式的沉淀和其后的交联化而直接用于酶的固定化而组成。 

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于使用必要量的分子量4000～10,000的聚乙二醇从无细胞提取液中把酶聚集体沉淀出来。 

3.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于酶聚集体交联使用的戊二醛的相对浓度为1×10^-2～5×10^-2mmol/mg蛋白。 

Images