CN103834633B - 一种α-氨基酸酯水解酶固定化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种获得固定化α-氨基酸酯水解酶的方法；本发明所使用的酶来源于含有重组质粒pET28a-aeh的大肠杆菌BL21(DE3)；所使用的载体为含环氧基活性基团的珠状聚合物；固定化酶活力为550-800U/g，固定化酶活回收率达到52%。<!--1-->
Description
技术领域：
本发明属于生物酶工程技术领域，提供了一种α-氨基酸酯水解酶（AEH）的固定化方法。
背景技术：
由于游离酶的不稳定性，限制了其在工业上的应用。而将其进行固定化处理后，所得到的固定化酶不但提高了对热、酸碱等的稳定性，而且还使得其能够回收重复使用，从而大大降低工业应用的成本。对于AEH酶的固定化，已经有些报道，其中固定化方法涉及交联聚集体（CLEA）。中国专利申请号200810044881.1报道了一种固定化工艺。该工艺采用红纹黄单胞菌发酵获得菌体，然后采用分步破碎的方式进行细胞破碎，先将菌体于-25~-30℃条件下利用低温效应破坏细胞，再用乙酸丁酯处理解冻的悬浮液，用絮凝剂除去细胞残片，离心获得无细胞提取液。向无细胞提取液中加入聚乙二醇沉淀目标蛋白，再加入戊二醛进行交联，制得交联蛋白聚集体形态的固定化α-氨基酸酯水解酶。其中蛋白含量为95%（干重），合成酶活力为2200U/g干重。中国专利申请号200910058710.9在此基础上对工艺进行了改进，该工艺同样采用红纹黄单胞菌发酵获得菌体，去除了对菌体进行低温冻融的步骤，而是直接用乙酸丁酯进行细胞破碎，然后加入絮凝剂，离心分离获得高纯度的无细胞提取液，其比活力为5.5-9.5U/mg蛋白。在2-4℃条件下加入分子量为6000-8000的聚乙二醇进行沉淀，再加入25%戊二醛水溶液进行交联，制得无载体固定化的α-氨基酸酯水解酶。其干重含量为21.7%，合成酶活力达到3680U/g干重。
上述2种固定化工艺极为相似，后者对前者进行了改进，都属于是无载体固定化形式。所得的固定化酶为酶蛋白交联聚集体，主要缺点有：
1、所制得的固定化酶颗粒大小不一，形状各异，不均匀。
2、蛋白聚集体颗粒强度低，易碎，不利于工业化应用。
3、所得固定化酶为蛋白聚集体，其中蛋白含量占其干重的95%，不易于长时间储存，影响工业化应用。
相对于交联聚集体的固定化形式，在载体上固定化的酶更稳定，强度更高，不易破碎，具有更高的循环使用次数。
发明内容
本发明的目的是提供一种α-氨基酸酯水解酶在一种含环氧基活性基团载体上的固定化方法。本发明所提供的固定化方法有以下优点：
1、所制得的固定化酶颗粒大小均匀，有利于工业化催化反应进行。
2、所制得的固定化酶颗粒机械强度高，不易破碎，有利于工业化生产中的反复利用，降低成本。
3、所制得的固定化酶由载体表面结合酶蛋白组成，蛋白与载体间以形成共价键方式结合，结合牢固，蛋白不易脱落，具有更高的循环使用次数。
4、相对于游离酶和无载体固定化酶，本方法所制得固定化酶易于储存和运输，更有利于工业化应用。
本发明提供的α-氨基酸酯水解酶固定化方法如下:
发酵含有重组质粒pET28a-aeh的大肠杆菌BL21(DE3)，离心收集菌体，称重。按照4ml/g菌体的添加量，用pH为7.8的缓冲液（含50mmol/lNaH2PO4和300mmol/l的NaCl）重悬菌体，搅拌均匀。向上述菌悬液中加入溶菌酶，其终浓度为80000-100000U/ml，间歇搅拌20分钟。之后向其中加入1%的曲拉通X-100，继续搅拌，体系变粘稠。向其中加入DNA酶和RNA酶，添加量分别为10ug/ml和20ug/ml。搅拌1小时，至体系不粘稠。在4℃条件下，8000r/min，离心10min。保留离心上清液，为无细胞提取液。于冰水浴中向其中加入硫酸铵至20%饱和度。缓慢搅拌2小时。然后在4℃条件下，9000r/min，离心25min，除去沉淀的杂蛋白，向离心上清液中继续加入硫酸铵至60%饱和度，保持冰水浴条件下缓慢搅拌2小时，沉淀目标蛋白。于4℃条件下，9000r/min，离心30min,所得沉淀为粗酶。活力为2000-3000U/g。
用去离子水将上述得到的粗酶溶解制得粗酶液，备用。配制乙酸钾溶液，用稀氨水调节pH为6.8-7.0备用。用去离子水洗涤含环氧基活性基团的树脂载体，除去悬浮于水面的破碎颗粒，按照QE=400-1000的量加入粗酶液，并向其中加入上述乙酸钾缓冲液，使得乙酸钾的终浓度为0.8-3.0mol/l，α-氨基酸酯水解酶活力为5-100U/ml,控制体系的pH为6.5-7.0，于摇床上100-150r/min转速震摇，摇床温度为10-25℃。振摇2-8小时后取出，用去离子水反复洗涤，至洗出液无酶活力。玻沙漏斗抽滤，得固定化α-氨基酸酯水解酶，活力为550-800U/g干重。
本发明中所提及的酶活力的定义为：含40mmol/L7-ACCA和80mmol/LD-PGM的底物溶液在pH6.0（0.05mol/L磷酸铵）和30℃条件下反应30min，每分钟生成1μmol头孢克洛所需酶量定义为一个酶活力单位（U）。
具体实施方式
实施例：
取170g含有重组质粒pET28a-aeh的大肠杆菌BL21(DE3)菌体。向其中加入680mlpH为7.8的缓冲液（含50mmol/lNaH2PO4和300mmol/l的NaCl），搅拌，形成菌悬液，体积880ml。向其中加入1g溶菌酶（活力为9650U/mg）,室温下搅拌20分钟，向体系中加入90ml10%曲拉通X-100溶液，继续搅拌，体系变粘稠状。再向其中加入9.5mg的DNA酶和19mg的RNA酶，继续搅拌1小时。在4℃条件下，8000r/min，离心10min。保留离心上清液，为无细胞提取液，体积825ml，活力为168U/ml。于冰水浴中向其中加入87.45g硫酸铵至20%饱和度。缓慢搅拌2小时。然后在4℃条件下，9000r/min，离心25min，除去沉淀的杂蛋白，向离心上清液中继续加入205g硫酸铵至60%饱和度，保持冰水浴条件下缓慢搅拌2小时，沉淀目标蛋白。于4℃条件下，9000r/min，离心30min,得47g粗酶，活力为2423U/g。
取26g上述粗酶，用少许去离子水溶解，向其中加入100ml的乙酸钾溶液，用稀氨水调节PH为6.8-7.0，控制乙酸钾的终浓度为1.3mol/l，用1.3mol/l，PH为6.8的乙酸钾溶液调节体系总体积为150ml，用去离子水洗涤载体3次，去除悬浮于水面的破碎颗粒，用玻沙漏斗抽滤，称取105g加入上述酶溶液中。保持固定化反应温度为15℃，摇床转速为150r/min，反应4小时后，取出载体用去离子水洗涤，玻沙漏斗抽干，如此反复4次，至洗涤液无酶活力。称重得固定化α-氨基酸酯水解酶110g，酶活力为713U/g干重，固定化酶活回收率为52%。
Claims (1)
1.一种α-氨基酸酯水解酶固定化方法，其特征在于，按如下步骤进行：
取170g含有重组质粒pET28a-aeh的大肠杆菌BL21(DE3)菌体，向其中加入680mlpH为7.8的含50mmol/lNaH2PO4和300mmol/l的NaCl缓冲液，搅拌，形成菌悬液，体积880ml；向其中加入1g溶菌酶，活力为9650U/mg，室温下搅拌20分钟，向体系中加入90ml10％曲拉通X-100溶液，继续搅拌，体系变粘稠状；再向其中加入9.5mg的DNA酶和19mg的RNA酶，继续搅拌1小时；在4℃条件下，8000r/min，离心10min，保留离心上清液，为无细胞提取液，体积825ml，活力为168U/ml；于冰水浴中向其中加入87.45g硫酸铵至20％饱和度，缓慢搅拌2小时，然后在4℃条件下，9000r/min，离心25min，除去沉淀的杂蛋白；向离心上清液中继续加入205g硫酸铵至60％饱和度，保持冰水浴条件下缓慢搅拌2小时，沉淀目标蛋白；于4℃条件下，9000r/min，离心30min，得47g粗酶，活力为2423U/g；取26g上述粗酶，用少许去离子水溶解，向其中加入100ml的乙酸钾溶液，用稀氨水调节pH为6.8-7.0，控制乙酸钾的终浓度为1.3mol/l，用1.3mol/l，pH为6.8的乙酸钾溶液调节体系总体积为150ml，用去离子水洗涤载体3次，去除悬浮于水面的破碎颗粒，用玻沙漏斗抽滤，称取105g加入上述酶溶液中，保持固定化反应温度为15℃，摇床转速为150r/min，反应4小时后取出用去离子水洗涤，玻沙漏斗抽干，如此反复4次，至洗涤液无酶活力，称重得固定化α-氨基酸酯水解酶110g，酶活力为713U/g干重，固定化酶活回收率为52％，所述的载体为含有环氧基活性基团的圆珠状聚合物，其粒径为150μm---300μm，环氧基官能团含量不低于50μmol/g，含水量40-70％，所述载体为含环氧基活性基团的树脂载体。
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