CN101845432B - 一种α-氨基酸酯水解酶制备非均相生物催化剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种氨基头孢菌素类和氨基青霉素类酶法合成用生物催化剂的制备，本发明α-氨基酸酯酶的分离使用红纹黄单胞菌菌丝体细胞；通过革除冷冻预处理步骤，用乙酸丁酯进行细胞破碎程序，接着在相应的优化条件下进行酶的提取；使用天然未冷冻的菌丝体细胞得到了高纯度的无细胞提取液(比酶活5.5-9.5U/mg蛋白)，蛋白聚集体以及最终得到的生物催化剂中α-氨基酸酯酶含量高，从而确保能生产出高活性的非均相生物催化剂(2400-3600U/g干重)；本发明的生物催化剂可用于氨基头孢菌素类和氨基青霉素类的合成。
Description
技术领域
本发明主要涉及氨基头孢菌素和氨基青霉素酶法合成用的非均相生物催化剂的制备。
背景技术
α-氨基酸酯水解酶(AEHs)有两种作用：一是催化水解α-氨基酸酯键及不同的头孢菌素和青霉素类的酰胺键，二是利用α-氨基酸的酯化作用使7α-氨基头孢烯和6α-氨基青霉烷的氨基发生N-酰化反应。相似的底物专属性使得α-氨基酸酯水解酶可以作为生物催化剂用于合成那些侧链α-位含有氨基的头孢菌素和青霉素类(即氨基头孢菌素和氨基青霉素)药物。
对α-氨基酸酯水解酶结构的研究已经证明了这类酶属于α/β折叠水解酶，其活性位点包含Ser-His-Asp三联体结构。α-氨基酸酯水解酶与β-内酰胺酰化酶的主要区别在于其结构、活性位点、底物特异性和催化性能。例如，青霉素G酰化酶虽然可用于合成β-内酰胺类抗生素，但从结构上看则是属于N末端水解酶，它含有N-末端残基的β链，β链在催化反应中发挥亲核作用。
从红纹黄单胞菌(Xanthomonas rubrilineans)中获得的α-氨基酸酯水解酶可以作为催化合成氨基α-内酰胺类抗生素的生物催化剂[Pat.Russia RU2221046(2004)；Kurochkina V.B.，Nys P.S.Antibiotics and chemotherapy(Russia)，No 8：6(1999)]。该文献描述了从红纹黄单胞菌中获得的α-氨基酸酯水解酶的生物化学、物理化学及其催化性质[Krestyanova I.N.，Uvarov N.N.，Rudenskaya G.N.et al.Biochemistry(Russia)55(12)：2226(1990)；Blinkovsky A.M.，Markaryan A.N.Enzyme Microb.Technol.15：965(1993)]。研究显示此酶具有四个亚基的结构，并且亚基的分子量均为70000-72000。
利用氨基酸酯水解酶开发酶法合成抗生素的方法需要对非均相生物催化剂进行技术创新，例如，以某种方式破坏生物细胞，提取酶并将其固定化的技术创新。
破坏含有氨基酸酯水解酶的红纹黄单胞菌细胞的方法是以与水不混溶的乙酸丁酯来处理细胞。几种处理方法的比较见表1。
表1用乙酸丁酯处理红纹黄单胞菌破裂细胞的方法与α-氨基酸酯水解酶产出量比较
| № | 破碎前预处理 | 细胞破碎方法 | 破碎率％ | 无细胞提取液的比重 | 参考文献 |
| 1 | 未处理 | 乙酸丁酯(10vol.％)，40℃，pH8. | 70～90 | ＜1.0 | 1# |
| 2 | 低温作用 | 乙酸丁酯(2-6vol.％)，25-35℃，pH-梯度 | 100 | 2.5～4.5 | 2# |
| 3 | 未处理 | 乙酸丁酯(4-4.5vol.％)28-30℃，pH-梯度 | 100 | 5.5～9.5 | 本发明方法(见例1和例2)。 |
1# Krestyanova I.N.Biochemistry(Russia)55(12)：2226(1990)；Zaslavskaya P.L.et al.Biotechnol.Appl.Biochem.18：299(1993).
2# Patent Application CN 200810044881.1；Patent Application RU2008107953.
无细胞提取液的酶比活性数值以毫克蛋白关联的国际单位U表示。1酶活单位(U)的制剂等于在指定条件下，时长1分钟时酶促转化1umol底物或者形成1umol产物所需的酶量。
在各个例子中，所有的活性数据度均折算成头孢氨苄合成时其水解酶和合成酶活性的实验之比表示的活性。第一法[Krestyanova I.N.，Uvarov N.N.，Rudenskaya G.N.et al.Biochemistry(Russia)55(12)：2226(1990)；Zaslavskaya P.L.，Chekalina I.V.，Igans D.N.et al.Biotechnol.Appl.Biochem.18：299(1993)]不含任何预处理过程，活性收率不会高于90％，所产生的无细胞提取物液酶的比活性低于1U/mg蛋白。第二法[PatentApplication CN 200810044881.1；Patent Application RU 2008107953]使用低温效应预处理程序、细胞破碎的条件和酶提取终止点判据的选择上与第一法不同。该法酶活性收率可达100％，所产生的无细胞提取液的酶比活为2.5-4.5U/mg蛋白。
最接近本发明制备胞内α-氨基酸酯水解酶的非均相生物催化剂的方法是来自红纹黄单胞菌的酶制取生物催化剂的方法[Patent Application CN200810044881.1；Patent Application RU 2008107953]，可以作为相对于本发明的原型。原型方法代表了从生物细胞开始制备非均相生物催化剂的一个完整程序。
按照原型，制备非均相生物催化剂的方法构成如下：
取胞内含α-氨基酸酯酶的红纹黄单胞菌菌丝体细胞，置于-25℃至-30℃冷冻，直至菌丝体细胞全部冻结，然后放置室温下至解冻。经低温预处理之后用乙酸丁酯来破碎菌丝体细胞，再按下列条件把酶提取到水相：菌丝体的浓度20-100mg(干重)/ml，乙酸丁酯浓度2-6％(体积计)，温度25～35℃，pH梯度。滴定溶液消耗速度变化的水平用作选择提取过程终止点的判据。
分离破碎的菌丝体，洗涤，可以制得透明的无细胞提取液，酶的比活性为20-100mg/(干重)ml。在酶分离过程中，活性收率是定量的(100±5)％。
通过酶聚集反应将制得的无细胞提取液进行α-氨基酸酯酶的固定化，生成交联聚集体。用分子量4000-10000的聚乙二醇进行酶聚集反应，用于聚集体交联的戊二醛相对浓度为1×10-2-5×10-2mmol/mg蛋白。
按照原型方法生成的固定化α-氨基酸酯酶的活性以干燥载体计算达到1300-2200U/g(干重)(以头孢氨苄合成计)。
按原型方法制备非均相生物催化剂的主要缺点：
酶的分离程序复杂，步骤多。使用菌丝体细胞的冷冻过程给放大生产造成了困难。
作为中间产品的无细胞提取液的酶活性水平不够高。
最终产品非均相生物催化剂(即固定化α-氨基酸酯酶)的酶活性不够高。
本发明用于解决以下问题：
1、通过革除菌丝体冷冻步骤简化了α-氨基酸酯酶分离的程序，这在大规模生产情况下特别有意义。
2、提高了α-氨基酸酯酶分离方法的专属性，得到的无细胞提取液的纯度(比活)明显增加。
3、无细胞提取液无需另外纯化，用它制备的非均相生物催化剂(无载体的固定化α-氨基酸酯酶)的合成酶活性增加。
一些问题通过革除冷冻预处理步骤得以解决，破碎细胞的程序中使用乙酸丁酯，再在相应的优化条件下进行酶的提取。α-氨基酸酯酶提取过程中终点的选择也已优化。细胞破碎的速度与作为维持稳定pH值的氨滴定溶液的消耗速度相一致。选择终点的判据是过程起始点和过程终止点时滴定溶液消耗的速度之比值(Kopt)。Kopt判据的过程优化目的在于使制得的无细胞提取液在定量活性收率条件下酶的比活性尽可能达到最大。比较采用冷冻预处理程序，用乙酸丁酯破碎细胞时天然未冷冻的菌丝体细胞的初始破裂速度低，因此Kopt值要比前者小；一段时间后，细胞破裂的速度就会达到一定水平，但对α-氨基酸酯酶提取的选择性则高于原型方法。作为本发明程序的结果，确保能在定量活性收率情况下制得高纯度的无细胞提取液(比活性5.5-9.5U/mg蛋白)。制得的无细胞提取液宜于直接进行α-氨基酸酯酶的无载体固定化，即通过聚集体交联以蛋白质聚集体的形式来沉淀目标酶和其它杂蛋白。本法比原型方法制得的无细胞提取液的纯度要高，可保障生产出更高活性的非均相生物催化剂，因为α-氨基酸酯酶的含量在蛋白聚集体和最终产品中更高一些。
本发明非均相生物催化剂的制备方法构成如下：
取含有α-氨基酸酯酶的红纹黄单胞菌天然菌丝体细胞悬浮于缓冲溶液中，所得悬浮溶液用乙酸丁酯破碎细胞，把酶提取到水相中。这一过程在优化的条件下进行，其操作参数有悬浮液中菌丝体细胞的浓度、反应混合物中乙酸丁酯的浓度、温度和pH梯度范围。此过程中pH值先是自发地下降，随后通过滴加氨溶液维持在一个特定的范围内。记录氨溶液的消耗量。可保障有最佳结果的pH梯度的范围取决于所使用的红纹黄单胞菌菌株及其生物培养合成的条件，并在系列预实验中做过测定。当氨溶液的消耗速度与初始速度比较出现降低，达到实验测定的Kopt时酶的提取过程即行终止。控制到达Kopt时间是菌丝体细胞破裂和酶提取过程持续的时长，数值从5-8小时不等，依初始菌丝体细胞生化参数和所实施工艺所选择的条件而异。
破碎的菌丝体细胞可用任何可行的有效方法(如离心法)和无细胞提取液分离，分离后再行洗涤。洗涤液并入无细胞提取液中。所得无细胞提取液是澄清透明的，比活性达5.5～9.5U/mg蛋白(以头孢氨苄合成计)。相对于初始菌丝体细胞的酶活，酶分离阶段的活性收率为(100±5)％，这是在实验误差值内的定量收率。
前述无细胞提取液无需任何纯化，可直接用于α-氨基酸酯酶的无载体固定化过程来生成蛋白(酶)聚集体及其交联聚集体。分子量6000-8000的聚乙二醇用作蛋白聚集体的沉淀反应。把聚乙二醇在不断搅拌下加入并溶解到无细胞提取液中，数量要能完全沉淀目标酶。蛋白(酶)聚集体的修饰和交联使用戊二醛，反应在特别优化的戊二醛浓度和修饰时长的条件下进行。非均相生物催化剂呈交联蛋白(酶)聚集体形式，用真空过滤从反应混合物中分离出来，再在多孔玻璃漏斗上洗涤。
如此产生的非均相生物催化剂(无载体固定化α-氨基酸酯酶)干块的活性为2400～3600U/g(干重)(以头孢氨苄合成计)。
对照原型方法，制备非均相生物催化剂的本发明方法得到的结果见表2。利用2株不同的红纹黄单胞菌菌株来证明革除掉冷冻处理菌丝体细胞预处理步骤的优点。
本发明方法制备非均相生物催化剂的优点：
1、实现了α-氨基酸酯酶的分离过程的简化，不再有耗费时间和动力的菌丝体细胞冷冻预处理阶段，这对于上规模的生产是特别重要的。
2、中间产品(无细胞提取液)的比活性增加2倍，在同样酶提取液量收率时，从原型方法的2.50-4.5U/mg蛋白增加到5.5～9.5U/mg蛋白。
3、非均相生物催化剂(固定化α-氨基酸酯酶)的合成酶活性提高约1.8倍(以头孢氨苄计)，本发明方法为2400-3600U/g干重，原型方法为1300-2200U/g干重。
表2除去冷冻作用对无细胞提取液、非均相生物催化剂的影响及其制备的效能
具体实施方式
本发明通过如下非均相生物催化剂制备方法的实例来阐明。在所有下述实例中，酶制剂的活性均以头孢氨苄合成来计算。在下列条件下测定目标产物形成的初始速度：pH6.0 6.2，温度(40±1)℃，底物浓度：7-ADCA(0.040±0.002)mol/l，苯甘氨酸甲酯(0.080±0.004)mol/l。制剂中蛋白的含量用传统办法测得，制剂中干物质含量在把制剂于(105±1)℃下干燥至恒重后用称量。
实施例1采用Xanthomonas rubrilineans VKPM B-9915菌株按本发明方法制备非均相生物催化剂的实例：
取俄罗斯国立工业微生物库(VKPM)Xanthomonas rubrilineans VKPMB-9915菌株的菌丝体细胞253g，其干重含量为21.0％，合成酶活性92.3U/g(湿重)，440U/g(干重)。把天然菌丝体细胞转移到2.5升反应瓶中，并配以夹套，温度控制装置，机械搅拌器，pH计和pH检测系统。
用乙酸丁酯处理菌丝体细胞和将酶提取到水相的过程在以上的反应瓶中进行，反应条件是：悬浮液中菌丝体细胞的浓度为40mg(干重)/ml；乙酸丁酯的浓度为4.5vol.％；30℃；pH梯度；连续搅拌。不经冷冻的菌丝体细胞悬浮于Tris-HCl缓冲液，0.05mol/l，pH7.8；考虑到使用的是湿的菌丝体细胞，缓冲液用量应能满足细胞悬浮液制剂中悬浮细胞的浓度达到要求。在实施过程中，取1130ml缓冲液来制备1330ml悬浮液。天然的菌丝体细胞在不高于20℃下悬浮于缓冲液中，向其中加入巯基乙醇160μl以稳定酶。然后再加入60ml乙酸丁酯，此时提取过程开始，加热，将反应器温度维持在30℃，控制初始pH值不得高于pH8.0。在反应过程中pH值会下降，从自然pH梯度降至pH7.1。在到达pH7.1时，打开滴定系统，向反应混合物中滴加12.5％氨溶液以维持pH7.1±0.1。要记录全过程中氨溶液的消耗量。6小时后，氨溶液的消耗速度与初始值比较降低1.8倍(Kopt＝1.8)时，酶提取过程即行终止。
将反应混合物快速冷却至15-20℃，用絮凝剂处理，以便于分离掉破碎的菌丝体细胞。用作絮凝剂的是水溶性的多聚阴离子含有季铵盐基，例如FlocatonPPS-400。用离心法把破碎的菌丝体细胞从无细胞提取液中分离掉，残渣用270ml乙酸钠缓冲液(乙酸钠0.1mol/l，乙酸钙0.005mol/l，pH6.5，)洗涤，洗涤液离心分出，并入无细胞提取液中。将制得的无细胞提取液调节到pH6.8-7.2范围内。
至此，制得1500ml澄清的无细胞提取液，具备如下特性：酶活性为15.6U/ml，蛋白含量为2.0mg/ml，比活性为7.8U/mg蛋白。从菌丝体细胞计算，酶分离提取收率ηisol＝100％。
酶固定化程序是在装有机械搅拌、置于冰浴的2升反应器中进行的。把1500ml无细胞提取液加入反应器，冷却至2-4℃，取分子量6000-8000的聚乙二醇420g(相当于每毫升无细胞提取液0.28g)加到无细胞提取液中以确保目标酶沉淀完全。反应混合物搅拌15分钟(至沉淀剂全溶)，再加入42ml 25％戊二醛水溶液(3.5×10-2mmol/mg蛋白)。反应混合物在2-4℃下轻微摇动，孵化2小时，将制得的固体颗粒减压滤出，在多孔玻璃漏斗上洗涤至滤液无色。
制得17.3g以交联蛋白(酶)聚集体形态的湿的无载体非均相生物催化剂，具备如下特性：干重含量2.8％，合成酶活性790U/g(湿重)，或3460U/g(干重)。α-氨基酸酯酶的活性收率ηim＝58.4％。
实施例2用Xanthomonas rubrilineans CGMCC No.2339菌株按本发明方法制备非均相生物催化剂的实例：
取中国普通微生物菌种保藏管理中心Xanthomonas rubrilineans CGMCC No.2339菌株的菌丝体细胞110g，其干重含量为20.0％，合成酶活性84.0U/g(湿重)，420U/g(干重)。
用乙酸丁酯处理细胞和将酶提取到水相的过程按照例1方法进行：悬浮液中菌丝体细胞的浓度为50mg(干重)/ml；乙酸丁酯的浓度为4.0vol.％；28℃；连续搅拌；pH梯度8.0-7.1，此后维持在7.1±0.1。各反应试剂的量：350ml缓冲液，65μl巯基乙醇，18ml乙酸丁酯。悬浮液体积为440ml。提取过程耗时7小时50分钟，当氨溶液消耗速度降到初始值的2.0倍时终止提取。
用絮凝剂处理反应混合物以及制备无细胞提取液按照例1的方法进行，得1550ml澄清的无细胞提取液。它具备如下特性：合成酶活性为17.0U/ml，蛋白含量为2.1mg/ml，比活性为8.1U/mg蛋白。从菌丝体细胞计算，酶分离提取收率ηisol＝99.8％。
按照例1描述的方法进行酶固定化程序，所不同的是无细胞提取液550ml，分子量8000的聚乙二醇138g，25％戊二醛水溶液6.9ml(1.5×10-2mmol/mg蛋白)。
制得的以交联蛋白(酶)聚集体形态的湿的无载体非均相生物催化剂7.64g，具备如下特性：干重含量21.7％，合成酶活性780U/g(湿重)，或3590U/g(干重)。α-氨基酸酯酶固定化过程的活性收率ηim＝63.7％。
实施例3水性介质中合成头孢氨苄：
取100ml玻璃反应瓶装以外套，温度控制装置，机械搅拌，pH计和pH检测系统，头孢氨苄的酶法合成在此瓶中进行，反应条件是：水性介质，10℃；pH6.0-6.2；酶浓度(15±1)U/ml，7-ADCA初始浓度25mg/ml，苯甘氨酸甲酯与7-ADCA摩尔比3.2∶1.计算初始反应混合物中试剂的浓度时要考虑到生物催化剂中含有的水。
底物溶液制备：取1.25g(5.84mmol)7-ADCA和40ml蒸馏水加入有电磁搅拌的100ml玻璃烧杯中，再加入12.5％氨水溶液，控制pH直至7-ADCA溶解，在此过程中pH值不得高于8.2。将3.77g(18.70mmol)苯甘氨酸甲酯盐酸盐于搅拌下分次加到以上溶液中，通过加入12.5％氨水溶液不使pH低于6.0。待苯甘氨酸甲酯盐酸盐溶解后，把溶液定量转移到量筒中，用水将体积调节至50ml。
头孢氨苄合成：把制得的底物溶液转移到反应器中，温度调至10℃，在充分搅拌下将例1得到的生物催化剂0.95g(酶活790U/g(湿重)，干物质含量22.8％)加进反应器。从加入生物催化剂的时刻起即视作合成反应开始。反应过程在10℃下进行65分钟，使用自动滴定系统加入12.5％氨水溶液维持pH6.0-6.2。过程完成时反应混合物经减压过滤分离出生物催化剂，用5ml水洗涤，洗涤液并入滤液，得合并滤液，其中头孢氨苄的含量以HPLC法测定之。按7-ADCA计算，头孢氨苄的收率为86.2％。
实施例4酶法合成氨苄西林：
氨苄西林酶法合成工艺在例3描述的反应器中进行，条件是：初始反应混合物中乙二醇的浓度30 vol.％；15℃；pH6.0-6.2；酶含量(30±1)U/ml；6-APA(6-aminopenicillanic acid，6-氨基青霉烷酸)30mg/ml；苯甘氨酸甲酯盐酸盐与6-APA在初始反应混合物中摩尔比为3.5∶1。
底物溶液制备：取1.50g(6.94mmol)6-APA和4.90g(24.31mmol)苯甘氨酸甲脂盐酸盐按例3描述的程序制备，但不同点是：使用25ml蒸馏水和15ml乙二醇溶解6-APA，pH值不超过7.5。
氨苄西林合成：按例3描述的程序制备，差别是：反应进行的时间为90分钟，15℃，1.98g生物催化剂(按例2法制得，酶活780U/g(湿重)，干物质含量21.7％)。以6-APA计，氨苄西林收率为84.9％。
Claims (4)
1.一种α-氨基酸酯水解酶制备非均相生物催化剂的方法，其步骤如下：
1）取VKPM B-9915或CGMCC No.2339菌株的菌丝体细胞不做冷冻处理而直接悬浮于Tris-HCl缓冲液中，加入巯基乙醇以稳定酶；
2）加入乙酸丁酯破碎菌丝体细胞，加热，将反应器温度维持在30℃，控制初始pH值不得高于pH8.0，在反应过程中pH值会下降，在下降到pH7.1时，滴加12.5%氨溶液以维持pH 7.1±0.1，CGMCC NO.2339菌株滴定7小时50分钟后，氨溶液的消耗速度与初始值比较降低2.0倍时，VKPM B-9915菌株滴定时间为6小时后，氨溶液的消耗速度与初始值比较降低1.8倍时，酶提取过程完成；
3）将酶提取液快速冷却至15-20℃，加入絮凝剂，离心分离破碎的菌丝体细胞，得无细胞提取液，残渣用乙酸钠缓冲液洗涤，洗涤液离心分出，并入无细胞提取液中，调节pH到6.8-7.2范围内；
4）把无细胞提取液加入反应器，冷却至2-4℃，加聚乙二醇到无细胞提取液中，搅拌15分钟，再加入25%戊二醛水溶液反应混合物在2-4℃下轻微摇动，孵化2小时，将制得的固体颗粒减压滤出，洗涤至滤液无色制得交联蛋白聚集体形态的湿的无载体非均相生物催化剂。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于菌丝体细胞不做冷冻处理而直接悬浮于Tris-HCl缓冲液中时其温度不高于20℃。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于用作絮凝剂的是水溶性的多聚阴离子含有季铵盐基的Flocaton PPS-400。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于聚乙二醇的分子量为6000-8000。
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Granted publication date: 20130605 Termination date: 20190326 |