RU2381273C2 - Способ получения гетерогенного биокатализатора, биокатализатор на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого биокатализатора - Google Patents
Способ получения гетерогенного биокатализатора, биокатализатор на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого биокатализатора Download PDFInfo
- Publication number
- RU2381273C2 RU2381273C2 RU2008107953/13A RU2008107953A RU2381273C2 RU 2381273 C2 RU2381273 C2 RU 2381273C2 RU 2008107953/13 A RU2008107953/13 A RU 2008107953/13A RU 2008107953 A RU2008107953 A RU 2008107953A RU 2381273 C2 RU2381273 C2 RU 2381273C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- biocatalyst
- enzyme
- cell
- biomass
- synthesis
- Prior art date
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 235
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 235
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 133
- 239000011942 biocatalyst Substances 0.000 title claims abstract description 125
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 67
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 66
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 title claims abstract description 17
- -1 alpha-aminoacid ethers Chemical class 0.000 title claims abstract description 15
- GCBWDZYSLVSRRI-UHFFFAOYSA-N 3-aminoazetidin-2-one Chemical compound NC1CNC1=O GCBWDZYSLVSRRI-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims abstract description 12
- 235000008206 alpha-amino acids Nutrition 0.000 title claims abstract description 10
- 230000009471 action Effects 0.000 title claims abstract description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title abstract description 16
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 78
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 claims abstract description 61
- 239000000284 extract Substances 0.000 claims abstract description 47
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 40
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 claims abstract description 39
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 39
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims abstract description 27
- 241001600124 Acidovorax avenae Species 0.000 claims abstract description 21
- DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N Butyl acetate Natural products CCCCOC(C)=O DKPFZGUDAPQIHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N hexanoic acid Chemical compound CCCCCC(O)=O FUZZWVXGSFPDMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 18
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 14
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 14
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims abstract description 12
- 108090000604 Hydrolases Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 102000004157 Hydrolases Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims abstract description 9
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims abstract description 9
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 8
- 241000589634 Xanthomonas Species 0.000 claims abstract description 8
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 claims abstract description 4
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims abstract description 3
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims abstract description 3
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 claims abstract 2
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 19
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 claims description 12
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 7
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 6
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000009467 reduction Effects 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims 1
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims 1
- 230000008569 process Effects 0.000 abstract description 37
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 20
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 4
- 229960000587 glutaral Drugs 0.000 abstract 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 102
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 54
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 40
- 229940106164 cephalexin Drugs 0.000 description 40
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 30
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 26
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 19
- NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 7beta-aminodeacetoxycephalosporanic acid Chemical compound S1CC(C)=C(C(O)=O)N2C(=O)[C@@H](N)[C@@H]12 NVIAYEIXYQCDAN-CLZZGJSISA-N 0.000 description 16
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 15
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 13
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 13
- NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 6-aminopenicillanic acid Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]1C(C)(C)S[C@@H]2[C@H]([NH3+])C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-ALEPSDHESA-N 0.000 description 11
- NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 6beta-amino-penicillanic acid Natural products OC(=O)C1C(C)(C)SC2C(N)C(=O)N21 NGHVIOIJCVXTGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 241000589655 Xanthomonas citri Species 0.000 description 11
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 10
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 10
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 7
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 7
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 description 6
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 6
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 6
- 241000589212 Acetobacter pasteurianus Species 0.000 description 5
- 239000005995 Aluminium silicate Substances 0.000 description 5
- 108010093096 Immobilized Enzymes Proteins 0.000 description 5
- 108010034561 alpha-amino acid esterase Proteins 0.000 description 5
- 235000012211 aluminium silicate Nutrition 0.000 description 5
- LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N amoxicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960003022 amoxicillin Drugs 0.000 description 5
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 5
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 5
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 5
- 239000003782 beta lactam antibiotic agent Substances 0.000 description 5
- QYIYFLOTGYLRGG-GPCCPHFNSA-N cefaclor Chemical compound C1([C@H](C(=O)N[C@@H]2C(N3C(=C(Cl)CS[C@@H]32)C(O)=O)=O)N)=CC=CC=C1 QYIYFLOTGYLRGG-GPCCPHFNSA-N 0.000 description 5
- 229960005361 cefaclor Drugs 0.000 description 5
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 5
- NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N kaolin Chemical compound O.O.O=[Al]O[Si](=O)O[Si](=O)O[Al]=O NLYAJNPCOHFWQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N p-Hydroxyampicillin Natural products O=C1N2C(C(O)=O)C(C)(C)SC2C1NC(=O)C(N)C1=CC=C(O)C=C1 LSQZJLSUYDQPKJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L calcium acetate Chemical compound [Ca+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O VSGNNIFQASZAOI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000001639 calcium acetate Substances 0.000 description 4
- 235000011092 calcium acetate Nutrition 0.000 description 4
- 229960005147 calcium acetate Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 4
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 239000007974 sodium acetate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 4
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 4
- 238000003828 vacuum filtration Methods 0.000 description 4
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000006286 aqueous extract Substances 0.000 description 3
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000002132 β-lactam antibiotic Substances 0.000 description 3
- 229940124586 β-lactam antibiotics Drugs 0.000 description 3
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589220 Acetobacter Species 0.000 description 2
- 108700023418 Amidases Proteins 0.000 description 2
- 229930186147 Cephalosporin Natural products 0.000 description 2
- LJCWONGJFPCTTL-SSDOTTSWSA-N D-4-hydroxyphenylglycine Chemical compound [O-]C(=O)[C@H]([NH3+])C1=CC=C(O)C=C1 LJCWONGJFPCTTL-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 2
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 2
- 108010073038 Penicillin Amidase Proteins 0.000 description 2
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 2
- 241000589516 Pseudomonas Species 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 2
- 102000005922 amidase Human genes 0.000 description 2
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 229940124587 cephalosporin Drugs 0.000 description 2
- 150000001780 cephalosporins Chemical class 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 229940079919 digestives enzyme preparation Drugs 0.000 description 2
- DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N ethyl mercaptane Natural products CCS DNJIEGIFACGWOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- BHFLUDRTVIDDOR-MRVPVSSYSA-N methyl (2r)-2-amino-2-phenylacetate Chemical compound COC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 BHFLUDRTVIDDOR-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 2
- 150000004702 methyl esters Chemical class 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 2
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JBJJTCGQCRGNOL-SSDOTTSWSA-N (2r)-2-amino-2-cyclohexa-1,4-dien-1-ylacetic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](N)C1=CCC=CC1 JBJJTCGQCRGNOL-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- ZCEXLMDGVLJRLC-SDMSXHDGSA-N (5r)-6-amino-4-thia-1-azabicyclo[3.2.0]heptan-7-one Chemical compound S1CCN2C(=O)C(N)[C@H]21 ZCEXLMDGVLJRLC-SDMSXHDGSA-N 0.000 description 1
- QITDACOZCQXYQY-BAFYGKSASA-N (6r)-7-amino-5-thia-1-azabicyclo[4.2.0]oct-2-en-8-one Chemical compound S1CC=CN2C(=O)C(N)[C@H]21 QITDACOZCQXYQY-BAFYGKSASA-N 0.000 description 1
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 description 1
- ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N D-alpha-phenylglycine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)C1=CC=CC=C1 ZGUNAGUHMKGQNY-SSDOTTSWSA-N 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N DEAE-cellulose Chemical compound OC1C(O)C(O)C(CO)O[C@H]1O[C@@H]1C(CO)OC(O)C(O)C1O GUBGYTABKSRVRQ-WFVLMXAXSA-N 0.000 description 1
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 230000006181 N-acylation Effects 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 241000947836 Pseudomonadaceae Species 0.000 description 1
- XERQKTRGJIKTRB-CIUDSAMLSA-N Ser-His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CO)N)CC1=CN=CN1 XERQKTRGJIKTRB-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- 241001148118 Xanthomonas sp. Species 0.000 description 1
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 1
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 1
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000001370 alpha-amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- FUBBGQLTSCSAON-PBFPGSCMSA-N cefaloglycin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)COC(=O)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 FUBBGQLTSCSAON-PBFPGSCMSA-N 0.000 description 1
- 229950004030 cefaloglycin Drugs 0.000 description 1
- 229960002588 cefradine Drugs 0.000 description 1
- 210000003850 cellular structure Anatomy 0.000 description 1
- RDLPVSKMFDYCOR-UEKVPHQBSA-N cephradine Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CCC=CC1 RDLPVSKMFDYCOR-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 1
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 1
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 1
- 238000003795 desorption Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 238000002386 leaching Methods 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000012038 nucleophile Substances 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 235000019371 penicillin G benzathine Nutrition 0.000 description 1
- 229940056360 penicillin g Drugs 0.000 description 1
- 150000002960 penicillins Chemical class 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 239000012716 precipitator Substances 0.000 description 1
- JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-O pyridinium Chemical compound C1=CC=[NH+]C=C1 JUJWROOIHBZHMG-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 125000001453 quaternary ammonium group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229920003169 water-soluble polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000003952 β-lactams Chemical class 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
Изобретение относится к биотехнологии. Способ получения гетерогенного биокатализатора для ферментативного синтеза аминобета-лактамного антибиотика на основе внутриклеточной гидролазы эфиров альфа-аминокислот из бактерий рода Xanthomonas, включающий разрушение биомассы клеток Xanthomonas rubrilineans, экстракцию из нее фермента в водную фазу и последующую его иммобилизацию. Причем разрушение клеток осуществляют поэтапно, сначала нарушая их целостность криогенным воздействием, а затем обрабатывая водную суспензию размороженных клеток бутилацетатом. Экстракцию фермента в водную фазу проводят при нагревании обработанной клеточной суспензии сначала в условиях спонтанно устанавливающегося градиента рН, а затем при постоянном значении рН. Получаемый бесклеточный экстракт используют для процедуры иммобилизации фермента путем его осаждения полиэтиленгликолем в виде ферментных агрегатов и их последующей поперечной сшивки в присутствии глутарового альдегида. Полученный таким образом гетерогенный биокатализатор содержит до 0,95 г белка/г сухого биокатализатора и обладает синтетазной активностью до 2200 МЕ/г сухого биокатализатора. Изобретение позволяет повысить эффективность процедуры получения биокатализатора, повысить активность и стабильность получаемого биокатализатора. 3 н. и 3 з.п. ф-лы, 2 ил., 4 табл.
Description
Область техники
Заявляемая группа изобретений относится к получению гетерогенных биокатализаторов для ферментативного синтеза аминобета-лактамного антибиотика.
Уровень техники
Гидролазами эфиров альфа-аминокислот (АЭГ) называют ферменты, катализирующие гидролиз эфиров альфа-аминокислот, гидролиз ациламидной связи различных цефалоспоринов и пенициллинов, а также N-ацилирование 7-аминоцефема и 6-аминопенама производными альфа-аминокислот (эфирами или амидами). Подобная субстратная специфичность позволяет использовать эти ферменты в качестве биокатализаторов процессов синтеза цефалоспоринов и пеницициллинов, содержащих в боковой цепи аминогруппу в альфа-положении аминоцефалоспоринов и аминопенициллинов, составляющих группу аминобета-лактамных антибиотиков.
Исследования структуры АЭГ показали, что эти ферменты относятся к классу α/β-гидролаз и содержат в активном центре каталитическую триаду Ser-His-Asp.По структуре, строению активного центра, субстратной специфичности и каталитическим свойствам АЭГ принципиально отличаются от таких ацилаз бета-лактамов как, например, пенициллин G ацилаза, также используемых для синтеза бета-лактамных антибиотиков. Эти ферменты структурно относятся к классу N-концевых гидролаз, содержащих в активном центре N-концевой остаток β-цепи, выступающий нуклеофилом при каталитическом акте.
Применительно к синтезу аминобета-лактамных антибиотиков известны ферменты из бактерий семейства Pseudomonadaceae, являющиеся гидролазами эфиров альфа-аминокислот [GB 1382255, Jpn. J.Antibiot Suppl. 30S: 230 (1977), CA 1044627, RU 2136759, KR 20010069097]. Наиболее полно изучены биохимические, физико-химические и каталитические свойства АЭГ из Acetobacter turbidans [Enzyme Microb. Technol. 9:339 (1987)], Xanthomonas citri [Agric. Biol. Chem. 44: 1069 (1980); Agric. Biol. Chem. 44: 1663 (1980)], Xanthomonas rubrilineans [Биохимия 55 (12): 2226 (1990); Enzyme Microb. Technol. 15: 965 (1993)], Pseudomonas melanogenum [BBA - Protein Struct.& Molecul. Enzymol. 1040 (1): 12 (1990)]. Показано, что эти ферменты обладают субъединичной структурой. Фермент из Pseudomonas melanogenum состоит из двух субъединиц с молекулярной массой 70000-72000 каждая, ферменты из Acetobacter turbidans, Xanthomonas citri и Xanthomonas rubrilineans состоят из четырех субъединиц такой же молекулярной массы. Биохимические и каталитические свойства АЭГ из различных источников близки. Установлена кристаллическая структура, определен состав активного центра и клонированы гены для ферментов из Xanthomonas citri [WO 02086111; J. Biol. Chem. 278: 23076 (2003); WO 02086127] и Acetobacter turbidans [WO 02086111; J.Biol. Chem. 277: 28474 (2002)].
Разработка методов ферментативного синтеза антибиотиков с использованием АЭГ требует создания технологических гетерогенных биокатализаторов, в том числе путем иммобилизации выделенных из биомассы клеток ферментов. Процедуры получения биокатализаторов на основе АЭГ состоят из трех основных этапов: (1) выделение фермента из биомассы клеток путем ее разрушения и экстракции фермента в водную фазу (получение бесклеточного экстракта); (2) получение ферментного препарата той или иной степени очистки; (3) иммобилизация фермента на каком-либо носителе.
Известны способы разрушения биомассы бактериальных клеток, содержащих АЭГ, под давлением (French Press) [Enzyme Microb. Technol. 15: 965 (1993); Enzyme Microb. Technol. 25: 336 (1999)] или путем гомогенизации [BBA - Protein Struct.& Molecul. Enzymol. 1040 (1): 12 (1990)]. Эти способы приводят к тотальному разрушению клеточных структур и позволяют практически полностью экстрагировать целевой фермент из разрушенной клеточной биомассы, обеспечивая высокий выход активности на стадии получения бесклеточного экстракта (до 100%). Однако белки и другие водорастворимые вещества также легко переходят в водную фазу из полностью разрушенных клеток, поэтому получаемый бесклеточный экстракт содержит много балластных веществ и имеет низкую удельную активность. Описан способ разрушения биомассы бактериальных клеток, содержащих АЭГ, с помощью ультразвука в присутствии поверхностно-активных веществ [Biotechnol. Bioeng. 23 (2): 361 (1981)]. При использовании этого относительно мягкого способа клетки разрушаются не полностью, что приводит к снижению выхода активности при экстракции фермента, однако обеспечивает более высокую чистоту беклеточного экстракта. Способ разрушения биомассы бактериальных клеток, содержащих АЭГ, под действием несмешивающегося с водой органического растворителя бутилацетата [Биохимия 55 (12): 2226 (1990); Zaslavskaya P.L.,. Biotechnol. Appl. Biochem. 18: 299 (1993)] действует более избирательно, чем обсуждавшиеся выше, однако его эффективность характеризуется недостаточно высоким выходом активности.
| Таблица 1 Сопоставление различных способов разрушения биомассы клеток бактерий рода Xanthomonas - продуцентов АЭГ |
||||
| Микроорганизм | Способ разрушения клеток | Выход процедуры разрушения, % | Удельная активность бесклеточного экстракта, МЕ/мг белка | Ссылка |
| Xanthomonas citri | Ультразвук в присутствии поверхностно-активных веществ | 80 | 2 | Choi W.G. et al. Biotechnol. Bioeng. 23 (2): 361 (1981) -Ближайший аналог |
| Xanthomonas rubrilineans | Под давлением (French Press) | 100 | Менее 1 | Blinkovsky A.M. и др. Enzyme Microb. Technol. 15: 965 (1993) |
| Xanthomonas rubrilineans | Бутилацетат (10 об.%),40°С, рН 8. | 70-90 | Менее 1 | Крестьянова И.Н. и др. Биохимия 55 (12): 2226 (1990); Zaslavskaya P.L. et al. Biotechnol. Appl. Biochem. 18:299 (1993) |
| Xanthomonas rubrilineans | Бутилацетат (4,5 об.%), 30°С, градиент рН | 100 | 2,5-4,5 | Заявляемый способ (см. пример 1 и 3) |
В таблице 1 сопоставлены различные способы разрушения биомассы клеток бактерий рода Xanthomonas с целью экстракции из них фермента АЭГ. Величины удельной активности бесклеточного экстракта даны в международных единицах (ME)* (* - За международную единицу (ME) ферментативной активности препарата в отношении какой-либо биокаталитической трансформации принимают такое количество этого препарата, которое катализирует превращение 1 мкмоля субстрата (или образование 1 мкмоля продукта) в выбранных условиях за 1 минуту), отнесенных к миллиграмму белка, и во всех случаях приведены к активности по синтезу антибиотика цефалексина с использованием экспериментальных соотношений между гидролазными и синтетазной активностью.
Известны способы получения АЭГ из различных бактериальных источников в водорастворимой форме, направленные на получение высокоочищенных ферментных препаратов, вплоть до получения гомогенных белков [Enzyme Microb. Technol. 9: 339 (1987); BBA - Protein Struct.& Molecul. Enzymol. 1040 (1): 12 (1990); Биохимия 55 (12): 2226 (1990); Enzyme Microb. Technol. 15: 965 (1993)]. Эти способы обязательно включают в себя несколько последовательных стадий хроматографической очистки фермента на различных сорбентах и непригодны для использования при получении технологических биокатализаторов из-за трудоемкости и продолжительности процедуры, а также низких выходов активности.
Известны способы получения гетерогенных биокатализаторов на основе АЭГ из Acetobacter turbidans путем выделения фермента из биомассы клеток, его частичной очистки и последующей иммобилизации. Способ выделения АЭГ, состоящий в механическом разрушении клеточной биомассы под давлением, экстракции фермента в водную фазу и частичной очистке АЭГ путем обработки водного экстракта стрептомицином с последующим диализом [Enzyme Microb.Technol. 25: 336 (1999)] не охарактеризован с точки зрения выхода активности процедуры. Получаемый грубоочищенный препарат АЭГ имеет очень низкую удельную активность, определяемую в отношении гидролиза бензилпенициллина, - 0,06 МЕ/мг белка. Способ ковалентной иммобилизации получаемого таким способом грубоочищенного фермента на модифицированной глутаровым альдегидом агарозе [Enzyme Microb.Technol. 25: 336 (1999)], а также усовершенствованный способ его иммобилизации, включающий дополнительную модификацию иммобилизованного на агарозе фермента альдегид декстраном [J. Mol. Catal. В: Enzym. 11: 633 (2001)], трудоемки и требуют специальной подготовки носителя. Указанные способы не охарактеризованы с точки зрения выхода активности процедуры иммобилизации и абсолютной активности биокатализатора в отношении синтеза какого-либо антибиотика (синтетазной активности). Известен также способ более глубокой очистки АЭГ из Acetobacter turbidans и его ковалентной иммобилизации на агарозе с последующей модификацией альдегид декстраном [Biomacromolecules 2(1): 95 (2001)]. Грубоочищенный водный экстракт с удельной активностью 0,1 МЕ/мг белка, определяемой в отношении гидролиза метилового эфира Д-фенилглицина (МЭФГ), подвергают двухстадийной хроматографической очистке на СМ-52 и фенил-сефарозе. Выход активности процедуры очистки составляет 62% по отношению к грубоочищенному экстракту, однако общий выход, по отношению к биомассе клеток не известен. АЭГ очищают в 420 раз по сравнению с грубоочищенным водным экстрактом, достигая удельной активности 42 МЕ/мг белка. Процедура иммобилизации очищенной таким образом АЭГ не охарактеризована с точки зрения выхода активности и абсолютной синтетазной активности продукта. Данный способ получения биокатализатора очень трудоемок и малоэффективен из-за применения процедуры глубокой очистки фермента перед иммобилизацией и сложной многостадийной процедуры иммобилизации.
Наиболее близким к заявляемому способу получения гетерогенного биокатализатора на основе внутриклеточной гидролазы эфиров альфа-аминокислот из бактерий рода Xanthomonas является способ получения биокатализатора на основе фермента из микроорганизма того же рода, а именно из Xanthomonas citri [Biotechnol. Bioeng. 23 (2): 361 (1981)]. Как и заявляемый способ, ближайший аналог отражает полную процедуру получения гетерогенного биокатализатора, исходя из биомассы клеток (фиг.1).
В качестве ближайшего аналога для заявляемого гетерогенного биокатализатора на основе внутриклеточной гидролазы эфиров альфа-аминокислот из бактерий рода Xanthomonas выбран гетерогенный биокатализатор на основе АЭГ из Xanthomonas citri, иммобилизованной на каолине, получаемый по способу [Biotechnol. Bioeng. 23 (2): 361 (1981)], содержащий не более 0,08 г белка/г сухого биокатализатора и характеризующийся синтезной активностью 510 МЕ/г сухого биокатализатора.
В качестве ближайшего аналога для заявляемого способа ферментативного синтеза аминобета-лактамного антибиотика путем ацилирования ключевого бета-лактамного соединения соответствующим производным эфиров Д-аминофенилуксусной кислоты выбран способ синтеза аминоцефалоспоринового антибиотика цефалексина путем ацилирования 7-аминодезацетоксицефалоспорановой кислоты (7-АДЦК) метиловым эфиром Д-аминофенилуксусной кислоты под действием гетерогенного биокатализатора на основе АЭГ из Xanthomonas citri [Biotechnol. Bioeng. 23 (2): 361 (1981)].
Способ получения гетерогенного биокатализатора согласно ближайшему аналогу состоит в следующем. Биомассу клеток подвергают ультразвуковой дезинтеграции в присутствии поверхностно-активных веществ и экстрагируют фермент в водную фазу. Получают бесклеточный экстракт с удельной активностью 2 МЕ/мг белка, определяемой по синтезу цефалексина. Выход активности на стадии получения бесклеточного экстракта (ηизвл) достигает 79%. АЭГ концентрируют из бесклеточного экстракта фракционным осаждением сульфатом аммония. После растворения ферментного осадка препарат обессоливают путем диализа и подвергают двухстадийной хроматографической очистке сначала на ДЕАЕ-целлюлозе, а затем на сефарозе 4-В. После каждой из хроматографических стадий ферментный препарат лиофильно сушат. Выход синтетазной активности на стадиях концентрирования и очистки АЭГ (ηоч) составляет 28%, при этом степень очистки препарата достигает 30 раз. Выход процедуры получения ферментного препарата, пригодного для иммобилизации (ηФП), определяется выходами стадий извлечения и очистки фермента и составляет 22%: (ηФП=ηизвл·ηоч).
Полученный частично очищенный препарат АЭГ с удельной активностью в отношении синтеза цефалексина 60 МЕ/мг белка иммобилизуют путем адсорбции на бентоните или каолине. Выход активности процедуры иммобилизации (ηим) составляет 71÷92% в зависимости от используемого носителя. Общий выход процесса получения гетерогенного биокатализатора от биомассы клеток (ηобщ) согласно ближайшему аналогу - 16-20%, продолжительность процедуры - не менее 70 часов.
Лучшим из биокатализаторов, полученных по способу согласно ближайшему аналогу, является АЭГ, иммобилизованная на каолине. Этот гетерогенный биокатализатор содержит не более 0,08 г белка/г сухого биокатализатора и обладает синтетазной активностью (в отношении синтеза цефалексина), отнесенной к массе сухого носителя, 510 МЕ/г сух. Операционные испытания его в процессе синтеза цефалексина при 30°С с использованием низкой (4 мг/мл) начальной концентрации субстрата 7-АДЦК показывают, что через 10 циклов остаточная активность биокатализатора составляет 85% от исходной. Период полуинактивации биокатализатора, рассчитанный по этим данным, составляет τ1/2=42 цикла. Однако обработка представленных в ближайшем аналоге экспериментальных данных по зависимости операционной стабильности биокатализатора от количества циклов показывает, что инактивация биокатализатора не подчиняется кинетическим закономерностям первого порядка и в первых пяти циклах протекает в 4÷5 раз быстрее, чем в пяти последующих. Это может свидетельствовать о частичном смывании фермента с носителя в процессе синтеза даже при использованных очень низких концентрациях субстратов. Повышение температуры до 35°С снижает операционную стабильность иммобилизованной на каолине АЭГ в 8 раз (τ1/2=5 циклов).
Способ синтеза аминоцефалоспоринового антибиотика цефалексина согласно ближайшему аналогу состоит в ацилировании 7-АДЦК, взятой в концентрации 4 мг/мл, метиловым эфиром Д-фенилглицина при молярном соотношении ацилирующего агента (МЭФГ) и 7-АДЦК в исходной реакционной смеси от 1 до 3. Реакцию синтеза проводят в течение 2÷3 часов при рН 6,2 и температуре 35°С в водной среде под действием гетерогенного биокатализатора на основе АЭГ из Xanthomonas citri, иммобилизованной на каолине. Лучший выход цефалексина (85% по 7-АДЦК) достигнут при использовании молярного соотношения субстратов 3:1. Данные по синтезу других аминоцефалоспоринов или аминопенициллинов в ближайшем аналоге отсутствуют.
Основные недостатки гетерогенного биокатализатора, а также способов его получения и использования согласно ближайшему аналогу следующие:
1. Сложность и многостадийность используемой процедуры выделения и очистки фермента; связанные с этим большие потери ферментативной активности, обуславливающие низкий выход активности процедуры получения биокатализатора в целом.
2. Получение биокатализатора с низким содержанием белка (не более 0,08 г белка/г сухого биокатализатора) из-за использования метода иммобилизации фермента на носителе, являющемся балластом.
3. Низкий уровень активности конечного продукта - гетерогенного биокатализатора.
4. Низкий уровень операционной стабильности биокатализатора, обусловленный использованием метода адсорбционной иммобилизации, не обеспечивающего многоточечного, прочного и необратимого связывания фермента с носителем; следствием этого является низкая термическая стабильность иммобилизованного фермента, а также возможная десорбция фермента и других белков раствором субстратов (особенно при высоких концентрациях субстратов).
5. Необходимость использования низких концентраций субстратов при синтезе антибиотика для уменьшения опасности загрязнения целевого продукта примесями белковой природы.
Раскрытие изобретения
Заявляемая группа изобретений направлена на решение следующих задач:
- повышение эффективности способа получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот за счет упрощения процедуры получения биокатализатора и увеличения выхода ферментативной (синтетазной) активности этой процедуры;
- повышение активности и стабильности получаемого биокатализатора;
- разработка способа ферментативного синтеза аминобета-лактамного антибиотика с использованием получаемого гетерогенного биокатализатора.
Поставленные задачи решают путем совокупного использования в процессе получения гетерогенного биокатализатора ряда приемов, осуществляемых в выбранных оптимизированных условиях. Для выделения АЭГ используют биомассу клеток бактерий Xanthomonas rubrilineans. Клетки, содержащие фермент, разрушают поэтапно в мягких условиях, сначала нарушая их целостность криогенным воздействием, а затем обрабатывая водную суспензию размороженных клеток бутилацетатом. Из разрушенной клеточной биомассы извлекают фермент путем его экстракции в водную фазу. Получаемый после отделения твердой фазы бесклеточный экстракт без какой-либо очистки используют для иммобилизации фермента. Для получения такого бесклеточного экстракта, который непосредственно пригоден для иммобилизации, процедуру разрушения биомассы клеток и извлечения фермента осуществляют в мягких условиях, оптимизированных по концентрации биомассы клеток в суспензии, концентрации бутилацетата, температуре, рН и моменту остановки процесса. Экстракцию ведут сначала в условиях спонтанно устанавливающегося градиента рН, а затем при постоянном значении рН, поддерживаемом путем добавления титранта, расход которого регистрируют.
Критерием выбора момента остановки экстракции служит изменение скорости расхода титранта. Получение бесклеточного экстракта требуемой чистоты при достижении (100±5)% выхода активности в процессе извлечения фермента обеспечивается остановкой процедуры в момент, когда скорость расхода титранта снижается в определенное число раз по сравнению с первоначальным значением. Степень снижения расхода титранта, обеспечивающая оптимальные результаты (Копт), зависит от используемого штамма Xanthomonas rubrilineans, а также от условий биосинтеза культуры и устанавливается в серии предварительных экспериментов (см. таблицу 2 в Примере 3).
Иммобилизацию осуществляют путем осаждения АЭГ в виде ферментных агрегатов из бесклеточного экстракта под действием полиэтиленгликоля с выбранной молекулярной массой, взятого в количестве, необходимом для полного осаждения целевого фермента, и последующей поперечной сшивки этих агрегатов глутаровым альдегидом, взятым в оптимизированной концентрации, рассчитываемой по отношению к содержанию белка в бесклеточном экстракте (см. Пример 4, №1-4 в таблице 3). Получение бесклеточного экстракта в оптимизированных для каждого штамма условиях обеспечивает стандартизованный исходный материал для процедуры иммобилизации, что видно при сравнении №2, 3 и 5 таблицы 3 в Примере 4.
Заявляемый способ получения гетерогенного биокатализатора схематически представлен на фиг.1 и заключается в следующем. Биомассу клеток бактерий Xanthomonas rubrilineans, содержащих фермент АЭГ, помещают в морозильную камеру с температурой -25°С или ниже, предпочтительно от -25 до -30°С, и выдерживают в течение времени, необходимого для промораживания всего объема биомассы до заданной температуры. Затем клеточную биомассу размораживают, выдерживая необходимое время при комнатной температуре, и суспендируют в буфере Трис-HCl, 0,05 моль/л, рН 7,8. Концентрация биомассы клеток в суспензии составляет 20÷100 мг сух/мл, предпочтительно 40÷50 мг сух/мл. К полученной суспензии добавляют бутилацетат в концентрации 2÷6 об.%, предпочтительно 4,5 об.%. Процедуру разрушения клеточной биомассы и экстракции фермента в водную фазу осуществляют при интенсивном перемешивании при температуре 25÷35°С, предпочтительно 30°С. Экстракцию ведут сначала в условиях спонтанно устанавливающегося градиента рН, а затем при постоянном значении рН, поддерживаемом путем добавления щелочного титранта, и регистрируют его расход. В качестве титранта используют водный раствор аммиака либо другие титранты, такие как водный раствор гидроокиси натрия или гидроокиси калия.
Диапазон рН, обеспечивающий оптимальные результаты, зависит от используемого штамма Xanthomonas rubrilineans, а также от условий биосинтеза культуры и устанавливается в серии предварительных экспериментов. Процедуру экстракции фермента прекращают, когда скорость расхода раствора аммиака сократится в установленное экспериментально число раз Копт. Время достижения Копт, то есть продолжительность процедуры разрушения клеточной биомассы и экстракции фермента не нормируется и составляет от 3 до 7 часов, в зависимости от биохимических параметров исходной биомассы клеток, а также от выбранных условий проведения процесса по температуре и концентрациям биомассы клеток и бутилацетата.
Разрушенную клеточную биомассу отделяют от бесклеточного экстракта любым доступным эффективным способом, например центрифугированием, и промывают натрий-ацетатным буфером, 0,1 моль/л, рН 6,5, содержащим 0,005 моль/л ацетата кальция. Буфер используют в количестве 20% от исходного объема клеточной суспензии. Промывные воды отделяют от разрушенной клеточной биомассы и присоединяют к бесклеточному экстракту. Получают прозрачный бесклеточный экстракт с удельной активностью 2,5÷4,5 МЕ/мг белка, определяемой по синтезу цефалексина. Выход активности на стадии извлечения фермента по отношению к активности исходной биомассы клеток составляет (100±5)%, то есть является количественным в пределах ошибки эксперимента.
Полученный бесклеточный экстракт используют без какой-либо очистки для процедуры иммобилизации фермента АЭГ путем получения ферментных агрегатов и их поперечной сшивки. Таким образом, выход процедуры получения ферментного препарата, пригодного для иммобилизации, тождественен выходу процедуры извлечения фермента:
ηФП=ηизвл=(100±5) %.
С целью осаждения ферментных агрегатов к бесклеточному экстракту добавляют полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000÷10000, предпочтительно 6000÷8000, взятый в количестве, необходимом для полного осаждения целевого фермента, а именно 0,25÷0,30 г/мл бесклеточного экстракта, в зависимости от молекулярной массы полиэтиленгликоля. Процедуру осуществляют при температуре 2÷4°С при перемешивании в течение времени, необходимого для полного растворения полиэтиленгликоля (15÷30 мин). Затем для поперечной сшивки ферментных агрегатов в реакционную смесь вносят глутаровый альдегид в количестве, необходимом для создания его относительной концентрации 1·10-2÷3·10-2 моль/мг белка, и проводят модификацию и сшивку белков в течение 2 часов при слабом перемешивании при температуре 2÷4°С. Гетерогенный биокатализатор в виде поперечно-сшитых ферментных агрегатов отделяют от реакционной смеси вакуумной фильтрацией и отмывают на пористом стеклянном фильтре до бесцветных промывных вод натрий-ацетатным буфером, 0,1 моль/л, рН 6,5, содержащим 0,005 моль/л ацетата кальция.
Выход активности процедуры иммобилизации АЭГ составляет 48÷70%. Так как выделение фермента осуществляют без потерь активности, то общий выход процесса получения гетерогенного биокатализатора (от биомассы клеток) по заявляемому способу - 48÷70%, продолжительность процедуры - 12÷15 часов.
Характеристика заявляемого биокатализатора. Гетерогенный биокатализатор, иммобилизованная АЭГ, не содержит балластного носителя и состоит преимущественно из белка (до 0,95 г белка/г сух). Иммобилизованная АЭГ обладает активностью (в отношении синтеза цефалексина), отнесенной к массе сухого биокатализатора, 1300÷2200 МЕ/г сух. Диапазон относительной концентрации глутарового альдегида в реакционной смеси при проведении поперечной сшивки ферментных агрегатов 1·10-2÷5·10-2 моль/мг белка обеспечивает получение иммобилизованного фермента, сочетающего указанный уровень синтетазной активности с операционной стабильностью, характеризующейся сохранением 95% исходной активности после использования биокатализатора в 10 циклах синтеза цефалексина (см. Пример 4, табл.3).
Более продолжительные операционные испытания биокатализатора в процессе синтеза цефалексина при 30°С и начальной концентрации субстрата 7-АДЦК 20 мг/мл показывают, что инактивация иммобилизованного фермента подчиняется кинетическим закономерностям первого порядка. Это свидетельствует об отсутствии вымывания АЭГ из биокатализатора даже при использованнии относительно высоких концентраций субстратов (в 5 раз выше, чем описано в ближайший аналоге). Период полуинактивации биокатализатора, определенный по 35 циклам использования в процессе синтеза цефалексина, составляет τ1/2=200 циклов (см. Пример 10 и фиг.2).
Заявляемый способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика в общем виде заключается в следующем. С использованием полученного биокатализатора проводят ферментативный синтез различных аминопенициллинов, например ампициллина, амоксициллина, и аминоцефалоспоринов например, цефалексина цефадроксила, цефрадина, цефаклора, цефалоглицина, путем ацилирования ключевого бета-лактамного соединения, взятого в концентрации 5÷40 мг/мл, соответствующими производными эфиров Д-аминофенилуксусной кислоты, например, метиловыми эфирами Д-фенилглицина, Д-пара-гидроксифенилглицина, Д-2,5-дигидрофенилглицина, взятыми в молярном избытке 1,5÷4,0. Реакцию синтеза проводят при рН 6,0÷6,2 и температуре 1÷40°С в водной среде или в смесях воды с многоатомным спиртом этиленгликолем при содержании последнего в исходной смеси 30÷50%. Содержание гетерогенного биокатализатора в реакционной смеси варьируют от 5 до 50 МЕ/мл в зависимости от выбранных условий проведения реакции синтеза так, чтобы длительность процесса не превышала трех часов.
Преимущества заявляемой группы изобретений:
1. Получение гетерогенного биокатализатора по простейшей возможной схеме (см. фиг.1), включающей лишь этапы выделения фермента из биомассы клеток и его иммобилизации (непосредственно из бесклеточного экстракта), в отличие от способа согласно ближайшему аналогу, включающего еще и многостадийный этап получения очищенного ферментного препарата; соответствующее сокращение общего времени процедуры до 12÷15 часов, вместо, по крайней мере, 70 часов по прототипу.
2. Повышение общего выхода активности процедуры получения биокатализатора более чем в 3 раза (48÷70% по заявляемому способу; 16÷20% согласно ближайшему аналогу).
3. Получение биокатализатора, не содержащего балластного носителя и состоящего преимущественно из белка (в заявляемом биокатализаторе до 0,95 г белка/г сух; в ближайшем аналоге - не более чем 0,08 г белка/г сух.).
4. Повышение синтетазной активности биокатализатора (в отношении синтеза цефалексина) в 3,3÷4,3 раза (в заявляемом биокатализаторе 1300÷2200 МЕ/г сух.; в ближайшем аналоге - 510 МЕ/г сух.).
5. Повышение операционной стабильности биокатализатора, по крайней мере, в 5 раз (при 30°С: τ1/2=200 циклов для заявляемого биокатализатора; не более чем τ1/2=42 цикла согласно ближайшему аналогу).
6. Отсутствие вымывания фермента из биокатализатора в процессе его эксплуатации даже при начальных концентрациях субстрата, в 5 раз превышающих концентрации, использованные при операционных испытаниях.
7. Возможность использования биокатализатора для ферментативного синтеза аминобета-лактамного антибиотика в широком диапазоне температур и концентраций исходных соединений в водной среде или в смесях воды с многоатомным спиртом этиленгликолем, что позволяет достигать более высоких выходов целевого антибиотика (до 98%, см. Пример 6) по сравнению с 85% согласно ближайшему аналогу.
Заявляемая группа изобретений проиллюстрирована следующими фигурами графического изображения:
Фиг.1 Схема способов получения биокатализатора на основе АЭГ.
Фиг.2 Операционная стабильность биокатализатора в процессе синтеза цефалексина (по данным таблицы 4).
Осуществление изобретения
Изобретение иллюстрируется следующими примерами осуществления способа получения биокатализатора и способа синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием полученного гетерогенного биокатализатора. Во всех описанных примерах приведена активность ферментных препаратов по синтезу цефалексина. Ее определяют по начальной скорости образования целевого продукта в следующих условиях: рН 6,0÷6,2, температура (40±1)°С, концентрации субстратов - (0,040±0,002) моль/л 7-АДЦК и (0,080±0,004) моль/л МЭФГ. Содержание цефалексина в реакционной смеси определяют методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Содержание белка в препаратах определяют традиционными методами [Biotechnol. Appl. Biochem. 29: 99 (1999)], а содержание сухих веществ - весовым методом после высушивания препарата при (105±1)°С до постоянной массы.
Пример 1. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием штамма Xanthomonas rubrilineans VKPM B-9915.
В качестве исходного материала для получения гетерогенного биокатализатора использована биомасса клеток штамма Xanthomonas rubrilineans VKPM B-9915 из Всероссийской коллекции промышленных микроорганизмов (VKPM). Культивирование продуцента проведено в течение 22 часов в колбах Эрленмейера на среде, состоящей из кукурузного экстракта (2% по сух.), пептона (1%) и глюкозы (1%) при 28°С на круговой качалке при 240-260 об/мин. Биомасса клеток отделена центрифугированием при 7000 об/мин.
Взято 273 г влажной биомассы клеток с содержанием сухих веществ 18,5%, синтетазной активностью 83,3 МЕ/г влажн, 450 МЕ/г сух.
Для осуществления криогенного воздействия биомассу клеток помещают в пластиковый сосуд и замораживают в морозильной камере при температуре - 28°С. Через 3 часа сосуд извлекают из морозильной камеры, биомассу размораживают при комнатной температуре и переносят в термостатируемый реактор объемом 2,5 л, снабженный механической мешалкой и системой контроля и поддержания рН.
Процедуру обработки клеток бутилацетатом и извлечения фермента в водную фазу осуществляют в этом реакторе в следующих условиях: концентрация биомассы клеток в суспензии 40 мг сух/мл; концентрация бутилацетата 4,5 об.%; температура 30°С; градиент рН, постоянное перемешивание. Размороженную биомассу клеток суспендируют в буфере Трис-HCl, 0,05 моль/л, рН 7,8, взятом в количестве, необходимом для получения суспензии клеток требуемой концентрации, с учетом влаги, содержащейся в биомассе клеток. При проведении данной процедуры для получения 1260 мл суспензии используют 1040 мл буфера. Размороженную биомассу суспендируют в буфере при температуре не выше 20°С, добавляют 150 мкл меркаптоэтанола для стабилизации фермента и вносят 57 мл бутилацетата. Момент добавления бутилацетата считают началом процедуры. В начальный момент времени включают обогрев реактора для поддержания температуры 30°С и контролируют исходное значение рН, величина которого не должна превышать 8,0. По ходу процесса рН снижается и процедура протекает в спонтанно устанавливающемся градиенте его значений, вплоть до рН 6,8. При достижении значения рН 6,8 включают систему автоматической подтитровки и поддерживают рН 6,8±0,1 путем добавления в реакционную смесь водного раствора аммиака с концентрацией 12,5%, фиксируя расход этого раствора по ходу процесса. Процедуру извлечения фермента прекращают через 4 часа 30 минут, когда скорость расхода раствора аммиака сократится в 2,5 раза.
Реакционную смесь быстро охлаждают до температуры 15÷20°С и обрабатывают флокулянтом для облегчения отделения разрушенной биомассы клеток. В качестве флокулянта используют водорастворимый полимерный анионит, содержащий пиридиниевые или четвертичные аммониевые основания, например Флокатон ППС-400. Разрушенную биомассу клеток отделяют от бесклеточного экстракта центрифугированием и промывают 250 мл натрий-ацетатного буфера, 0,1 моль/л, рН 6,5, содержащего 0,005 моль/л ацетата кальция. Промывные воды, отделенные центрифугированием, присоединяют к бесклеточному экстракту. В полученном растворе контролируют рН и устанавливают значение рН 6,8÷7,2.
Получают 1440 мл прозрачного бесклеточного экстракта с синтетазной активностью 16,0 МЕ/мл, содержанием белка 4,2 мг/мл, удельной активностью 3,8 МЕ/мг белка. Выход активности процесса извлечения фермента из биомассы клеток составляет ηизвл=101%.
Процедуру иммобилизации фермента осуществляют в реакторе объемом 2 л, снабженном механической мешалкой и помещенном в ледяную баню. 1440 мл бесклеточного экстракта помещают в этот реактор, охлаждают до 2÷4°С и при постоянном перемешивании добавляют к нему полиэтиленгликоль с молекулярной массой 6000, взятый в количестве 403 г (0,28 г/мл бесклеточного экстракта), что обеспечивает полное осаждение целевого фермента. Перемешивают реакционную смесь в течение 15 мин (до полного растворения осадителя) и добавляют 76,7 мл 25% водного раствора глутарового альдегида (3,5·10-2 ммоль/мг белка). Реакционную смесь инкубируют при слабом перемешивании при температуре 2÷4°С в течение 2 часов. Полученные твердые частицы отделяют вакуумной фильтрацией и отмывают на пористом стеклянном фильтре до бесцветных промывных вод натрий-ацетатным буфером, 0,1 моль/л, рН 6,5, содержащим 0,005 моль/л ацетата кальция. На промывку расходуют 1500 мл этого буфера.
Получают 38,6 г влажного гетерогенного биокатализатора в виде поперечно-сшитых ферментных агрегатов АЭГ с содержанием сухих веществ 20,4%. Синтетазная активность продукта составляет 370 МЕ/г влажного или 1810 МЕ/г сухого биокатализатора. Содержание белка в продукте составляет 0,93 г белка/г сух. Выход активности процедуры иммобилизации АЭГ составляет ηим=59,1%, общий выход активности процесса получения гетерогенного биокатализатора (от биомассы клеток) ηoбщ=59,8%. Период полуинактивации биокатализатора, определенный по 35 циклам его использования в процессе синтеза цефалексина, составляет τ1/2=200 циклов (см. Пример 10).
Пример 2. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора с использованием штамма Xanthomonas rubrilineans CGMCC №2339
В качестве исходного материала для получения гетерогенного биокатализатора использована биомасса клеток штамма Xanthomonas rubrilineans CGMCC №. 2339 из Главной китайской коллекции культур микроорганизмов (CGMCC). Биомасса получена в условиях, приведенных в примере 1.
Взято 91,2 г влажной биомассы клеток с содержанием сухих веществ 19,5%, синтетазной активностью 70,2 МЕ/г влажн, 360 МЕ/г сух.
Криогенное воздействие на биомассу клеток осуществляют по методике, описанной в примере 1, но при температуре -30°С и в течение 5 часов.
Процедуру обработки клеток бутилацетатом и извлечения фермента в водную фазу осуществляют согласно примеру 1 в следующих условиях: концентрация биомассы клеток в суспензии 50 мг сух/мл; концентрация бутилацетата 4,0 об.%; температура 28°С; градиент рН, постоянное перемешивание. Используют следующие количества реагентов: 280 мл буфера, 50 мкл меркаптоэтанола, 14 мл бутилацетата. Объем суспензии составляет 355 мл. Процедуру извлечения фермента осуществляют в течение 6 часов 10 минут и останавливают в момент достижения снижения скорости расхода титранта в 2,8 раза по сравнению с ее исходным значением.
Обработку реакционной смеси флоккулянтом и получение бесклеточного экстракта осуществляют согласно примеру 1. Получают 420 мл прозрачного бесклеточного экстракта с синтетазной активностью 15,7 МЕ/мл, содержанием белка 3,5 мг/мл, удельной активностью 4,5 МЕ/мг белка. Выход активности процесса извлечения фермента из биомассы клеток составляет ηизвл=103 %.
Процедуру иммобилизации фермента осуществляют по методике, описанной в примере 1, с той разницей, что используют 420 мл бесклеточного экстракта, 105 г полиэтиленгликоля с молекулярной массой 8000 (0,25 г/мл бесклеточного экстракта) и 8,8 мл 25% водного раствора глутарового альдегида (1,5·10-2 ммоль/мг белка).
Получают 11,1 г влажного гетерогенного биокатализатора в виде поперечно-сшитых ферментных агрегатов АЭГ с содержанием сухих веществ 20,2%. Синтетазная активность продукта составляет 380 МЕ/г влажного или 1880 МЕ/г сухого биокатализатора. Содержание белка в продукте составляет 0,92 г белка/г сух. Выход активности процедуры иммобилизации АЭГ составляет ηим=64,0%, общий выход активности процесса получения гетерогенного биокатализатора (от биомассы клеток) ηобщ=65,9%. Относительная остаточная активность биокатализатора после 10 циклов синтеза цефалексина (см. Пример 10) составляет 96,3%.
Пример 3. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора при варьировании момента остановки процесса извлечения фермента
В таблице 2 (№1-3) приведены данные, полученные с использованием культуры штамма Xanthomonas rubrilineans VKPM В-9915. Процедуры криогенного воздействия на биомассу клеток, ее обработки бутилацетатом и извлечения фермента в водную фазу осуществляют согласно примеру 1, с той разницей, что варьируют момент остановки процесса извлечения фермента, соотнося его со скоростью расхода раствора аммиака. Бесклеточные экстракты используют для иммобилизации фермента согласно процедуре, описанной в примере 1.
Представленные результаты отражают влияние момента остановки процесса на свойства бесклеточных экстрактов и биокатализаторов, а также на эффективность процессов извлечения и иммобилизации фермента. В таблице 2 (№4) приведены также данные примера 2 по получению биокатализатора, исходя из биомассы клеток штамма Xanthomonas rubrilineans CGMCC №2339, демонстрирующие зависимость оптимального момента остановки процесса экстракции фермента от используемого штамма.
| Таблица 2 Влияние момента остановки процесса извлечения фермента на свойства бесклеточного экстракта и гетерогенного биокатализатора, а также на эффективность их получения |
|||||||||
| № | Штамм Xanthomonas rubrilineans | Продолжительность процесса | Бесклеточный экстракт | Гетерогенный биокатализатор | Общ. выход акт., ηобщ, % | ||||
| Акт., МЕ/мл | Белок, мг/мл | Удельн. акт., МЕ/мг белка | Выход акт., ηизвл, % | Акт., МЕ/г сух | Выход акт., ηим, % |
||||
| 1 | VKPM B-9915 |
3 час 20 мин | 14,1 | 3,1 | 4,5 | 90 | 1450 | 49,0 | 44,1 |
| 2 Пример 1 |
VKPM B-9915 |
4 час 30 мин | 16,0 | 4,2 | 3,8 | 101 | 1810 | 59,1 | 59,8 |
| 3 | VKPM B-9915 |
6 час 10 мин | 16,2 | 7,5 | 2,2 | 102 | 1220 | 65,9 | 67,2 |
| 4 Пример 2 |
CGMCC №2339 | 6 час 10 мин | 15,7 | 3,5 | 4,5 | 103 | 1880 | 64,0 | 65,9 |
Пример 4. Осуществление заявляемого способа получения биокатализатора при различных концентрациях глутарового альдегида
В таблице 3 (№1-4) приведены данные, полученные с использованием культуры штамма Xanthomonas rubrilineans VKPM B-9915. Процедуры криогенного воздействия на биомассу клеток, ее обработки бутилацетатом и извлечения фермента в водную фазу осуществляют согласно примеру 1, то есть в оптимизированных для данного штамма условиях. Полученные бесклеточные экстракты используют для иммобилизации фермента согласно процедуре, описанной в примере 1, с той разницей, что варьируют относительную концентрацию глутарового альдегида в реакционной смеси при поперечной сшивке ферментных агрегатов.
В качестве критерия для сопоставления стабильности иммобилизованных ферментов, полученных в различных условиях, используют остаточную ферментативную активность биокатализатора после его эксплуатации в 10 циклах синтеза цефалексина, осуществляемого согласно примеру 10. Представленные результаты отражают влияние концентрации глутарового альдегида на свойства биокатализаторов и эффективность процесса иммобилизации.
| Таблица 3 Влияние относительной концентрации глутарового альдегида в реакционной смеси на свойства гетерогенного биокатализатора и эффективность процесса иммобилизации фермента |
|||||
| № | Штамм Xanthomonas rubrilineans | Относительная концентрация глутарового альдегида, ммоль/мг белка | Гетерогенный биокатализатор | ||
| Активность, МЕ/г сух. | Выход активности ηим, % | Относительная остаточная активность после 10 циклов синтеза, % | |||
| 1 | VKPM В-9915 | 0,2·10-2 | 2200 | 58,3 | 89,7 |
| 2 | VKPM В-9915 | 1,0·10-2 | 2210 | 70,2 | 96,3 |
| 3 Пример 1 |
VKPM В-9915 | 3,5·10-2 | 1810 | 59,1 | 96,7 |
| 4 | VKPM В-9915 | 5,0·10-2 | 1320 | 48,1 | 98,1 |
| 5 Пример 2 |
CGMCC №2339 |
1,5·10-2 | 1880 | 64,0 | 96,3 |
В таблице 3 (№5) приведены также характеристики биокатализатора, полученного исходя из биомассы клеток штамма Xanthomonas rubrilineans CGMCC №2339. Согласно примеру 2 бесклеточный экстракт получают в условиях, оптимизированных для данного штамма, затем осаждают ферментные агрегаты и осуществляют поперечную сшивку в условиях, попадающих в оптимальный для штамма VKPM В-9915 диапазон концентраций глутарового альдегида, достигая при этом аналогичных характеристик конечного биокатализатора.
Пример 5. Синтез цефалексина в водной среде
Процесс ферментативного синтеза цефалексина проводят в термостатируемом стеклянном реакторе вместимостью 100 мл, снабженном механической мешалкой и устройством для измерения и поддержания рН, в следующих условиях: водная среда; температура 2°С; рН 6,0÷6,2; содержание фермента (25±1)МЕ/мл; начальная концентрация 7-АДЦК 25 мг/мл; молярное соотношение МЭФГ и 7-АДЦК в исходной реакционной смеси 3,0:1. Расчет концентраций реагентов в исходном растворе проводят с учетом объема влаги, вносимой с навеской биокатализатора.
Для приготовления раствора субстратов 1,25 г (5,84 ммолей) 7-АДЦК помещают в химический стакан вместимостью 100 мл, добавляют 40 мл дистиллированной воды. При перемешивании на магнитной мешалке и контроле рН к суспензии порциями добавляют 12,5% раствор аммиака до растворения навески 7-АДЦК. При этом рН не должно превышать значения 8,2. Затем к раствору при перемешивании добавляют порциями 3,53 г (17,52 ммолей) гидрохлорида МЭФГ, не допуская снижения рН раствора ниже 6,0 путем добавления 12,5% раствора аммиака. После растворения МЭФГ раствор количественно переносят в мерный цилиндр и объем раствора доводят водой до 50 мл.
Приготовленный раствор субстратов переносят в реактор, устанавливают температуру 2°С и при интенсивном перемешивании добавляют 3,4 г биокатализатора, полученного по примеру 1, с активностью 370 МЕ/г влажн биокатализатора и содержанием сухих веществ 20,4%. Момент добавления биокатализатора считается началом реакции синтеза. Процесс проводят в течение 70 минут при температуре 2°С и значении рН 6,0÷6,2, которое поддерживают путем добавления 12,5% раствора аммиака в автоматическом режиме. По окончании процесса биокатализатор отделяют от реакционной смеси вакуумной фильтрацией, промывают 10 мл воды и в фильтрате, объединенном с промывкой, определяют содержание цефалексина методом ВЭЖХ. Выход цефалексина по 7-АДЦК составляет 85,7%.
Пример 6. Синтез цефалексина в смеси воды с этиленгликолем
Процесс ферментативного синтеза цефалексина проводят в реакторе, описанном в примере 5, в следующих условиях: содержание этиленгликоля в исходной реакционной смеси 50 об.%; температура 5°С; рН 6,0÷6,2; содержание фермента (40±1) МЕ/мл; начальная концентрация 7-АДЦК 30 мг/мл; молярное соотношение МЭФГ и 7-АДЦК в исходной реакционной смеси 2,5:1.
Приготовление раствора субстратов из 1,50 г (7,01 ммолей) 7-АДЦК и 3,53 г (17,52 ммолей) гидрохлорида МЭФГ осуществляют по методике, описанной в примере 5, с той разницей, что вместо 40 мл воды для растворения навески 7-АДЦК используют смесь 15 мл дистиллированной воды и 25 мл этиленгликоля.
Синтез цефалексина осуществляют согласно примеру 5 с той разницей, что процесс ведут в течение 180 минут при температуре 5°С, используя 5,41 г биокатализатора, полученного по примеру 1, с активностью 370 МЕ/г влажн биокатализатора и содержанием сухих веществ 20,4%. Выход цефалексина по 7-АДЦК составляет 98,3%.
Пример 7. Синтез цефаклора
Процесс ферментативного синтеза цефаклора проводят в реакторе, описанном в примере 5, в следующих условиях: содержание этиленгликоля в исходной реакционной смеси 45 об.%; температура 10°С; рН 6,0-6,2; содержание фермента (40±1)МЕ/мл; начальная концентрация 3-хлор-7-аминоцефалоспорановой кислоты (7-АХЦК) 15 мг/мл; молярное соотношение МЭФГ и 7-АХЦК в исходной реакционной смеси 4:1.
Приготовление раствора субстратов из 0,75 г (3,20 ммолей) 7-АХЦК и 2,58 г (12,80 ммолей) гидрохлорида МЭФГ осуществляют по методике, описанной в примере 5, с той разницей, что вместо 40 мл воды для растворения навески 7-АХЦК используют 17,5 мл дистиллированной воды и 22,5 мл этиленгликоля.
Синтез цефаклора осуществляют согласно примеру 5 с той разницей, что процесс ведут в течение 100 минут при температуре 10°С, используя 5,41 г биокатализатора, полученного по примеру 1, с активностью 370 МЕ/г влажн биокатализатора и содержанием сухих веществ 20,4%. Выход цефаклора по 7-АХЦК составляет 92,4%.
Пример 8. Синтез ампициллина
Процесс ферментативного синтеза ампициллина проводят в реакторе, описанном в примере 5, в следующих условиях: содержание этиленгликоля в исходной реакционной смеси 30 об.%; температура 20°С; рН 6,0÷6,2; содержание фермента (30±1) МЕ/мл; начальная концентрация 6-аминопенициллановой кислоты (6-АПК) 40 мг/мл; молярное соотношение МЭФГ и 6-АПК в исходной реакционной смеси 3:1.
Приготовление раствора субстратов из 2,00 г (9,26 ммолей) 6-АПК и 5,60 г (27,7 ммолей) гидрохлорида МЭФГ осуществляют по методике, описанной в примере 5, с той разницей, что вместо 40 мл воды для растворения навески 6-АПК используют 25 мл дистиллированной воды и 15 мл этиленгликоля, а рН раствора при растворении 6-АПК не превышает значения 7,5.
Синтез ампициллина осуществляют согласно примеру 5 с той разницей, что процесс ведут в течение 75 минут при температуре 20°С, используя 3,97 г биокатализатора, полученного по примеру 1, с активностью 370 МЕ/г влажн биокатализатора и содержанием сухих веществ 20,4%. Выход ампициллина по 6-АПК составляет 88,6%.
Пример 9. Синтез амоксициллина
Процесс ферментативного синтеза амоксициллина проводят в реакторе, описанном в примере 5, в следующих условиях: водная среда; температура 40°С; рН 6,0÷6,2; содержание фермента (6,5±0,5) МЕ/мл; начальная концентрация 6-АПК 10 мг/мл; молярное соотношение метилового эфира Д-пара-гидроксифенилглицина (МЭГФГ) и 6-АПК в исходной реакционной смеси 1,7:1.
Для приготовления раствора субстратов 0,720 г (3,97 ммолей) МЭГФГ помещают в химический стакан вместимостью 100 мл, добавляют 40 мл дистиллированной воды. При перемешивании на магнитной мешалке и контроле рН к суспензии порциями добавляют 20% раствор соляной кислоты до растворения навески МЭГФГ. Затем рН раствора доводят до 6 путем добавления 12,5% раствора аммиака и сразу же вносят в раствор 0,500 г (2,34 ммолей) 6-АПК. При перемешивании к суспензии добавляют порциями 12,5% раствор аммиака до растворения навески 6-АПК, следя, чтобы рН не превышало значения 6,5. После растворения 6-АПК раствор количественно переносят в мерный цилиндр и объем раствора доводят водой до 50 мл.
Синтез амоксициллина осуществляют согласно примеру 5 с той разницей, что процесс ведут в течение 60 минут при температуре 40°С, используя 0,86 г биокатализатора, полученного по примеру 2, с активностью 380 МЕ/г влажн биокатализатора и содержанием сухих веществ 20,2%. Выход амоксициллина по 6-АПК составляет 72,8%.
Пример 10. Операционная стабильность биокатализатора в процессе синтеза цефалексина
Для изучения операционной стабильности биокатализатора проводят ряд последовательных циклов синтеза цефалексина с использованием одной и той же порции биокатализатора в следующих условиях: содержание этиленгликоля в исходной реакционной смеси 40 об.%, температура 30°С, рН 6,0÷6,2, содержание фермента (15±1) МЕ/мл, начальная концентрация 7-АДЦК 20 мг/мл; молярное соотношение МЭФГ и 7-АДЦК в исходной реакционной смеси 2,5:1.
Первый цикл синтеза цефалексина проводят по методике, описанной в примере 5, но при температуре процесса 30°С и в объеме реакционной смеси 100 мл. По окончании реакции биокатализатор отделяют от реакционной смеси вакуумной фильтрацией, промывают его 10 мл воды и используют в следующем цикле синтеза цефалексина. В объединенном фильтрате определяют содержание цефалексина методом ВЭЖХ и рассчитывают выход цефалексина по 7-АДЦК.
Последующие циклы синтеза проводят аналогичным образом. После каждых пяти циклов определяют остаточную активность биокатализатора и содержание в нем сухих веществ. Для создания выбранных стандартных условий процесса по концентрации биокатализатора объем реакционной массы соответствующего цикла корректируют с учетом снижения активности биокатализатора и уменьшения его массы из-за расхода на аналитические процедуры. Проводят необходимое количество последовательных циклов синтеза цефалексина. Результаты экспериментов, проведенных с использованием биокатализатора, полученного по примеру 1, представлены в таблице 4.
Обработка экспериментальных данных таблицы 4 показывает, что инактивация биокатализатора в процессе синтеза цефалексина подчиняется кинетическим закономерностям первого порядка с периодом полуинактивации τ1/2=200 циклов (см. фиг.2).
| Таблица 4 Операционная стабильность биокатализатора, полученного по примеру 1, в процессе синтеза цефалексина при температуре 30°С |
||||
| Количество циклов синтеза | Выход продукта по 7-АДЦК, % | Активность биокатализатора | ||
| Остаточная активность, AN, МЕ/г сух | Относительная остаточная активность, Аотн, % | lg Аотн | ||
| 0 | 95,7 | 1810 | 100 | 2 |
| 5 | 93,9 | 1780 | 98,3 | 1,993 |
| 10 | 96,1 | 1750 | 96,7 | 1,985 |
| 15 | 94,5 | 1721 | 95,1 | 1,978 |
| 20 | 95,6 | 1692 | 93,5 | 1,970 |
| 25 | 93,6 | 1663 | 91,9 | 1,963 |
| 30 | 94,9 | 1636 | 90,4 | 1,956 |
| 35 | 95,2 | 1609 | 88,9 | 1,949 |
Источники информации
1. GB 1382255
2. Takahashi Т., Kato К, Yamazaki Y., et al.: Synthesis of cephalosporins and penicillins by enzymatic acylation. Japanese Journal of Antibiotics (Suppl.) 30S: 230-238 (1977)
3. CA 1044627
4. RU 2136759
5. KR 20010069097
6. Ryu Y.W., Ryu D.D.Y., Semisynthetic β-lactam antibiotics synthesizing enzyme from Acetobacter turbindance: purification and propeties. Enzyme Microb. Technol. 9: 339-344 (1987)
7. Kato К., Kawahara К, Takahashi Т., Kakinuma A.: Purification of α-amino acid ester hydrolase from Xanthomonas citri. Agric. Biol. Chem. 44: 1069-1074 (1980)
8. Kato К., Kawahara К, Takahashi Т. et al. α-amino acid ester hydrolase from Xanthomonas citri. Agric. Biol. Chem. 44: 1663-1664 (1980)
9. Крестьянова И.Н., Уваров Н.Н., Руденская Г.Н. и др.: Внутриклеточная аминопептидаза из Xanthomonas rublineans, гидролизующая эфиры α-аминокислот и цефалексин. Биохимия 55 (12): 2226 (1990)
10. Blinkovsky A.M., Markaryan A.N., Synthesis of β-lactam antibiotics containing α-aminophenylacetyl group in the acyl moiety catalyzed by D-(-)-phenylglycyl-β-lactamide amidohydrolase. Enzyme Microb. Technol. 15: 965-973 (1993)
11. Kim D.J., Byun S.M., Purification and properties of ampicillin acylase from Pseudomonas melanogenum. Biochim Biophys Acta 1040 (1): 12-18 (1990)
12. WO 02086111
13. Barends T.R.M., Polderman-Tijmes J.J. et al., The sequence and crystal structure of the α-amino acid ester hydrolase from Xanthomonas citri define a new family of β-lactam antibiotic acylases. J. Biol. Chem. 278: 23076-23084 (2003)
14. WO 02086127
15. Polderman-Tijmes J.J., Jekel P.A. et al.: Identification of the catalytic residues of α-amino acid ester hydrolase from Acetobacter turbindance by labeling and site-directed mutagenesis. J. Biol. Chem. 277, No32: 28474-28482 (2002)
16. Hernandez-Justiz O., Terreni M., Pagani G. et al.: Evaluation of different enzymes as catalysts for the production of b-lactam antibiotics following a kinetically controlled strategy. Enzyme and Microb. Technol., 25, 336 (1999)
17. Choi W.G., Lee S.B., Ryu D.D.Y, Cephalexin synthesis by paratially purified and immobilized enzymes. Biotechnol. Bioeng. 23 (2): 361-371 (1981)
18. Zaslavskaya P.L., Chekalina IV., Igans D.N. et al.: Interrelated approach to optimization of biosynthesis and chemical isolation of biologically active substances: the production of penicillinamidase by Escherichia coli and peptidohydrolase by Xanthomonas sp. Biotechnol. Appl. Biochem. 18: 299-309 (1993)
19. Fernandez-Lafuente R., Hernandez-Justiz O., et al.: Stabilization of tetrameric enzyme (α-amino acid ester hydrolase from Acetobacter turbindance) enables a very improved perfomance of ampicillin syntesis. J. Mol. Catal. B: Enzym. 11: 633-638 (2001)
20. Fernandez-Lafuente R., Hernandez-Justiz O., et al.: Biotransformations catalyzed by multimeric enzymes: stabilization of tetrameric ampicillin acylase permits the optimization of ampicillin synthesis under dissotiation conditions. Biomacromolecules 2 (1): 95-104 (2001)
21. Sapan C.V., Lundblad R.L., Price C.: Review. Colorimertric protein assay technoques. Biotechnol. Appl. Biochem. 29: 99-108 (1999)
Claims (6)
1. Способ получения гетерогенного биокатализатора для ферментативного синтеза аминобета-лактамного антибиотика на основе внутриклеточной гидролазы эфиров альфа-аминокислот из бактерий рода Xanthomonas, включающий разрушение биомассы клеток, экстракцию из нее фермента в водную фазу и последующую его иммобилизацию, отличающийся тем, что используют биомассу клеток бактерий Xanthomonas rubrilineans; разрушение клеток осуществляют поэтапно, сначала нарушая их целостность криогенным воздействием, замораживая биомассу до температуры -25°С или ниже, предпочтительно от -25°С до -30°С, а затем, обрабатывая водную суспензию размороженных клеток с концентрацией биомассы от 20 до 100 мг сух./мл бутилацетатом в концентрации 2÷6 об.%; экстракцию фермента в водную фазу проводят при нагревании обработанной клеточной суспензии сначала в условиях спонтанно устанавливающегося градиента рН, а затем при постоянном значении рН, поддерживаемом путем добавления раствора титранта, вплоть до прекращения процедуры экстракции, используя в качестве критерия выбора момента остановки степень снижения скорости расхода раствора титранта; бесклеточный экстракт, получаемый после отделения разрушенной клеточной биомассы, используют для процедуры иммобилизации фермента путем его осаждения полиэтиленгликолем в виде ферментных агрегатов и их последующей поперечной сшивки в присутствии глутарового альдегида.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что экстракцию фермента осуществляют при температуре 25÷35°С.
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что для осаждения ферментных агрегатов из бесклеточного экстракта используют полиэтиленгликоль с молекулярной массой 4000÷10000 в количестве, необходимом для полного осаждения фермента.
4. Способ по п.1, отличающийся тем, что для поперечной сшивки ферментных агрегатов используют глутаровый альдегид в относительной концентрации
1·10-2÷5·10-2 ммоль/мг белка.
1·10-2÷5·10-2 ммоль/мг белка.
5. Гетерогенный биокатализатор для ферментативного синтеза аминобета-лактамного антибиотика на основе внутриклеточной гидролазы эфиров альфа-аминокислот из бактерий рода Xanthomonas, характеризующийся тем, что он получен способом по п.1, содержит до 0,95 г белка/г сухого биокатализатора и обладает синтетазной активностью до 2200 МЕ/г сухого биокатализатора.
6. Способ ферментативного синтеза аминобета-лактамного антибиотика путем ацилирования ключевого бета-лактамного соединения соответствующими производными эфиров Д-аминофенилуксусной кислоты, отличающийся тем, что ферментативную реакцию синтеза проводят под действием гетерогенного биокатализатора по п.5.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008107953/13A RU2381273C2 (ru) | 2008-03-04 | 2008-03-04 | Способ получения гетерогенного биокатализатора, биокатализатор на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого биокатализатора |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| RU2008107953/13A RU2381273C2 (ru) | 2008-03-04 | 2008-03-04 | Способ получения гетерогенного биокатализатора, биокатализатор на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого биокатализатора |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| RU2008107953A RU2008107953A (ru) | 2009-09-10 |
| RU2381273C2 true RU2381273C2 (ru) | 2010-02-10 |
Family
ID=41166021
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| RU2008107953/13A RU2381273C2 (ru) | 2008-03-04 | 2008-03-04 | Способ получения гетерогенного биокатализатора, биокатализатор на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого биокатализатора |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| RU (1) | RU2381273C2 (ru) |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2499830C1 (ru) * | 2012-05-18 | 2013-11-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИДРОЛАЗЫ ЭФИРОВ АЛЬФА-АМИНОКИСЛОТ ИЗ Xanthomonas rubrilineans И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ГИДРОЛАЗЫ ЭФИРОВ АЛЬФА-АМИНОКИСЛОТ НА ОСНОВЕ ЭТОГО ШТАММА |
| RU2502797C1 (ru) * | 2012-09-18 | 2013-12-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИДРОЛАЗЫ ЭФИРОВ АЛЬФА-АМИНОКИСЛОТ ИЗ Xanthomonas rubrilineans И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ГИДРОЛАЗЫ ЭФИРОВ АЛЬФА-АМИНОКИСЛОТ НА ОСНОВЕ ЭТОГО ШТАММА |
| RU2535893C1 (ru) * | 2013-08-20 | 2014-12-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот, гетерогенный биокатализатор, полученный таким способом, и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого гетерогенного биокатализатора |
| RU2650668C1 (ru) * | 2016-12-13 | 2018-04-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы дрожжей Candida antarctica фракции В |
-
2008
- 2008-03-04 RU RU2008107953/13A patent/RU2381273C2/ru not_active IP Right Cessation
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| КУРОЧКИНА В.Б. и др. Ферментативный синтез беталактамных антибиотиков, II Аминоцефалоспорины. - Антибиотики и химиотерапия, №8, 1999, с.6-11. Найдено в Интернете http://nature.web.ru/db/msg.html?mid=1179482&s=[24.02.2009]. * |
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| RU2499830C1 (ru) * | 2012-05-18 | 2013-11-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | РЕКОМБИНАНТНЫЙ ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИДРОЛАЗЫ ЭФИРОВ АЛЬФА-АМИНОКИСЛОТ ИЗ Xanthomonas rubrilineans И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ГИДРОЛАЗЫ ЭФИРОВ АЛЬФА-АМИНОКИСЛОТ НА ОСНОВЕ ЭТОГО ШТАММА |
| RU2502797C1 (ru) * | 2012-09-18 | 2013-12-27 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | ШТАММ Escherichia coli - ПРОДУЦЕНТ ГИДРОЛАЗЫ ЭФИРОВ АЛЬФА-АМИНОКИСЛОТ ИЗ Xanthomonas rubrilineans И СПОСОБ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО СИНТЕЗА ГИДРОЛАЗЫ ЭФИРОВ АЛЬФА-АМИНОКИСЛОТ НА ОСНОВЕ ЭТОГО ШТАММА |
| RU2535893C1 (ru) * | 2013-08-20 | 2014-12-20 | Федеральное государственное унитарное предприятие "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов" (ФГУП "ГосНИИгенетика") | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот, гетерогенный биокатализатор, полученный таким способом, и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого гетерогенного биокатализатора |
| RU2650668C1 (ru) * | 2016-12-13 | 2018-04-16 | Федеральное государственное бюджетное учреждение "Государственный научно-исследовательский институт генетики и селекции промышленных микроорганизмов Национального исследовательского центра "Курчатовский институт" (НИЦ "Курчатовский институт" - ГосНИИгенетика) | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе липазы дрожжей Candida antarctica фракции В |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| RU2008107953A (ru) | 2009-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Wilson et al. | Encapsulation of crosslinked penicillin G acylase aggregates in lentikats: evaluation of a novel biocatalyst in organic media | |
| Klibanov | Immobilized enzymes and cells as practical catalysts | |
| Van de Velde et al. | Carrageenan: A food‐grade and biocompatible support for immobilisation techniques | |
| D'souza | Immobilized enzymes in bioprocess | |
| US6596520B1 (en) | Immobilizing lipase by adsorption from a crude solution onto nonpolar polyolefin particles | |
| MX2008012233A (es) | Metodo para la producción enzimática de ácidos carboxílicos 2-hisdroxi-2metilo. | |
| RU2381273C2 (ru) | Способ получения гетерогенного биокатализатора, биокатализатор на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого биокатализатора | |
| JP5583586B2 (ja) | グリコール酸の生産のための固定化微生物ニトリラーゼの改善 | |
| CN107208085B (zh) | 固定化细胞及其制备方法 | |
| Sambyal et al. | Exploitation of E. coli for the production of penicillin G amidase: a tool for the synthesis of semisynthetic β-lactam antibiotics | |
| EP2173892B1 (en) | Process for the preparation of penicillin or cephalosporin antibiotics | |
| WO2007026860A1 (ja) | 光学活性α－ヒドロキシカルボン酸の製造方法 | |
| Cheng et al. | Immobilization of permeabilized whole cell penicillin G acylase from Alcaligenes faecalis using pore matrix crosslinked with glutaraldehyde | |
| Chibata et al. | Immobilized cells: Historical background | |
| JP2016524899A (ja) | セルロースオリゴマーのエンドグルカナーゼ誘導産生 | |
| CN104480084B (zh) | 一种耐多种纯有机溶剂的脂肪酶及其编码基因和在多种高产酯类化合物合成中的应用 | |
| WO1991019002A1 (en) | A process for chiral enrichment of asymmetric primary amines | |
| CN101525603B (zh) | 固定化α-氨基酸酯水解酶及其制备与应用 | |
| RU2535893C1 (ru) | Способ получения гетерогенного биокатализатора на основе гидролазы эфиров альфа-аминокислот, гетерогенный биокатализатор, полученный таким способом, и способ синтеза аминобета-лактамного антибиотика под действием этого гетерогенного биокатализатора | |
| Vandamme | Use of microbial enzyme and cell preparations to synthesise oligopeptide antibiotics | |
| Wyss et al. | Novel reactive perstraction system applied to the hydrolysis of penicillin G | |
| IE893773L (en) | Biocatalysts and processes for the manufacture thereof | |
| Van den Tweel et al. | Biocatalyst production | |
| Antony et al. | Overview of the Enzyme Support System of Immobilization for Enhanced Efficiency and Reuse of Enzymes | |
| Klibanov | 18. Immobilized Enzymes and |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PC43 | Official registration of the transfer of the exclusive right without contract for inventions |
Effective date: 20170327 |
|
| PD4A | Correction of name of patent owner | ||
| MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20210305 |