CN101410517B - 用于在蚕中制备重组蛋白质的多聚核苷酸 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了以下新方法：作为能使蚕中部绢丝腺中产生的重组蛋白质分泌到茧中，从茧中容易地并且不使蛋白质的立体结构发生变性地提取重组蛋白质的新方法；还提供用于在蚕中部绢丝腺中使重组蛋白质表达的表达盒中与重组蛋白质的结构基因功能性地连接的多聚核苷酸，即，将构成丝胶蛋白1或者丝胶蛋白2基因的启动子区域的多聚核苷酸和构成杆状病毒同源性区域多聚核苷酸功能性地连接的多聚核苷酸。
Description
技术领域
本发明涉及用于在蚕中制备重组蛋白质的多聚核苷酸。更具体地讲，本发明涉及在可以用于由蚕进行有用重组蛋白质的大量生产的多聚核苷酸、含有该多聚核苷酸的载体、以及使用该载体制备的转基因蚕，还涉及从该转基因蚕所作的茧中提取有用重组蛋白质的重组蛋白质的制备方法。
背景技术
蚕在变成蛹之前作茧。该茧的主要成分是绢蛋白质，每个茧含有0.3～0.5g的绢蛋白质。绢蛋白质中约70％是丝心蛋白(fibroin)，余量的约30％是由被称为丝胶蛋白(sericin)的蛋白质所构成的。这些绢蛋白质是在绢丝腺合成的。绢丝腺是由后部绢丝腺、中部绢丝腺以及前部绢丝腺构成的，分别在后部绢丝腺中特异性地合成·分泌丝心蛋白，在中部绢丝腺中特异性地合成·分泌丝胶蛋白。从后部绢丝腺分泌的丝心蛋白，通过绢丝腺的蠕动运动缓慢地送到中部绢丝腺，并且通过分泌的丝胶蛋白包被四周，再送到前部绢丝腺，作为绢丝而被吐丝。所以在所吐出的绢丝中，丝心蛋白在丝的中心，丝胶蛋白包裹着丝心蛋白的周围而存在。
丝胶蛋白是起到浆糊的作用的蛋白质，发挥着使所吐出的绢丝相互进行粘接的功能。相对于丝心蛋白对水具有极大的不溶性，而丝胶蛋白比较易于溶于水中。由茧进行纺丝的情况下，通过将茧煮沸等操作，去除可溶性的丝胶蛋白，只将不溶性的丝心蛋白纤维作为生丝进行纯化。
本申请的发明人等着眼于蚕具有绢蛋白质的合成能力，开发了与绢蛋白质一起使大量的重组蛋白质分泌到茧中的转化蚕。对于导入了外来基因的转化蚕的制备，建立了将重组了来自鳞翅目昆虫Trichoplusiani的DNA型转座子piggyBac的质粒载体微量注射到蚕卵中的方法(Nat.Biotechnol.18，81-84，2000)。使用该基因导入法将在绢蛋白质基因启动子的下游连接的人·胶原cDNA重组到蚕中，开发以重组人·胶原作为茧或者绢丝腺内的蛋白质的一部分而产生的转化蚕(非专利文献1)、或者申请专利(专利文献1-3)。还有，也申请了涉及通过相同的方法，制备在绢丝腺或者茧丝中生产细胞因子的基因重组蚕，从绢丝腺或者茧丝回收细胞因子的重组型细胞因子的制备方法的专利申请(专利文献4)。
此外，本申请的发明人等，为了提高茧中的重组蛋白质的含量，着眼于具有高转录活性的丝心蛋白的重链基因，确定作为从上游区域开始具有促进基因的转录活性的最小区域的多聚核苷酸，提出了促进外源基因表达的多聚核苷酸(非专利文献2-3)，或者申请专利(特愿2003-147497)。
现有技术文献列表
专利文献1：特开2001-161214号公报
专利文献2：特开2002-315580号公报
专利文献3：特开2004-016144号公报
专利文献4：特开2003-325188号公报
非专利文献1：Tomita，M，et al，Nature Biotechnology.21，52-56，2003
非专利文献2：第25回日本分子生物学会program/LectureAbstracts，2002年11月25日，2P-1588
非专利文献3：第26回日本分子生物学会program/LectureAbstracts，2003年11月25日，2PC-174
发明内容
如上所述，约70％的构成茧的绢蛋白质是在后部绢丝腺合成的丝心蛋白。所以，利用丝心蛋白重链或者轻链的启动子以及增强子在后部绢丝腺表达重组蛋白质基因的话，能够向茧中分泌大量的蛋白质。这种情况下，因为重组蛋白质埋在不溶性的丝心蛋白纤维之中，所以是用于得到例如大量的重组蛋白质和茧的混合物的有效手段。还有，从该混合物中提取重组蛋白质，能够仅分离重组蛋白质。
不过，因为如果不使不溶性的丝心蛋白纤维溶解的话，就不能从茧中提取重组蛋白质，所以从重组蛋白质和茧的混合物进行重组蛋白质的提取以及分离也一定不容易。通常，为了使丝心蛋白纤维溶解，使用硫氰酸锂、硫氰酸胍、溴化锂等的离液剂盐、或者氯化钙和乙醇的混合液等，即使使用这些溶液，使丝心蛋白纤维完全地溶解也是很困难的。此外，如果使用这些溶液提取重组蛋白质的话，存在造成大部分重组蛋白质的立体结构变性的危险。所以在重组蛋白质具有依赖于立体结构的生理活性的情况下，必须进行使变性了的立体结构再生的处理，有时也会得不到活性型重组蛋白质。
此外，为了在后部绢丝腺表达重组蛋白质，有效地向茧中分泌，认为有必要将重组蛋白质作为与丝心蛋白或者与丝心蛋白的部分序列的融合蛋白质进行合成。这是因为从后部绢丝腺细胞分泌的内源性的丝心蛋白分子在形成绢丝的过程中，形成了极其致密的结晶结构。使重组蛋白质不是作为与丝心蛋白的融合蛋白质，而是单独的分子进行表达的情况下，重组蛋白质难以嵌入到内源性的丝心蛋白的结晶之间。另一方面，如果作为与丝心蛋白的融合蛋白质进行合成的话，融合蛋白质的丝心蛋白部分帮助嵌入到结晶结构中，能够使重组蛋白质埋入到结晶结构中，其结果可以向茧进行分泌。所以，例如，作为制备由丝心蛋白和重组蛋白质构成的有用的融合蛋白质(例如，与重组生理活性蛋白质融合的绢纤维等)的有效手段，为了向茧中分泌，有必要与丝心蛋白融合化，考虑要从茧中仅获得重组蛋白质的情况下，并不优选。因为为了仅提取重组蛋白质，必须例如、预先在编码丝心蛋白的多聚核苷酸和编码重组蛋白质的多聚核苷酸之间，插入编码因子X或者肠激酶等蛋白酶的切割序列的多聚核苷酸，进行将茧中存在的融合蛋白质用因子X或者肠激酶处理这样的、繁琐且需要成本的步骤。
如上所述，利用丝心蛋白重链或者轻链的启动子以及增强子，在后部绢丝腺表达重组蛋白质基因的方法具有能够合成大量蛋白质的优点，不过在重组蛋白质提取的过程中存在几个问题。
本申请的发明鉴于上述那样的情况，将消除现有技术中的问题，提供使蚕中部绢丝腺中产生的重组蛋白质向茧中分泌，能够从茧中容易地并且不使蛋白质的立体结构变性地提取重组蛋白质的新手段作为课题。
本申请作为解决上述的课题的发明，提供了下述(1)～(16)的发明。
(1)在用于在蚕中部绢丝腺中表达重组蛋白质的表达盒中，与重组蛋白质结构基因功能性地连接的多聚核苷酸，其为将构成丝胶蛋白1或者丝胶蛋白2基因的启动子区域的多聚核苷酸、和构成杆状病毒同源性区域的多聚核苷酸功能性地连接的多聚核苷酸。
(2)上述发明(1)的多聚核苷酸，其中构成丝胶蛋白2基因的启动子区域的多聚核苷酸是序列号1的核苷酸序列或者其一部分。
(3)用于在蚕中部绢丝腺中表达重组蛋白质的表达盒，其为上述发明(1)或者(2)的多聚核苷酸和重组蛋白质结构基因连接了的表达盒。
(4)多聚核苷酸，是促进上述发明(1)或者(2)的多聚核苷酸所具有的转录活性的多聚核苷酸，其为将构成丝胶蛋白1或者丝胶蛋白2基因的启动子区域的多聚核苷酸与编码杆状病毒I E1蛋白质的多聚核苷酸功能性地连接的多聚核苷酸。
(5)上述发明(4)的多聚核苷酸，其中，构成丝胶蛋白2基因的启动子区域的多聚核苷酸是序列号1的核苷酸序列或者其一部分。
(6)多聚核苷酸，是在上述发明(4)或者(5)的多聚核苷酸中还连接有构成杆状病毒同源性区域的多聚核苷酸。
(7)具有上述发明(3)的表达盒的表达载体。
(8)上述发明(7)的表达载体，其中，表达盒被夹在来自昆虫的DNA型转座子的一对反向重复序列之间。
(9)具有上述发明(4)、(5)或者(6)的多聚核苷酸的载体。
(10)上述发明(9)的载体，其中多聚核苷酸被夹在来自昆虫的DNA型转座子的一对反向重复序列之间。
(11)具有上述发明(3)的表达盒、和上述发明(4)、(5)或者(6)的多聚核苷酸的载体。
(12)上述发明(11)的载体，其中表达盒和多聚核苷酸被夹在来自昆虫的DNA型转座子的一对反向重复序列之间。
(13)在基因组中具有上述发明(3)的表达盒，使重组蛋白质在中部绢丝腺中表达的转基因蚕。
(14)在基因组中具有上述发明(4)、(5)或者(6)的多聚核苷酸，使杆状病毒IE1蛋白质在中部绢丝腺中表达的转基因蚕。
(15)在基因组中具有上述发明(3)的表达盒、和上述发明(4)、(5)或者(6)的多聚核苷酸，使重组蛋白质在中部绢丝腺中表达的转基因蚕。
(16)重组蛋白质的制备方法，其特征在于，从上述发明(13)的转基因蚕的茧中提取重组蛋白质。
(17)重组蛋白质的制备方法，其特征在于，从上述发明(15)的转基因蚕的茧中提取重组蛋白质。
(18)构成丝胶蛋白2基因的启动子区域的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸由序列号1的核苷酸序列或者其一部分序列构成。
如果根据本申请的发明，提供了能够以从转基因蚕的茧中容易地并且不使蛋白质的立体结构发生变性地进行提取的状态，能够表达重组蛋白质的多聚核苷酸。
通过使用丝胶蛋白的启动子以及增强子在中部绢丝腺中表达重组蛋白质基因，能够全部克服使用丝心蛋白的启动子区域，在后部绢丝腺中表达重组蛋白质的情况下的问题，即在从茧中提取重组蛋白质的过程中的问题。如果在中部绢丝腺中表达重组蛋白质基因的话，合成的重组蛋白质分泌到相对于水为可溶性的丝胶蛋白层。所以为了提取重组蛋白质，没有必要使用使蛋白质变性的溶液，可以不使重组蛋白质变性地容易地提取。即使在获得具有依赖于立体结构的生理活性的重组蛋白质的情况下，也没有必要进行使变性了立体结构再生的处理。此外，在中部绢丝腺合成的内源性的丝胶蛋白，因为不形成丝心蛋白那样的结晶结构，没有必要为了使重组蛋白质向茧中分泌而作为融合蛋白质被合成。所以也不需要通过蛋白酶处理，从融合蛋白质切取重组蛋白质的处理。
如上所述，使重组蛋白质在中部绢丝腺表达，分泌到丝胶蛋白层的话，能够解决从茧中提取重组蛋白质所涉及的问题。不过丝胶蛋白是构成30％的绢蛋白质的蛋白质，与丝心蛋白相比，含量少。所以，为了在中部绢丝腺中表达重组蛋白质基因，使大量的重组蛋白质向茧中分泌，需要作为在中部绢丝腺中具有极高的转录活性的基因表达控制序列的多聚核苷酸。本申请的发明提供了在构成丝胶蛋白1或者丝胶蛋白2基因的启动子区域的多聚核苷酸、作为能提高它们的启动子所具有的转录活性的多聚核苷酸，连接了构成杆状病毒同源性区域的多聚核苷酸的多聚核苷酸。还有，另外提供了能够增强作为连接了丝胶蛋白1或者丝胶蛋白2基因的启动子和杆状病毒同源性区域的多聚核苷酸的转录活性的多聚核苷酸：连接构成丝胶蛋白1或者丝胶蛋白2基因的启动子区域的多聚核苷酸、和编码杆状病毒IE1蛋白质的多聚核苷酸的多聚核苷酸。
通过使用如上所述的多聚核苷酸，能够使用蚕容易并且大量地生产不变性的重组蛋白质。
并且，在本发明中，“多聚核苷酸”是指嘌呤或者嘧啶与糖以β-N-糖苷键合的核苷酸的磷酸酯(ATP、GTP、CTP、UTP；或者dATP、dGTP、dCTP、dTTP)，以2个以上键合的分子。多聚核苷酸和其它的多聚核苷酸“功能性地连接”是指不损害各多聚核苷酸所具有的功能地，并且通过连接确保能够发挥所期望功能的状态的状态。具体而言，是指一多聚核苷酸的3’端的核苷酸和另一多聚核苷酸的5’端的核苷酸直接或者通过其它的连接序列连接的状态。
此外，本发明中“蛋白质”是指通过酰胺键(肽键)彼此键合的多个氨基酸残基构成的分子，“重组蛋白质”是指基因工程性制备的蛋白质。
还有，本发明中的“重组蛋白质结构基因”是指含有编码重组蛋白质的区域(open reading flame：ORF)的多聚核苷酸，例如，重组蛋白质基因的cDNA。“基因启动子区域”是指含有从编码蛋白质的基因区域的转录起点开始的上游区域中存在的用于开始转录的必须序列区域，通常指被称为“启动子区域”以及“增强子区域”的区域。
本发明中其他的用语或者概念，在发明的实施方式的说明或者实施例中进行了详细的规定。或者，为了实施本发明而使用的各种技术，除了特别明示了出处的技术以外，根据公知的文献等，如果是本领域技术人员的话就能够容易并且确实地实施。例如、基因工学和分子生物学技术在Sambrook and Maniatis，in Molecular Cloning-ALaboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NewYork，1989，Ausubel，F.M.et al，Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley&Sons，New York，N.Y，1995等中有记载。
附图说明
图1表示：调查使用在使用了基因枪的绢丝腺中的瞬时性基因表达系统，hr3以及IE1导致的丝胶蛋白1基因启动子的活性促进效果的结果。启动子活性表示为将中部绢丝腺中丝胶蛋白1基因启动子的活性作为1的情况下的相对值。PSG和MSG分别表示在后部绢丝腺以及中部绢丝腺中的启动子活性。
图2表示转基因蚕制备用载体pMSG2的结构。piggyBacR：piggyBac3’末端侧序列；3xP3-TATA：在眼或神经系统中引起表达的启动子；DsRed：红色荧光蛋白质基因；SV40 polyA：来自SV40的多聚A添加信号；IE1：BmNPV IE1的ORF；Pser1：蚕丝胶蛋白1基因启动子；HR3：BmNP hr3；attR1-Cm-ccdB-attR2：Gateway盒；FibL polyA；蚕丝心蛋白L链多聚A添加信号；piggyBa cL：piggyBac 5’末端侧序列。
图3是茧提取液的Western印迹解析的结果。将野生型蚕的茧、由pMOSRA-7载体制备的转基因蚕的茧、以及由pSEM2载体制备的转基因蚕的茧分别浸泡到含有1％triton-X的PBS中，提取蛋白质。提取的蛋白质进行电泳后，使用抗EGFP抗体进行Western印迹。
具体实施方式
已知在蚕的中部绢丝腺中合成的丝胶蛋白里，至少存在4～6种以上的分子种类，不过，这些丝胶蛋白是来者两种丝胶蛋白基因、即丝胶蛋白1基因以及丝胶蛋白2基因的合成产物。分别从丝胶蛋白1以及丝胶蛋白2的基因，通过选择性剪切机制，合成大小不同的各种丝胶蛋白mRNA，从这些mRNA翻译成各种分子量的丝胶蛋白蛋白质群(Dev.Biol.124，431-440，1987)。在本申请的发明中，为了在中部绢丝腺表达重组蛋白质基因，使用丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因的启动子区域。此处所说的启动子区域是指含有从丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因的转录起点开始的上游区域中存在的开始转录所必需的序列区域。实质上，是指来自丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因的碱基序列，能够开始该序列的下游上连接的重组蛋白质基因在中部绢丝腺细胞的转录的序列，只要是满足这些条件的序列，对序列的长度等没有限制。此外，含有促进启动子区域的转录活性、即所说的增强子序列也可以。丝胶蛋白1基因的启动子区域可以利用公知的碱基序列(GeneBank/AB007831)等，设计引物，通过进行基因组PCR等方法获得。丝胶蛋白2基因的启动子序列可以利用本申请的发明人等使用不对称PCR法克隆的序列号1记载的丝胶蛋白2基因5’上游区域的碱基序列(发明(18))、或者公知的碱基序列(GeneBank/J01036)等，设计引物，通过进行基因组PCR等的方法获得。
如上所述，能在中部绢丝腺表达重组蛋白质基因，并且使大量的重组蛋白质表达是本申请的发明中的课题。所以通过下述详细记载的发明能够增强丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因的启动子所具有的在中部绢丝腺细胞中的转录活性。
发明(1)(2)是在构成丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因启动子区域的多聚核苷酸中，通过组合构成杆状病毒同源性区域的多聚核苷酸(有下述所示的“hrs”或者表示单数的情况下记作“hr”的情况)增强丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因启动子所具有的在中部绢丝腺细胞的转录活性的多聚核苷酸。“hrs”是在杆状病毒(BmNPV、AcNPV、CfNPV、LdNPV、OpNPV等)的基因组内散在的一种重复序列，除了作为病毒DNA的复制起点发挥作用以外，还具有作为促进杆状病毒基因组内的各种基因的转录活性的增强子的功能(J.Biol.Chem.272，30724-30728，1997)。此外，已知hrs对杆状病毒基因以外的基因的转录也作为增强子发挥作用。例如据报道，BmNPV的hrs之一的hr3对蚕肌动蛋白启动子(J.Biol.Chem.272，30724-30728，1997)、AcNPV的hrs之一的hr 5对Rous sarcoma病毒的LTR发挥作用(J.Virol.61，2091-2099，1987)，增强它们的转录活性等。不过尚且不知丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因启动子所具有的在中部绢丝腺细胞的转录活性是否能由hrs提高。所以通过后述的实施例1对于这一点进行研究。结果发现hrs能够增强丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因启动子所具有的在中部绢丝腺细胞的转录活性，完成了发明(1)(2)。在本申请的发明中使用的hr只要具有增强丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因启动子的活性的效果，可以是来自任何杆状病毒。此外，在已知至少9种以上中的任何种类的hr都可以。此外，只要具有增强丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因启动子的活性效果，也可以是hrs的部分序列。这些hrs或者hrs的部分序列可以通过利用公知的碱基序列(GeneBank/NC_001962、GeneBank/NC_001623等)设计引物，使用病毒基因组作为模板而进行的PCR等方法获得。
发明(3)是发明(1)的多聚核苷酸和重组蛋白质结构基因连接得到的表达盒。盒内的重组蛋白质结构基因可以使用编码任何蛋白质的cDNA等。重组蛋白质只要是分泌蛋白质，可以直接使用编码蛋白质的cDNA，或者，如果不是分泌蛋白质的情况下，也可以在cDNA的5’末端侧添加编码信号肽的序列。编码信号肽的序列可以是来者丝胶蛋白等的绢蛋白质的，此外也可以是来者任何其它的分泌蛋白质的。在发明(3)的表达盒中，丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因启动子区域有必要连接在重组蛋白质结构基因的上游，不过，对于hrs，位于丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因启动子区域和重组蛋白质结构基因构成的多聚核苷酸的上游也可以，位于下游也可以。此外，也可以紧邻丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因启动子区域和重组蛋白质结构基因所构成的多聚核苷酸连接的话，只要有效果并且在其范围内的话，分开连接也可以。
本申请的发明(4)(5)是用于进一步增强发明(1)的多聚核苷酸所具有的转录活性的多聚核苷酸。该多聚核苷酸是由构成丝胶蛋白1或者丝胶蛋白2基因的启动子区域的多聚核苷酸、和其下游连接的编码杆状病毒IE1蛋白质的多聚核苷酸构成的。IE1是杆状病毒感染了宿主细胞之后立即合成的一组蛋白质中的一个，39k或者p35等病毒基因，此外还是活化编码IE1蛋白质的ie1基因自体表达的反式调节子(J.Virol.57，563-571，1986、J.Virol.66，7429-7437，1992)。已知IE1活化这些病毒基因表达的机制中包括通过hrs提高启动子的转录活性的机制、和不通过hrs的直接作用启动子的机制(J.Virol.77，5668-5677，2003)。此外，已知IE1活化肌动蛋白基因等、宿主细胞的基因的表达(Virology 218，103-113，1996)。
本申请的发明人等考虑到发明(1)(2)的多聚核苷酸所具有的在中部绢丝腺细胞的转录活性有可能被IE1蛋白质所增强，通过后面的实施例1对这种可能性进行验证。其结果发现：IE1蛋白质通过hrs提高启动子的转录活性的机制、和不通过hrs的直接作用启动子的机制这两种机制，增强了发明(1)(2)的多聚核苷酸所具有的在中部绢丝腺细胞中的转录活性。所以，如下面的为了使IE1蛋白质在中部绢丝腺细胞进行合成，制备在编码IE1蛋白质的ORF的上游连接了丝胶蛋白1基因或者丝胶蛋白2基因的启动子的多聚核苷酸，完成了发明(4)(5)。此外，开发了向发明(4)(5)的多聚核苷酸中连接杆状病毒hrs，使在中部绢丝腺细胞中能合成更多的IE1蛋白质的多聚核苷酸(发明(6))。在本发明(6)中，hrs可以连接在发明(4)(5)的多聚核苷酸的上游，也可以连接在下游。此外，也可以紧邻连接，只要具有hr s的效果以及在其范围内，也可以分开连接。这些编码发明(4)(5)以及发明(6)中IE1蛋白质的ORF可以利用公知的碱基序列(GeneBank/AY048770、GeneBank/M16820)等，设计引物，使用病毒基因组作为模板进行的PCR等方法获得。编码IE1蛋白质的ORF只要具有能增强合成的IE1对丝胶蛋白基因1或者2的启动子区域或者发明(1)(2)的多聚核苷酸的转录活性的效果可以来自任一杆状病毒，或者也可以是IE1的部分序列或者碱基序列的一部分改变得到的产物。
发明(7)是具有发明(3)的表达盒的表达载体。此外，发明(9)是具有发明(4)(5)或者(6)的多聚核苷酸的载体。这些载体只要能够用于作为蚕的转化的昆虫用载体，没有特别的限制。例如：AcNPV载体、或者重组了来自昆虫的DNA型转座子的质粒载体等，特别优选后者(发明(8)以及发明(10))。作为来自昆虫DNA型转座子已知piggyBac、mariner(Insect Mol.Biol.9，145-155，2000)、以及Minos(Insect Mol.Biol.9，277-281，2000)等。这些转座子因为在蚕细胞内表现出转移活性，所以有可能通过以这些DNA型转座子为基础制备的载体转化蚕。特别是以piggyBac为基础制备的质粒载体，通过向蚕卵进行微量注入，实际地成功转化了蚕(Nat.Biotechnol.18，81-84，2000)。
发明(11)具有发明(3)的表达盒、即用于表达重组蛋白质的多聚核苷酸、和发明(4)(5)或者发明(6)的多聚核苷酸、即表达IE1的多聚核苷酸这二者的载体。此外，发明(12)是发明(10的一个实施方式，载体是以DNA型转座子为基础而制备的载体。这些载体中，可以将表达重组蛋白质的表达盒、和合成IE1的核苷酸完全独立地含有在一个载体内，或者也可以共有启动子或者hrs。例如如果按照重组蛋白质基因-启动子-hrs-启动子-IE1ORF的顺序重组到载体中的话，可以共有hrs。或者，使用在蚕绢丝腺细胞中具有功能的IRES(Internal Ribosome Entry Site)，例如：如果按照hrs启动子-重组蛋白质基因-IRES-IE1ORF的顺序，重组到载体的话，可以共有hrs和启动子。
使用发明(7)或者发明(8)的载体，能够制备在基因组中具有用于表达重组蛋白质的表达盒的转基因蚕(发明(13))，或者使用发明(9)或者发明(10)的载体，能够制备在基因组中具有表达IE1的多聚核苷酸的转基因蚕(发明(14))。还有，如果使用发明(11)或者发明(12)的载体的话，能够制备在基因组中具有用于表达重组蛋白质的表达盒和表达IE1的多聚核苷酸这二者的转基因蚕(发明(15))。
对于转基因蚕的制备，例如在利用piggyBac为基础制备载体的情况下，可以使用与田村等人的方法(Nat.Biotechnol.18，81-84，2000)相同的方法进行。即，将piggyBac的一对反向重复序列重组到适当的质粒载体中，将插入的多聚核苷酸被一对反向重复序列夹着的方式插入。并且，将该质粒载体和piggyBac的转座子表达载体(辅助质粒)一起微量注入蚕卵中。该辅助质粒是缺少了piggyBac的反向重复序列的一方或者双方的、实质上仅重组了piggyBac的转座子基因区域的重组质粒载体。该辅助质粒中用于使转座子表达的启动子可以直接利用内源性转座子启动子，或者，也可以利用蚕·肌动蛋白启动子或者果蝇HSP70启动子等。为了容易地进行下一代蚕的筛选，可以向插入多聚核苷酸的重组的载体内同时重组标记基因。这种情况下，在标记基因的上游，例如蚕·肌动蛋白启动子或者果蝇HSP70启动子等的启动子序列，通过其作用使标记基因表达。为了使标记基因表达的启动子不受存在于载体内的hrs的影响可以在使标记基因表达的启动子和hrs之间重组隔离子。作为使用的隔离子，例如可以列举果蝇gypsy转座子的隔离子等。
饲养从微量注入了载体的蚕卵孵化的幼虫(F0代)，将得到的全F0代的蚕与野生型蚕、或者F0代蚕彼此进行交配，从下一代(F1代)的蚕中选择转基因蚕。转基因蚕的选择，例如可以使用PCR法或者Southern印迹法进行。还有，在重组有标记基因的情况下，可以利用其表型性质进行选择。例如作为标记基因利用GFP等荧光蛋白质基因的情况下，对F1代的蚕卵或者幼虫进行激发光照射，通过检测荧光蛋白质发出荧光进行检测。通过以上的方法能够制备转基因蚕。
发明(13)以及发明(15)的转基因蚕在中部绢丝腺表达重组蛋白质，向绢丝的丝胶蛋白层分泌重组蛋白质。发明(15)的转基因蚕因为除了重组表达蛋白质的表达盒外，还重组了表达I E1的多聚核苷酸，所以通过仅仅重组了表达发明(13)的重组蛋白质的表达盒的转基因蚕能够表达大量的重组蛋白质。发明(15)的转基因蚕如上所述，能够使用发明(11)或者发明(12)的载体制备，或者在重组了表达发明(13)的重组蛋白质的表达盒的转基因蚕中，使用发明(9)或者发明(10)的载体，重组表达IE1的多聚核苷酸，或者在重组有表达发明(14)的IE1的多聚核苷酸的转基因蚕中，使用发明(7)或者发明(8)的载体，通过重组表达重组蛋白质的表达盒进行制备。还有，使发明(13)的转基因蚕和发明(14)的转基因蚕交配，从下一代蚕中通过选择同时兼具表达重组蛋白质的表达盒和表达IE1的多聚核苷酸二者的蚕进行制备。
发明(16)和发明(17)分别是从发明(13)以及发明(15)的转基因蚕的茧提取重组蛋白质的重组蛋白质的制备方法。发明(13)以及发明(15)的转基因蚕合成的重组蛋白质分泌到构成茧的绢丝的丝胶蛋白中。如前所述，丝胶蛋白层是有对水可溶性的丝胶蛋白所构成的，存在于该层的重组蛋白质，能够不使用使蛋白质变性的溶液来进行提取。用于从丝胶蛋白层提取重组蛋白质的提取液只要是能够提取重组蛋白质的，就没有特别的限制。例如可以是：中性盐类的溶液、含有表面活性剂、或者其他有效地进行提取的试剂等的溶液。使用这些提取液，从茧中提取重组蛋白质时，能够使用例如将片段化的茧浸泡在提取液中进行搅拌等的方法。还有，在提取前也可以进行将茧进行微粉末化的处理，也可以在提取时并用进行超声波处理等机械性处理。
实施例
下面通过实施例更加详细并且具体地说明本发明，不过本发明不局限于下述的例子。
实施例1
通过hr 3以及IE1验证丝胶蛋白1基因的启动子活性促进效果
制备下述3种载体，对BmNPV的hrs之一的hr3与BmNPV的IE1导致的蚕丝胶蛋白1启动子的转录活性促进效果，利用使用基因枪的瞬时性基因表达系统进行研究。
在丝胶蛋白1启动子的下游具有萤火虫荧光素酶基因的载体
将对应于以蚕丝胶蛋白1基因的转录起点定为+1的情况下的-304？+20的区域的DNA片段是通过用蚕成虫腹部提取的基因组DNA作为模板进行PCR而得到的。所使用的引物是5’-GCTAGCAGTCGAATTTCGACTACTGCG-3’(序列号2)和5’-GCTAGCCCCGATGATAAGACGACTATG-3’(序列号3)，在各自的5’末端添加NheI位点。将得到的PCR产物用Nhe I切割后，插入到萤火虫荧光素酶报告基因载体pGL3-basic(Promega)的Nhe1位点。
在hr3和丝胶蛋白1启动子的下游具有萤火虫荧光素酶基因的载体
含有BmNPV的hr3(碱基号64321？66017：GeneBank数据库登记号NC_001962)的DNA片段是通过使用pXINSECT-DEST38(Invitrogen)作为模板的PCR得到的。使用的引物是5’-CGGAATCTATGTTACGGACTTC-3’(序列号4)和5’-GAGCTCGATATCGAATTCCTGCAGCC-3’(序列号5：5’末端添加有SacI位点)。得到的PCR产物用SacI切割后，插入在具有上述①的丝胶蛋白1启动子，即pGL3的丝胶蛋白启动子的上游的SacI位点。使插入的DNA片段的方向为使hr3的5’末端(碱基号64321)侧位于丝胶蛋白1启动子侧。
在hr3和丝胶蛋白1启动子的下游具有IE1的ORF的载体
BmNPV的IE1的ORF(碱基号116981？119482：GeneBank数据库登记号NC_001962)是通过用pXINSECT-DEST38作为模板的PCR得到的。使用的引物为：5’-GGATCCCAACCAAACGACTATGACGC-3’(1序列号6：5’末端添加BamHI位点)和5’-CAGGAGTGGGCATACTCTTG-3’(序列号7)。得到的PCR产物插入到pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)中。然后，丝胶蛋白1启动子通过PCR从[1]的具有丝胶蛋白1启动子的pGL3载体扩增得到。使用的引物是5’-GGATCCGAGCTCAGTCGAATTTCGACTACTGCG-3’(序列号8：5’末端添加BamHI位点和SacI位点)、和5’-GGATCCGCTAGCCCCGATGATAAGACGACTATG-3’(序列号9：5’末端添加BamHI位点)。PCR产物用BamHI消化，插入到具有上述的IE1ORF的pCR4Blunt-TOPO载体的IE1ORF的5’末端侧存在的BamHI位点。最后，将[2]的在hr3和丝胶蛋白1启动子的下游具有萤火虫荧光素酶基因的载体用SacI消化，由此从该载体中切取hr3，插入到存在于具有上述的丝胶蛋白1启动子和IE1ORF的载体的、丝胶蛋白1启动子的5’末端侧的SacI位点。插入的方向是使hr3的3’末端(碱基号66017：GeneBank数据库登记号NC_001962)侧在丝胶蛋白1启动子侧。
准备将上述[1]的载体和不含插入的DNA的pCR4Blunt-TOPO载体按照1∶1的比例混合的DNA溶液(以下记作Pser)，上述[2]的载体和不含插入的DNA的pCR4Blunt-TOPO载体按照1∶1的比例混合的DNA溶液(以下记作pser+hr3)、上述[1]的载体和上述[3]的载体按照1∶1的比例混合的DNA溶液(以下记作Pser+IE1)、以及上述[2]的载体和上述[3]的载体按照1∶1的比例混合的DNA溶液(以下记作Pser+hr3+IE1)，根据下述记载的方法，将这4种DNA混合液导入到蚕绢丝腺中，测定荧光素酶活性。
1)金粒子的制备：使每1mg的金粒子附着188ng的DNA混合液。
2)绢丝腺获取：从5龄1天的幼虫得到绢丝腺用Grace培养基洗涤。
3)通过基因枪将DNA导入绢丝腺：使用基因枪(Helios GeneGun；BioRad)，向绢丝腺打入附着有DNA的金粒子。每个绢丝腺打入0.02mg的金粒子(3.8ng DNA)。
4)绢丝腺的移植：将绢丝腺用Grace培养基洗涤后，移植到与取出了绢丝腺的个体具有相同日龄的幼虫的背侧后方体腔内。饲养移植了绢丝腺的幼虫3天时间。
5)绢糸腺的回收：从宿主取出移植的绢丝腺，用Grace培养基洗涤后，将绢丝腺分割成中部绢丝腺和后部绢丝腺。
6)荧光素酶活性的测定：中部绢丝腺和后部绢丝腺在passivelysis buffer(Promega)中匀浆后离心，使用荧光素酶定量系统(Promega)测定上清中的荧光素酶活性。
针对一种DNA混合液，进行向9～12个绢丝腺的导入，测定荧光素酶活性。算出各自的平均值和标准偏差(SEM)。图1显示了该结果。值表示为将导入了Pser的绢丝腺之中的中部绢丝腺中的荧光素酶活性的平均值作为1的情况下的相对值。
导入了Pser、Pser+hr3、Pser+IE1、以及Pser+hr3+IE1的中部绢丝腺中的荧光素酶相对活性分别是1、5.2、3.7、31.4。这样可知，hr3以及IE1各自即使单独使用也能增强丝胶蛋白1启动子的转录活性，不过同时存在hr3以及IE1二者的时候，转录活性的增强效果极高。
实施例2
转基因蚕制备用载体的制备
制备使5’末端磷酸化的寡核苷酸5’-AATTCCTTAAGCTCGAGTCGCGA-3’(序列号10)和5’-AATTTCGCGACTCGAGCTTAAGG-3’(序列号11)退火得到的双链寡核苷酸。该双链寡核苷酸具有Af1II、XhoI、NruI限制性酶识别序列，使两末端为可以连接到EcoRI位点的结构。在具有作为标记基因的、在眼或者神经系统表达的红色荧光蛋白质(DsRed)基因的piggyBac载体，也就是pBac[3xP3-DsRed/pA](Nat、Biotechnol.21，52-56(2003)的EcoRI位点插入该双链寡核苷酸，向pBac[3xP3-DsRed/pA]载体中插入Af1II、XhoI、NruI的限制性酶识别序列。
通过将实施例1的载体[3](在hr3和丝胶蛋白1启动子的下游具有IE1的ORF的载体)作为模板的PCR，扩增由丝胶蛋白1启动子和IE1ORF构成的DNA片段。PCR中使用的引物是5’GAATTCAGTCGAATTTCGACTACTGCG-3’(序列号12)以及5’-GAATTCCAGGAGTGGGCATACTCTTG-3’(序列号13)，分别在5’末端添加有EcoRI位点。所以，得到的DNA片段的两末端上添加有EcoRI位点。将该DNA片段用EcoRI消化，插入到具有上述的Af1II、XhoI、NruI的piggyBac载体的EcoRI位点。
同样地通过将实施例1的载体[2](在hr3和丝胶蛋白1启动子的下游具有萤火虫荧光素酶基因的载体)作为模板的PCR，扩增由hr3和丝胶蛋白1启动子构成的、并且在两末端具有XhoI位点的DNA片段。所使用的引物是5’-CTCGAGGATATCGAATTCCTGCAGCC-3’(序列号14)以及5’-CTCGAGCCCGATGATAAGACGACTATG-3’(序列号15)。扩增的DNA片段用XhoI消化后，插入到插入了上述的丝胶蛋白1启动子以及IE1ORF的piggyBac载体的XhoI位点。
最后，使用Gateway载体转化系统(Invitrogen)，在上述的载体的NruI位点插入含有来自λ噬菌体的部位特异性重组位点，也就是attR1以及attR2的DNA片段(Gateway盒)(pMSG2：图2)。通过插入该DNA片段，可以利用Gateway系统(Invitrogen)，将想要表达的任意的基因重组到添加了hr3的丝胶蛋白1启动子的下游。重组的任意的基因通过添加了hr3的丝胶蛋白1启动子可以在中部绢丝腺进行高表达。此外，通过由重组在同一载体内的IE1ORF合成的IE1蛋白质增强该表达。因为在重组到载体中的IE1ORF的上游有hr3和丝胶蛋白1启动子，所以IE1蛋白质在中部绢丝腺进行高表达。所以在中部绢丝腺中任意的基因的表达都能达到非常高的水平。
实施例3
制作向丝胶蛋白层分泌绿色荧光蛋白质的转基因蚕
通过使用含有编码人钙网蛋白的信号肽的序列的引物(5’-CACCATGGTGCTATCCGTGCCGTTGCTGCTCGGCCTCCTCGGCCTGGCCGTCGCCGTGAGCAAGGGCGAGGAG-3’：序列号16)和含有EGFP的终止密码子的引物(5’-TTTACTTGTACAGCTCGTCCATGC-3’：序列号17)，以pEGFP(Clontech)作为模板的PCR，制备在编码人钙网蛋白的信号肽的序列的5’末端添加了EGFP的cDNA。将得到的cDNA片段重组到pENTR载体(Invitrogen)中，再利用Gateway系统插入到pMSG2中构建表达分泌型EGFP的载体(pSEM2)。
将pSEM2通过氯化铯超离心法纯化后，将pSEM2和辅助质粒pHA3PIG(Nat.Biotechnol.18，81-84(2000))按照质粒量成为1∶1地混合，然后进行乙醇沉淀后，将pSEM和pHA3PIG各自的浓度分别为200μg/ml那样地溶解到注射缓冲液(0.5mM磷酸缓冲液pH7.0，5mM KCl)中。将该DNA溶液在产卵后2～8小时时向前胚盘叶期的蚕卵(蚕胚)中，按照每个卵约15？20nl的液量进行微量注入。共计向3466个卵进行了微量注入。
将微量注入了载体DNA的卵在25℃下温育后，有553个卵孵化了。继续饲养孵化了的蚕，使得到的可以生殖的成虫进行交配，得到143组F1的卵块。通过将产卵日起第5～6天的F1卵块用荧光实体显微镜进行观察，筛选从眼或者神经系发出红色荧光的转基因蚕的卵。其结果，能够得到7组含有转基因蚕的卵的卵块。使得到的卵块孵化，饲养后，来自6组卵块的转基因蚕在到达吐丝期前死亡。来自1组卵块的转基因蚕正常地作茧，成蛹，再羽化，成为具有生殖能力的成虫。于是与野生型的蚕交配，建立转基因系统。
由pSEM2制出的转基因蚕一旦到达了5龄期，就从它的中部绢丝腺发出强的绿色荧光。然后，到达吐丝期时，吐出发出绿色荧光的茧丝作成茧。这样，暗示着转基因蚕在中部绢丝腺合成EGFP，向茧丝的丝胶蛋白层分泌EGFP。所以接着将茧丝浸入不含蛋白质变性剂的中性缓冲液中，尝试提取EGFP。用剪刀将茧丝片段化后，悬浮到含有1％triton-X的PBS中，在4℃中温育48小时。与上述同样，野生型蚕的茧丝以及通过pMOSRA-7载体(Nat.Biotechnol.21，52-56(2003))制备的转基因蚕的茧丝(不溶性丝心蛋白层含有丝心蛋白L链、小分子胶原的三螺旋区域以及EGFP的融合蛋白质)的片段也在含有1％Triton-X的PBS中温育。通过离心，去除茧丝片段，将各提取液在荧光实体显微镜下观察。其结果仅从由pSEM2制备的转基因蚕的茧提取液中检测到了绿色荧光。从提取液中检测到绿色荧光的事实表明分泌到丝胶蛋白层中的EGFP未伴随立体结构变性地被提取到中性缓冲液中。
此外，将提取液中含有的蛋白质进行电泳、Western印迹解析。将与提取液等量的SDS样品与缓冲液混合，95℃加热5分钟。将该试样提供给SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(Nature 227，680-685，1970)，根据Matsudaira等人的方法(J.Biol.Chem.262，10035-10038，1987)，将电泳的蛋白质转移到硝基纤维素膜BA85(S&S)上。将该硝基纤维素膜用封闭液(5％Skim milk/50mM的Tris盐酸缓冲液pH7.5、150mM NaCl)在室温下处理1小时后，和用封闭液稀释了1000倍的抗EGFP多克隆抗体(Clontech)在室温下反应1小时。然后，与用含有Tween20的TBS(50mM Tris盐酸缓冲液pH 7.5、150mM NaCl)稀释了3000倍的辣根过氧化物酶标记的抗兔IgG抗体(CellSigna ling Technology)在室温下反应约1小时。最后使用ECL WesternBlotting Detection Reagents(Amersham Bioscicnces>检测与抗体反应的蛋白质。
其结果，从用野生型蚕的茧以及pMOSRA-7载体制备的转基因蚕的茧提取液中检测不到与EGFP抗体反应的条带，不过从使用pSEM2载体制备的转基因蚕的茧提取液中，在与EGFP的分子量一致的27kDa的位置处能够检测到清楚的条带(图3)。
通过以上的结果可知，能够确认在用pSEM2载体制备的转基因蚕的茧中，含有能够用不含蛋白质变性剂的中性缓冲液提取的重组EGFP。这样一来可以明确，插入到pMSG2载体中的重组蛋白质基因不仅可以是与丝心蛋白等绢蛋白质的融合蛋白质，而且也可以作为重组蛋白质单独表达以及分泌，此外，还能够不发生蛋白质的高级结构的变性地从在中性缓冲液的茧中提取。
实施例4
蚕丝胶蛋白2基因5’上游区域序列的克隆
对于蚕丝胶蛋白2基因的5’上游区域序列，仅仅报道了将转录起点作为+1的情况下的碱基号-80～+60的序列(Gene 86，177-184，1990)，该序列的更上游区域的序列尚且未知。所以，对丝胶蛋白2基因序列未测定的5’上游区域，通过不对称PCR从蚕基因组DNA进行扩增，对序列进行测定。所述的不对称PCR法是通过针对已知的序列，使之与该序列特异性的引物进行退火，针对未知的序列，使之与简并的随机引物进行退火，进行PCR，得到与已知序列相邻的未知序列的方法。为了防止扩增非目的序列的扩增，将已知序列特异性引物作为嵌套引物，进行多次PCR，纯化扩增产物。丝胶蛋白2基因的已知序列在Michaille等的论文(Gene 86，177-184，1990)中有所记载。参考将转录起点的碱基定为+1时的、从碱基号-80到碱基号+60的碱基序列，设计了3个引物作为序列特异性嵌套引物：GSP-A(5’-TGGGATCTTCATGATGACTCGTGTGGCTC-3’：序列号18)、GSP-B(5’-GACAGACCACCTTTATATAGCCGGTGCCAC-3’：序列号19)、GSP-C(5’-GACAGTGCACGTCGGTCAAACTGTGTCAAC-3’：序列号20)。模板使用从蚕成虫的腹部提取的基因组DNA 100ng。不对称PCR反应使用APAgene Locator试剂盒(Bio S&T Inc.)进行。简并随机引物、酶、底物等使用试剂盒附带的，此外，反应条件全部按照试剂盒附带的说明书进行。其结果能够扩增约1.5kb的DNA片段。该扩增产物亚克隆到pCR4Blunt-TOPO载体(Invitrogen)中，通过双脱氧法测定碱基序列。碱基序列如序列号1所示。
产业上的可利用性
如以上详细说明，通过本申请的发明，能够在中部绢丝腺中表达重组蛋白质基因，并且提供了由具有高转录活性的基因表达控制序列构成的多聚核苷酸。此外，提供了含有该多聚核苷酸的载体、使用该载体制备的转基因蚕、以及由该转基因蚕作成的茧中提取重组蛋白质的重组蛋白质的制备方法。如果利用本发明，能够使各种重组蛋白质不仅作为与丝蛋白质的融合蛋白质，而且也可以作为单独的蛋白质，向蚕的茧中分泌。而且能够使重组蛋白质不发生变性地、很容易地从茧中提取。所以能够使在医疗、食品、化妆品、纤维等的各种产业领域中可以利用的重组蛋白质大量地并且容易地进行生产。
序列表
<110>Hiroshima Industrial Promotion Organization and
Biointegrence Inc.
<120>用于在蚕中制备重组蛋白质的多聚核苷酸
<130>05-F-064PCT
<150>JP2004-301834
<151>2004-10-15
<160>20
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>1490
<212>DNA
<213>Bombyx moti
<400>1
cagaatctac cacgatcgga aacgcgaccc actgagaaga tccggcgaga aactcagtga 60
gctgtgtcta tgggttaatt tactcgtcga gccctgttta ctgtttaggg cgacgtcgac 120
tgttaccatt cggtctacag gatcgagtgt gcattcttgt atcatcgttc tattatcacg 180
agtcattttg cgttttttcg gatcccctgg aagtcgtcgt ggcctaagag ataagaagtc 240
cggtgcattc gtgttgagcg atgcacctgt gttcgaatcc taggcgggta ccaatttttc 300
taatgaatta cgtacccaac aaattgttca cgattgcctt ccacggtgaa ggaataacat 360
cgtgcaataa aagtgaaacc cgcaaaatcc ggtgctttta agcttttcaa gcaccggtca 420
ccatcctcgt tgaactcatc gatctacaag cgatctaatc tatagaccca atccactaag 480
atctcaccgg atcttctcag tggttcgcat tccagtggta gattcaattc gctgctcttg 540
ctagggctag tgttagcaaa ttccttcggg ttaagcccga gagctcacct atccgtccgc 600
gctaagctgg aaaagcccct taagctgttt tttttttgta tagcctttat tgctaatact 660
aaacaataac taataatttt acatacagta acaaattgtt ttaacttaaa tctaatacat 720
cggatttccc ggttcagtga tcagcgtgtc ctgtgacaca taggcctctt ccagctgctt 780
tcatttttct ctattggtag cttttcttga ccagattgtc tctccaatca tcttgatatc 840
gtctgtccat cttctagctt gcctggctct tttcctttaa accaggggtc gtgaattcaa 900
tcctcacagg aagccgggat taggtgggag aatatagttc cgatgttttg aatgctttat 960
attttctgtg gtcgaaaatg atactagagc tacgcgtcga caattgaata ttatgctaac 1020
taccctctat ttattaaaag acttttacga ttcatttcgc acagaaccaa tcgactgggt 1080
ttagaggttt agcagtttgt tgaatgaact cgttttcatc ttcacgatta gaggatccca 1140
ggtgttaggt aaaggatatt ctagattgca ggagattttt cataaataat cacgcgatgg 1200
agcggtaatc agccaacata gtcgatcggc atcattattg gagaccaaac aacacttcag 1260
ttatccaagc gcgtcttaag tcgcattcgg ataatcttga atagcctgga agtgaatttt 1320
taaaaagttt gtctcgaaca aacatcaatt actttgtaat tgaaccgaaa aaagaggata 1380
aacattatta gcattcgttg taatgaaata taatgttgac acagtttgac cgacgtgcac 1440
tgtcttttgt ggcaccggct atataaaggt ggtctgtccg ttctgagcca 1490
<210>2
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>2
gctagcagtc gaatttcgac tactgcg 27
<210>3
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>3
gctagccccg atgataagac gactatg 27
<210>4
<211>22
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>4
cggaatctat gttacggact tc 22
<210>5
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>5
gagctcgata tcgaattcct gcagcc 26
<210>6
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>6
ggatcccaac caaacgacta tgacgc 26
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>7
caggagtggg catactcttg 20
<210>8
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>对人工序列的描述：合成的寡核苷酸
<400>8
ggatccgagc tcagtcgaat ttcgactact gcg 33
<210>9
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
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<223>对人工序列的描述：合成的寡核苷酸
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ggatccgcta gccccgatga taagacgact atg 33
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gaattccagg agtgggcata ctcttg 26
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ctcgaggata tcgaattcct gcagcc 26
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caagggcgag gag 73
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<400>20
gacagtgcac gtcggtcaaa ctgtgtcaac 30
Claims (14)
1.一种用在使重组蛋白质在蚕中部绢丝腺中表达的表达盒中的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸与重组蛋白质结构基因功能性地连接，所述多聚核苷酸由BmNPV的hr3多聚核苷酸序列与丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游第-304～+20位多聚核苷酸序列组成，其中BmNPV的hr3多聚核苷酸序列的下游与丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游第-304～+20位多聚核苷酸序列连接。
2.用于使重组蛋白质在蚕中部绢丝腺中表达的表达盒，所述表达盒是权利要求1的多聚核苷酸的下游与重组蛋白质结构基因连接了的表达盒。
3.一种促进权利要求1的多聚核苷酸所具有的转录活性的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸由丝胶蛋白1基因的转录起点5’上游-304～+20的多聚核苷酸序列与编码BmNPV IE1蛋白质的多聚核苷酸序列组成，其中丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游第-304～+20位多聚核苷酸的下游与编码BmNPV的IE1蛋白质的多聚核苷酸序列连接。
4.多聚核苷酸，所述多聚核苷酸是在权利要求3的多聚核苷酸的上游还连接有构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸。
5.表达载体，具有权利要求2的表达盒。
6.权利要求5的表达载体，表达盒被夹在来自昆虫的DNA型转座子的一对反向重复序列之间。
7.载体，具有权利要求3或权利要求4的多聚核苷酸。
8.权利要求7的载体，多聚核苷酸被夹在来自昆虫的DNA型转座子的一对反向重复序列之间。
9.载体，具有权利要求2的表达盒、和权利要求3的多聚核苷酸，其中，
权利要求2的表达盒连接有构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸序列、丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多聚核苷酸序列、以及重组蛋白质结构基因，其中，构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸的下游与丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸序列连接，丝胶蛋白1基因转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸的下游与重组蛋白质结构基因连接；
权利要求3的多聚核苷酸由丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多聚核苷酸与编码BmNPV的I E1蛋白质的多聚核苷酸序列构成，其中丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多聚核苷酸的下游与BmNPV的IE1蛋白质的多聚核苷酸序列连接。
10.载体，具有权利要求2的表达盒和权利要求4的多聚核苷酸，其中
权利要求2的表达盒连接有构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸序列、丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多聚核苷酸序列、以及重组蛋白质结构基因，其中，构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸的下游与丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸序列连接，丝胶蛋白1基因转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸的下游与重组蛋白质结构基因连接；
权利要求4的多聚核苷酸连接有：构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸、丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多聚核苷酸、以及编码BmNPV的IE1蛋白质的多聚核苷酸序列，其中，构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸的下游与丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸连接，与丝胶蛋白1基因转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸的下游与编码BmNPV的IE1蛋白质的多聚核苷酸序列连接。
11.权利要求9或10的载体，其中，表达盒和多聚核苷酸被夹在来自昆虫的DNA型转座子的一对反向重复序列之间。
12.重组蛋白质的制备方法，其特征在于，由转基因蚕的茧提取重组蛋白质，其中转基因蚕在基因组中带有权利要求2的表达盒，在中部绢丝腺表达重组蛋白质。
13.重组蛋白质的制备方法，其特征在于，由转基因蚕的茧提取重组蛋白质，其中转基因蚕在基因组中带有权利要求2的表达盒和权利要求3的多核苷酸，在中部绢丝腺表达重组蛋白质，
其中权利要求2的表达盒连接有：构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸序列、丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多聚核苷酸序列、以及重组蛋白质结构基因，其中，构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸的下游与丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸连接，在丝胶蛋白1基因转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸的下游与重组蛋白质结构基因连接；
权利要求3的多聚核苷酸由丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多聚核苷酸与编码BmNPV的IE1蛋白质的多聚核苷酸序列构成，其中丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多聚核苷酸的下游与BmNPV的IE1蛋白质的多聚核苷酸序列连接。
14.重组蛋白质的制备方法，其特征在于，由转基因蚕的茧提取重组蛋白质，其中转基因蚕在基因组中带有权利要求2的表达盒和权利要求4，在中部绢丝腺表达重组蛋白质，
权利要求2的表达盒连接有构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸序列、丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多聚核苷酸序列、以及重组蛋白质结构基因，其中，构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸的下游与丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸序列连接，丝胶蛋白1基因转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸的下游与重组蛋白质结构基因连接；
权利要求4的多聚核苷酸连接有：构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸、丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多聚核苷酸、以及编码BmNPV的IE1蛋白质的多聚核苷酸序列，其中，构成BmNPV的hr3的多聚核苷酸的下游与丝胶蛋白1基因的转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸连接，丝胶蛋白1基因转录起点5′上游-304～+20的多核苷酸的下游与编码BmNPV的IE1蛋白质的多聚核苷酸序列连接。
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