CN108642059B

CN108642059B - 适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因及其表达载体和应用

Info

Publication number: CN108642059B
Application number: CN201810421158.4A
Authority: CN
Inventors: 王峰; 夏庆友; 陈文静; 王日远; 王元成; 赵萍
Original assignee: Southwest University
Current assignee: Chongqing Century Legend Technology Development Partnership LP
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2020-07-28
Anticipated expiration: 2038-05-04
Also published as: CN108642059A

Abstract

本发明涉及适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因及其表达载体和应用，该基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，其编码的氨基酸如SEQ ID NO.1所示，将改造具有促进细胞增殖因子基因与分泌型丝胶1基因启动子和分泌型丝胶1基因终止子构成表达框，并用增强子hr3增强表达，同时连入piggyBac转座臂和荧光筛选标记基因构建表达系统，该表达系统能够在家蚕丝腺中高效表达具有活性的促进细胞增殖因子，获得具有促进细胞增殖的蚕丝，有巨大的开发价值。

Description

适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因及其表达载体和应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因，还涉及相关表达载体和应用。

背景技术

家蚕又称桑蚕，起源于中国，在我国具有上千年人工驯化的历史。家蚕是以桑叶为食的吐丝结茧的经济昆虫，蚕丝是构成丝绸产业的基础。蚕丝作为纺织材料，具有易加工、保湿性能良好、抵抗紫外线等多种优势；同时蚕丝作为生物材料，具有良好的机械性能、生物相容性、较强的环境稳定性及可降解性等特性，逐渐在医学和生物组织工程等领域被关注。然而长期以来，蚕丝自身性能的缺陷，如不易染色、机械性能差等，成为制约丝绸产业发展的瓶颈，也不能满足医学组织工程研究的需要。因此，对蚕丝本身进行创新研究，对蚕丝自身性能和功能的优化以及改善刻不容缓。

21世纪初，果蝇等模式生物的相关研究中发现并成功运用piggyBac转座子的转基因研究取得了重大突破，受该研究的启示，有研究人员利用显微注射家蚕胚胎的方法将将携带有绿色荧光蛋白(EGFP)报告基因的piggyBac转座表达载体导入家蚕早期胚胎，并在G1代蚕卵中成功获得了表达EGFP的转基因蚕。随后，Thomas等将神经复眼组织特异性启动子的绿色荧光蛋白基因遗传标记(3XP3-EGFP)应用到家蚕转基因遗传筛选中，简化了转基因家蚕的制备流程，提高了转基因的筛选效率。利用该转基因技术，建立了包括丝素表达系统及丝胶表达系统在内的多种表达系统，可以在家蚕蚕丝中成功表达转入的外源蛋白。基于piggyBac 转座载体，将外源蛋白导入蚕丝蛋白中得到新型的蚕丝材料，这为新型蚕丝材料的改性与创制提供了新的途径。

蚕丝主要由丝胶和丝素组成，丝胶蛋白是一种胶状蛋白，包裹在丝素蛋白的外层形成蚕丝纤维。丝胶蛋白极易溶于水，由丝胶1基因(Ser1)、丝胶2基因(Ser2)和丝胶3基因(Ser3) 先后在中部丝腺不同部位表达，其中Ser1基因表达量最高，因此该基因的启动子序列常被用于表达外源蛋白得到新型蚕丝素材。2007年，Tomita等利用家蚕丝胶1基因(Ser1)启动子建立了Ser1表达系统，由300bp的Ser1启动子调控EGFP基因在丝胶层的分泌表达，并利用源自杆状病毒的反式调控元件IE1和增强子元件hr3激活Ser1启动子的活性，使得EGFP的表达水平增加10倍，占茧层质量的0.7％。随后Iizuka等利用BmNPVpol基因的5'端非翻译区(5'-UTR)对该系统进行优化，使外源蛋白EGFP的翻译效率提高2倍。但是，hr3/IE1会破坏Ser1启动子的组织特异性，导致标记基因与外源基因异位表达，进而引起转基因家蚕死亡。2013年，Wang等报告了一种高效的Ser1表达系统hSRSE，该系统由Ser1基因528bp 的启动子，58bp完整的5'-UTR以及87bp的信号肽编码序列构成。为提高表达效率，又利用 hr3CQ增强子以及Ser1基因的3'-UTR(Ser1PA)优化了Ser1表达系统，使得重组红色荧光蛋白(DsRed)的产量提高16倍，达到茧层质量的9.5％，这也是目前已报告的表达效率最高的Ser1表达系统。2010年，Adachi等研究团队在Ser1基因启动子前添加hr3增强子融合表达人Ι型胶原蛋白α链，成功获得人Ι型胶原蛋白α链的转基因蚕丝，外源蛋白在茧丝中的含量可以达到8％。该转基因蚕丝可以作为细胞培养的蚕丝材料，其中表达的人Ι型胶原蛋白α链具有生物学活性。2014年，WangF等研究团队同样利用hr3增强子及Ser1基因启动子表达重组人酸性成纤维细胞生长因子(hFGF1)，获得一种新型蚕丝生物材料，该蚕丝不做任何处理可显著促进小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3的增殖，并且生丝的机械性能略有增强。含有 hFGF1的转基因生丝有望可以直接应用于医用领域。

人血小板衍生生长因子是存在于血小板颗粒中的碱性蛋白质，具有A、B、C、D四种亚基，由两条相同或不同的的多肽链形成同型或异型二聚体发挥作用。B链单体大小约为14kD，由两条B链形成的二聚体PDGF-BB可在多条通路中发挥作用，是人体内的主要存在形式。 PDGF具有多种功效，因此在医学美容等方面都具有广阔的应用前景。在医学上，PDGF由于具有促进伤口愈合的作用，对于烧伤患者及皮肤病患者是一剂良药。当出现伤口时，多种细胞均可释放PDGF，如血管发生破裂可血小板释放出多种生长因子，其中包括PDGF，PDGF可刺激邻近的结缔组织细胞生长，而结缔组织是重建受损组织、愈合创口的先锋队。因此PDGF在伤口愈合过程中发挥重要作用。同时，PDGF在美容行业也是祛皱抗衰的良药，这是由于PDGF具有的血管再生重塑的作用，PDGF可促进皮下血管形成，修复皮下血液微循环系统，为皮肤提供充足营养，还可以促进胶原蛋白的合成，延缓皮肤衰老。PDGF是一种重要的促有丝分裂因子，可促进多种细胞群分裂增殖，从而使皱纹自然长平。因此，利用转基因重组技术生产PDGF-BB蛋白可作为蛋白的新来源，有望出现新的应用形式，具有巨大的开发前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因；本发明的目的之二在于提供含有所述适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因的表达载体；本发明的目的之三在于提供所述表达载体在家蚕中生产具有促进细胞增殖的蚕丝中的应用；本发明的目的之四在于提供利用所述表达载体在家蚕中生产具有骨修复功能蚕丝的方法。

为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：

1.适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因，所述改造具有促进细胞增殖因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.含有所述适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因的表达载体。

优选的，所述表达载体依次含有增强子hr3，分泌型丝胶1基因启动子、改造具有促进细胞增殖因子基因和丝胶1基因的终止子。

优选的，所述表达载体还含有荧光筛选标记基因表达框，所述荧光筛选标记基因表达框位于所述增强子hr3上游。

优选的，所述表达载体由SEQ ID NO.2所示序列连入SEQ ID NO.3所示序列的BamHI 和NotI酶切位点处，再用AscI酶切后连入经相同酶切的pBac{3xp3EGFPaf}载体中。

3.所述表达载体在家蚕中生产具有促进细胞增殖的蚕丝中的应用。

4、利用所述表达载体在家蚕中生产具有骨修复功能蚕丝的方法，包括如下步骤：将所述表达载体注射已解除滞育的家蚕蚕卵，用无毒胶水封口后经甲醛蒸汽消毒，孵化，至成虫后进行自交或回交制种，筛选转基因阳性蛾圈，阳性转基因家蚕的茧壳即为具有骨修复功能蚕丝。

本发明的有益效果在于：本发明公开了适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因，通过将人血小板衍生生长因子蛋白(HumanPlatelet Derived Growth Factorsubunit B， hPDGFB)的成熟肽氨基酸序列，与PlGF-2蛋白的第123-144位氨基酸(PlGF-2123-144)融合，形成PDGF-Modified(PDGFM)，然后利用前期建立的高效丝胶1表达系统驱动PDGFM 在家蚕中制备蚕丝，制得的蚕丝具有促进细胞增殖的生物学活性，从而使皱纹自然长平。因此，制得的蚕丝可以作为生物材料使用，具有巨大的开发前景。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为转基因表达载体pBac[3xp3DsRed,hSPDGF-BBMSer1PA]结构图(3xp3DsRed表示转基因荧光筛选标记基因；hr3CQ表示增强子hr3；Ser1Pro表示分泌型丝胶1基因启动子；5'UTR表示5'端非翻译区；SP表示信号肽；PDGF-BB表示经过密码子优化设计的人血小板衍生生长因子基因编码序列；M表示胞外结合域序列；Ser1PA表示丝胶1基因的终止子；ITR 表示piggyBac转座臂序列)。

图2为转基因荧光筛选图(A：蚕卵荧光图B：蚕卵白光图C：蛾荧光图D：蛾白光图)。

图3为PDGFM家蚕茧壳蛋白SDS-PAGE电泳图及WesternBlot检测图(WT：正常茧壳蛋白；1-15：转基因阳性个体茧壳蛋白)。

图4为PDGF增殖通路示意图。

图5为PDGFM蚕丝处理后NIH3T3细胞内PDGFR磷酸化水平的变化。

图6为PDGFM蚕丝处理后NIH3T3细胞内MEK磷酸化水平的变化。

图7为PDGFM蚕丝处理后NIH3T3细胞内ERK磷酸化水平的变化。

图8为转PDGFM基因茧片促进NIH3T3细胞增殖Live&Dead染色结果。

图9转PDGFM基因茧片促进NIH3T3细胞增殖EdU染色结果。

图10转PDGFM基因茧片促进NIH3T3细胞增殖CCK-8实验

图11为转基因蚕丝中PDGFM蛋白的释放曲线(A：蚕丝浸提液Western Blot分析；B：释放曲线)。

图12为正常蚕丝与PDGF转基因蚕丝红外光谱图。

具体实施方式

下面将结合附图，对本发明的优选实施例进行详细的描述。

本发明实施例中供试家蚕品种大造(P50)由本实验室保存。幼虫在25℃人工气候箱中以人工饲料饲养。小鼠胚胎成纤维细胞NIH3T3由本实验室保存，并培养于含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO2。质粒载体pSLfa1180fa、 pBac{3xp3EGFPaf}，pBac{3xp3DsRedaf}由本实验室保存。

主要试剂及溶液的配制如下：分子克隆过程中所用到的常规培养基，试剂缓冲液等参照《分子克隆实验指南第三版译》以及《TaKaRa商品目录》中实验室常规试剂配制方法章节 (S1-S11)进行配置。DNA聚合酶Ex-Taq，LA-Taq Kit，常规限制性内切酶，碱性磷酸酶，测序克隆载体pMD19-T simple载体Kit，DNA Ligation Kit Ver.2.0，荧光定量PCR试剂盒SYBR premix Ex Taq^TM均购自TaKaRa公司。转化用大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，常规质粒DNA 提取试剂盒Easypure Plasmid MiniPrep Kit购自全式金公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒Gel Extraction Mini Kit(50)购自华舜生物科技公司。转基因注射用超纯质粒提取试剂盒QIA prep Spin Miniprep Kit(50)购自QIAGEN。Total RNA Kit II(50)试剂盒购自Omega Bio-Tec公司。人(PDGF)蛋白多克隆抗体anti-rhPDGF antibody、重组人血小板衍生生长因子蛋白标准品rhPDGF-std均购自abcam公司，细胞增殖检测CCK-8试剂盒购自碧云天公司，活/死细胞染色(Live&Dead)试剂盒及EdU细胞增殖试剂盒均购自invitrogen公司。

实施例1、基因的合成

为提高PDGF-BB的细胞外基质结合能力，将从NCBI下载人血小板衍生生长因子蛋白 (HumanPlatelet Derived Growth Factor subunit B，hPDGFB，GenBank:NM_002608.3)的成熟肽氨基酸序列，与PlGF-2蛋白的第123-144位氨基酸(PlGF-2123-144)融合，形成PDGF-Modified(PDGFM)，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，其中第1～110位为hPDGFB，第101～132位为PlGF-2123-144，根据家蚕密码子使用偏好性对PDGFM进行优化，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，并由公司合成基因序列。

实施例2、转基因表达载体的构建

将商业合成的PDGFM基因编码序列通过BamHI和NotI酶切位点构建到 psl1180[hr3CQSer1spDsRedSer](SEQ ID NO.3)中，形成psl1180hr3CQSer1spPDGFMSer1，再通过AscI位点构建到pBac{3xp3DsRedaf}载体的AscI位点中，形成转基因表达载体 pBac{3xp3DsRed,hSPDGF-BBMSer1PA}，其结构图如图1所示。

实施例3、显微注射与荧光筛选

利用QIAGEN Plasimd Mini Kit质粒抽提试剂盒提取转基因表达载体phPDGFMSer1以及辅助载体pHA3PIG质粒，将各质粒浓度稀释至400ng/μl，并按1∶1摩尔比分别与辅助载体 pHA3PIG质粒进行混合。将混合后的质粒注射已解除滞育的大造早期胚胎(产卵后2～5h)，随后用无毒胶水对注射孔进行封口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于25℃，相对湿度 85％的环境中孵化，孵化的幼虫(G0代)采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交或回交制种，获得的G1代蚕卵(第7天)在宏观体视荧光显微镜(Olypus MVX10，日本)下检测，红色荧光观察采用波长为490～530nm的激发光，筛选出在眼睛或神经特异激发红色荧光的转基因阳性蛾圈，并命名为PDGFM，结果如图2所示。其转基因家蚕的荧光筛选统计如表1所示，其中从PDGFM的58个G1代蛾圈中总共筛选到13个阳性蛾圈，阳性率为22.4％。

表1.转基因家蚕的荧光筛选统计

实施例4、重组PDGFM蛋白的表达检测

将重组PDGFM转基因家蚕的G1代不同的阳性蛾圈中的阳性个体分别单独饲养，并对上蔟后的15个阳性个体的茧壳进行重组蛋白的SDS-PAGE检测和WesternBlot检测，检测方法如下：将茧壳于液氮中浸泡直至变脆，使用粉碎机粉碎成粉末，按照30mg/ml的茧壳浓度溶于8MUrea，50mMTris-Cl，pH8.0，的缓冲液中，80℃水浴30min，室温下13400rpm/min 离心10min收集上清。经萃取的茧壳总蛋白进行12％SDS-Page电泳检测，考马斯亮蓝染色，同时将萃取的总蛋白经12％SDS-Page胶电泳分离后，采用电转膜法将SDS-PAGE胶中的蛋白转移至PVDF膜上。PVDF膜置于含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液中，4℃过夜封闭。免疫杂交前，于室温利用TBST清洗PVDF膜3次，每次5min。利用含5％脱脂奶粉的TBST按1： 1000稀释配置抗rhPDGF(abcam)一抗杂交液，将PVDF膜浸入杂交液中室温振荡孵育2h， TBST清洗5次，每次10min。利用TBST按1：20000稀释比例配置HRP标记的羊抗兔二抗 (购自碧云天公司)杂交液，将TBST清洗后的PVDF膜浸入二抗杂交液中于室温振荡孵育 2h，TBST清洗5次，每次10min。将清洗后的PVDF膜置于干净的保鲜膜上，将ECL显色液(Amersham Biosciences)均匀滴在PDVF膜面上，室温避光孵育5min，利用Chemiscope Series (Clinx scienceinstruments)仪器进行曝光和成像，结果如图3所示。结果显示：转基因茧壳蛋白泳道在14kDa分子Marker处出现差异条带，与PDGF-B的理论大小一致。以上结果表明，本研究建立的Ser1表达系统可以高效的重组生产人PDGF蛋白，并分泌到家蚕蚕丝中。此外，重组蛋白在不同阳性蛾圈的个体中的含量具有显著的差异，暗示着转PDGFM基因家蚕在丝腺细胞中的表达受到强烈的染色体位置效应的影响。

实施例5、增殖通路相关因子磷酸化水平的检测

在PDGF引发的增殖通路中，由于PDGF与受体PDGFR的结合导致受体发生磷酸化，引起下游MEK、ERK等相关因子磷酸化水平的升高，信号传递至核内，最终引起细胞增殖 (图4)。将正常蚕茧与转PDGFM基因蚕茧以30mg/ml的浓度浸没在PBS溶液中，室温震荡。每隔4h离心收取上清，再加入等体积新的PBS溶液继续震荡浸提。将正常蚕茧与转PDGFM 基因蚕茧收集的所有上清液浓缩后，与低血清DMEM培养基一起处理NIH3T3细胞5min。裂解细胞后通过Western Blot检测胞内PDGFR、MEK、ERK的含量及三者的磷酸化水平。经过正常蚕丝及转PDGFM基因蚕丝提取液处理后的NIH3T3细胞内相关因子检测结果显示，中并未检测到PDGFR磷酸化水平，而转PDGFM基因蚕丝提取液处理后的细胞中PDGFR磷酸化水平显著升高(图5)，同样的，转PDGFM基因蚕丝提取液处理后的细胞中MEK及ERK 的磷酸化水平都明显高于正常蚕丝提取液处理组(图6，图7)。以上结果进一步证实了转 PDGFM基因蚕丝具有促进细胞增殖的作用。

实施例6、转基因蚕丝增殖活性检测

将正常蚕茧与转基因蚕茧去掉外层茧衣及内层茧壳，留下的中间层剪成相同的圆形茧片若干，大小比96孔细胞培养板各孔略小，用双蒸水清洗茧片3次，紫外照射过夜消毒待用。NIH3T3细胞更换培养基为0.5％(v/v)FBS的低血清DMEM培养基进行饥饿处理，重悬后接种至96孔细胞培养板，密度为2×10³个/孔，培养12h后细胞贴壁，向其中加入紫外处理后的正常蚕茧及转基因蚕茧的茧片，于培养箱中继续培养。24h后使用Live&Dead染色试剂盒进行染色，每孔加入100μl染色工作液，避光孵育20min，分别在绿色荧光下红色荧光下观察活细胞与死细胞，并拍照。在正常蚕茧及转基因蚕茧的茧片与细胞共培养24h后，进行EdU染色，染色后在DAPI光下观察细胞核，红色荧光下观察新增殖的细胞，并拍照。同样的，在正常蚕茧及转基因蚕茧的茧片与细胞共培养24h后向每孔加入10μl CCK-8试剂，于培养箱中继续孵1h，450nm处检测吸光值。Live&Dead染色结果中绿色荧光显示活细胞，红色荧光显示死细胞，转PDGFM基因茧片处理组的NIH3T3活细胞的数量明显多于对照组，说明获得的新型蚕丝具有促进细胞增殖的活性(图8)。EdU染色结果中红色荧光表示新增殖的细胞，DAPI光显示细胞核，转PDGFM基因茧片处理组新增殖的NIH3T3细胞的数量明显多于对照组，说明获得的新型蚕丝具有促进细胞增殖的活性(图9)。CCK-8结果显示，转PDGFM 基因茧片处理组的NIH3T3细胞的数量明显多于对照组，说明获得的新型蚕丝具有促进细胞增殖的活性(图10)。

实施例7、转基因蚕丝中PDGFM重组蛋白的释放

利用PBS浸提蚕丝得到蚕丝浸提液，对浸提液进行Western Blot分析，结果如图12中A 所示。说明该方法可成功提取出蚕丝中的重组蛋白。延长浸提总时间，根据WesternBlot结果利用软件Lane 1D进行灰度分析可以得到各样品蛋白含量，累加后得到图11中B中的释放曲线。结果表明，随着浸提时间延长，释放的PDGFM重组蛋白含量逐渐增加。

实施例8、蚕丝性能分析

使用傅里叶红外光谱仪对正常蚕丝及转PDGFM蚕丝进行二级结构含量的测定，结果如图12所示。30次测定的结果显示，二者在800～4000cm范围内的红外吸收图谱并无明显差异。对酰胺Ⅰ的特征峰进行分峰处理后的结果如表2所示，结果显示转基因蚕丝中α螺旋与β折叠结构的含量无明显差异。

表2 正常蚕丝与PDGF转基因蚕丝中二级结构的含量

综上，本发明中首先对表达系统进行优化，建立了高效的转基因家蚕丝腺生物反应器表达系统，实现了外源基因的高效分泌表达。在此基础之上，以具有促进细胞增殖及迁移功能的人血小板衍生生长因子(PDGF)作为靶标，对人血小板衍生生长因子(PDGF-BB)蛋白进行重组表达，根据家蚕基因组密码子使用的偏好性人工设计、修饰并合成了人血小板衍生生长因子(PDGF-BBM)的编码基因，构建转基因表达载体 pBac{3xp3DsRed,hSPDGF-BBMSer1PA}，通过显微注射家蚕胚胎，我们建立转基因家蚕品系 PDGF，筛选获得13个不同阳性蛾圈来源的品系，得到了遗传改良的蚕丝。利用SDS-PAGE 和Western blot检测方法，我们在PDGFM家蚕的茧壳中检测到PDGF蛋白有高效表达。

我们利用建立的高效转基因家蚕丝腺生物反应器表达系统对蚕丝进行了遗传改良，并就该蚕丝用做生物医学材料的潜力进行初步的探索。研究发现，转基因蚕丝具有促进细胞生长增殖及迁移的功能，且可以在蚕丝中长期保存。因此通过遗传改良的新型蚕丝可进一步开发成具有促进伤口愈合功能的生物医学材料。通过这种在蚕丝中表达功能蛋白的方法，可以广泛用于遗传改良获取具有不同功能和用途的新型蚕丝，拓展蚕丝的应用领域，提高蚕丝的市场竞争力，创造更多的经济价值，为丝绸产业的振兴注入新动力。

最后说明的是，以上优选实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 西南大学

<120> 适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因及其表达载体和应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 132

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Ser Leu Gly Ser Leu Thr Ile Ala Glu Pro Ala Met Ile Ala Glu

1 5 10 15

Cys Lys Thr Arg Thr Glu Val Phe Glu Ile Ser Arg Arg Leu Ile Asp

20 25 30

Arg Thr Asn Ala Asn Phe Leu Val Trp Pro Pro Cys Val Glu Val Gln

35 40 45

Arg Cys Ser Gly Cys Cys Asn Asn Arg Asn Val Gln Cys Arg Pro Thr

50 55 60

Gln Val Gln Leu Arg Pro Val Gln Val Arg Lys Ile Glu Ile Val Arg

65 70 75 80

Lys Lys Pro Ile Phe Lys Lys Ala Thr Val Thr Leu Glu Asp His Leu

85 90 95

Ala Cys Lys Cys Glu Thr Val Ala Ala Ala Arg Pro Val Thr Arg Arg

100 105 110

Arg Pro Lys Gly Arg Gly Lys Arg Arg Arg Glu Lys Gln Arg Pro Thr

115 120 125

Asp Cys His Leu

130

<210> 2

<211> 399

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgagcctgg gtagcctgac catagcggag cctgccatga ttgcggaatg taaaactcgt 60

actgaagtct ttgaaataag ccgtaggtta atagacagaa caaacgctaa tttcctggtc 120

tggcctccat gcgtggaagt tcaacgctgt tcaggttgct gtaacaatag aaacgtgcag 180

tgccgcccga cacaagttca gttgcgtccc gtccaagtaa ggaaaatcga gatagtcaga 240

aaaaagccta tcttcaagaa ggccactgta actttggaag accacttggc ctgtaaatgc 300

gaaacggttg ctgctgctcg tcctgtcacc cgtcgacgcc ctaaaggtcg tggtaaacgt 360

cgacgcgaaa aacaacgtcc tactgattgt catttataa 399

<210> 3

<211> 2036

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

ccatggcagc gtcgtgaaaa gaggcaatga caaatacaaa acgacgtatg agcagacccg 60

tcgccaagac gggtctacct ctaagatgat gtcatttgtt ttttaaaact aactcgcttt 120

acgagtagaa ttctacgtgt aaaacataat caagagatga tgtcatttgt ttttcaaaac 180

caaactcgct ttacgagtag aattctacgt gtaaaacaca atcaaaagat gatgtcattc 240

gtttttcaaa accgaattta agaaatgatg tcatttgttt ttcaaaacca aactcgcttt 300

acgagcagaa ttctacgtgt aaaacacaat caagagatga tgtcatttgt ttttcaaaac 360

tgaatgatgt catttgtttt tcaaaactaa acttgctttg cgagtagaat tctacgtgta 420

aaacacagtc aagagatgat gtcatttgtt tttcaaaact gaaccggctt tacgagtaga 480

attctacttg taaaacataa tcaagagatg atgtcatttg tttttcaaaa ctgaactggc 540

tttacgagta gaattctacg tgtaaaacat aatcaagaga tgatgtcatc attaaactga 600

tgtcatttta tacacgattg ttaacatgtt taataatgac taatttgttt ttccaaatta 660

aactcgcttt acgagtagaa ttctacttgt aacgcacgat taagtatgaa tcataagctg 720

atgtcatttg ttttcgacat aaaatgttta tacaatggaa tcttcttgta aattatccaa 780

ataatataat ttatccgatt ctacgttaca tttaaattcg ttgttatcgt acaattcttc 840

aggacacgcc atgtattggt catttttagc gtgcaaccaa cgattgtatt tgacgccgtc 900

gttggattgc gtgttcaggt tggcgtacac gtgactgggc acggcttctt tttccatggg 960

acgtcgacga aaacagcaca cacactacat accatgtatt tgacgcacac acgcatgtat 1020

actatttatt gtcaaacttt tgttcttgac gtctgtgttc aaactgagaa tagattaaat 1080

attgtttgtc tttattaata ttttttaata gtgtagtctt ggcgaaattt gtgattataa 1140

aagtataaaa tacaatcata atagtgtacg aacttacaat tccaattaat tatagtcgaa 1200

tttcgactac tgcgggacct ctagtattaa taattctctt taaaaaaaaa cagagcatca 1260

aatactgcac aaatgtcaag cgggtctcaa cgagccatga ataaattaga aatcaattaa 1320

taacataaaa taggcaaaca aaataaaacc atttacatag agaacgtttg ttgaacaaaa 1380

acaataactt gtatacattg tttgcacaaa tgtttgaagc gaaaatttat tactctctac 1440

gtaagcttga tcaaacttcg ttttcgtata aaacgcgttg gcccaaccac tttggcatag 1500

tcgtcttatc atcgggtctc taaggatcaa gcgatccaaa gaccgccaac atgcgtttcg 1560

ttctgtgctg cactttgatt gcgttggctg cgctcagcgt aaaagccttc ggtcaccacc 1620

ccggcaatcg agatacagga tccgcggccg ctacaactaa acacgacttg gagtattcct 1680

tgtagtgttt aagattttaa atcttactta atgacttcga acgattttaa cgataacttt 1740

ctctttgttt aactttaatc agcatacata aaaagccccg gttttgtatc gggaagaaaa 1800

aaaatgtaat tgtgttgcct agataataaa cgtattatca aagtgtgtgg ttttccttta 1860

ccaaagaccc ctttaagatg ggcctaatgg gcttaagtcg agtcctttcc gatgtgttaa 1920

atacacattt attacactga tgcgtcgaat gtacactttt aataggatag ctccactaaa 1980

aattatttta tttatttaat ttgttgcacc aaaactgata cattgacgaa aagctt 2036

Claims

1.适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因，其特征在于：所述改造具有促进细胞增殖因子基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.含有权利要求1所述适用于家蚕表达的改造具有促进细胞增殖因子基因的表达载体。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体依次含有增强子hr3，分泌型丝胶1基因启动子、改造具有促进细胞增殖因子基因和丝胶1基因的终止子。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体还含有荧光筛选标记基因表达框，所述荧光筛选标记基因表达框位于所述增强子hr3上游。

5.根据权利要求2或3所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体由SEQ ID NO.2所示序列连入SEQ ID NO.3所示序列的BamHI和NotI酶切位点处，再用AscI酶切后连入经相同酶切的pBac{3xp3EGFPaf}载体中。

6.权利要求2～5任一项所述表达载体在家蚕中生产具有促进细胞增殖的蚕丝中的应用。

7.利用权利要求2～5任一项所述表达载体在家蚕中生产具有骨修复功能蚕丝的方法，其特征在于，包括如下步骤：将所述表达载体注射已解除滞育的家蚕蚕卵，用无毒胶水封口后经甲醛蒸汽消毒，孵化，至成虫后进行自交或回交制种，筛选转基因阳性蛾圈，阳性转基因家蚕的茧壳即为具有骨修复功能蚕丝。