CN116239667B - 具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白及其制备方法和应用，ehEGF重组蛋白由人EGF成熟肽为基础，在人EGF成熟肽的N‑末端融合PTD序列，C‑末端融合PlGF‑2基序而得；通过利用Ser1表达系统，将ehEGF根据家蚕基因组密码子使用的偏好型人工设计并合成了ehEGF的编码基因，构建转基因表达载体ph ehEGFSer1，然后建立ehEGF基因家蚕品系，获得在家蚕中高效表达ehEGF的转基因家蚕，家蚕丝腺合成的ehEGF具有比商品化EGF更优的促细胞增殖活性，能够用于促细胞增殖活性。

Description

具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及生物材料领域，具体涉及具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白，还涉及ehEGF重组蛋白的制备方法和应用。

背景技术

进入21世纪以来，随着人类对医用、药用、食用、美容、保健等各种用途的功能性蛋白需求量的日益增大，依靠提取、生产天然来源的蛋白质已无法满足快速增长的市场需求。建立和完善各种高效的原核和真核表达系统，利用大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞、昆虫以及哺乳动物等作为宿主生物反应器，是实现低成本、规模化生产具有生物学活性的重组外源蛋白的有效和可持续方法，并成为当今世界研究的热点。利用中国仓鼠卵巢细胞作为生物反应器生产外源蛋白是目前最为标准的表达模式，但其运营成本和对环境的要求极为苛刻，严重限制了其大规模推广应用。为了建立低成本、规模化、安全可持续的高效生产外源蛋白的生物工厂，自2000年以来，科研人员开始尝试利用转基因生物，如哺乳动物、鸟类、昆虫以及植物的器官作为生物反应器来生产重组外源蛋白。

家蚕以泌丝著称，是最早被人类所完全驯化利用的经济动物(昆虫)之一。家蚕的丝腺是合成、分泌蚕丝蛋白的器官，是整个蚕丝业的生物学基础。经过数千年的人工驯化，家蚕的丝腺具备了超强的蛋白质合成与分泌能力，一头体重5g左右家蚕能合成分泌约0.5g蚕丝蛋白，为目前已知昆虫之最。蚕丝蛋白主要由丝素蛋白(fibroin)和包裹在其外层的丝胶蛋白(sericin)构成：丝素蛋白是蚕丝的主体，约占75％，由蚕的后部丝腺合成，包括fib-H链、fib-L链和P25三种主要组分，均不溶于水；其余为丝胶蛋白，约占25％，由蚕的中部丝腺合成，包括丝胶1(Sericin1)、丝胶2(Sericin2)和丝胶3(Sericin3)三种主要组分，其中又以丝胶1蛋白含量最高，均可溶于水。随着现代分子生物学和转基因技术的发展，家蚕绢丝腺的高效合成与分泌丝蛋白这一特征，以及所具备的糖基化、甲基化等对外源蛋白保持活性极其重要的蛋白质翻译后修饰加工能力，饲养成本低，可工厂化生产，对人畜安全等特点，使其成为理想的生物反应器模型，备受各国研究人员关注并竞相开发利用。

2000年，田村等人利用pBac转座子介导显微注射家蚕蚕卵并获得了稳定遗传的转基因家蚕；2003年，夏庆友等人完成了家蚕基因组计划，家蚕丝腺中涉及丝蛋白合成的重要编码基因如丝素重链(FibH chain)基因、丝素轻链(FibL chain)基因、丝胶1(Sericin1)基因、丝胶2(Sericin2)基因、丝胶3(Sericin3)基因以及P25基因等的启动子调控元件被鉴定和克隆，同时，前期通过对表达系统进行优化，获得了高效的转基因家蚕丝胶1表达系统。这些基础研究结果使得利用转基因家蚕组织特异表达系统，在丝腺中大规模生产重组外源蛋白成为可能。近年来，国内外利用pBac转座子介导的转基因技术以及家蚕组织特异启动子元件在丝腺中尝试表达了多个外源蛋白，包括：在后部丝腺表达了丝素重链融合的EGFP(Zhao et al.2010)、猫干扰素(Kurihara et al.2007)、蜘蛛丝牵引蛋白(Zhu etal.2010)、人Ⅲ型胶原蛋白的部分肽段(Tomita et al.2003)、增强型红色荧光蛋白(Tomita et al.2003)，丝素轻链融合的羟基脯氨酸胶原部分肽段(Adachi et al.2006)、成纤维细胞生长因子(Hino et al.2006)、增强型绿色荧光蛋白(Shimizu et al.2007)、部分胶原蛋白肽段(Yanagisawa et al.2007)，以及P25融合的红色荧光蛋白(Royer etal.2005)等；在中部丝腺表达了人血清白蛋白(Ogawa et al.2007)、增强型绿色荧光蛋白(Tomita et al.2007)、鼠单克隆抗体(Iizuka et al.2009)、人胶原蛋白α链基因(Adachiet al.2010)以及可溶性GM-Csf受体α(Urano et al.2010)等。综合以上国内外的研究结果表明，利用家蚕丝腺作为生物反应器，生产具有高附加值的外源蛋白，不仅具有广阔的市场前景，同时也能打破家蚕只能作为传统产业的壁垒，为家蚕新型产业的开发提供基础技术体系保障。

EGF是一种低分子量的单链多肽，其通过酪氨酸激酶膜受体对上皮细胞、成纤维细胞样细胞和内皮细胞发挥其促有丝分裂作用，从而刺激细胞增殖分化(Berlanga-Acosta Jet al.2017)。EGF无糖基修饰，因此非常稳定，并且耐酸耐高温。由于其极强的促进细胞分裂能力，EGF一直被人们用于伤口愈合的研究，近几年来，人们发现EGF在一些慢性伤口疾病如糖尿病足溃疡中具有很好的治疗作用(Bui T Q et al.2019)，利用基因重组技术来生产EGF具有巨大的市场开发前景。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白；本发明的目的之二在于提供适于在家蚕丝腺高效表达的ehEGF重组蛋白编码基因；本发明的目的之三在于提供含有所述适于在家蚕丝腺高效表达的ehEGF重组蛋白编码基因的表达载体；本发明的目的之四在于提供所述的ehEGF重组蛋白编码基因或所述的表达载体在家蚕中生产具有促细胞增殖活性的蚕丝中的应用；本发明的目的之五在于提供利用所述ehEGF重组蛋白编码基因在家蚕中生产具有促细胞增殖活性的蚕丝的方法；本发明的目的之六在于提供利用所述ehEGF重组蛋白编码基因在家蚕中生产具有促细胞增殖活性的重组蛋白的方法；本发明的目的之七在于提供所述ehEGF重组蛋白在制备促细胞增殖的材料中的应用。

为实现发明目的，本发明首先通过经过人工改造设计的人源化表皮细胞生长因子(ehEGF)，然后根据家蚕基因组密码子使用的偏好型人工设计并合成了ehEGF的编码基因，在ehEGF的编码基因构建入Ser1表达系统hSRSE得到构建转基因表达载体ph ehEGFSer1，将转基因表达载体通过显微注射家蚕胚胎建立转ehEGF基因家蚕品系，本发明提供的具体技术方案如下：

1、具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白，所述ehEGF重组蛋白是以人EGF成熟肽为基础，在人EGF成熟肽的N-末端融合PTD序列，C-末端融合PlGF-2基序。

本发明优选的，所述ehEGF重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、适于在家蚕丝腺高效表达的ehEGF重组蛋白编码基因，所述ehEGF重组蛋白编码基因的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。

3、含有所述适于在家蚕丝腺高效表达的ehEGF重组蛋白编码基因的表达载体。

本发明优选的，表达载体依次含有增强子hr3，分泌型丝胶1基因启动子、ehEGF重组蛋白编码基因和丝胶1基因的终止子。

本发明优选的，所述表达载体由SEQ ID NO.2所示序列连入psl1180[hr3PSer1spRedSer1PA]的BamHI和NotI酶切位点处，再用AscI酶切后连入经相同酶切的pBac[3xp3DsRedaf]载体中。

4、所述的ehEGF重组蛋白编码基因和所述的表达载体在家蚕中生产具有促细胞增殖活性的蚕丝中的应用。

5、利用所述ehEGF重组蛋白编码基因在家蚕中生产具有促细胞增殖活性的蚕丝的方法，将含有ehEGF重组蛋白编码基因的表达载体注射已解除滞育的家蚕蚕卵，用无毒胶水封口后经甲醛蒸汽消毒，孵化，至成虫后进行自交或回交制种，筛选转基因阳性蛾圈，阳性转基因家蚕的茧壳即为具有促细胞增殖活性的蚕丝。

6、所述的ehEGF重组蛋白编码基因和所述的表达载体在家蚕中生产具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白中的应用。

优选的，所述重组蛋白的制备方法具体如下：将含有ehEGF重组蛋白编码基因的表达载体注射已解除滞育的家蚕蚕卵，用无毒胶水封口后经甲醛蒸汽消毒，孵化，至成虫后进行自交或回交制种，筛选转基因阳性蛾圈，将筛选获得阳性转基因家产卵孵化，饲养至上簇吐丝节茧，取茧壳粉碎后用PBS缓冲液溶解，固液分离得到ehEGF重组蛋白。

7、所述ehEGF重组蛋白在制备促细胞增殖的材料中的应用。

本发明的有益效果在于：本发明在于提供具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白，该蛋白通过Ser1表达系统hSRSE，能在ehEGF转基因家蚕的茧壳中检测到重组ehEGF蛋白高效表达。Bandscan计算重组蛋白的含量最高的占茧丝可溶蛋白的6.24±0.59％；通过利用PBS对ehEGF家蚕蚕丝中的ehEGF重组蛋白进行粗提取，获得ehEGF浓度为10-30μg/mL的蚕丝蛋白粗提物，为下一步的大规模分离纯化奠定基础。并通过细胞增殖活性检测确定了家蚕丝腺合成的ehEGF具有比商品化EGF更优的促细胞增殖活性。因此，可以用于制备促进细胞增殖材料的原料。

附图说明

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：

图1为转ehEGF基因家蚕品系的构建以及ehEGF重组蛋白的表达检测(A：人工改造EGF的序列示意图；B：转ehEGF基因载体示意图；C：转ehEGF基因家蚕荧光筛选图，第一排从左至右分别为转ehEGF基因蚕卵白光图，红色荧光图，绿色荧光图，第二排从左至右分别为转ehEGF基因蚕蛹白光图，红色荧光图，绿色荧光图，第三排从左至右分别为转ehEGF基因蚕蛾白光图，红色荧光图，绿色荧光图；D：SDS-Page检测转基因家蚕不同个体的蚕茧中ehEGF重组蛋白，红色箭头所示为ehEGF蛋白的SDS-Page染色条带，黑色箭头所示为ehEGF蛋白的western blot显色条带)。

图2为蚕丝粗提物中ehEGF重组蛋白的浓度计算；

图3为蚕丝粗提物中ehEGF重组蛋白粗细胞增殖活性检测(A：CCK-8检测各样品组处理受试细胞24小时时间点的细胞增殖情况；B：CCK-8检测各样品组处理受试细胞48小时时间点的细胞增殖情况；C：EdU染色检测各样品组处理受试细胞24小时时间点的细胞增殖情况，红色荧光为EdU染色效果，蓝色荧光为细胞核，标尺大小：100μm)。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。

本发明中实验材料供试家蚕品种大造(P50)由本实验室保存。幼虫在25℃人工气候箱中以人工饲料饲养。人类永生化表皮细胞HaCaT细胞系由实验室保存，并培养于含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO₂。质粒载体pSLfa1180fa、pBac[3xp3EGFPaf]，pBac[3xp3DsRedaf]由本实验室保存。

主要试剂及溶液的配制：分子克隆过程中所用到的常规培养基，试剂缓冲液等参照《分子克隆实验指南第三版译》以及《TaKaRa商品目录》中实验室常规试剂配制方法章节(S1-S11)进行配置。DNA聚合酶Ex-Taq，LA-Taq Kit，常规限制性内切酶，碱性磷酸酶，测序克隆载体pMD19-T simple载体Kit，DNA Ligation Kit Ver.2.0，荧光定量PCR试剂盒SYBRpremix Ex TaqTM均购自TaKaRa公司。转化用大肠杆菌感受态细胞Trans1-T1，常规质粒DNA提取试剂盒Easypure Plasmid MiniPrep Kit购自全式金公司。琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒Gel Extraction Mini Kit(50)购自华舜生物科技公司。转基因注射用超纯质粒提取试剂盒QIA prep Spin Miniprep Kit(50)购自QIAGEN。Total RNA Kit II(50)试剂盒购自Omega Bio-Tec公司。人EGF多克隆抗体anti-EGF antibody，人EGF蛋白标准品(EGFstd)购自Abcam公司。

本发明中所有数据为至少3个数值的平均值。通过Student’s t-test分析数据，*p<0.05，**p<0.01和***p<0.001分别是具有统计学意义、高度显著性和极显著性。

实施例1、EGF基因的设计改造与合成

为提升EGF的信号转导和ECM结合效率，以人EGF成熟肽氨基酸序列(Homo sapiensEpidermal growth factor，GenBank:AAG33031)为模板，并在EGFN-末端融合HIV-1TATprotein transduction domain(PTD)增加其信号转导能力，同时在C-末端融合PlGF-2基序增加其与细胞外基质结合的效率，形成工程化改造的ehEGF(图1中A)，其氨基酸序列如SEQID NO.1所示。随后，根据家蚕密码子使用偏好型进行优化设计编码序列，并在5’-端和3’-端分别接上BamHI和NotI酶切位点，由Genscript公司合成基因序列，核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

实施例2、转基因表达载体的构建

将商业合成的ehEGF序列通过BamHI和NotI酶切位点构建到psl1180[hr3PSer1spRedSer1PA](参见公开号为CN108486123A的中国专利)中间载体，该载体含有家蚕核型多角体病毒增强子Hr3、家蚕sericin1基因启动子PSer1-和3'-UTR终止序列Ser1PA，启动子PSer1-和3'-UTR终止序列Ser1PA调控Red表达，形成psl1180[hr3PSer1sp-ehEGF-Ser1PA]，再通过AscI位点将ehEGF表达框构建到pBac[3xp3DsRedaf]载体的AscI位点中，形成转基因表达载体pBac[3xp3DsRed；hr3Ser1p-rhEGF-Ser1PA]，简称phSehEGFSer1(图1中B)，序列如SEQ ID NO.3所示，其中第9～955位为增强子Hr3，第968～1639位为Ser1启动子，第1646～1903位为ehEGF基因，第1912～2290位为SerPA。

实施例3、转ehEGF基因家蚕品系的构建

利用QIAGEN Plasimd Mini Kit质粒抽提试剂盒提取转基因表达载体phSehEGFSer1以及辅助载体pHA3PIG质粒，将各质粒浓度稀释至300-500ng/μL，并按1∶1摩尔比分别与辅助载体pHA3PIG质粒进行混合。将混合后的质粒注射已解除滞育的大造早期胚胎(产卵后2～5h)，随后用无毒胶水对注射孔进行封口，经35％的甲醛蒸汽消毒5分钟后，置于25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化的幼虫(G0代)采用人工饲料饲育，至成虫后进行自交或回交制种，获得的G1代蚕卵(第6-7天)在宏观体视荧光显微镜(Olypus MVX10,日本)下检测，红色荧光观察采用波长为510～550nm的激发光，绿色荧光观察采用波长为460～490nm的激发光，筛选出在眼睛或神经特异激发红色荧光的转基因阳性蛾圈，并命名为sgHSA(图1中C)。转基因家蚕的荧光筛选统计见表1，其中从12个G1代蛾圈中总共筛选到8个阳性蛾圈，阳性率为67％。

表1、转ehEGF基因家蚕显微注射与荧光筛选统计表

实施例4、转ehEGF基因家蚕分泌的蚕茧中ehEGF重组蛋白的表达检测

将筛选获得的阳性蚕卵置于25℃，相对湿度85％的环境中孵化，孵化的幼虫(G1代)采用人工饲料或桑叶饲育至上簇吐丝节茧，利用荧光显微镜筛选眼睛具有红色荧光标记的阳性蚕蛹(图1中C)，并对其蚕茧进行外源蛋白表达检测。茧壳总蛋白中重组蛋白的提取和检测方法：将茧壳于液氮中粉碎成粉末，按照10-50mg/mL的茧壳浓度溶于20mM Tris-Cl，pH7.9，8M Urea的缓冲液中，并在80℃水浴锅中处理30-45min，之后离心收集上清，离心条件：18000×rpm，4℃，15min。经萃取的茧壳总蛋白进行12％SDS-Page电泳检测，并利用考马斯亮蓝染色。将萃取的总蛋白经12％SDS-Page胶电泳分离后，采用电转膜法将SDS-Page胶中的蛋白转移至PVDF膜上。PVDF膜置于含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液中，4℃过夜封闭。免疫杂交前，于室温利用TBST清洗PVDF膜3次，每次10min。利用含5％脱脂奶粉的TBST按10000倍稀释比例配置抗EGF一抗(Abcam)杂交液，将PVDF膜浸入杂交液中室温振荡孵育2h，TBST洗膜5次，每次5min。利用TBST按20000倍稀释比例配置HRP标记的羊抗兔二抗(购自碧云天公司)杂交液，将TBST清洗后的PVDF膜浸入二抗杂交液中于室温振荡孵育2h，TBST洗膜5次，每次5min。将清洗后的PVDF膜置于干净的保鲜膜上，将ECL显色液(Amersham Biosciences)均匀滴在PDVF膜面上，室温避光孵育5min，利用Chemiscope Series(Clinx scienceinstruments)仪器进行曝光和成像。结果显示，转基因家蚕组的茧壳蛋白样品在10-15kDa蛋白分子量marker之间，存在一条与对照家蚕差异条带，推测其为ehEGF重组蛋白，并且这条差异蛋白条带的强度在不同的个体之间差异明显，推测可能是不同的转基因插入位点所导致(图1中D)。通过对蛋白条带进行灰度计算，初步估算不同个体之间蚕丝中ehEGF重组蛋白的平均含量约为6.24±0.59％。进一步利用Western Blot验证该差异蛋白条带即为ehEGF重组蛋白(图1中D)，表明构建的转基因家蚕在丝腺中成功表达出ehEGF重组蛋白并分泌到蚕丝中。最后，将蛋白表达量最高的转基因家蚕个体保留制种。

实施例5、蚕丝中ehEGF重组蛋白促细胞增殖活性检测

为提取蚕丝中的活性ehEGF重组蛋白，将转ehEGF基因家蚕品系分泌合成的ehEGF蚕茧经液氮冷却后粉碎成蚕茧粉。随后，按照1-5％(w/v)的浴比将ehEGF蚕茧粉加入至PBS缓冲液(pH＝7.0)中，室温充分搅拌0.5-2h，采用9000-12000rpm，4-16℃离心15-45min后收集上清液，获得ehEGF重组蛋白粗提物。利用SDS-Page和western blot技术与EGF标准品进行灰度比对，初步估算出蚕丝粗提物中ehEGF重组蛋白的浓度为10-30μg/mL(图2)。

随后，将人类永生化表皮细胞HaCaT细胞系培养于含有10％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中，培养条件为37℃，5％CO₂，收集生长至96％汇合度的HaCaT细胞按照500/100μL/孔的细胞浓度贴壁平铺于96孔板中，并用含0.5％(v/v)胎牛血清(FBS，Gibco)的DMEM培养基中饥饿处理24小时。按照ehEGF终浓度为50-100ng/mL的工作浓度，将一定体积的ehEGF蛋白粗提物添加至96孔板中，并以等浓度的EGF标准品作为阳性对照，以等体积的正常蚕丝粗提取物为阴性对照，在孵育的24和72小时时间点分别对细胞进行增殖检测。方法为：首先在显微镜下观察经过蚕丝孵育后的细胞的生长状况。随后，向96孔板内按照10μL/孔的剂量加入CCK-8试剂(购自碧云天公司)，于37℃反应4h后，在450nm波长下测定孔内细胞的吸收值。每个测试组分别设置3个平行试验，且重复3次以上。结果显示，与空白对照组和WT蚕丝粗提物组相比，ehEGF粗提物组在24小时和48小时时间点对HaCaT细胞具有显著的促进细胞增殖活性，且促细胞增殖效果显著优于同等剂量的EGF商业化标准品(图中3中A-B)。随后，利用EdU染色检测个样品与受试细胞共培养24h后细胞的DNA复制情况，红色荧光(EdU)表示处于增殖状态的细胞，利用DAPI(蓝色荧光)对细胞核进行染色。结果显示：与空白对照组和WT蚕丝粗提物组相比，ehEGF粗提物处理组在24小时的HaCaT细胞具有显著增强的红色荧光信号，且红色荧光信号的强度显著高于同等剂量的EGF商业化标准品处理组(图3中C)。以上结果表明，提取的ehEGF重组蛋白粗提物具有促细胞增殖活性，且通过在天然EGF的N-末端融合HIV-1TAT protein transduction domain(PTD)，以及在C-末端融合PlGF-2基序，对EGF进行人工设计改造形成ehEGF，提升了EGF的信号转导和与细胞外基质结合的效率，表现出比商品化EGF更优的粗细胞增殖活性。

综上所述，通过家蚕hSRSE表达系统可实现ehEGF蛋白在转基因家蚕丝腺中的高效分泌表达，合成具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白。通过家蚕丝腺生物反应器合成分泌的ehEGF重组蛋白即可通过分离纯化形成ehEGF制剂，可以与蚕丝联合制备功能性蚕丝生物材料，用于促伤口愈合和组织修复，未来广泛应用于医疗美容，组织工程等领域。

以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。

Claims (9)

1.具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白，其特征在于：所述ehEGF重组蛋白由人EGF成熟肽为基础，在人EGF成熟肽的N-末端融合PTD序列，C-末端融合PlGF-2基序而得；所述ehEGF重组蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.适于在家蚕丝腺高效表达的ehEGF重组蛋白编码基因，其特征在于：所述ehEGF重组蛋白编码基因的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。

3.含有权利要求2所述适于在家蚕丝腺高效表达的ehEGF重组蛋白编码基因的表达载体。

4.根据权利要求3所述的表达载体，其特征在于：表达载体依次含有增强子hr3，分泌型丝胶1基因启动子、ehEGF重组蛋白编码基因和丝胶1基因的终止子。

5.根据权利要求3或4所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体由SEQ ID NO.2所示序列连入psl1180[hr3PSer1spRedSer1PA]的BamHI和NotI酶切位点处，再用AscI酶切后连入经相同酶切的pBac[3xp3DsRedaf]载体中。

6.权利要求2所述的ehEGF重组蛋白编码基因或权利要求3~5任一项所述的表达载体在家蚕中生产具有促细胞增殖活性的蚕丝中的应用。

7.利用权利要求2所述ehEGF重组蛋白编码基因在家蚕中生产具有促细胞增殖活性的蚕丝的方法，其特征在于：将含有ehEGF重组蛋白编码基因的表达载体注射已解除滞育的家蚕蚕卵，用无毒胶水封口后经甲醛蒸汽消毒，孵化，至成虫后进行自交或回交制种，筛选转基因阳性蛾圈，阳性转基因家蚕的茧壳即为具有促细胞增殖活性的蚕丝。

8.权利要求2所述的ehEGF重组蛋白编码基因或权利要求3~5任一项所述的表达载体在家蚕中生产具有促细胞增殖活性的ehEGF重组蛋白中的应用。

9.权利要求1所述ehEGF重组蛋白在制备促细胞增殖的材料中的应用，其特征在于：所述ehEGF重组蛋白编码基因的核苷酸如SEQ ID NO.2所示。