CN101395280A

CN101395280A - 基于测序的高通量SNPs连接检测技术

Info

Publication number: CN101395280A
Application number: CNA200780007373XA
Authority: CN
Inventors: M·J·T·范埃克; R·C·J·赫格尔斯
Original assignee: Keygene NV
Current assignee: Keygene NV
Priority date: 2006-03-01
Filing date: 2007-03-01
Publication date: 2009-03-25
Also published as: EP1991698B1; ES2446927T3; US8460866B2; WO2007100243A1; EP1991698A1; US20090215633A1; DK1991698T3; JP5237126B2; JP2009528054A

Abstract

检测一个或多个样品中一个或多个靶序列存在或缺如的方法。该方法基于使用各种连接探针进行寡核苷酸检测。连接探针中包含标识子序列，标识子序列采用高通量测序技术进行测定。

Description

基于测序的高通量SNPs连接检测技术

技术领域

本发明涉及分子生物学和生物技术领域。特别地，本发明涉及核酸检测领域，更特别地，在于可用于高通量核酸检测的探针的设计和组合(集合)。本发明也涉及到用探针和探针组合检测核酸的方法。本发明进一步提供了可与目的基因的靶序列杂交的探针和连接探针的扩增引物，这些探针和引物在鉴定和/或检测与各种各样的遗传性状和基因有关系的核苷酸序列的用途，适用于本发明的方法中使用的探针和引物的试剂盒。无论是人工合成的、植物、动物或人类来源的或以上的组合的靶核苷酸序列的高通量检测都适用于本发明。特别适用于高通量检测基因分型领域。

背景技术

人们对于检测特定核酸序列的兴趣迅速增长。自从人类基因组核苷酸序列草图和许多其他基因组草图问世，以及人类和许多其他生物体基因组草图中大量单核苷酸多态性(SNP)和小的插入/缺失多态性(indel)的发现，人们开始对核酸测定产生兴趣。而标记技术(如AFLP)、SNPWave技术和一般的检测与特定核酸序列相关性的识别技术可检测作为遗传性疾病特征的特异核酸序列，如检测乳腺癌基因brca1的各种等位基因以筛选乳腺癌的易感性。这些技术的出现使人们对于核酸测定更加感兴趣。由于认识到基因中单核苷酸的替代和插入/缺失其实包含了大量生物学信息，人们对于核酸序列检测的兴趣愈加浓厚。现在，人们普遍认为，在人类或其他进化出复杂表型的生物(如植物和牲畜物种的生产性能属于复杂表型)，这些单核苷酸替代是造成众多单基因遗传病和多基因遗传病的主要原因。因此在许多情况下，单核苷酸替代与人类、植物和动物的重要性状相关或至少提示了人类、植物和动物的重要性状。

分析这些单核苷酸替代和indels将得到丰富的有价值的信息。这些信息将对医药和农业的方方面面产生广泛的影响。举例来说，可以预期的是，这个领域的发展有可能实现个性化医疗。分析这些遗传多态性越来越需要有足够多的、可靠和快速的方法能够高通量地处理大量样品和大量SNPs(主要)，而几乎不影响得到的数据质量。其中，分析已知核酸序列的主要方法是基于两个探针与靶序列退火，两个探针结合在靶序列的相邻位置，而后连接这两个探针。

美国专利4,988,617(Landegren等人)已经描述了寡核苷酸连接检测技术的原理(OLA)。这个专利公开了在可能存在已知突变的已知核酸序列区检测核酸序列的方法。为了检测基因突变，选定寡核苷酸，退火，使之恰与待测片段结合。其中一个选定寡核苷酸在其末端有一个核苷酸与在已知核酸序列相应位置的正常或突变的核苷酸互补。当两个探针碱基配对正确并且恰好彼此相邻时，连接酶共价连接这两个探针。连接探针的存在、缺如或其数量是已知序列和/或突变存在的标示。

尼尔森等人公开了基于OLA的其他变通的技术。见于如下文章或专利：Human mutation，2002，19,410-415；Science 1994，265：2085-2088；US 5,876,924；WO 98/04745；WO 98/04746；US 6,221,603；US 5,521,065；US 5,962,223；EP 185494B1；US 6,027,889；US 4,988,617；EP 246864B1；US 6,156,178；EP 745140B1；EP 964704B1；WO 03/054511；US2003/0119004；US 2003/190646；EP 1313880；US 2003/0032016；EP912761；EP 956359；US 2003/108913；EP 1255871；EP 1194770；EP1252334；WO 96/15271；WO 97/45559；US 2003/0119004A1；US5,470,705。

特别是OLA技术上的改进已由荷兰的Keygene，Wageningen(地名)公开。在国际专利WO 2004/111271、WO2005/021794、WO2005/118847和WO03/052142中，他们描述了几种改进OLA可靠性的方法和探针设计。在这些申请中进一步公开了可以在多重水平上实现的显著改善OLA的技术。然而，上述所有公开都有缺点，那就是它们都是基于电泳或芯片的检测方法。进一步的缺点是所用探针长度范围很大，导致扩增一致性较差。

对于寡核苷酸探针而言，尚需结合本领域公知的各种连接探针和检测方法的优势，避免其特定弊端，这一点很清楚。尚需通过更有优势的探针进一步改进技术。本发明的目标之一就是提供这种探针。本发明的另一个目标就是避免本文前面提到的公知探针的弊端。本发明的进一步的目标是提供适于高通量检测的探针。为靶核酸序列检测，优选是寡核苷酸连接检测，提供高效、可靠和/或高通量的方法也是本发明的目标之一。

发明人已着手消除或至少减少本领域中存在的问题，而同时试图保持很多优势方面，进而改进这项技术。通过本发明的整个描述，图表和此处所述的各种实施例，本发明中提及的该实验技术和解决方案的其他问题变得很清楚。

发明内容

发明人已经能够将新型高通量测序技术与多功能性寡核苷酸连接检测技术结合起来。特别是，本发明涉及基于寡核苷酸连接检测技术的高通量靶核酸序列检测技术。其中，修改用于连接检测的探针，以使高通量测序方法能够明确地揭示一个或多个靶核酸序列的存在或缺如。

因此，发明人发现，在用OLA法检测样品中的每一个靶序列时，至少在一个探针中掺入独特的寡核苷酸标识子序列，在连接和扩增反应之后，利用高通量测序方法对该标识子序列进行后续检测，这种方法相对于现有技术更加可靠和高效。与本领域中公知探针不同，无论是线性探针还是环形探针，本发明方法中采用的探针的长度可以相同或十分近似。这个统一的长度是有利的，当扩增连接探针时，所有连接探针的扩增效率相似。已观察到，不同长度的连接探针其扩增效率可能大相径庭，从而损害整个检测结果的可靠性。当用标识子序列进行检测时，统一的长度也有利于使所有连接探针的标识子序列位于同一位置。通过这种方式改进OLA检测，一个重要的步骤在于对每一个特定靶序列而言，提供越来越多的易于设计的统一检测，能够可靠地区分出各个靶序列和样品，并能够以高通量和高度复杂性的方式进行检测。

在某些实施例中，提供了高通量检测一个或多个靶核苷酸序列的方法。在某些实施例中，提供了高通量检测来源于一个或多个样品的一个或多个靶核苷酸序列的方法。在某些实施例中，该方法包括为每个靶核苷酸序列提供第一探针和第二探针。

在某些实施例中，第一探针在其3′端包含一段靶序列特异区段。在某些实施例中，第一探针进一步包含第一标签区段。在某些实施例中，第一标签区段非互补于靶核苷酸序列。在某些实施例中，第一标签区段进一步包含第一引物结合序列。

在某些实施例中，第二探针在其5′端包含第二靶序列特异区段。在某些实施例中，第二探针包含第二标签区段。在某些实施例中，第二标签区段非互补于靶核苷酸序列。在某些实施例中，第二标签区段进一步包含第二引物结合序列。在某些实施例中，第一或第二标签区段包含一个标识子序列。在某些实施例中，第一和第二标签区段都包含一个标识子序列。在某些实施例中，标识子序列位于第一引物结合序列和第一靶序列特异区段之间。在某些实施例中，标识子序列位于第二引物结合序列和第二靶序列特异区段之间。

在某些实施例中，允许第一和第二探针与样品靶序列杂交。探针各自的第一和第二靶序列特异区段最好与靶序列上基本邻近部分杂交，尽管在某些实施例中可能会在两部分之间形成缝隙(结构)。在某些实施例中，第一和第二探针是连接在一起的即彼此相接。连接的第一和第二探针形成连接探针。

在某些实施例中，扩增连接探针以提供扩增子。在某些实施例中，扩增反应使用一个或多个引物。在某些实施例中，第一引物用于扩增。在某些实施例中，第二引物用于扩增。

在某些实施例中，第一引物用于扩增。在某些实施例中，第二引物用于扩增，这些引物可各自含有不同的限制性核酸内切酶的酶切位点。该扩增子被限制性内切酶酶切消化，其酶切位点位于第一引物上，在某些实施例是第二引物。随后，第三引物，在某些实施例是第四引物，就可以连接到消化后的扩增子上以提供扩增模板。在某些实施例中，第三引物和第二引物，在某些实施例中，第三引物和第四引物用于扩增。

在某些实施例中，将连接探针，或在某些实施例中，将来自连接探针的扩增的扩增子，进行高通量测序以确定连接探针或其扩增子的至少部分核苷酸序列。在某些实施例中，用高通量测序确定的连接探针或其扩增子的部分核苷酸序列中至少包含标识子序列。

在某些实施例中，样品中靶核苷酸序列的存在与否是通过确定核苷酸序列中相关的标识子序列的存在与否而鉴别出来的。

附图说明

通过下列图来阐明本发明

图1：图1简要说明了具有A/C多态性的目的基因靶核苷酸序列探针的不同类型(A、B、C、D、E、F)。在全部图中，探针的各个包含部分描述方法相同。

图1A说明了线性探针类型。其中第一探针(1)包含第一靶序列特异区段(TS1)和第一标签区段，第一标签区段包含第一标识子序列(ID1)和能退火结合第一引物(P1)的第一引物结合序列(PBS1)。第二探针(2)包含第二靶序列特异区段(TS2)和第二标签区段，第二标签区段包含第二标识子序列(ID2)和能退火结合第二引物(P2)的第二引物结合序列(PBS2)。在进行等位基因特异性检测的实施例中，TS2可含有，最好是在其3′末端，等位基因特异性核苷酸(G或T)和不同标识子序列(ID2或ID2`)。可通过检测ID1是否与ID2或ID2`合并存在而确定是否存在等位基因联合位点(基因分型)。所有等位基因的各种多态性基因可以以类似的方式进行基因分型。也可以以类似方式为其他公开的探针类型设计等位基因特异性探针。

图1B说明了环形探针类型。环形探针中包含第一靶序列特异区段(TS1)和第二靶序列特异区段(TS2)，每个都位于环形探针和包含第一标识子序列(ID1)的标签区段的末端(分别位于3′和5′末端)；第一引物结合序列(PBS1)能退火结合第一引物(P1)；第二引物结合序列(PBS2)能退火结合第二引物(P2)和第二标识子序列(ID2)(可选的)。ID1和ID2位置相邻或没有相邻。在某些实施例中，这种环形探针与核酸外切酶联合使用，以去除可能增加基因分型的假阳性的非连接探针。在某些设计中，ID1和ID2的联合可能代表基因座位/等位基因的联合。扩增环形探针产生短扩增子，可对短扩增子测序，确定含有ID1和/或ID2的样品是期望得到的基因多态性中阳性的基因型。

图1C说明了环形探针的另一种类型。该探针包含与上述环形探针相同的成分，但ID1、ID2、PBS1和PBS2的相对位置和方向保证只有当探针是环形时扩增才会发生。这样可免去去除非连接探针的任何步骤。

图1D说明了一种与图IA的线性类型类似的线性探针形式。此外，这种探针还将发夹结构部分C1和C2加入标签区段中，优选是在末端，也可位于ID和TS之间或PBS和ID之间。C1和C2彼此退火/杂交，形成类似挂锁的形式。与常规的线性探针类型相比，这种方式尤其是改进了杂交动力学(图IA)，同时也避免了图1B或C中探针扩增子的串联问题。

图1E说明了复合探针及其加长型的构象。第一探针(1)优选包含第一靶序列特异区段(TS1)。第二探针(2)包含第二靶序列特异区段(TS2)和包含第二标识子序列(ID2)的第二标签区段和第二引物结合序列(PBS2)。杂交/连接反应之后或与杂交/连接反应同时，复合探针(C)以能够杂交(部分杂交)到第一靶序列特异区段(TSP1)的部分与TS1部分退火杂交。(C)进一步还包含能够与引物(P1)结合的引物结合序列(PBS1)。复合探针的加长型多出的部分与第二靶序列特异区段(TSP2)和第二标识子序列(ID2)互补，与能退火与引物cP2结合的第二引物结合序列(cPBS2)互补。使用引物P1和cP2进行扩增，能够产生可以进行测序的扩增子。

图1F说明了一系列不均一探针的构象。第一探针(1)包含第一靶序列特异区段(TS1)，是外切酶抗性的(star)。第二探针(2)包含第二靶序列特异区段(TS2)和包含两个引物结合序列(分别是PBS1和PBS2)的标签区段和位于PBS1和PBS2之间的第二标识子序列ID2。非连接探针的成功连接和移除以及随后的扩增反应产生可以进行测序的扩增子。

图2显示连接/扩增反应之后，连接探针/扩增子的主要结构。图1A直到1F说明每个探针类型。

图3显示简要地说明了本发明中高通量测序的步骤，即连接探针/扩增子结合到表面(在乳液PCR情况下，结合到微珠表面，接着是在454技术的情况下的焦磷酸测序反应，或者结合到流动的细胞表面)。表面有cPBS序列，这个序列能够退火结合一个或两个引物结合序列PBS。连接探针/扩增子与表面序列杂交后，杂交序列可以在含有扩增序列的微珠上扩增，也可以在流动的细胞表面上产生扩增序列丛。随后，这些序列才能使用所描述的高通量测序技术测序。这些序列可在加入测序引物、核苷酸和酶后进行单向或双向测序。

图4至15，说明了一系列简并连接探针(即对等位基因而言，A和G简并)。这些简并连接探针包含，此外，或者替代图1中描述的元件如靶序列部分(TS1、TS2等)，一个用于测序步骤的单独的引物结合位点(sPBS)和一个(反向)PCR引物结合位点(PBS2)。样品的特定(反向)引物结合位点(OPBS)引进了一个可变部分作为一个样品的识别码(SIS)，因而是简并序列。每个样品可以通过使用样品特异性引物(SSP)进行选择性扩增，在这里显示的是样品1、样品2、直到样品n。使用多重简并反向引物更加经济，可用于多种检测。多重样品池可以使用一系列相应的简并引物进行扩增。使用GC锚定序列可使所有等位基因或样品具有相同的引物结合效率和扩增效率。探针在其引物结合位点的5′末端可进一步包含一个可选的C，一个相应的C位于(反向)引物(SSP)的3′末端。探针可以进一步为每个要进行检测的等位基因包含一个等位基因标识子序列(AIS)。等位基因和样品标识子序列优选是从3bp至5bp，优选是没有两个相同的连续碱基(均聚物)。标识子序列之间优选至少两个碱基不同。

具体实施方式

本发明第一方面涉及一个或多个样品中的一个或多个靶核苷酸序列的高通量检测方法，该方法包括下列步骤：

(a)为每一个靶核苷酸序列提供第一探针和第二探针。其中第一探针在其3′端包含一个靶序列特异区段、非互补于靶核苷酸序列的第一标签区段和第一引物结合序列。第二探针在其5′端包含第二靶序列特异区段、非互补于靶核苷酸序列的第二标签区段和第二引物结合序列。其中第一或第二标签区段包含，或两者都包含，标识子序列，该序列位于各自的第一或第二引物结合序列与各自的第一或第二靶序列特异区段之间，

(b)使得第一和第二探针能够杂交结合到靶序列上。

(c)当探针上各自的靶序列特异区段杂交到靶序列上基本相邻的部分时，连接第一和第二探针以产生连接探针。

(d)可选地，用第一和第二引物扩增连接探针产生扩增子。

(e)将连接探针或扩增子用高通量测序技术测定至少部分核苷酸序列，至少包括该连接探针或扩增子的标识子序列。

(f)通过测定步骤(e)中核苷酸序列中的标识子序列的存在或缺如来确定样品中靶核苷酸序列的存在或缺如。

该方法首先提供一个或多个可包含目的序列的样品(即可以合并或富集)。向样品中加入一系列探针(为每个靶序列提供不同系列的探针)。在适宜条件下，探针的靶序列特异区段可以杂交到靶序列上。杂交后，任何杂交到靶序列上相邻位置上的探针被连接起来产生连接探针。该连接探针可扩增，或者可选择地，也可以直接用基于合成测序技术的高通量测序方法进行测序。测序及后续标识子序列的鉴定过程完成之后，样品中是否含有靶序列被确定，基因分型完成。

一个方面，本发明涉及到本发明中用到的具有优势的探针的设计。下文更详细地讨论了这些探针。本发明的另一个有利方面，在于将为了寡核苷酸联合分析的现有技术高通量测序技术作为检测平台，与OLA分析技术的高分辨能力结合。就目前所知，OLA技术仅被用做检测平台、这个平台是基于长度/移动分离(即电泳分析)、杂交(基于芯片)或大规模测定(质谱/MALDI-TOF即飞行质谱)，而没有开发出合适的可用于高通量测序检测平台的探针。申请人须指出，除了在探针设计上的创新，结合了高通量测序反应的OLA检测技术，无论探针还是实验程序，都需要认真的修改。

靶核苷酸序列

广义地讲，靶序列可是任何目的核苷酸序列。靶序列可以是任何想检测或测定的序列，例如，因为它可以暗示、与之相关或代表某种疾病、某种基因构成或基因失调。靶序列优先地是包含、代表或与之关联的多态性核苷酸序列。术语多态性在此是指存在由基因决定的两个或两个以上的替代序列或人群中的等位基因。多态性标记或位点是出现序列分歧的基因座位。优选的标记物至少有两个等位基因，每个发生频率大于1％。更优选地，在选定人群中大于10％或20％。多态性位点也许小到一个碱基对。多态性标记物包括限制性酶切片段长度多态性、可变数目串联重复序列(VNTR’S)、高度可变区、微卫星、二核苷酸重复序列、三核苷酸重复序列、四核苷酸重复序列、简单重复序列和插入元件如Alu序列。指定首次确定的等位基因的形式为参考形式，则其他形式的等位基因被称为替代或变异等位基因。在选定人群中最常见的等位基因形式，有时是被称为野生型的形式。二倍体(四倍体/六倍体)的生物体，其等位基因形式可能是纯合子或杂合子。双等位基因多态性有两种形式。三等位基因多态性有三种形式。单核苷酸多态性出现在被一个单核苷酸占用的多态位点，这是等位基因序列之间的差异性位点。这个位点通常位于等位基因的高度保守序列(例如，群体中有不到1/100或1/1000的人口在其上有区别的序列)之前和之后。单核苷酸多态性的出现通常由于在多态位点上一核苷酸被另一个核苷酸所替代。相对于参考等位基因而言，单核苷酸多态性也可以是缺失一个核苷酸或插入一个核苷酸。其他多态性包括(小的)缺失或插入几个核苷酸，称为indels。用本文所描述的方法分析DNA样品，特别是分析个体DNA样品中存在的遗传变异(多态性)的过程，在本申请中有时被称为基因分型或SNP分型(特指单核苷酸多态性)。

DNA

在核酸样品中，包含靶基因的核酸可是任何目的核酸。尽管样品中的核酸通常以DNA的形式存在，但样品中包含的核苷酸序列信息可能来自任何来源的核酸，包括如RNA、polyA⁺、RNA、cDNA、基因组DNA、细胞器DNA如线粒体DNA或叶绿体DNA、合成核酸、DNA文库(如BAC文库/富集的BAC克隆)、克隆银行或上述其他任何选择或组合。核酸样品中的DNA可能会是双链、单链、双链DNA变性成的单链DNA。双链序列的变性产生两个单链片段，其中的一方或双方可通过各自链的特异性探针来分析。优选的核酸样品包括cDNA、基因组DNA、限制性酶切片段、有适配子的限制性酶切片段、扩增的有适配子的限制性酶切片段、扩增片段长度多态性(AFLP)片段或以AFLP片段为模板预扩增片段上的靶序列。

样品

优选地，一个样品中包含两个或更多不同的靶序列。“两个或更多”指的是两个或更多的特征不同的靶序列，而不是指样品中靶序列的数量。特别是样品包含至少两个不同的靶序列，特别是至少100个，优选地是至少250个，更优选地是至少500个，更尤其是至少1000个，优选地是至少2500个，更优选地至少5000个和最优选地至少10000个的靶序列。在实际中，样品中可分析的靶序列的数量是有限的，除外其他条件，可检测的扩增子的数量是有限的。本文用的检测方法能检测相对大量的靶序列。

探针

设计寡核苷酸探针上与靶序列互补的区段，以为样品中的每一个靶序列提供一对第一和第二探针，其中每个探针在其末端都包含与靶序列互补的部分(分别是靶序列特异区段的第一和第二部分)和靶序列上相应的互补性部分优选地基本上彼此相邻。

在某些实施例中，对应于基因座位(locus)上不同等位基因，可以提供另外的第一和/或第二探针。在某些实施例中，等位基因特异的核苷酸位于第一探针或者第二探针的位置，在这个位置发生连接反应，即，在靶序列特异区段的末端发生连接反应(见图1A节)。

在某些实施例中，在一对寡核苷酸探针内，第一寡核苷酸探针在其(磷酸化)5′端有一部分与靶序列的第一部分互补，第二寡核苷酸探针在其3′(羟基)端有一部分与靶序列的第二部分互补。因此，当这对探针退火到靶序列的互补序列时，第一寡核苷酸探针的5′末端基本与第二寡核苷酸探针的3′末端相邻，这两个探针的末端能够形成磷酸二脂键或以其他合适的方式形成共价键而连接起来。

在某些实施例中，在一对寡核苷酸探针内，第一寡核苷酸探针在其(磷酸化)3′端有一部分与靶序列的第一部分互补，第二寡核苷酸探针在其5′端有一部分与靶序列的第二部分互补。因此，当这对探针退火到靶序列的互补序列时，第一寡核苷酸探针的3′末端基本与第二寡核苷酸探针的5′末端相邻，这两个探针的末端能够形成磷酸二脂键或以其他合适的方式形成共价键而连接起来。

在某些实施例中，要确定样品中每一个靶序列存在、缺如或其数量。设计一对特异的第一和第二寡核苷酸探针，每个探针都有一个部分互补于每个靶序列上相邻的互补性部分，如上文所述。因此，在本发明的方法中，对于每一个出现在样品中的靶序列而言，连接探针或其相应(特异)扩增子可通过扩增样品而获得。某些实施例提供了与样品中多重靶序列互补的多重的第一和第二寡核苷酸探针。样品中特定靶序列的一对第一和第二寡核苷酸探针，至少在核苷酸序列上区别于其他靶序列或其他样品的探针对，并可在长度和/或数量上区别于其他靶序列或其他样品的探针对(正如上文所述，虽然这不是优选)。更优选地，某一特定靶序列的一对探针，其产生的连接探针和/或扩增子序列上区别于样品中其他靶序列对应的连接探针，如下文所述。

探针的变化形式

挂锁型探针

本发明的某些实施例使用了环形探针或挂锁型探针。第一和第二探针被合并成一个探针。该环形探针是一个线性寡核苷酸，当与靶序列退火时，连接形成环形拓扑构象，锁定到靶序列中去。在某些实施例中，在连接步骤之后扩增步骤(优选PCR扩增)之前，用核酸外切酶处理样品，以消除任何非连接的环形探针，防止任何非连接探针进行扩增。本领域所指的环形探针是指如专利EP745140或文献(Van eijket al.，Nucleic Acids Research，2004，32，e47.)中的探针。已知探针可用滚环扩增方式常规扩增或用聚合酶链式反应产生串联体。此外，在已知环形探针上的引物结合位点的方向使得包括任何靶序列特异区段在内的整个环形探针扩增。为了规避PCR扩增产物中串联体的出现，在连接探针中的引物结合位点之间掺入封闭性修饰，例如WO03/052142描述的类型。在某些实施例中，本发明中环形探针的引物结合位点的方向，使得优选只有包含引物结合位点和标识子的区段被扩增和优选连接的靶特异区段不被扩增。优选地，与使用常规方法扩增环形探针的产物相比，结合使用核酸外切酶消除非连接环形探针，可得到长度较短的扩增子。这样可避免形成大的串联体，及进一步的整个环形探针的不必要扩增。

在某些实施例中，标识子序列与其中一个引物结合序列基本相邻，优选位于第一和第二引物结合位点之间，以使扩增后的产物至少包括其中两个引物结合位点中的一个和这个间断性的标识子序列。随后扩增子的高通量测序将测出标识子序列并据此确定样品中靶序列的存在。

钥—锁型探针

在某些实施例中，对于每一个要检测的特定靶序列，优选至少设计一对探针，其中每个探针都能与一部分靶序列杂交，其中每个探针都含有与这对探针中的另外一个探针对应部分互补的部分，这样两个探针能够彼此杂交。一对探针的两个探针被设计成当彼此杂交时，每个探针也能够与靶序列杂交。当彼此杂交用于寡核苷酸连接反应检测靶核苷酸序列时，两个探针模拟了或起到挂锁型探针的作用，而在随后的扩增和检测步骤中，探针是线性连接产物的功能。这种类型的探针已被称为“钥—锁型探针“，并已在WO2004111271中公开。

在某些实施例中，第一寡核苷酸探针在其5′端有一部分互补于第一靶序列区段，第二寡核苷酸探针在其3′端有一部分互补于第二靶序列区段。在某些实施例中，第一寡核苷酸探针进一步包括一个发夹结构部分，该发夹结构部分与第二寡核苷酸探针的发夹结构部分互补，而这两个发夹结构部分基本上不能与靶序列互补。在某些实施例中，该发明涉及本文中所概述的，测定样品中靶序列的存在、缺如或者至少一个靶序列的数量的方法。该方法包括为每个要检测的靶序列提供一对带有发夹结构的探针。在某些实施例中，寡核苷酸探针可退火到靶序列上，提供了连接第一和第二寡核苷酸探针的方法，使得第一和第二寡核苷酸探针连接起来以产生一个对应于样品中靶序列的连接探针。

发夹结构优选位于相对探针的靶序列部分较远的末端或其附近，即靶序列位于3′端，发夹结构则位于5′端的远端，反之亦然。发夹结构不一定位于5′端或3′端的最远端，它的后面可能跟着其他部分，这部分在本文的其他部分将要讨论到。优选地，设计发夹结构使之不能与探针上的靶序列部分杂交。优选地，将一对探针中的第一和第二探针的发夹结构设计成能够彼此杂交。优选地，将发夹结构设计成和探针上的靶序列部分与其在靶核苷酸序列上的互补序列之间的结合力相比，两个互补的发夹结构彼此之间的结合力更强。

这实际上意味着，发夹结构彼此杂交时形成的双链，与探针上的靶序列部分与靶寡核苷酸上的互补区杂交时形成的双链相比，具有更强的结合力。与探针上的靶序列部分与靶寡核苷酸上的互补区的杂交相比，互补的发夹结构杂交需要更高的温度。换句话讲，在其他条件可比的情况下，杂交的发夹结构变性与探针对中的靶序列互补区的变性相比，需要更高的温度或者更严谨的条件。这就允许人们在使用本发明的方法时可以选择条件以使杂交或锁住的发夹结构部分保持杂交或闭合状态直到探针连接起来形成连接探针。(连接的)探针在能够使锁住的发夹结构变性的温度条件或其他条件下变性，锁住的发夹结构可被打开。

一对包含锁住的发夹结构的探针，其杂交动力学和杂交行为类似或相同。就像一对环形探针或挂锁型探针。两个探针可分别加入到样品中，然后再彼此杂交。或者这两个探针在加入到样品中之前即杂交锁住。

在优选的实施例，发夹结构部分的变性温度(或熔解温度，Tm)超过这对探针中的靶互补序列的变性温度至少1摄氏度，优选地5摄氏度；更优选地，超过T1或T2部分的最低Tm温度10摄氏度。一个寡核苷酸序列的变性温度可通过一般公式Tm＝(4×G或C)+(2×A或T)或Tm＝(4×G/C)+2×A/T)-5C来计算或估计(Meinkoth et al.Anal.Biochem.(1984)138：267-284)。其他基于Tm(发夹结构)和Tm(靶序列)两部分之间不同的变性温度的公式也同样适用。改变发夹结构部分的变性温度，不仅可以通过改变发夹结构部分的长度，而且通过改变发夹结构部分的GC含量。与一对AT碱基对相比，一对GC碱基对可使Tm增加2摄氏度。

典型的发夹结构可包含10至30个核苷酸，优选15至25个核苷酸，更优选18至24个核苷酸。当GC含量较低时，增加核苷酸的数目以得到预期杂交特征。也可用修饰核苷酸促进两个发夹结构部分之间的杂交。这里讲的促进杂交特征的核苷酸有在WO 99/14226、WO00/56748、WO 00/66604和WO01/25478中公开的锁式核酸，肽核酸或能使杂交DNA稳定或增强的其他分子如DNA小沟区结合剂和EP0974672中描述的其他分子。

发夹结构部分的GC含量可以有所变化，其变化范围可以从50％以上到100％，优选是60％以上，更优选70％以上，最优选80％以上，并优选地是在90％-100％范围内。因此，大多数发夹结构附带包含A/T组合或将其作为结构基础。发夹结构部分的优选组是GC丰富的ZIP序列(Iannone et al.(2000)，Cytometry 39：pp.131-140)。优选发夹结构部分由超过T1和T2至少1个，优选地是至少超过2、3、4或5个选自由G和C组成的组的核苷酸所组成。

在某些实施例中，使用一组探针对时，一组内的每一对探针都有不同的发夹结构。发夹结构部分被设计成第一对探针的发夹结构和第二对或其他对探针彼此区分开来，优选地在连接检测条件不会发生交叉杂交。每对探针包含一个独特的发夹结构，从而避免了发夹结构之间的交叉杂交。为此，发夹结构部分可能包括额外的核苷酸或发夹结构部分的寡核苷酸序列在其组内或其组合内是独特的，以区分一组内两个发夹结构，或者在多重样品连接检测中，增加靶序列上可能不会发生交叉结合的发夹结构结合序列的数量。这后一种实施例可在同一样品中同时检测多个靶序列。该实施例也可在多个样品中使用同一组探针对先后检测一个或多个不同靶序列。该实施例可重复使用同一组探针检测不同的靶序列。

当使用发夹结构不同的一组探针对时，这些发夹结构的Tm值变化范围优选很小，优选在60—90摄氏度之间，更优选在65—88摄氏度之间，最优选在70—85摄氏度之间。众所周知，核苷酸的杂交特征也受盐浓度的影响。正像这里提到的杂交反应一般特征的比较或者尤其是寡核苷酸的变性温度的比较认为是在可比的盐浓度条件下进行比较，除非特别注明。本发明用到的替代性的发夹结构包含有光降解环节的核酸。连接后，光降解环节消除，连接探针得以扩增和/或检测。

在某些实施例中，本发明的探针带有上述发夹结构。在某些实施例中，第一和/或第二探针中的全部或部分发夹结构含有外切酶抗性，这种外切酶抗性在介绍其他探针时简要提到过。在某些实施例中，发夹结构或部分发夹结构可基于发夹结构杂交来分离任何非连接第一探针和/或连接探针，这一点在本文其它部分公开过，如HBP杂交(Hybridization Based Pullout)或其他基于使用玻片、芯片、微珠和磁性颗粒等分离方法的杂交。在某些实施例中，发夹结构在用外切酶处理和/或分离非连接第一探针或连接探针之前变性。

在钥锁型探针，标识子序列位于探针的引物结合区段和靶序列特异区段之间。钥锁型探针的两部分可配备一个标识子序列。

复合探针

本发明的某些实施例使用WO2005021794中描述的一系列探针。将靶序列加入到第一和第二探针中，其中第一探针包含互补于靶序列的第一靶序列特异区段，其中第一探针，优选在可选的第一标签区段不包含第一引物结合序列。第二探针包含了第二靶序列特异区段和第二标签区段，其中第二标签区段包含第二引物结合序列。第二标签区段在第二引物结合序列和第二靶序列特异区段之间包含一个标识子序列。在两个探针杂交和连接之后或与此同时，加入复合探针。该复合探针包含一个能与第一靶特异序列区段杂交或部分杂交的部分，进一步包含一个含有引物结合区段的部分。该复合探针与连接的第一和第二探针杂交。复合探针沿连接的第一和第二探针延伸，产生延长型的复合探针，后者随后用第一引物和第二引物进行扩增。第一引物和第二引物可与第一引物结合位点和第二引物结合位点结合。扩增产物能用本发明中描述的高通量测序技术进行检测。样品中的靶序列能够通过鉴定标识子序列的存在或缺如进行鉴定。

非对称探针

某些实施例使用WO2005118847中描述的一系列探针。在这个实施例，将靶序列加入到第一和第二探针中。第一探针包含第一靶序列特异区段和优选不包含可包含第一引物结合序列的第一标签区段。第一靶序列特异区段优选位于潜在连接位点的远末端，可包含使探针具有核酸外切酶抗性的基团，如生物素或修饰核酸如单硫代磷酸酯修饰核酸、二硫代磷酸酯修饰核酸、磷酸酰胺修饰核酸和PNAS及LNAS(这方面详细资料见WO2005118847)。第二探针包含了第二靶序列特异区段和第二标签区段。第二标签区段通常包括第一和第二引物结合序列和间断分布的标识子序列。成功的杂交和连接反应产生连接探针。加入核酸外切酶以消除所有非连接探针即第二探针。只有连接探针才能被扩增，这是因为连接探针由于第一探针的存在而具有核酸外切酶抗性。用一系列第一和第二引物扩增连接探针产生短扩增子，短扩增子主要由两个引物和间断的标识子序列组成。这些短扩增子(和其中的标识子序列及后续相关靶序列)可用本发明中的高通量测序方法进行鉴定。

标签区段

术语“标签区段“是指探针上不能杂交到靶核苷酸序列上的部分。标签区段通常含有标识子序列和引物结合位点，在某些情况下，如本文其他部分提及的，标签区段含有发夹结构。

引物结合序列

引物结合序列可被加入探针中以方便扩增，无论是线性扩增或指数扩增。引物结合位点，优选是探针上有别于靶序列特异区段的其他部分，优选在标签区段，此部分基本上与靶序列无互补，主要是非互补的靶序列。引物结合位点能结合引物启动引物的延伸或扩增。优选地，在一组探针对内，引物结合位点是普遍存在的，即只有一个预测定组的引物结合位点纳入了探针，以扩增或延伸数量有限的多重引物，如在其3′端含有一个或多个选择性碱基的引物，见于AFLP(EP 0 534858)。不同组的探针对之间，引物结合位点可有所不同。在某些实施例中不同组的探针对之间结合到不同引物结合位点的引物的Tm值不同。

探针上标识子序列的功能和引物结合位点的功能可以合并起来，形成意义上相关联的特殊部分。探针上的这个特殊部分对于(选择性)引物延伸/扩增而言，可以作为引物结合位点(部分)，同时或者不同时可以作为标识子序列(部分)来区分预期的和基于检测平台的区别，见此文其它部分。

标识子序列

在某些实施例中，本发明中的寡核苷酸探针进一步包括标识子或标识子序列。标识子序列是序列可变的寡核苷酸序列。标识子序列的长度从1bp到30bp可变，优选从2bp到20bp，更优选从3bp到10bp，最优选从4bp至6bp。标识子序列是一个独特的序列。它的独特性可以被解释为一个ZIP编码序列类型(Iannone et al.(2000)，Cytometry 39：pp.131-140)。一个6核苷酸的标识子序列最多可形成4096个独特的组合(＝4⁶)。优选地，标识子序列在其3′端包含2个碱基的GC(或其他定义的短GC丰富区)锚定序列以保证相同的结合力和扩增效率。进一步优选地，标识子序列不含两个连续的相同碱基；进一步优选地，一系列标识子序列中的所有标识子序列之间至少有两个碱基的区别以保证序列识别的准确性。在多种样品中使用时，每个样品都可被一系列特异性标识子序列识别。一般于使用引物结合序列扩增连接探针时在其末端加入标识子序列使得产生的扩增子包含标识子序列。典型地，通过上述方法加入到连接探针上的标识子序列通常位于引物结合位点之间。某些实施例用两个或更多的标识子序列，例如等位基因联合体，标识子序列同样位于引物结合位点之间。某些实施例提供两个标识子序列，分别位于两个探针上。其中一个探针可被看作一个基因座位探针，例如指向特异的基因座位并包含该基因座位特异性的标识子序列。另一个探针可作为等位基因特异性探针，例如，优选在其连接位点上包含等位基因特异性核苷酸。等位基因特异性探针可包含等位基因特异性标识子序列。以这种方式，一个特异性基因座位—等位基因联合体可通过鉴定联合标识子序列的存在或缺如而鉴定。当试验一种多态性的所有等位基因变种时，只需一种基因座位探针，和四种等位基因特异性探针一同使用。某些实施例，只有等位基因特异性探针可包含一个标识子序列，该标识子序列包含基因座位特异性标识子序列和等位基因特异性标识子序列，例如一个5个碱基对的基因座位标识子序列，后面是2个碱基对的等位基因标识子序列。

杂交

某些实施例，将探针加入到样品中与靶序列杂交结合。这对寡核苷酸探针随即退火到，优选比邻，样品中靶序列上的互补部分。寡核苷酸探针特异性退火到互补的靶序列上的方法和条件为人们所熟知(Sambrook and Russel(2001)＂Molecular Cloning：A Laboratory Manual(3rd edition)，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring HarborLaboratory Press)。

通常，在寡核苷酸探针与靶序列混合后，混合物在盐缓冲液中温浴变性较短时间(一般在94摄氏度和96摄氏度之间，30秒至5分钟)。使含有变性探针和靶序列的样品冷却到对于探针和靶序列的特异性退火最佳的杂交温度。与探针上的靶序列互补区和其在靶序列上的互补区的杂交的解链温度相比，这个最佳的杂交温度通常低5摄氏度。为了防止一对探针中两个探针中的一个发生非特异性杂交或杂交不充分或是样品中含有多重靶序列，在一个样品内，不同靶序列之间，探针上与靶序列互补部分的熔解温度优选相似，更优选相同。因此，第一和第二探针的互补部分的熔解温度差别优选小于20、15、10、5或2摄氏度。使用下列探针可易化杂交过程：第一和第二探针上的靶序列互补部分长度相似或GC含量相似，互补部分长度上的差别优选小于20、15、10、5或2个核苷酸，GC含量上的差别小于30％、20％、15％、10％或5％。这里说的互补是指在正常严谨性条件下，第一条核苷酸序列能特异性地与第二条核苷酸序列杂交。认为互补于另一条核苷酸序列的一条核苷酸序列可包含少量碱基错配，优选低于20％、15％、10％、5％或2％。可选地，可能有必要掺入所谓的通用核苷酸补偿错配，比如专利EP-A 974 672中描述的例子，或通过掺入某种能够补偿错配碱基的修饰核苷酸如LNAs，来提高熔解温度或杂交特异性。由于探针退火结合到靶序列上是浓度依赖过程，因此退火过程优选在小体积内进行，如小于25微升，更优选的，小于10微升。在上述杂交条件下，探针通常很快退火到靶序列上，不会超过5、10或15分钟。尽管只要杂交温度足以避免非特异性退火就能够使用较长的退火时间，但较长的退火时间对于需要定量的杂交反应才更加重要或更加需要，因为只有连接探针完整占用靶序列才能对不同样品间靶序列进行检测或相对定量。

在本发明某些实施例，延长杂交时间可得到优良的结果。杂交过夜或重复杂交，如1小时10个循环。对于由于杂交效率不同造成得到的信号不同的实验，延长杂交时间可使这种差别减小。也可通过延长杂交时间使存在靶序列与其所有探针完全杂交和连接。用本文描述的耐热连接酶合并杂交—连接步骤可得到优良的结果。在这个实施例中，用下述步骤进行杂交—连接反应：在耐热连接酶作用下探针杂交1小时，接着进行变性步骤。重复上述步骤2次，得到较好的结果；重复10次，得到优良的结果。为了避免变性和退火过程中的蒸发，反应仓(反应管或微孔)的四壁和盖子应加热到与反应混合物至少相同的温度，通常通过使用商业化的DNA扩增仪或用矿物油覆盖反应混合物来达到这一点。在优选的寡核苷酸探针中，靶序列互补区的长度优选至少15、18或20个核苷酸，优选不得超过30、40或50个核苷酸，探针靶序列区的熔解温度优选至少50、55或60摄氏度。

连接

一对第一和第二寡核苷酸探针各自的5′磷酸端和3′羟基端，用任何适当的本领域公知方法连接形成共价键。或一对环形探针，其靶特异区段退火后基本彼此相邻，互补于靶序列上的互补部分，其各自的5′磷酸端和3′羟基端，用任何适当的本领域公知方法连接形成共价键。探针末端可用连接酶，优选是DNA连接酶，连接形成磷酸二酯键。DNA连接酶能够催化结合在一条互补链上的两条核苷酸链的相邻末端之间形成磷酸二酯键。DNA连接酶封闭双链DNA上的缺口通常需要ATP(EC 6.5.1.1)或NAD(EC 6.5.1.2)作为辅因子。

本发明中使用的适当的DNA连接酶是T4DNA连接酶、大肠杆菌DNA连接酶或优选一种耐热连接酶如嗜热水生菌连接酶(Taq连接酶)、嗜热生物DNA连接酶或火球菌属DNA连接酶。

另外，化学连接适当修饰的多(聚)核苷酸末端可被用来连接退火到靶序列互补性部分上相邻位置的两个寡核苷酸探针。典型的修饰多(聚)核苷酸末端的活性基团包括但不限于磷硫酰基、甲苯磺酸根、或碘化、酯类和酰肼、RC(O)S、RCH2S、α-haloacyl、thiophosphoryl、溴乙酸盐和S-pivaloyloxymethyl-4-thiothymidine。

化学连接试剂包括但不限于激活剂、浓缩剂和还原剂如碳化二亚胺、溴化氰(BrCN)、N-cyanoimidazole、咪唑、1-甲基咪唑/碳化二亚胺/六甲烯四胺、二硫苏糖醇(DTT)和紫外线。自动连接，即在缺少连接试剂时自发性连接，也属本发明的范围。化学连接方法的详细步骤和活性基团的适当说明也见于其他文献和专利(Xuet al.，NucleicAcid Res.，27：875-81(1999)；Gryaznov and Letsinger，Nucleic Acid Res.21：1403-08(1993)；Gryaznovet al.，Nucleic Acid Res.22：2366-69(1994)；Kanaya and Yanagawa，Biochemistry 25：7423-30(1986)；Luebkeand Dervan，Nucleic Acids Res.20：3005-09(1992)；Sievers and vonKiedrowski，Nature 369：221-24(1994)；Liu and Taylor，Nucleic AcidsRes.26：3300-04(1999)；Wang and Kool，Nucleic Acids Res.22：2326-33(1994)；Purmalet al.，Nucleic Acids Res.20：3713-19(1992)；Ashley andKushlan，Biochemistry 30：2927-33(1991)；Chu and Orgel，Nucleic AcidsRes.16：3671-91(1988)；Sokolovaet al.，FEBS Letters 232：153-55(1988)；Naylor and Gilham，Biochemistry 5：2722-28(1966)；and U.S.Pat.No.5,476,930)。

与在连接位点上或接近连接位点上存在错配的探针—靶序列复合物相比，完全匹配的探针—靶序列复合物使用化学方法连接和酶法连接更为有效(Wu和Wallace，1989，Gene 76：245-254；Xu和Kool，supra)。为了增加连接的特异性，连接的特异性即完全匹配寡核苷酸相对于错配寡核苷酸的连接效率，连接反应优选在高温下进行。因此，本发明某些实施例在延伸时间内使用DNA连接酶，该酶在50—65摄氏度仍能保持活性，但是在较高的温度很容易灭活，例如PCR的变性步骤，通常是90—100摄氏度。从WO01/61033得知，这是一种需要NAD的DNA连接酶，来自于革兰氏阳性菌(MRCH 065菌株)。该连接酶被称为“连接酶65”，可从荷兰阿姆斯特丹的MRC公司购到。某些实施例使用Taq连接酶。在某些实施例中，连接酶在连接第一和第二探针之后失活。在某些实施例中，连接探针变性，与靶序列分离。

缝隙连接

在另一种实施例，例如有关indels鉴定的实施例，第一和第二探针上靶序列互补区段末端分别退火以致留下一个缝隙结构。在某些实施例中，靶核苷酸序列上的第一和第二部分并不相邻。换句话讲，第一和第二探针上的第一和第二靶序列特异性区段没有杂交到靶核苷酸序列上相邻的第一和第二部分。这与这项技术的其他变化形式有基本不同，其他变化形式见于EP 185494、US5521065、US5692223和WO03054311。

这个缝隙结构可被合适的(第三方)(寡)核苷酸填充和连接。该方法名为“缝隙连接”，见于WO 00/77260、US5185243、EP439182、EP320308和W090/01069。另一种可能可以填充这个缝隙的方法是用聚合酶和连接酶以及单或多核苷酸延伸探针的一个末端，其中单或多核苷酸可从A、T、C或G或双核苷酸或其它小的寡核苷酸中预选。如果靶序列是RNA，还有另外一种填充缝隙结构的可能，就是用反转录酶、连接酶、单或多核苷酸延伸探针的一个末端，其中单或多核苷酸可从A、T、C或G或双核苷酸、三核苷酸或其他小的寡核苷酸中预选。缝隙连接可用于单SNPs/indels检测或位置相近的多SNPs检测(单体分型)。

扩增

本发明方法，用本领域公知的任何合适的核酸扩增方法扩增连接探针以产生包含扩增的(能被检测的)连接探针(扩增子)的扩增样品。连接探针(或扩增子)代表靶核苷酸序列。核酸扩增方法通常使用一到二个引物、dNTPs和DNA聚合酶。一个优选的扩增方法是PCR。＂PCR＂或多聚酶链式反应是体外酶法快速扩增特异性DNA片段的过程。待扩增的DNA通过加热样品而变性，在DNA聚合酶和过量的脱氧核苷酸、三磷酸盐存在条件下，寡核苷酸能够特异性杂交到靶序列上启动新的DNA合成。优选地，聚合酶是不会表现或者不显著表现链替代活性的DNA聚合酶。这种聚合酶的例子有Amplitaq、Amplitaq Gold(供应商：Perkin Elmer)和Accuprime(供应商：Invitrogen)。一轮合成反应生成一条一定长度的新链，这条新链与亲本链相似，在变性和退火之后，能够与引物杂交。变性、退火和合成的第二个循环，产生两条单链产物，这两条单链产物能组成一条不连续的双链产物，长度恰好是模板链上两个引物末端之间的长度。

每经过一个连续循环，不连续产物呈指数级积聚。超过大约20到30个循环，不连续片段可以得到许多亿倍的扩增。PCR方法在本领域内为人所熟知，见于标准实验手册(Ausubel et al.，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，Inc.(1995))。

本发明中应用PCR方法的适宜条件的描述见EP-A 0534858和文献(Vos et al.1995；Nucleic Acids Res.23：4407-4414)。其中，多种DNA片段，长度在70到700个核苷酸之间，包含相同的引物结合序列。这些DNA片段使用一对引物以近乎相同的效率进行扩增。某些实施例，聚合酶在扩增后失活。也可用其他多重和/或等温扩增的方法进行扩增，如滚环扩增、连接酶链式反应、自主序列复制、Q-B复制酶介导的RNA扩增或链置换扩增。在某些条件下，在不背离本发明要义的前提下，对探针和引物进行了不同的设计。

引物

用对应于引物结合位点的一对引物扩增连接探针。在某些实施例中，只用这对引物中的一个引物扩增，扩增是线性扩增而非指数扩增。在某些实施例中，这对引物包含第一引物，后者能与第一引物结合区段退火，启动扩增或延伸。在某些实施例中，这对引物进一步包含第二引物，后者能与第二引物结合区段退火，启动扩增或延伸。在某些实施例中，第二引物与探针上第二引物结合位点序列相同。在优选实施例，至少一对引物或相同对数的引物对样品中两个或多个不同的连接探针进行扩增。优选地，扩增样品中所有连接探针。这样的引物有时被称作通用引物，能够启动所有含有相应通用引物结合位点的连接探针的扩增，因此产生含有通用引物结合位点的连接探针。步骤(1)的扩增中使用的不同引物优选在退火、启动效率上基本相等。因此，样品中的引物熔解温度的差别优选低于20、15、10、5或2摄氏度。这一点对于寡核苷酸探针的靶特异性区段以此处简述的方法能达到。与靶特异性区段的序列不同，引物序列不由靶序列限定，所以能方便地通过从核苷酸四聚体中组装序列来设计引物，每个四聚体包括一个A、T、C和G或通过其他途径保证引物的G/C含量和熔解温度相同或非常相似。引物长度(和第二探针标签区段上相应的引物结合位点)优选至少12、15或17个核苷酸，优选不超过25、30、40个核苷酸。

在某些实施例中，至少两条第二寡核苷酸探针互补于样品中至少两个不同的靶序列，每个探针包含一个标签区段，此标签区段包含一个引物结合区段，该引物结合区段互补于一条单引物序列。

在某些实施例中，与其他结合在同一锚定序列上的引物相比，为确保相似引发效率，引物可包含3′锚定序列，优选是2bp的锚定序列，优选是GC锚定序列。典型的，相应的引物结合序列也结合在其中的互补区。

因此，优选的，一对引物的第一和第二引物中至少一个引物用于扩增至少与样品中两个不同靶序列对应的连接探针。更优选的，用于对应于样品中所有靶序列的连接探针的扩增。优选的，只使用第一引物。在某些实施例中，只用单独的第一引物和单独的第二引物扩增所有连接探针。使用通用引物扩增多种不同片段通常对于扩增效率是有益的。得自探针相邻区段退火连接反应的连接了的探针被扩增，用一对引物，优选的，含有用样品中每个连接探针的每对引物进行扩增。引物对包括那些与连接探针中的引物结合序列互补的引物。一个引物对通常包括一个第一引物和至少一个第二引物，也可能仅包含一个单一引物引发双向扩增。用那些本领域公知的引物已经获得优良的结果。这些引物如AFLP引物在EP534858和Vos等人的文章(Nucleic AcidResearch，1995，vol.23，4407-44014)中已有说明。在此处下文将会更详细地讨论这些引物。

选择性引物

在某些实施例中，用于本发明扩增步骤中的一个或多个引物是选择性引物。选择性引物在此处是指一个引物，除了含有与探针上引物结合位点互补的一般性序列之外，还含有一个包含所谓“选择性核苷酸”的区域。这个包含选择性核苷酸的区域位于通用引物的3′末端。选择性核苷酸的原理已公开，见EP534858和Vos等人的文章(NucleicAcid Research，1995，vol.23，4407-44014)中不同的上下文，如DNA指纹分析法。选择性核苷酸与(连接)探针上与引物结合序列相邻的核苷酸互补。选择性核苷酸一般不形成(连接)探针上引物结合序列的一部分。含有选择性核苷酸的引物被称为+N引物，其中N代表出现在引物3′末端的选择性寡核苷酸的数目。N优选从A、C、T和G之中选择。

扩增子

“扩增子“一词此处是指连接探针在扩增步骤的产物。术语”扩增子“此处是指扩增的连接探针。连接反应中加入连接酶、连接探针连同一个或多个引物和聚合酶，可将两个靶特异性区段连接并扩增产生扩增子。连接探针、引物、聚合酶和/或其他参数和变量设置产生代表了连接探针的线性扩增的扩增结果。优选的，一个扩增子是代表扩增的连接探针的单体。某些实施例，扩增子包含优选由第一引物和可选的第二引物和位于两者之间的标识子序列组成。本发明的许多实施例将详细说明这一点(图2)。

高通量测序

高通量测序或筛选，通常缩写为HTS(High ThroughoutSequencing)，是一个科学实验的方法，特别是与生物学和化学领域相关。通过结合现代机器人技术和其他专门的实验室硬件，HTS可使研究人员能同时有效筛选大量样品。

优选用高通量测序方法进行测序。这些高通量测序方法在WO03/004690、WO 03/054142、WO 2004/069849、WO 2004/070005、WO2004/070007和WO 2005/003375(都被称之为454生命科学)，在由Seo等人发表在(2004)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101：5488-93上的文章和Helios技术(Solexa，US Genomics)中都有描述，列于此处以供参考。

454技术

在某些实施例中，优选用在WO 03/004690、WO 03/054142、WO2004/069849、WO 2004/070005、WO 2004/070007和WO 2005/003375(都被称之为454生命科学)专利中公开的技术和装置进行测序。这项技术可在一个泳道上对4百万个碱基进行测序，并比其竞争技术快100倍，便宜100倍。该测序技术大致包含5个步骤：1)DNA链的分离和特异性适配子的连接产生单链DNA(ssDNA)文库；2)将ssDNA退火到微珠上，微珠在水—油微型反应器内乳化形成PCR乳液以扩增微珠上的每条ssDNA；3)表面含有扩增的ssDNA分子的微珠的富集和筛选；4)用Pico Titer(TM)平皿沉淀DNA携带微珠；5)通过产生焦磷酸光信号对100,000个孔同时测序。下文将对此方法详细解释。

在一个优选的实施例中，测序包括下列步骤：

(a)退火适合片段到微珠上，每个微珠与一条单一适合片段退火；

(b)在水—油微型反应器内乳化微珠，每个水—油微型反应器包含单一微珠；

(c)将微珠固定在孔内，每孔含有一个微珠；产生一个焦磷酸光信号。

在第一步(a)中，测序适配子连接到文库内的片段上。所述测序适配子包括：至少一个退火到微珠上的“钥匙”区、一个测序引物区和一个PCR引物区。因此可得到适配子片段。在第一步中，适配子片段退火到微珠上，每个微珠与一个适配子片段退火。为了富集适配子片段，加入过量的微珠以保证对于大多数微珠而言(泊松分布)，每个微珠上的单一适配子片段的退火。在下一步，微珠在水—油微型反应器中乳化，每个水—油微型反应器含有一个微珠。水—油微型反应器中的PCR试剂使得PCR在微型反应器中发生。接着，打碎微型反应器，富集包含DNA的微珠(DNA阳性微珠)。在接下来的步骤中。微珠被置于孔内，每孔包含一个微珠。优选地，这些孔是PicoTiter(TM)皿的一部分，能同时对大量片段测序。加入酶携带微珠后，用焦磷酸测序法测定片段的序列。在连续的步骤中，在常规测序试剂存在条件下，用不同的脱氧核糖核苷酸处理，在掺入脱氧核糖核苷酸之后产生光信号，记录光信号。正确核苷酸的掺入产生可检测到的焦磷酸测序信号。本领域所公知的焦磷酸测序技术说明见于网站www.biotagebio.com和www.pyrosequencing.com/section technology。这项技术在WO 03/004690、WO 03/054142、WO 2004/069849、WO2004/070005、WO 2004/07000和WO 2005/003375(都称之为454生命科学)中有进一步的说明。本发明中，优选微珠上带有引物(结合)序列和/或发夹结构区段或其它能与扩增子或连接探针结合的结构(视情况而定)。在其它实施例，用于扩增的探针或引物和能够结合扩增子或连接探针的序列被装到微珠上以使后续的乳液内扩增及测序得以完成。连接探针的测过序的扩增子揭示标识子序列的性质因而能够揭示样品中靶序列的存在或缺如。

Solexa技术

Solexa技术是高通量测序的方法之一，来自英国的Solexa公司(www.solexa.co.uk)，并见于WO0006770、WO0027521、WO0058507、WO0123610、WO0157248、w00157249、WO02061127、WO03016565、WO03048387、WO2004018497、WO2004018493、WO2004050915、WO2004076692、WO2005021786、WO2005047301、WO2005065814、WO2005068656、WO2005068089和WO2005078130。在本质上，该方法从基因组DNA的适配子—连接片段开始。适配子连接的DNA是随机吸附在附着到固体表面密集的引物“坪”上，通常是流动的细胞。这个适配子连接片段的另一端在表面上与一个互补的引物杂交。引物在核苷酸和聚合酶存在的条件下以所谓的固相桥式扩增延伸产生双链片段。固相桥式扩增的变性和循环使得分布在表面上的扩增片段呈密集的丛状分布。在流动细胞中加入的四种不同标记的可逆的终止核苷酸、引物和聚合酶开始测序。经过第一轮的引物延伸，检测标记，记录第一次掺入的碱基类别，封闭的3′末端和荧光团从掺入的碱基上移除。然后第二个碱基的类别以相同的方式检测，以此继续测序。

在本发明中，连接探针或其扩增子，经引物结合序列、引物序列或发夹结构或其两者组合(在一些实施例中)结合到表面上。如概述的那样测序，包括标识子序列和相关的靶序列，该序列存在或缺如得以确定。

在另外的实施例，用此处所述测序方法进行测序，扩增使用的探针或引物可包含特异区段(作为此处描述的引物或引物结合序列的替代物)用来在随后的测序步骤中将连接探针/扩增子结合到表面上。这些区段一般都被描述为关键区段。

在整个说明书、图和附加的权力要求中，用“第一”和“第二”的概念区分检测中用到的探针及其不同组成。“第一”和“第二”的概念此处不用做总和，即当也含有第一种成分时，并不只是被称为第二种成分。为使概念前后一致和易于指代，当这个实施例本身不是由两条探针或两条探针成分组成时也使用这些概念。例如，环形探针只是一条探针，仍旧含有第一和第二靶序列特异性区段。同样地，图IA，第一和第二探针中的任何一个都含有一个标识子序列。把第一探针中的标识子序列称为第一标识子序列，而把第二探针中的标识子序列称为第二标识子序列。第二探针包含标识子序列而第一探针不包含标识子序列的情况下，这个标识子序列在这项应用中是指第二标识子序列，不包含第一标识子序列。

本发明的进一步方面涉及到使用本发明的方法的试剂盒，包含各种此文其他地方所描述的第一、第二和或环形探针。

用常规方法从2个亲本和88个子代中分离DNA。亲本(2×)和子代(4×)双链使用不同的标识子以测试可重复性。用来区分样品或SNP等位基因的标签，至少在2个核苷酸上分别区别于在鉴定样品或等位基因的实验中使用的任何其它标签。始终使用琼脂糖凝胶查验各个步骤的质量。

实施例1

对于每个DNA样品，连接步骤是用Probesets设计检测30个SNP位点，每个位点包含2个等位基因。扩增引物序列基于位于Solexa高通量测序系统表面的杂交序列。特别是P5序列(PBS2)位于与TS2杂交的探针的5′部分。P7序列(PBS1)位于与TS1杂交的探针的3′部分。与P5序列的3′部分邻近的是一个简并的样品鉴定序列(SIS)，它包含一个NNNNN序列。GC二核苷酸锚定序列位于SIS之后。等位基因鉴定可通过定位一个相邻GC发夹结构的3′端的五个碱基的标识子序列而进行。测序引物结合位点(sPBS)的反向互补区在等位基因标识子序列(AIS)之后。

连接混合物使用P5和P7引物序列扩增，其中P5引物在其3′端包含一个样品鉴定序列和一个GC发夹结构。用琼脂糖检测和后续使用葡聚糖柱(Sephadex^tm柱)纯化，查验扩增产量和适当的长度分布。测定浓度，并使浓度标准化，建立“富集池”。对“富集池”进行基于Solexa技术的大规模并行测序。Solexa技术包含桥式扩增与序列测定及其随后的数据分析，以确定亲本及其子代的基因型。

在替代性情况下，连接混合物可以用两步法扩增。第一步是用无样品标识序列的P5和P7引物序列进行扩增。用琼脂糖检测查验产物产量和适当的长度分布。第二步PCR反应用P7引物连同一个P5引物进行扩增，其中P5引物在其3′端含有SIS序列和一个GC发夹结构。用琼脂糖检测查验产物产量和适当的长度分布。使浓度标准化和富集样品。产物用Qiagen柱纯化。

在第二种替代性情况下，基于测序的检测是采用Sanger测序法：把扩增产物克隆进一个细菌质粒，随后进行转化，克隆化PCR扩增产物。分析数据确定基因型。

实施例2

扩增的连接产物的测序是采用Sanger测序法。实验性序列涉及连接步骤；使用不含SIS和GC发夹结构的引物进行首次扩增；使用包含SIS和GC发夹结构的引物进行第二次扩增；第二次扩增产物克隆到细菌质粒中；随后转化进细菌宿主；挑选克隆化的PCR扩增产物及采用Sanger法测序。玉米亲本系B73和Mol7使用上述方法测序。测定200余个扩增的连接产物的序列，为基于测序的单核苷酸多态性检测提供了原则性证明。

选用亲本系B73和Mol7。使用Ligation Probesets设计检测30个SNP位点，为此准备连接产物。用不含SIS和GC发夹结构的引物进行扩增。进行克隆的片段用含有SIS和GC发夹结构部分的引物扩增。用Invitrogen公司的TOPO TA克隆试剂盒进行克隆。将一个单克隆进行PCR扩增用做Sanger法测序的模板片段。在B73和Mol 7中一个27bp的序列标签以不同频率与引物结合位点序列相邻，鉴定这个标签的位置从而鉴定基于测序的连接标志。

基于测序的连接标志的数据与SNPWave标志评分进行比较，SNPWave标志评分用基于长度检测的常规SNPWave指纹印记法得出。用Sanger测序法证明了基于测序的连接标志检测的可行性。其中评价较小数目的连接标志是使用基于测序的检测而不是用常规的板坯凝胶。然而，采用大规模并行测序技术如Solexa技术可以很容易地加大测序规模。标志物数据之间的比较显示，基于测序的检测和板坯凝胶检测之间具有相同的分离模式。

Claims

1、高通量检测一个或多个样品中的一个或多个靶核苷酸序列的方法。该方法包括以下步骤：

(g)为每个靶核苷酸序列提供第一探针和第二探针，其中第一探针包括位于其3′端的第一靶序列特异区段、非互补于靶核苷酸序列的第一标签区段和第一引物结合序列；第二探针包括位于其5′端的第二靶序列特异区段、非互补于靶核苷酸序列的第二标签区段和第二引物结合序列，其中第一或第二标签区段包含或两者都包含标识子序列，该标识子序列位于各自的第一或第二引物结合序列和各自的第一或第二靶序列特异区段之间，

(h)使第一和第二探针的第一和第二靶序列特异区段分别杂交到靶序列上，

(i)当第一和第二探针上各自的靶序列特异区段杂交到靶序列上基本相邻的部分时，连接第一和第二探针形成连接探针，

(j)可选地，用第一和第二引物扩增连接探针产生扩增子，

(k)对连接探针或其扩增子用高通量测序技术进行测序，以确定连接探针或其扩增子的至少部分核苷酸序列，至少包括其标识子序列，

(1)通过(e)步骤测定核苷酸序列中有无标识子序列，鉴定样品中的靶核苷酸序列的存在。

2、根据权利要求1的方法，其中，第一和第二探针被环形探针取代。

3、根据权利要求1的方法，其中，第一和第二探针都是钥-锁型探针，每个探针都含有发夹结构部分。

4、根据权利要求1的方法，其中，第一探针被包含第一靶序列特异区段不包含第一引物结合序列的第一探针取代；其中还提供复合探针，该复合探针含有能与第一探针上第一靶序列特异性区段杂交或部分杂交的区段和一个引物结合区段，复合探针的延伸产生可扩增的延长型复合探针。

5、根据权利要求1的方法，其中，第一探针包含第一靶序列特异区段，不包含引物结合序列，并在远离连接位点的位置带有核酸外切酶抗性区段；其中，第二探针包含第二靶序列特异区段和第二标签区段，第二标签区段包含第一和第二引物结合序列和间断分布的标识子序列。

6、根据权利要求1的方法，其中，第一和第二探针退火到靶序列上的非相邻区段上，第三探针退火到靶序列上与第一和第二靶序列特异区段相邻的位置和在第一和第二靶序列特异区段之间的位置。

7、根据权利要求1的方法，其中，第一和第二探针退火到靶序列上的非相邻区段上，提供聚合酶和核苷酸填充第一和第二探针之间的缝隙结构。

8、根据权利要求1至7的方法，其中，采用高通量测序方式进行测序。

9、根据权利要求8的方法，其中，高通量测序在固相支持物上进行。

10、根据权利要求8的方法，其中，高通量测序基于合成-测序技术。

11、根据权利要求8的方法，其中，高通量测序的步骤包括：

-连接探针或扩增子退火到微珠上，每个微珠与单一连接探针或扩增子退火；

-微珠在微型反应器内乳化，每个水-油微型反应器含有单一微珠；

-在微珠表面进行乳化PCR反应以扩增连接探针或扩增子；

-可选择的，筛选或者富集含有扩增了的待测序-适配子-连接片段；

-把微珠装入微孔，每个微孔含有单一微珠；

-产生焦磷酸信号。

12、根据权利要求8的方法，其中，高通量测序的步骤包括：

-在水-油微型反应器内使微珠乳化，每个水-油微型反应器含有单一微珠；

-在微珠表面进行乳化PCR反应以扩增连接探针或扩增子；

-可选择的，筛选/富集含有扩增了的测序-适配子-连接片段；

-把微珠装入微孔，每个微孔含有一个单一微珠；

-使用标记的可逆终止核苷酸测定扩增的连接探针或扩增子的核苷酸序列。

13、根据权利要求8的方法，其中，高通量测序的步骤包括：

-连接探针或其扩增子退火到分别含有第一和第二引物或第一和第二引物结合序列的表面上，

-分别进行桥式扩增以产生扩增的连接探针丛或其扩增子丛；

14、根据权利要求8的方法，其中，高通量测序的步骤包括：

-进行桥式扩增以产生扩增的连接探针丛或扩增子丛，

-产生焦磷酸光信号。

15、根据权利要求17的方法，其中，标识子是样品标识子。

16、根据权利要求1的方法，其中，标识子是基因座位/等位基因联合标识子。

17、根据权利要求17的方法，其中，标识子包括样品标识子和基因座位或者等位基因标识子。

18、根据权利要求1的方法，其中，标识子是1—30bp，优选2—16bp，更优选3—8bp，最优选是4—6bp。

19、根据权利要求1的方法，其中，引物包括3′锚定序列。

20、根据权利要求1的方法，其中，标识子不包含2个或更多的相同连续碱基。

21、根据权利要求1的方法，其中，对于两个或两个以上的样品组合，或对于两个或两个以上的基因座位或者等位基因组合，相应的标识子包含至少两种不同的核苷酸。

22、根据权利要求1的方法，其中，对于两个或两个以上的样品组合，或对于两个或两个以上的基因座位或者等位基因组合，标识子序列用于对样品进行基因分型以分成一个或多个序列和/或多态性，如SNPs和/或indels。

23、高通量测序在使用基于连接反应的检测方法确定一个或多个样品中一个或多个靶序列的存在或缺如中的用途。

24、包含如权利要求1、3、4、5、6或7中所述的第一探针和/或第二探针的试剂盒。

25、包含环形探针的试剂盒。

26、根据权利要求24所述的试剂盒，其进一步包含复合探针。

27、根据权利要求24所述的试剂盒，其进一步包含第三探针。