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CN101316937A - 多核苷酸扩增 - Google Patents

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CN101316937A CNA2006800447235A CN200680044723A CN101316937A CN 101316937 A CN101316937 A CN 101316937A CN A2006800447235 A CNA2006800447235 A CN A2006800447235A CN 200680044723 A CN200680044723 A CN 200680044723A CN 101316937 A CN101316937 A CN 101316937A
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Abstract

本发明提供扩增样品中一群多核苷酸分子的方法，其特征在于包括下述步骤：a)获取样品或RNA并反转录整条RNA分子从而创制全长cDNA或获取全长cDNA的样品，b)用多核苷酸尾在3’端后在转录的cDNA的3’端加尾，c)用一对引物扩增cDNA，其中第一(3’)引物对cDNA的5’端特异，第二(51)引物对多核苷酸尾的上游部分和cDNA的3’多核苷酸尾上游的最近的1到10个核苷酸特异。

Description

多核苷酸扩增
技术领域
本发明涉及特定多核苷酸扩增的领域。
背景技术
为了理解生命本身呈现的不同状态的因果关系，人们需要发现导致该因果关系的因素和过程。在这个探索中的一个中心因素是基因组，在基因组中信息通过以高度保守方式增殖而繁殖的方式储存。在执行包含在基因组中的信息时，DNA被转录成RNA并进而翻译成蛋白质。对基因组(DNA)、转录组(RNA)和蛋白质组(蛋白质)的研究近年来已经大大地促进了我们对生命的分子基础的理解。
存在大量的体外比较RNA样品的可能性。早期的方法是差示杂交或差示筛选的方法(Rebagliati et al.，1985)。它涉及从cDNA文库中少量地挑选随机克隆(或序列)并检查它们在RNA样品中不同浓度中的存在。必须投入巨大的劳动量来鉴定单个的差异表达的转录物，因为认为它们的总数低于1％。已经提出减除杂交法来通过在筛选前富集差异表达的转录物克服这个问题。通过引入高密度微阵列做出了处理丰度问题的另一种途径。在使用微阵列技术时，与目标基因的RNA相符，点样100s到1000s的cDNA并将其结合到表面。它们通常来源于测序的EST文库并且-假如不是多余的-能覆盖同配备到膜上的点一样多的转录物。简言之，将从目标细胞或组织抽提的RNA进行标记，例如在反转录时，并杂交到这些微阵列上。然后能比较在两个或更多个RNA制备物间的相应点的信号强度。即使该技术已经产生了大量的数据，所有这些杂交技术都存在两个主要的缺点。其中一个是交叉杂交。这意味着，杂交时两条DNA分子的整条链不必都是互补的。因此，这为同微阵列的点杂交(结合)的分子的鉴定引入了错读。第二点，人们只能比较已经点样的分子，这限制了对存在于用来产生微阵列的文库中的序列的寻找。
在1992年引入了今天通常称为“差异显示”(DD)(Liang et al.，1992；Welsh et al.，1992)的可选方法。在DD中，在反转录(RT)过程中，首先将样品的总mRNA群体分成确定的cDNA群(pools)。通过用一个、两个或X个碱基锚定的寡寡脱氧胸苷酸引物启动RT，将样品分割成3、12或3X4x-1个部分而完成该方法。这些锚点碱基(anchorbase)同紧邻聚腺苷酸尾上游的碱基杂交。因此，选择待反转录的mRNA分子其碱基紧邻聚腺苷酸尾上游的序列同该引物的锚点碱基互补。在随后的聚合酶链反应(PCR)中，使用随机引物和锚定引物来扩增确定的cDNA群。在通过大小分离它们的胶上将相应的群并排跑胶。以带的强度差异反映表达水平的差异。将目标带从胶上切下，再扩增并测序。最初的DD的一个缺点是，它使用随机引物进行扩增。这样的鸟枪法能通过覆盖转录组多次而达到仅是统计学上的全转录组覆盖。因此，在展示中必须将某些RNA分子提呈多次而其他的RNA分子可能根本不用提呈。
近来引入了以更系统的方式扩增RNA群的方法((Prashar et al.，1996；Prashar et al.，1999)。大体而言，涉及三个额外的步骤。在第一链cDNA合成后，进行第二链合成来得到能用限制酶切割的双链DNA。在第三个步骤中，将接头连接到片段的5’端。然后用一个与5’接头序列互补的引物和用于RT的锚引物PCR扩增这些片段。该文作者评价，每一个6-碱基切割限制酶从mRNA的3’聚腺苷酸尾的50和400碱基间的位置切割8％的cDNA。因此，为了接近转录组的彻底覆盖，必需超过12种的限制酶。Matz et al.(1997)用利用了PCR抑制效应(suppression effect)优点的“有序差异显示”的引入描述了该方法多少更巧妙的变化。
然而，除了仅在一个或另一个水平上统计学上覆盖了转录组外，上面提及的所有DD方法都具有另一个缺点。它们仅能为研究人员提供差异表达的部分mRNA序列。在这些DD技术的下游，人们仍将必须筛选cDNA文库或可获得的全长克隆的在线序列库或使用能从部分已知的mRNA序列如RACE发现5’和3’序列的方法学(Frohman et al.，1988)。甚至鉴定这样的全长转录物也将不能提供确定性，至少在发现的mRNA是产生信号的mRNA的真核生物中是如此，因为在真核生物中，主要的基因组复杂性的贡献因素是剪切。因此，在展示上发现的序列能是多个剪切变种共有的。进一步的，基因的不同剪切变种可能具有不同的功能，这使知晓正确的产生信号的剪切变种是高度渴望的。
发明内容
本发明的一个目的是提供能以样品中存在的所有mRNA分子的全覆盖扩增(富集)确定的全长转录物的亚群的方法。
本发明现在提供了扩增样品中一群(a pool of)多核苷酸分子的方法，其特征在于包括下述步骤：
a)获取(或提供)RNA样品并反转录整条RNA分子从而创立全长cDNA或获取(或提供)全长cDNA的样品，
b)用多核苷酸尾在3’端后给转录的cDNA的3’端加尾，
c)用一对引物扩增cDNA，其中第一(3’)引物对cDNA的5’端特异，第二(5’)引物对多核苷酸尾的上游部分和cDNA的3’多核苷酸尾上游的最近的1到10个核苷酸(即最近的1或2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸)，优选1到5个核苷酸，更优选3到5个核苷酸。当然，第二引物也能包含尾特异区域(互补物)上游的1到10个核苷酸更上游的更特异的核苷酸。
能通过下面公开的反转录方法或本领域已知方法创立全长cDNA。本领域技术人员公知大量的产生全长cDNA的方法，例如，在专利US5,962,271和US5,962,272中公开的。也能将这样产生的cDNA用作将全长cDNA混合集中成不同部分的起始物质。这些方法使用了反转录酶的模板开关能力来以帽子依赖的方式将确定的序列加入到cDNA的5’端。随后的扩增所需的引物将因而具有同因此产生的cDNA的3’端互补的部分并将确定cDNA的什么部分将通过扩增的mRNA分子的5’端确定的多个，例如1到10个额外的碱基进行扩增。
因此，优选地，通过反转录酶的模板开关能力将尾加到cDNA，优选地，以帽子依赖的方式，并且，第二扩增引物(5’引物)包含同因此加上的尾和寡脱氧胞苷酸和寡脱氧胞苷酸序列上游的1到10个核苷酸互补的核苷酸。
如本文所用，术语“反转录酶”涉及任何具有反转录酶活性并能用来从RNA合成cDNA的聚合酶。
如本文所用，术语“全长cDNA”定义为包括同RNA序列从RNA的第一个碱基到最后一个碱基互补的序列的DNA。同例如最多的真核生物mRNA的情况一样，在具有帽子和/或聚腺苷酸尾的RNA分子的情况下，将“全长cDNA”定义为包括同RNA从RNA的帽子，例如RNA7-甲基鸟苷帽子或RNA m7G帽子后的第一个碱基到用作模板的RNA的聚腺苷酸尾前的最后一个碱基互补的序列的DNA。
如本文所用，将术语“全长扩增产物”定义为包括同RNA从RNA第一个碱基到最后一个碱基互补的序列的DNA。同例如最多的真核生物mRNA的情况一样，在具有帽子和/或聚腺苷酸尾的RNA分子的情况下，将“全长扩增产物”定义为包括同RNA从RNA帽子后的第一个碱基到用作模板的RNA的聚腺苷酸尾前的最后一个碱基互补的序列的DNA。
本发明的中心元素是能以全长RNA分子的5’和/或3’端确定的亚群代表全长RNA分子的事实。基本上，这意味着，在利用本领域已知的任何方式产生全长cDNA后，能用5’和/或3’序列来公式化一套具有下述质量的引物组合(引物矩阵(primer matrix))。
1)仅利用一个引物对在缺少引导错误(miss priming)下扩增每一个cDNA。因此，在没有重复的情况下，能达到完全的转录组覆盖。
2)在这样确定的群内的每一个cDNA序列将编码从相应的RNA翻译而来的蛋白的全部氨基酸序列，并且也
3)确定在它的基因上的转录起始位点(能有从能有不同转录起始位点的同一基因转录的不同的RNA分子)。
在将质量(1)同最初的DD比较时，人们能说，其中随机引物具有不同特定cDNA互补或互补一次或互补超过一次的性质。因此，能根本不或一次或多于一次的代表每一个cDNA。当使用可选的包括限制酶的方法学时，每一种限制酶要么根本不要么一次要么多于一次切割特定的cDNA。因此，永远也不能达到真正彻底的转录组覆盖。并且，增加mRNA在展示中被代表至少一次的概率将意味着增加重复。
使用截至目前的差异显示技术而不使用诸如RACE的下游技术也不能达到质量(2)和(3)。
本发明通过差异表达的RNA分子的定性和定量检测提供扩增和分析转录组的方法。根据本发明的技术是有组织的全长表达展示。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法包含对RNA或mRNA的(优选地3’聚腺苷酸)尾和用于反转录的(聚腺苷酸)尾上游的最近的1到10个核苷酸，优选地1到5个核苷酸，更优选地3到5个核苷酸特异的引物和/或一个对cDNA的相应的(5’聚胸苷酸)序列特异的扩增引物，该序列对RNA或mRNA的(3’聚腺苷酸)尾和cDNA的相应的(5’聚胸苷酸)序列下游的最近的的1到10个核苷酸，优选1到5个核苷酸，更优选3到5个核苷酸互补。相应地，除上面公开的选择性3’引物外，也能使用选择性5’引物来增加引物对的选择能力并因而增加被最接近末端序列锚点的特定核苷酸所确定的cDNA群的数目。
优选地，用来反转录的引物包含脱氧核苷酸。
一般地，贯穿本说明书的引物能是任何核苷酸，例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸。尽管在多数情况下优选脱氧核糖核苷酸，核糖核苷酸引物也是可行的。因此，在例如在下面的实施例中给出的给定引物中的脱氧核糖核苷酸可能会由它的核糖核苷酸类似物所取代(例如脱氧鸟苷被鸟苷、脱氧腺苷被腺苷、脱氧胞苷被胞苷、脱氧胸苷被胸苷或尿苷)或被其他核苷酸类似物所取代。
优选地，使用末端转移酶进行3’端的加尾。-尽管也公开了其他的加尾方法，像能是例如确定的随机序列的尾序列的连接。末端转移酶能加上一定数目的核苷酸，优选地，一律选自一种核苷酸类型。也能使用任何其他的加上一个尾序列的加尾方法，例如，通过使用反转录酶的模板开关能力或通过连接能一律是一种类型核苷酸或各种核苷酸的尾序列。这样一个尾优选地是范围在5和500个核苷酸间的，更优选地少于400、少于300、少于200、少于100、少于50或少于30个核苷酸的序列。
在优选的实施方案中，利用PCR进行使用选择性引物的cDNA序列的扩增。PCR或聚合酶链反应是本领域公知的得到良好建立的使用聚合酶，核苷酸三磷酸酶，引物，缓冲物质和例如Mg离子的辅因子和用于杂交，聚合和解链或链分离的温度设计扩增多核苷酸的技术。
优选地，用于扩增的第一和/或第二引物包含脱氧核苷酸。
在优选的实施方案中，根据本发明的方法包含根据其长度分离扩增产物的额外步骤。创立的多核苷酸的分离为每一群提供了选择性聚合后的可能的鉴定、分离和序列测定，其事实上允许了这个优选实施方案的显著优点。
优选地，利用凝胶电泳进行分离，优选地，琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯凝胶电泳或毛细管电泳。
更优选地，根据本发明的方法包含额外的测定扩增产物的同一性或序列的步骤。例如，能用凝胶测序，例如使用双脱氧核苷酸的PCR或在自动测序仪中进行序列测定。
优选地，利用在芯片上的自动程序进行扩增产物的同一性和序列测定步骤。
用于反转录的样品优选地含有来源于试样的总RNA或mRNA，优选地，纯化的RNA或mRNA。总RNA包括但不限于，蛋白质编码RNA也称为编码RNA，例如信使RNA(mRNA)和非蛋白编码RNA(非编码RNA或ncRNA)，例如核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、干涉小RNA(siRNA)、piwi-interacting RNA(piRNA)、核内小RNA(snRNA)和核仁小RNA(snoRNA)。能按照本发明范围内的方法对这些分类的每一种，单独的或同一个或更多个分类共同地进行分析。
优选地，利用使用例如寡脱氧胸苷酸-纤维素柱的亲和层析纯化这些RNA分子。因此，能预选具有聚腺苷酸的mRNA。
本发明方法优选，在高严谨条件下进行反转录来增加可在一个聚合反应中用作一群锚定引物的锚定引物以及不同聚合反应的分离引物的选择性。在本发明中，短语“严谨杂交条件”或“严谨条件”指在该条件下本发明引物将同它的目标序列杂交但仅同最小数目的其他序列杂交的条件。例如，能通过使用单独的高退火温度或高退火温度结合例如二甲基亚砜(DMSO)、甲酰胺、氯化四甲铵(TMAC)和乙二酸四甲铵(TMAO)的化学添加物获得高严谨性(Kovarova et al.2000)。在Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory，N.Y.1989)和Ausubel et al.，Current Protocols inMolecular Biology，Greene Publishing Assoc，and Wiley and Sons，N.Y.1994中提供了高严谨杂交条件的例子。在标准的PCR条件中，经常选择的退火温度是低于引物解链温度5摄氏度的温度。保持反应条件的不变，解链温度依次主要依赖于寡核苷酸的长度和GC含量，解链温度可以通过本领域公知的普通方法进行计算。在更严谨的条件下，将退火温度提高到高于在标准条件中使用的温度来降低引导错误的可能性。能将退火温度提高到仍能允许足够的扩增的启动事件发生的温度。例如，假如引物具有50℃的解链温度，则应在标准条件中选择45℃的退火温度，因此，50℃的退火温度将比45℃更严谨。例如，dT16VN类型的引物在标准RT条件下能导致强的引导错误，因而降低了合成的cDNA群的特异性(Mizuno et al.，1999)。已经报道了AMV和HIV-1反转录酶的类似结果。能通过在退火和反转录时增加温度降低引物混杂。为了这个目标，能使用显示反转录酶活性的热稳定酶或通过加入例如海藻糖的热保护剂到反应中热保护反转录酶(Carninci et al.，1998)。使用海藻糖的增加的好处是全长cDNA的量增加了(Carninci et al.，1998)。Spiess et al.(2002)也公开了这个性质。此外，Spiess显示，甜菜碱也能增加全长cDNA的量以及甜菜碱和海藻糖的结合给出了最好的结果(Spiess et al.，2002)。这样的RT能来源于莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)(US4,943,531A)或在更优选的实施方案中，缺少RNA酶H活性的M-MLV(US5,405,776A)。另一种提高引物特异性的可能性是来包括如Mizuno et al.(1999)公开的竞争性寡核苷酸阻滞剂。因此，本发明也包括一种方法，其中反转录和/或扩增的过程使用了高严谨条件。
优选地，在根据本发明的方法中，通过利用海藻糖、甜菜碱、氯化四甲铵、乙二酸四甲铵、甲酰胺和寡-阻滞剂或通过在聚合酶链反应过程中使用二甲基亚砜增加反转录和/或扩增反应，特别是聚合酶链反应的选择性来降低引导错误的发生并增加全长cDNA的量。
因为所有的反转录酶都具有高错误率，优选在反应中包括校正读码活性。通过它们的3’→5’核酸外切酶功能具有这样的活性的酶是，例如PFU、Ultma、Vent、Deep Vent、PWO和Tli的聚合酶，或E.coli核酸外切酶III。除了降低在RT过程中引入到cDNA中的错误外，包括校正读码活性也能增强全长cDNA合成(Hawkins，2003)。
进一步优选的，也将这样的校正读码活性包括在该方法的PCR步骤。在一方面，这将降低PCR过程中引入到序列中的错误也扩大了能被扩增的cDNA分子的大小(Barnes，1994)。因为这样的3’→5’核酸外切酶活性能降解反应中使用的引物，优选保护引物使不降解，例如，通过在引物的3’端引入磷硫酰键(Skerra，1992；Di Giusto，2004)或通过使用LNAs(锁核酸)。
在反转录和/或PCR时，优选使用具有高持续合成能力和保真度的酶或酶的组合。
本发明提供了全转录组覆盖和至少基本无重复的方法。然而，例如引导错误和聚合酶停止的系统性质能影响结果。因此，长mRNA的覆盖依赖于使用的酶。用于长PCR方法的校正读码酶在理想条件下为给定的酶和方法参数(例如长扩增时间)扩大了转录组覆盖的范围到至少99％。能通过例如严谨性和校对读码活性最小化的退火错误(misanealing)可能导致覆盖的转录组的受限的重复。
能被展示的RNA分子的最大长度特别地依赖于反转录和扩增反应如PCR的质量。基本地，长PCR能扩增长达至少35kb的DNA(Barnes，1994)，RT-PCR能长达至少20kb(Thiel et al.，1997)，因此能展示所有转录物的至少99.9％。然而，存在例外的长RNA分子，例如具有大约80kb的长度的titin(NCBI登入号X90568)，并且即使理论上是可展示的，但由于实际的原因，人们将不可能调节这样的转录物的展示。
优选地，通过源自莫洛尼鼠白细胞病毒、AMV、HIV-1、HIV-2的反转录酶进行反转录，其中这些RT的RNA酶H活性存在或不存在或被降低。能通过具有反转录酶活性的任何酶，例如在存在Mn2+时显示了反转录酶活性的Tth DNA聚合酶进行反转录。此外，在反转录步骤后，RNA能被降解，例如，被例如RNA酶的RNA降解酶，来促进长PCR。
优选地，对于设计的反转录和扩增，能使用不依赖于热循环步骤，即能等温聚合的酶。
进一步优选地，用于反转录的引物在它们的3’端，优选地在末端脱氧胸苷序列的最后脱氧胸苷上游的位置2到4间的一个或更多个碱基，优选地1、2、3、4或5个碱基中具有摆动(wobble)来进一步增加特异性。
如本文所用，术语“引物”指具有相同序列的寡核苷酸的混合物。
如本文所用，术语“摆动引物”(wobble primer)指具有相同序列的寡核苷酸的混合物，除了是“摆动”的部分的碱基外。
如本文所用，术语“摆动”指引物群中以两个、三个或四个不同的核苷酸的混合物存在的碱基。
例如，摆动引物能包含序列ACACACN的寡核苷酸，其中N称为摆动且N是腺苷、胞苷、胸苷或鸟苷。然后这个摆动引物可能包含序列ACACACA、ACACACC、ACACACT和ACACACG的核苷酸的混合物。
当在摆动引物中使用N核苷酸作为混合物(N是脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷的混合物)时，能更换使用具有通用碱基的核苷酸，例如脱氧肌苷、3-硝基吡咯2’-脱氧核苷(3-nitropyrrole 2′-deoxynucloside)和5-硝基吲哚2’-脱氧核苷。通用碱基将同任何核苷酸(脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷和脱氧胸苷)碱基配对。
因此，根据本发明，用于反转录或扩增的引物优选地在它们的3’-端的一个或两个碱基中，优选在最后的核苷酸的上游的位置2和4间具有摆动碱基替换，例如，脱氧胸苷可能被脱氧鸟苷、脱氧腺苷、脱氧胞苷替换，反之亦然，优选地，5’RT引物和3’扩增引物(用于5’-＞3’链合成)具有脱氧胸苷，5’扩增引物具有脱氧腺苷。在该方法的PCR步骤，能使用这样的“摆动”引物来增加待扩增cDNA分子的5’和3’端的特异性。
也能使用摆动来锚定同起始RNA的(例如聚腺苷酸)尾互补的引物到紧邻该尾上游的碱基。在这种情况下，能通过对起始RNA的帽子后的碱基对应的碱基特异的引物获得到不同群的选择。能将相同的推理应用到cDNA的3’端，其中摆动能锚定引物到相应于起始RNA帽子下游的碱基的碱基。因此，通过对相应于紧邻起始RNA的(例如聚腺苷酸)尾上游的碱基的碱基特异的引物将能完成到不同群的选择。
更进一步优选的是根据本发明的方法，其中摆动碱基代表能同任何正规核苷酸如脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷或脱氧胸苷碱基配对的通用碱基的替换，优选脱氧肌苷、3-硝基吡咯2’-脱氧核苷和5-硝基吲哚2’-脱氧核苷。
在优选的实施方案中，能通过使用其3’端抗外切核酸酶的引物(例如通过引入磷硫酰修饰或锁核酸)与3’-＞5’外切核酸酶功能，这样的活性是例如Pfu DNA聚合酶的性质的组合增强扩增的cDNA的特异性。假如引物3’端的前8个碱基中发生一个或多个不匹配，这为扩增提供了“关闭”(off switch)(Yang et al.，2005)。由于引物3’最初端上的碱基是区分本发明提交的方法中的cDNA群的那些碱基，优选地，将这样的“关闭”引入来终止同cDNA错配的引物的延长，从而进一步增强特异性。优选地，在本发明方法中使用了对引物和RNA或cDNA的核苷酸间的错配敏感的聚合酶(在反转录期间或在扩增期间)，并且聚合酶不扩增错配的抗外切核酸酶的引物，其中抗外切核酸酶的引物是优选的，特别优选通过磷硫酰修饰的或锁核酸。
在优选的实施方案中，反转录使用的引物包括寡脱氧胸苷酸序列或没有锚点的尾互补序列。因为特异性RNA的选择在cDNA水平经由上面公开的扩增步骤发生，在RT水平的(锚点的)特异性不是必需的。当然，应当避免引导错误，特别是在(寡胸苷酸)引物同RNA的(聚腺苷酸)尾序列的上游序列对齐的地方。通过使用严谨条件和/或使用具有校正读码性质的酶可避免引导错误。优选地，依赖于使用的引物的解链温度，RT过程中的退火温度介于30到50℃。
即使使用严谨条件如应用更高的退火温度、摆动引物和寡-封堵剂能降低反转录(RT)过程中的引导错误事件，优选的解决方法是在RT过程中不要分成不同的群。因为反转录酶反应比扩增反应(例如PCR反应)允许更多的待延伸的错误引导序列，最优选的是在扩增反应过程中完成到群的分离。这也将每个待展示样品必需的RT反应降低到一个。
在优选的实施方案中，能更进一步促进全长cDNA的产生。在非最佳条件下，反转录酶可能在到达RNA分子的5’端前终止聚合和/或从RNA链上脱落。一般地，这归因于未解链的以及聚合酶不能横过的二级结构。因此，也产生部分的cDNA。为了降低这样的转录物干扰随后的(PCR)扩增的可能性，人们可以利用反转录酶的内在能力来加上少量(Mn2+和Mg2+依赖的1-6个核苷酸，Schmidt et al.，1975)脱氧胞苷，一旦它到达mRNA分子的5’帽子端(Clark，1988)。同没有帽子结构的mRNA相比，帽子(Furuichi et al.，1975)结构巨大地增加了RT加上非模板核苷酸的能力。能使用这个能力来进一步富集全长cDNA。在随后的PCR反应中，能选择具有通过在5’引物内在互补位置引入脱氧鸟苷核苷酸而存在的这些胞苷的cDNA。在这样的情况下，能用除脱氧胞苷外的任何核苷酸完成加尾，优选用脱氧胸苷或脱氧腺苷。然后，将选择具有加入到它们的5’端的三个胞苷的cDNA的5’PCR引物是dTxdGdGdGHNy或dAxdGdGdGHNy或dCxdGdGdGHNy；H能是脱氧腺苷、脱氧胞苷或脱氧胸苷。
在优选的实施方案中，在反转录过程中，依赖于模板RNA或mRNA的5’帽子，根据本发明的方法包括具有寡脱氧胞苷酸的3’序列的cDNA的产生，优选具有长度为1到6个脱氧胞苷的核苷酸。
优选地，通过在反转录过程中加入Mn2+离子来增加反转录酶产生寡脱氧胞苷酸的3’序列的能力。能通过如在Schmidt et al.，1999中公开的方法在RT反应中引入Mn离子增加加入的核苷酸数目。因此，在优选的的实施方案中，在RT反应中引入Mn离子来以帽子依赖的方式在cDNA的3’端大量增加脱氧胞苷的非模板增加。随后，为了允许帽子依赖的脱氧胞苷的选择用除脱氧胞苷外的任何核苷酸进行加尾。能通过在这个过程中提供恰如所需的核苷酸完成加尾过程中的加入核苷酸的选择。因此，一个用于(PCR)扩增的引物能具有通用的公式dPxdGyHNZ；Px代表同尾互补的核苷酸；dG是脱氧鸟甘酸，y是0和10间的整数，优选1和5间的，更优选3和5间的；H能是脱氧腺苷或脱氧胞苷或脱氧胸苷；以及N是核苷酸序列，它的数目独立地选自脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷或脱氧胸苷；z是0和10间的整数，优选0和5间的。
在优选的实施方案中，使用帽子依赖的寡脱氧胞苷酸的3’序列来通过在扩增过程中使用对寡脱氧胞苷酸序列特异的第二引物分离完全转录的cDNA。通过使用上面公开的引物能完成这个步骤。
优选地，用特征为缺少脱氧胞苷的多核苷酸序列进行cDNA的3’端加尾。
更优选的用于扩增反应的DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶、TflDNA聚合酶、aTaq DNA聚合酶、测序酶或Klentaq。
在特别的实施方案中，使用具有校正读码活性的酶，在扩增反应中使用优选自PFU、Ultma、Vent、Deep Vent、PWO和Tli聚合酶和E.coli外切核酸酶III的酶。除聚合酶外，能使用这样的酶，优选地在比聚合酶浓度更低的浓度下，或，假如它本身是聚合酶。具有校正读码活性的聚合酶在DNA扩增过程中阻止了终止并确保了具有显著降低的错误的长转录物。优选地，将具有校正读码能力的这样的酶与上面的聚合酶组合使用。
在更优选的实施方案中，用于扩增反应，优选聚合酶链反应的引物的特征是通用公式dPxdGyHNz，其中Px代表同例如通过末端转移酶或通过反转录酶的模板开关性质或通过任何其它方式加入到cDNA的3’端的尾互补的核苷酸，dG是脱氧鸟甘酸，y是包括0的整数，优选2和5间的，H是脱氧胸苷或脱氧腺苷或脱氧胞苷，N是具有长度Z的核苷酸序列，其中它的成员核苷酸独立地选自脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷或脱氧胸苷，z是0和10间的整数，优选0和5间的。
用于RT和PCR的引物的5’端也能锚定到允许进行RT和PCR的任何序列上。5’和3’PCR引物可能具有不同的解链温度，可能通过在一个或两个引物中加入锚点平衡引物对的解链温度而最佳化PCR条件。对于某些下游应用，加入例如能启动RNA聚合酶转录(例如T7或T3)的启动子或引入限制性位点的特定序列也可能具有益处。
在最优选的实施方案中，通过PCR进行扩增并且PCR引物包含锚定序列，其允许在cDNA的3’或5’寡核苷酸末端序列的末端合适地布局。
优选地，扩增引物或反转录引物包含RNA聚合酶的启动子。这个可选的特点允许cDNA和它的PCR产物的转录。
优选地，启动子通过T7、T3或SP6RNA聚合酶增强转录。
能使用本领域已知的能使它们被检测到的任何报告基团标记引物以及PCR产物。报告基团的例子包括荧光、化学发光或放射性同位素和其它本领域已知的报告基团。能使用能被例如荧光测量、光发射测量、闪烁计数和本领域已知的其它方式的技术检测的任何报告基团。
相应地，在本发明的优选的实施方案中通过报告基团标记扩增引物和/或扩增产物，优选荧光标记、化学发光标记或反射性同位素。优选地，使用这些报告基团来检测DNA。
近来，研究显示，在转录过程中，至少某些真核生物如拟南芥(Jinet al.，2004)能将随机核苷酸加到RNA分子的紧邻聚腺苷酸尾前的3’端，在大多数情况下是一个或两个。甚至是在某些基因中，这样的核苷酸加入是异原的。因此，通过使用一套在反转录过程中区分聚腺苷酸上游的第一个和/或第二个碱基的引物，mRNA种类到cDNA的某些群中的目标混合集中对某些转录物将是失败的。然而，通过使用这些随机加上的针对定义组分的引物的核苷酸的上游的核苷酸能获得更高度的混合集中。优选的用于反转录和PCR扩增的同聚腺苷酸尾互补并选择这些加入物上面的碱基的引物具有下述通用结构dTxVNyMz，其中dT描述了具有X重复的脱氧胸苷；V和N是摆动碱基，其中V是脱氧腺苷、脱氧胞苷或脱氧鸟苷；N是每一个成员独立选择的脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷或脱氧胸苷的序列；y是等于或大于0的整数，优选1和5间的，并且M是脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷或脱氧胸苷；z是大于1的整数，优选1和10间的。在这样的引物中，Mz将指定要扩增的cDNA群。因为即使对一个特定的转录物，在多聚腺苷酸化前加到RNA分子上的核苷酸的数目也可能变化，引物能是寡核苷酸的混合物，其中N中的y的量是不同的。额外的好处是，为了使聚合酶能延伸链，摆动后的碱基的正确杂交的压力将强烈增加，因此，降低了定义将被扩增的部分的碱基的引导错误，从而增加了特异性。
在根据本发明的优选的方法中，将人工核苷酸，优选地一到三个核苷酸在转录后但在(例如聚腺苷酸)尾加入前加到RNA或mRNA的3’端，并且反转录和/或PCR的引物包含具有相应于人工序列的摆动序列。
能通过不使用RT酶的3’(脱氧胞苷)非模板化加载功能公式化本发明的不特定选择全长cDNA的简化版本。在正常RT条件下仍有部分未加上脱氧胞苷的全长cDNA。能按公开的方法使用加尾和PCR来选择性扩增cDNA的群。每一cDNA仍将在恰好一个群中存在。然而，存在的同全长RNA分子对应的PCR产物的范围仅由RT反应的质量决定。由于人们选择了进行全长cDNA拷贝的PCR反应，多于一个的cDNA分子可能引起代表单个RNA分子的PCR产物，从而引入多余。每个RNA分子仍仅被代表一次。通过使用有助于全长反转录的方法，如上面公开的加入海藻糖和/或甜菜碱和/或增加温度能最小化多余度。尽管在这个实施方案中可能不废止多余，每一个RNA分子仍将仅被提呈一次。同其他的仅能在统计学上达到对某些mRNA分子的代表的DD技术相比，这是一个进步。
也存在不具有聚腺苷酸尾和帽子结构的RNA分子种类。然而，这样的RNA分子也具有能在随后的扩增中用来富集定义的本发明的目的组分的5’和3’最初末端。
具有或不具有帽子和具有或不具有聚腺苷酸尾的RNA的例子是非蛋白编码RNA(ncRNA)如核糖体RNA(rRNA)、转移RNA(tRNA)、微小RNA(miRNA)、干涉小RNA(siRNA)、piwi-interacting RNA(piRNA)和核内小RNA(snRNA)。
在不具有聚腺苷酸尾的RNA分子中，在反转录前合成地(例如酶学方法地)加上例如聚腺苷酸尾的尾。优选地，加上多核苷酸尾，其中核苷酸独立地选自腺苷或胞苷或鸟苷或尿苷。
存在具有某些大小范围的RNA种类，例如大约长19到23个碱基的miRNA。因此，限制了衍生自miRNA的扩增产物的群的大小分离。当展示具有19-23个碱基大小范围的miRNA时，根据大小每个群能解决最多5个分子。因此，必须使用非常大的引物集合(引物矩阵)来分辨所有的miRNA分子。
在可选的方法中，能使用miRNA一端的核苷酸来根据miRNA的末端序列人工扩大特定数目的核苷酸的扩增产物。这样的引物的通用公式是PxNy；P代表同尾互补的核苷酸；N代表独立地选自腺苷、胞苷、鸟苷或胸苷的核苷酸；y是0和10间的整数；x定义核苷酸的数目并对所有的Ny是不同的。假如为这样大小的扩增使用miRNA的5’端，以同选择miRNA分子的末端核苷酸的3’引物组合方式使用含有某些或全部可能的5’引物的引物混合物来定义某些群。在图6中显示了根据本发明原理的一个可能的引物矩阵。
因此，在本发明的优选实施方案中，依赖于RNA或全长cDNA的5’或3’序列，产生了通过一定数目的核苷酸差别扩大的扩增产物-特别是全长扩增产物。
优选地，与RNA相比，通过使用具有不同长度并识别RNA或全长cDNA的不同5’或3’末端序列的引物产生通过在它们的5’和/或3’端的确定数目的核苷酸差异扩大的扩增产物。并且，优选地，RNA相比，通过使用作为引物的5’和/或3’引物混合物，其中每种引物识别一种不同的末端序列并具有不同的长度，产生通过在它们的5’和3’端的确定数目的核苷酸扩大的扩增产物的群。优选地，引物具有不同cDNA(在扩增步骤过程中)或RNA(在反转录步骤过程中)互补的确定序列。
在原核生物中，mRNA不具有聚腺苷酸尾。已经发明了能从这样的分子制备全长cDNA的方法(Amara et al.，1997)，例如加上合成的聚腺苷酸尾。将所述方法应用到这样的分子也处于本发明的范围内。
优选地，在根据本发明的方法中，使用不具有聚腺苷酸尾或尾序列的，并在反转录前合成地(酶学方法地)加上优选地多核苷酸尾，特别优选地聚腺苷酸尾的RNA或mRNA样品。
为了降低执行展示所必需的RNA的量，能在扩增反应，如PCR前引入预扩增步骤。在反转录(RT)步骤中是否进行到群的分离，必须以扩增所有的想在扩增(PCR)步骤中分离入确定的群的cDNA的方式设计预扩增步骤。能在加尾前或加尾后，在用特异的引物的主要扩增前，引入预扩增步骤。
例如，能将启动子如T7RNA聚合酶加到用于启动RT反应的引物的5’端。在RT后并在扩增(PCR)前，能通过对启动子如T7RNA聚合酶特异的RNA聚合酶合成RNA。必须再次反转录这样获得的扩增的RNA，并且，依赖于序列是否存在于同RNA的第一个碱基互补的并能用来在这个末端启动扩增反应(PCR)的cDNA碱基的下游，必须将这样的序列加上，例如通过反转录酶的模板开关能力或通过用末端脱氧核苷酸转移酶进行的加尾。
另一个预扩增步骤的例子是使用预扩增PCR。在末端脱氧核苷酸转移酶加尾的cDNA的情况中，一条引物必须特异于因此加上的尾。例如，多聚胸苷酸加尾的cDNA需要引物如dAx和同起始RNA的聚腺苷酸尾互补的引物如dTx。优选地，人们能通过引入可变量的，优选地1和5间的鸟苷仅预扩增全长cDNA来使引物仅同完全反转录的并因而以帽子依赖方式通过反转录酶的非模板核苷酸加载能力加上胞苷的cDNA杂交。此外，通过引入一个或多个摆动，能将能同与起始RNA互补的序列杂交的引物锚定到聚腺苷酸尾的5’端。这有助于通过必需地扩增聚腺苷酸尾的长序列增加获得的扩增(PCR)产物的长度。这样的引物具有通用公式dTxVNy(x是脱氧胸苷的量，V是鸟苷、胞苷或腺苷，N是任何核苷酸)。
通过使用多于一个的扩增(PCR)步骤也能完成cDNA到不同群的辨别。每一个扩增(PCR)步骤将对待扩增的群更特异。例如在第一个扩增(PCR)中，能用引物如dTx同cDNA在同RNA的聚腺苷酸尾侧互补的侧杂交。在接下来的步骤中，能使用3个反应，其中一个用dTxG启动，一个用dTxA启动，一个用dTxC启动。从而创立了3个群。在另一个PCR步骤中，能进一步分开所述群。例如，通过用dTxGA、dTxGC、dTxGG和dTxGT启动能将dTxG群分成4个群。从而总共创立了12个群。能将相同的推理应用到cDNA的另一端并且假如需要，能将两侧的混合集中组合。这样的连续混合集中能一方面进一步降低所需的起始物质(RNA)的量或有助于获得调向待研究的样品的复杂度或研究人员想覆盖的深度的混合集中。
也能根据公开的方法展示利用提供这样的RNA或它们的衍生的cDNA或PCR产物间的正态化或消减的方法组合的两个或多个RNA样品。例如，通过减少高浓度的RNA种类能(预)处理RNA。
因此，本发明也涉及一种方法，其中预扩增在样品中的RNA或cDNA，优选地通过PCR，或其中正态化或消减RNA样品。优选地，在主要的(区别)扩增c)前引入这些(预)处理步骤。
在根据本发明的方法的进一步的实施方案中，通过凝胶电泳、脉冲场电泳、琼脂糖凝胶电泳、PAGE、毛细管电泳或脉冲场毛细管电泳进行扩增产物的分级步骤。能通过任何允许根据特定性质如序列或大小区分DNA分子的方法完成PCR过程中产生的样品的分级和比较。这样的方法学包括例如，凝胶电泳如聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。尤其合适的是毛细管电泳，因为它的高分辨力以及因为能在毛细管中容易地分析许多样品(Behr et al.，1999)。现在，标准的毛细管电泳机器能在一轮中处理384个样品。并且通过使用恰当的实验设计，人们能获得覆盖宽大小范围的必需分辨力。用脉冲场毛细管电泳能充分地分辨特别长的片段(Heller et al.，2001；Morris et al.，2001)。并且，已经发明了方法来收集毛细管中分离的分子组分(Irie et al.，2000；Magnusdottir et al.，2001)。然后，能将代表目标转录物(例如差异表达的基因)的这样的组分进行进一步的分析，例如测序，来测定分子的同一性。
在优选的实施方案中，能将两个cDNA群间的差异的检测引入方法的PCR步骤。能测量PCR过程中DNA水平和/或这样的水平的改变的这样的方法学通常指“实时PCR”(例如Wittwer et al.，1997a，Wittweret al.，1997b)。一个可应用的操作测量了来源于加到PCR反应的SYBRGreen I染料的荧光。当嵌入双链DNA时，这个染料显示了荧光的强烈增加。反应中存在的DNA越多，荧光越强。因此，提供了计算反应中存在的DNA的量的方法。通常在聚合步骤的末期进行测量，因为此时产物变成双链。因为在随后的循环中DNA的量增加了，荧光也将增加。例如能够通过在一个曲线上印迹比较这个数据，并且能比较不同样品间的曲线。假如仅有一个扩增的cDNA，曲线将具有指数相。通过比较样品间的指数相的开始，人们能计算DNA的相对量。假如在给定样品中存在两个或更多个产物，曲线将相互叠加并产生不合道理的改变。假如扩增的cDNA群不是太复杂，仍然能比较不同样品间的这样的数据。优选地，将在荧光PCR反应中扩增的cDNA的量减少到仍能检测每个产物的扩增的区别的点。当使用实时PCR时，另一个分析样品的方式是计算存在于每一个循环末期的DNA的解链曲线的可能性。存在于反应中的每一个PCR产物将在特定的由该序列确定的温度解链。因为产物解链成它的单链，而染料再也不嵌入DNA，借此将产生荧光的下降。在不同温度解链的产物将以增加然后在解链曲线的不同区域的不合道理的降低而被代表。通过比较循环间的和待扩增的同一cDNA群的不同样品间的曲线，人们能鉴定具有不同轮廓的样品。也仅能在PCR的末期进行解链曲线的分析，然而，不检测已经停滞的产物中的差异。
在自动化操作中优选的这样的分析方法的使用能快速筛选在PCR过程中或PCR末期显示差异的样品并排除了全部的通过例如凝胶电泳的分级程序分析它们的需要。
因此，在优选的实施方案中，在扩增步骤，优选地是该方法的PCR步骤，优选地是实时PCR过程中或扩增步骤的末期进行两个cDNA群优选地两个或更多个样品间的相应的群间的差异的检测。
清楚地，能将本发明公开的方法加入到部分或全部自动化的程序中。例如，能在芯片上进行大小分级、不同样品的比较、组分的收集和测序。已经基本上证明了所述技术(Xie et al.，2001)。
该方法的PCR步骤也能在这样的整合到芯片上的程序进行。优选地，将引物或引物对点样和/或结合到固体支撑物上来使固相DNA扩增(例如通过PCR)成为可能。通过微阵列化或纳米阵列化或单分子阵列化结合到固体支撑物上的全套引物能创立包含全部引物矩阵或其部分的单反应器。代替了使用每一个5’-3’引物对的自己的反应器，因此，单反应器包含所有的引物对。优选地，每一个引物对位于确定的区域。
也能创立引物矩阵，其中将每一个5’-3’引物对结合到它自己的固体支撑物(例如珠子)，然后将该固体支撑物本身以能独立定址每一个引物组合或引物对的方式进行安排。例如，能在微孔中随机安排珠子矩阵并且能以本领域已知的方法解码每一个珠子的位置(例如Gunderson et al.，2004)。因此，能改编Gunderson公开的方法并将其引入本发明。该方法仅需要少数标签和一些连续的杂交来以巨大的准确度鉴定数千个不同的DNA序列。关于引物矩阵，在区域中的引物可能包含解码它们自身(例如作为通过多个杂交、检测和洗涤步骤而被其他标记的寡核苷酸解码的序列)或与本发明的引物共同的信息，解码寡核苷酸能结合到载体上。
因此，在优选的实施方案中，将5’引物或3’引物或5’-3’引物对点样和/或结合到固体载体上，优选地，点或固体支撑物位于确定的2-维或3-维区域，优选地，这样的区域包含解码位于该区域的引物或引物对的同一性的信息。
在优选的实施方案中，通过5’引物或3’引物或5’-3’引物对的直接在芯片上的合成产生引物矩阵。
在根据本发明的优选的方法中，在一个步骤中进行反转录和扩增的步骤。
本领域的技术人员公知，存在其他的富集全长cDNA的可能性。能容易地改变这样的方法来扩增通过与5’端和/或聚腺苷酸尾上游的3’端上的核苷酸互补的核苷酸确定的全长cDNA的连续的群。
例如，能使用帽子选择(Capselect)方法(Schmidt et al.，1999)来替换反转录和cDNA的3’端加尾的步骤。这个方法也依赖于反转录酶的胞苷核苷酸的非模板化加载和多聚N尾的加载，优选地，聚腺苷酸尾。然而，聚腺苷酸尾包含核糖核苷酸而不是脱氧核糖核苷酸，因为据声称，末端转移酶优选地仅加载3到4个核糖核苷酸，与此相比较，加载未指定量的脱氧核糖核苷酸。这对该方法是重要的，因为在下一个步骤中，将把一个接头特异地连接到选择3’-AAACCC-5’的cDNA的3’端。通过使用对这个接头互补的引物和对聚腺苷酸尾互补的引物，预期扩增全长cDNA。不是通过使用通用引物来扩增所有的cDNA，人们能使用选择5’和/或3’核苷酸并扩增cDNA群的多套引物。同聚腺苷酸尾杂交并选择聚腺苷酸尾前的x量的碱基的引物结构同上文公开的引物结构相同。为了扩增mRNA的5’端，人们能使用接头序列以及随后的3到4个胸苷和3到4个鸟苷和相应于RNA转录物的5’序列的x量的碱基。增加x将降低通过这样的引物扩增的转录物的数目。
优选地，通过末端转移酶加载的多核苷酸尾包含核糖核苷酸，优选地，2到6个核糖核苷酸，优选地腺苷或胸苷，在寡-脱氧胞苷酸的3’序列后，优选地，长度为1到6个脱氧胞苷核苷酸，其在反转录过程中产生，依赖于模板RNA或mRNA的5’帽子，并且第二扩增引物(5’引物)包含同核糖核苷酸和寡-脱氧胞苷酸和寡-脱氧胞苷酸序列上游的1到10个核苷酸互补的核苷酸。
也能使用扩增衍生自mRNA的某些cDNA的方法来测定单个mRNA的表达水平。优选地，为了测量信使RNA的表达水平，使用根据本发明的方法，包括扩增结果的分离和/或鉴定。像在普通的DD中一样，能比较某些细胞系的结果以更好地可视化表达差异。
此外，本发明提供根据本发明的方法的试剂盒，该试剂盒包含DNA聚合酶，优选地Taq聚合酶，反转录酶或不同聚合酶的混合物，聚合酶所需的辅因子或金属离子的盐，优选地Mg2+和Mn2+，引物和可选地，末端转移酶和额外的缓冲物质。优选地，引物选择如上面所述的RNA或cDNA的5’和3’端。更优选地，引物套(primerset)的引物选择RNA或cDNA的第一个、第二个、第三个、第四个和/或第五个末端核苷酸(任一端，彼此独立地)。优选地，该试剂盒包含1、2、3、4、5、10、多于10、多于20或多于30个引物对。通过使用这个试剂盒，能容易地和快速地进行根据本发明的方法。优选地，也包括完成该方法的说明书。优选地，将完整的引物套(引物矩阵)或其部分-优选地每一个引物对-结合到如芯片，优选地玻璃芯片的固体支撑物上。
在本发明的另一方面，提供固体表面，优选地，芯片，特别优选地玻璃芯片，在确定的区域，优选地点中包含一对引物，其中不同的引物选择至少3个，更优选地，至少4个，最优选地至少10个不同的目标多核苷酸的3’或5’端序列，优选地，选自RNA或cDNA，并且每一个区域包含针对至少两个不同末端序列(例如一对5’和3’引物)的引物，优选地，一个引物选择(例如聚腺苷酸)尾或其互补物，更优选地，选择最近的1到10个核苷酸，优选地，最近的1、2、3或4个核苷酸(5’和/或3’引物的任一。如上所述，引物能是特异的。也能在试剂盒或该方法中使用这些引物，例如这些组合。在一个区域中的选择mRNA的引物对特异于聚腺苷酸尾和5’(帽子)端，以及最近的1个核苷酸(在每一个区域中均不同)。优选地，固体表面包含至少两个、至少4个、至少10个、至少20个或至少40个不同的引物对。
进一步提供的是固体表面，优选地芯片，特别优选地玻璃芯片，在确定的区域，优选地在点中，包含5’引物和3’引物或一对引物，其中，如上所述，引物对cDNA或RNA的两端特异，特别包含公式dPxdGyHNz；特别优选地，固体表面包含至少两个，更优选地，至少9个，特别优选地，至少20个，最优选地，至少60个具有不同引物或引物对的不同区域。
也提供的是固体表面，优选地芯片，特别优选地玻璃芯片，在确定区域，优选地点中，含有包含上面所述的公式(dPxdGy HNz)的5’或3’引物或其互补物，优选地选自包含下述序列之一的引物：AGAGAT TTT TTT TTT TTT TT GA、AGA GAT TTT TTT TTT TTT T GG、AGA GAT TTT TTT TTT TTT T GC、AGA GAT TTT TTT TTT TTT TTGT、AGA GAT TTT TTT TTT TTT TT CA、AGA GAT TTT TTT TTT TTTTT AG、AGA GAT TTT TTT TTT TTT TTT AA、AAA AAA AAA AAAAAA GGG ATA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG ACA、AAA AAAAAA AAA AAA GGG AGA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG AAA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG GTA、AAA AAA AAA AAA AAA GGGCTA、AAAAAAAAAAAAAAA GGG TTA，特别优选地，固体表面包含至少两个，更优选地至少9个，特别优选地，至少20个，最优选地，至少60个具有不同引物或引物对的不同区域。
在进一步的方面，提供了扩增样品中的多核苷酸分子群的方法，包含步骤：
a)获得(或提供)RNA样品并反转录整条RNA分子从而创立全长cDNA或获得(或提供)全长cDNA样品，
b)用多核苷酸尾在3’端后给转录的cDNA的3’端加尾，
c)使用一对引物扩增cDNA，其中第一(3’)引物对cDNA的5’端特异，第二(5’)引物对多核苷酸尾的上游部分以及cDNA的3’多核苷酸尾上游的最近的1到100个核苷酸，优选地最近的1到50个核苷酸，特别优选地最近的1到20个核苷酸，特别优选地最近的1到10个核苷酸(即核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)特异，优选地也包含非特异的摆动核苷酸，特别优选地在1到100个核苷酸范围内的上游部分-其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个核苷酸对cDNA的核苷酸特异；优选地，该方法进一步如上面给出的描述进行定义。
该方法优选地包括使用引物，该引物对RNA(可选地加载的3’尾)或mRNA(优选地内源的3’聚腺苷酸尾)的3’尾特异并且将3’尾上游的最近的1到100个核苷酸，优选地最近的1到50个核苷酸，特别优选地最近的1到20个核苷酸，特别优选地最近的1到10个核苷酸(即核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)用于反转录和/或第一扩增引物对cDNA的5’尾特异，该引物对RNA或mRNA的3’尾、5’尾下游的最近的1到100个核苷酸，优选地最近的1到50个核苷酸，特别优选地最近的1到20个核苷酸，特别优选地最近的1到10个核苷酸(即核苷酸1、2、3、4、5、6、7、8、9或10)特异。当然，双方都或彼此独立地，在5’和3’引物中，尾(或尾互补物)下一个的核苷酸序列(1到100个核苷酸)也可能包含非特异的核苷酸(例如摆动核苷酸)，除了选择扩增产物的不同群(具有或不具有群分离)的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个特异核苷酸外。当然，也能将这样的引物用于反转录。这样的摆动引物(其中在摆动位置对应位置上存在任何核苷酸)的产物仍满足全长cDNA或全长扩增产物的要求，尽管在相应于非特异核苷酸位置的位置上可能不保存该序列。通过使用更长的非特异核苷酸引物序列，引物环可能发生从而产生具有改变的长度的产物，然而仍将其认为是本发明的全长cDNA或扩增产物的同等物。
用下述实施例和附图进一步解释本发明，而没有限制到那里。
附图说明
图1：显示了使用本发明的原理来扩增全长cDNA到确定的亚群的方法的图解表示。在引物中显示的寡-胸苷酸和寡-鸟苷酸序列是引物的末端锚点并且，N、NN和NNy表明了用于确定亚群的选自腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷的核苷酸。
图2：根据实施例2获得的一群人工mRNA分子展示的凝胶电泳产物：泳道1-7中，引物nr.8同引物nr.1-7共同使用。在泳道8-13中，引物nr.1与引物9-14共同使用。
图3：根据实施例3获得的小鼠肝脏RNA的有机化的全长表达展示的凝胶电泳产物。
图4：根据实施例4用PCR预扩增获得的小鼠肝脏RNA的有机化的全长表达展示的凝胶电泳产物。
图5：筛选非多余全长小鼠cDNA克隆的NCBI核苷酸数据库。数据库中存在的16854个克隆的99％的长度在200和6000个碱基间，99.9％的长度低于7500个碱基，没有克隆大于9500个碱基。
图6：显示了如何将没有帽子和尾的RNA如miRNA分成亚群。a)方法的步骤。引物命名如图1。b)一个可能的通过增加扩增产物的大小范围而增加分辨力的引物矩阵。5’引物中的B表明了选自胸苷、鸟苷或胞苷的混合的碱基(摆动)。
具体实施方式
实施例
实施例1：方法的原理
在图1中给出了根据本发明的多核苷酸扩增方法的例子的概述。用于反转录的锚定引物能符合公式dTxV或dTxVNy(定义了与V或VNy组合的脱氧胸苷(“dT”)的重复的x分配了足够高的特异性和解链温度来成功地启动RT反应；V是脱氧鸟甘酸(“dG”)、脱氧腺苷(“dA”)或脱氧胞苷(“dC”)；N是独立选自脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷或脱氧胸苷的y核苷酸的序列；假如锚定引物使用了多于一个的碱基，y确定了它们的数目；增加y将增加反转录产物的亚群。通过使用末端转移酶能进行具有多聚N尾的这样合成的cDNA的3’端加尾-N代表具有选自脱氧胸苷、脱氧腺苷、脱氧胞苷或脱氧鸟苷的均一核苷酸的序列，独立地形成在反转录引物中表明的“N”。可选地通过聚合酶链反应(PCR)确定的VNy序列而预选的cDNA群的扩增可通过使用与cDNA的5’和3’端杂交的引物而进行，通过选择到像被末端转移酶加载的核苷酸的末端序列(cDNA的3’；相应于起始mRNA的5’端)和多聚胸苷酸序列(cDNA的5’；同起始mRNA的3’聚腺苷酸尾互补)并选择寡dNy序列，其中N是数个核苷酸的序列，再一次地，独立地选自脱氧胸苷、脱氧腺苷、脱氧胞苷或脱氧鸟苷并通过紧邻尾的y碱基定义不同的mRNA群。
实施例2：存于样品中的所有RNA分子的扩增
因为存在于样品，即使是在特征已经良好刻画的组织如来源于人或小鼠的肝脏中的所有mRNA分子是未知的，并且它们的数目可能成千上万，选择一种方法来使用由14个人工合成的mRNA分子组成的群来显示存在于该样品中的所有RNA分子均被检测。为了这个目的，使用标准PCR扩增来源于小鼠GAPDH基因(GenBank登入号：NC 000072)的具有不同长度的基因组DNA的序列。使用具有锚定的T7聚合酶启动子的5’引物。在启动子后引入定义其5’端上每一个mRNA的4个碱基的组合。为3’端选择的引物包括在GAPDH特异序列后的将定义聚腺苷酸尾上游的这些分子的4个碱基的组合。在这四个碱基后，为聚腺苷酸尾引入21个脱氧胸苷，或在一个RNA中，22个脱氧胸苷。将获得的包括7-甲基-鸟苷(帽子)的PCR产物进行凝胶纯化并进行标准的T7RNA转录。将这样的T7反应产物再次进行凝胶纯化。将这样获得的合成mRNA分子的混合物用作反转录(RT)的起始物质。为了显示公开的方法对mRNA分子5’以及3’末端特异，14个分子中的7个在5’端具有不变的序列在3’端具有多变的序列，7个分子在3’端具有不变的序列在5’端具有多变的序列。关于产生的人工mRNA分子序列，请参见表1。
在含有50mM Tris-HCl(ph 8.3)、75mM KCl、3mM MgCl2、10mMDTT、0.6M海藻糖、2M甜菜碱、0.5mM dATP、0.5mM dTTP、0.5mM dCTP、0.5mM dGTP、40nM引物(寡dT(21))的25μ1反应中进行反转录。以大约4ng/μl反应体积的水平引入人工mRNA混合物。将反应(没有RT)加热到70℃20秒、32℃2分钟。然后加入浓度为4-8单位/μ1反应体积的缺少RNA酶H活性的莫洛尼鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV RT(-H))并且反应在32℃继续2分钟。在这个点，加入0.5单位的Pfu聚合酶。使用四个50℃10分钟和60℃10秒的循环来完全地反转录RNA，其后将反应冷却到4℃。
表1：待展示的人工RNA的序列
  RNANr， 5’序列......3序列 RNA长度  预测的PCR产物长度
  1   m7 G AT AT CCG CCC TGT GCT......CTG TGG GCA AGG TC TC A(21)   1515  1531
  2   m7 G AT AT CCG CCC TGT GCT......TGT CCC TTT TGG TC CC A(21)   1333  1348
  3   m7 G AT AT CCG CCC TGT GCT......TTG TGG AAG GGC TC GC A(21)   1243  1258
  4   m7 G AT AT CCG CCC TGT GCT......CGA TGC CCC CAT TC AC A(21)   1112  1128
  5   m7 G AT AT CCG CCC TGT GCT......CAC CAC CAT GGA TC TG A(21)   942  958
  6   m7 G AT AT CCG CCC TGT GCT......CAA CGG GAA GCC TC TA A(21)   843  859
  7   m7 G AT AT CCG CCC TGT GCT......ACG ACC CCT TCA TC TT A(21)   736  753
  8   m7 G AT AT GAT GCG CAA AGG......TCC TGC GGC CCA TC TC A(21)   687  703
  9   m7 G AC AT GGC CTA AGC AAG......TCC TGC GGC CCA TC TC A(21)   786  802
  10   m7 G AG AT GAG CAC GGA AGC......TCC TGC GGC CCA TC TC A(21)   880  896
  11   m7 G AA AT CCG CTT TGA TTT......TCC TGC GGC CCA TC TC A(21)   994  1010
  12   m7 G GT AT CAG CTC CCC ATC......TCC TGC GGC CCA TC TC A(21)   1070  1086
  13   m7 G CT AT GGG CCT GGG TCA......TCC TGC GGC CCA TC TC A(21)   1178  1194
  14   m7 G TT AT GGG CGG AGT GGA......TCC TGC GGC CCA TC TC A(21)   1287  1303
用酚/氯仿抽提cDNA，乙醇沉淀和重溶在10μl的H2O中。在含有0.2mM dTTP、100mM二甲砷酸盐缓冲液(pH 6.8)，1mM CoCl2，0.1mM DTT和15单位末端脱氧核苷酸转移酶的20μl反应中在37℃15分钟进行多聚腺苷酸加尾。用酚/氯仿抽提反应物，乙醇沉淀并重溶在100μl的H2O中。
在含有2.5μl加尾的cDNA、50mM Tris(pH 8.8)、14mM(NH4)2SO4、4mM MgCl2、0.2mM每一种dNTP、0.2μM每一种引物(表2，图2)、0.5单位Taq聚合酶和0.03单位Pfu聚合酶的10μl反应中进行PCR。样品在93℃变性30秒，在93℃10秒、55℃30秒、72℃10分钟循环21次。最初的退火温度是55℃，每一个循环降低0.5℃。其后进行93℃10秒、49℃30秒、72℃10分钟的19个循环，最后在72℃延伸2分钟。
表2：PCR引物
  引物nr. 序列
  1   AGA GAT TTT TTT TTT TTT TT GA
  2   AGA GAT TTT TTT TTT TTT T GG
  3   AGA GAT TTT TTT TTT TTT T GC
  4   AGA GAT TTT TTT TTT TTT TT GT
5 AGA GAT TTT TTT TTT TTT TT CA
  6   AGA GAT TTT TTT TTT TTT TT AG
7 AGA GAT TTT TTT TTT TTT TTT AA
  8   AAA AAA AAA AAA AAA GGG ATA
  9   AAA AAA AAA AAA AAA GGG ACA
  10   AAA AAA AAA AAA AAA GGG AGA
  11   AAA AAA AAA AAA AAA GGG AAA
  12   AAA AAA AAA AAA AAA GGG GTA
  13   AAA AAA AAA AAA AAA GGG CTA
  14   AAA AAA AAA AAA AAA GGG TTA
将2.5μl反应产物加入到2.5μl100％甲酰胺上样缓冲液中并在96℃变性2分钟并在冰上冷却，上样到3.5％丙烯酰胺、7M尿素凝胶上并在180V跑胶2小时，随后银染。
结果见图2。在泳道1-7，引物nr.8同引物nr.1-7共同使用。在泳道8-13，引物nr.1同引物9-14共同使用。在每一个泳道中，PCR扩增的特异产物，如表1中显示的预测的PCR产物长度，极好地符合胶上的产物的长度。
泳道1中的引物组合扩增了2个特异的相应于待展示的RNA的产物。在泳道1中进行的反应是该系列中最渴望的反应，因为必须扩增两个产物，这些代表了RNA 1到8。此外，如能从表1中所见的，以增强在泳道1中代表的PCR反应的引导错误的方式设计RNA分子。所有的RNA分子(除了RNA nr.6)在腺苷酸尾前的位置3和4具有同RNA 1和8的位置1和2上的碱基相同的碱基。因为引物nr.1使用它的最后两个碱基来选择待扩增的cDNA，它可能错误引导样品中存在的任何其他cDNA。并且因为cDNA分子1-8在它的另一端具有相同的碱基，仅有引物1的最后两个碱基选择了反应1中的这8个分子。然而，仅展示了待扩增的两个RNA，这显示了能在这样的展示中达到巨大的特异性。
泳道2显示了这个反应的限制。除了待扩增的带外，还扩增了相应于RNA nr.4的模糊条带。然而，待扩增的条带比通过引导错误事件产生的条带的强度强若干倍。而且，纵使为热循环使用了降落方案，所有的不同引物组合均使用了相同的轮廓。为了显示反应基本上能为具体的引物序列而最佳化，进行了另一个包括1.302M甜菜碱和1.3％DMSO的反应。这个产物显示在泳道14中并且仅显示了正确的条带。
实施例3：从小鼠肝脏扩增总RNA。
在与实施例2中针对完整人工RNA系列的条件相同的条件下反转录、加尾并PCR扩增来源于小鼠肝脏的总RNA(13μg)。
使用与RT、加尾和PCR相同的条件来显示可能在与使人工RNA的反应成为可能的条件相同的严谨条件下从复杂混合物中展示RNA分子。在0.7％琼脂糖凝胶上跑PCR产物来分辨更长的分子。如能在图3中所见的，每一个引物组合均扩增了唯一的轮廓。
在图3中展示的RNA分子的长度分布非常符合在筛选非多余全长小鼠cDNA克隆的NCBI核苷酸数据库中的cDNA的长度分布(图5)。
因为能在每一个泳道上平均看到大约10-15个条带，全系列的768个引物组合(3×44)展示大约7680-11520个代表了肝脏中表达全长RNA分子的PCR产物。能在简单的0.7％琼脂糖凝胶上分辨这样的轮廓的这个结果显示了该方法的能力以及能用其在实验室中进行的轻易性。
实施例4：利用PCR预扩增步骤。
在含有2.5μl纯化的加尾的按实施例3中所述方法产生的cDNA、50mM Tris(pH 8.8)、14mM(NH4)2SO4、4mM MgCl2、0.2mM每一种dNTP、0.2μM引物dT(21)、0.2μM引物dA(21)、0.5单位Taq聚合酶和0.03单位Pfu聚合酶的10μl反应中进行预扩增。在93℃将样品变性30秒、并在93℃10秒、42℃30秒、72℃11分钟循环11次，最后在72℃延伸2分钟。通过加入990μl H2O将这个反应稀释到1ml。在随后的使用与实施例3中的PCR条件相同的条件的PCR中使用2.5μl该稀释物，不同之处为，最后的2个循环省略了。如能在图4中所见的，每一个引物组合均能看到与众不同的显带。如实施例中所用的预扩增步骤显示，500ng的总RNA足以为的确巨大的每个RNA样品768个反应的展示提供物质，如分辨来源于像脑组织的高度复杂的RNA混合物可能所需的。通过增加预扩增过程中的循环数能容易地降低使用的RNA量。因此，展示的灵敏度应符合真正最所需的应用，其中仅能提供有限量的RNA。此外，每个引物对的条带量与实施例3相比增加了。因为在实施例3和4中的识别PCR步骤中使用的高退火温度显示了极高的严谨性，当不使用预扩增步骤时，某些低水平的转录物可能恰好低于检测限下。
实施例5：miRNA展示
在图6中给出了根据本发明的多核苷酸扩增方法的实施例的概述，其中RNA没有帽子和聚腺苷酸尾，在该情况下是微小RNA(miRNA)。
为了能从没有聚腺苷酸尾的miRNA反转录全长cDNA，通过使用聚腺苷酸聚合酶加载合成的尾。第二步，通过使用寡脱氧胸苷酸引物将聚腺苷酸加尾的RNA反转录成cDNA。在通过末端转移酶将cDNA多核苷酸加尾后，cDNA样品具有足够长的允许引物根据起始miRNA分子的5’和3’序列退火和扩增cDNA序列到不同群的核苷酸末端(图6a)。
因为微小RNA(miRNA)分子具有大约19-23个碱基大小，必须使用足够巨大的引物矩阵(5’和3’引物的所有可能组合)来将全部的miRNA分离成不同的群，其中能测量样品间的表达差异。
可选地，能使用miRNA序列的一个末端来根据miRNA的末端序列人工扩大特定数目的核苷酸的扩增产物。图6b显示了这样的矩阵的例子。在这个情况下，使用5’引物来根据miRNA的第二个和第三个核苷酸将miRNA扩增产物分成不同长度。在通过加入大小分级(如毛细管凝胶电泳)而进行不同群的比较的情况下，能将图6b的所有16个5’引物用作引物矩阵。这个5’引物矩阵和一个3’引物定义了群。因此，当与192×16＝3072个群相比时，192个群具有相似的分辨率，其中将每一个5’引物与每一个3’引物共同使用。
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<223>n是a、c、g或t
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<213>人工
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<223>RNA-末端
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caccaccatg gatctga                                               17
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caacgggaag cctctaa                                               17
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Claims (33)

1、扩增样品中的一群多核苷酸分子的方法，其特征在于包括下述步骤：
a)获得RNA样品并反转录整条RNA分子，从而创立全长cDNA或获得全长cDNA的样品，
b)用多核苷酸尾在3’端后将转录的cDNA的3’端加尾，
c)使用一对引物扩增cDNA，其中第一(3’)引物对cDNA的5’端特异，第二(5’)引物对多核苷酸尾的上游部分和cDNA的3’多核苷酸尾上游的最近的1到10个核苷酸特异。
2、根据权利要求1的方法，其特征在于反转录使用了引物，该引物对RNA或mRNA的3’聚腺甘酸尾和聚腺甘酸尾上游的最近的1到10个核苷酸特异，和/或第一扩增引物对cDNA的5’聚胸苷酸序列特异，其对RNA或mRNA的3’聚腺甘酸尾和5’聚胸苷酸序列下游的最近的1到10个核苷酸互补。
3、根据权利要求1或2任一项的方法，其特征在于使用末端转移酶完成3’端加尾。
4、根据权利要求1到3任一项的方法，其特征在于用PCR完成扩增。
5、根据权利要求1到4任一项的方法，其包含根据扩增产物的长度分离扩增产物的额外步骤，优选地通过凝胶电泳，优选地聚丙烯酰胺凝胶电泳、毛细管电泳、脉冲场电泳、琼脂糖凝胶电泳、PAGE或脉冲场毛细管电泳。
6、根据权利要求1到5任一项的方法，其包含测定扩增产物的同一性或序列的额外步骤，优选地通过芯片上的自动程序。
7、根据权利要求1到6任一项的方法，其中样品含有来源于试样的总RNA或mRNA，优选地纯化的RNA或mRNA。
8、根据权利要求1到7任一项的方法，其中反转录和/或扩增过程中使用高严谨条件。
9、根据权利要求1到8任一项的方法，其中通过利用海藻糖、甜菜碱、氯化四甲铵、乙二酸四甲铵、甲酰胺和寡-阻滞剂或者通过在聚合酶链反应过程中利用二甲基亚砜增加反转录和/或扩增，优选聚合酶链反应的选择性来降低引导错误的发生。
10、根据权利要求1到9任一项的方法，其中通过衍生自莫洛尼鼠白血病病毒、AMV、HIV-1、HIV-2的反转录酶完成反转录，其中这些RT的RNA酶H活性存在、降低或不存在。
11、根据权利要求1到10任一项的方法，其中反转录或扩增使用的引物在它的3’端的一个或两个碱基中，优选地在最后的核苷酸上游的位置2和4间，具有摆动的替代，优选地，脱氧鸟苷、脱氧腺苷或脱氧胞苷替代脱氧胸苷，反之亦然，其中摆动碱基优选地代表能与任何正规的核碱基如脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷或脱氧胞苷碱基配对的通用碱基的替换，通用碱基优选脱氧肌苷、3-硝基吡咯2’-脱氧核苷或5-硝基吲哚2’-脱氧核苷。
12、根据权利要求1到11任一项的方法，其使用对引物和RNA或cDNA的核苷酸间的错配敏感的聚合酶，该聚合酶不延伸错配的外切核酸酶抗性引物，其中优选地，该引物抗外切核酸酶，特别优选地，通过磷硫酰修饰或锁核酸。
13、根据权利要求1到12任一项的方法，依赖于模板RNA或mRNA的5’帽子，通过该方法在反转录过程中产生具有寡脱氧胞苷酸的3’序列，优选地具有1到6个脱氧胞苷的长度，优选地，其中使用帽子依赖的寡脱氧胞苷酸的3’序列，通过在扩增过程中使用对寡脱氧胞苷酸序列特异的第二引物分离完整转录的cDNA。
14、根据权利要求1到13任一项的方法，其中用特征为缺少脱氧胞苷的多核苷酸序列完成cDNA 3’端的加尾。
15、根据权利要求1到14任一项的方法，其中扩增反应使用的DNA聚合酶是Taq DNA聚合酶、Tfl DNA聚合酶、aTaq DNA聚合酶、测序酶或Klentaq和/或具有校正读码活性的酶，优选地，选自PFU、Ultma、Vent、Deep Vent、PWO或Tli聚合酶或E.coli外切核酸酶III。
16、根据权利要求1到15任一项的方法，其中预扩增样品中的RNA或cDNA，优选地通过PCR，或其中将RNA样品正态化或消减。
17、根据权利要求1到16任一项的方法，其中扩增反应使用的引物的特征是具有通用公式dPxdGyHNz，其中Px代表同加到cDNA的3’端的序列互补的核苷酸，dG是脱氧鸟苷，y是整数，优选地2和5间的，H是脱氧胸苷或脱氧腺苷或脱氧胞苷，N是具有长度z的核苷酸序列，其中它的成员核苷酸独立地选自脱氧腺苷、脱氧胞苷、脱氧鸟苷或脱氧胸苷，且z是0和10间，优选地，0和5间的整数。
18、根据权利要求1到17任一项的方法，其中通过PCR完成扩增，且PCR引物包含允许在cDNA的3’或5’寡核苷酸末端序列的末端适当布局的锚定序列。
19、根据权利要求1到18任一项的方法，其中扩增引物或反转录引物包含RNA聚合酶的启动子，优选地，其中启动子增强了T7或T3或SP6RNA聚合酶的转录。
20、根据权利要求1到19任一项的方法，其中通过报告基团，优选荧光标记、化学发光标记或放射性同位素，优选地其中使用这些报告基团检测DNA，标记扩增引物和/或扩增产物。
21、根据权利要求1到20任一项的方法，其中在转录后但在(例如聚腺苷酸)尾加载前将随机核苷酸，优选一到三个核苷酸加到RNA或mRNA的3’端，且反转录和/或PCR的引物包含具有相应于随机序列的摆动序列。
22、根据权利要求1到21任一项的方法，其中与RNA相比，通过使用具有不同长度并识别RNA或全长cDNA的不同5’或3’端序列的不同引物产生通过在它们的5’和/或3’端的确定数目的核苷酸差异扩大的扩增产物。
23、根据权利要求1到22任一项的方法，其中使用了不具有聚腺苷酸尾或尾序列并在反转录前合成加上优选为多核苷酸尾，特别优选地聚腺苷酸尾的RNA或mRNA。
24、根据权利要求1到23任一项的方法，其中在扩增步骤过程中或在扩增步骤的末期，优选通过实时PCR进行两个cDNA群，优选两个样品间的相应的群间差异的检测。
25、根据权利要求1到24任一项的方法，其中将5’引物或3’引物或5’-3’引物对点样和/或结合到固体载体上，优选地，点或固体载体位于确定的2-维或3-维区域，优选地，这样的区域包含解码位于该区域的引物或引物对的同一性的信息。
26、根据权利要求1到25任一项的方法，其中一步骤完成反转录和扩增的步骤。
27、根据权利要求1到26任一项的方法，其中通过末端转移酶加载的多核苷酸尾由核糖核苷酸，优选地2到6个核糖核苷酸，优选为腺苷或胸苷组成，在寡脱氧胞苷酸的3’序列后，优选地具有在反转录过程中产生的1到6个脱氧胞苷核苷酸，依赖于模板RNA或mRNA的5’帽子，且第二扩增引物(5’引物)包含同核糖核苷酸和寡脱氧胞苷酸以及寡脱氧胞苷酸序列上游的1到10个核苷酸互补的核苷酸。
28、根据权利要求1到27任一项的方法，其中通过反转录酶的模板开关能力将尾加到cDNA上，优选地以帽子依赖的方式，且第二扩增引物(5’引物)包含同因此加上的尾和寡脱氧胞苷酸以及寡脱氧胞苷酸序列上游的1到10个核苷酸互补的核苷酸。
29、测量信使RNA表达水平的方法，其特征为使用根据权利要求1到28任一项的方法，包括扩增结果的分离和/或鉴定。
30、用于根据权利要求1到29任一项的方法的试剂盒，其包含DNA聚合酶，优选地Taq聚合酶，反转录酶或不同聚合酶的混合物，聚合酶所需的辅因子或金属离子的盐，优选地Mg2+和Mn2+，引物，优选地对RNA或cDNA的5’和/或3’端有选择力的，更优选地对RNA或cDNA的第一、第二、第三、第四和/或第五末端核苷酸有选择力的，以及可选地末端转移酶和额外的缓冲物质。
31、固体表面，优选地芯片，特别优选地玻璃芯片，在确定的区域，优选地点中包含5’引物和3’引物或一对引物，其中引物如权利要求1中c)点、权利要求2、权利要求11、权利要求12或权利要求17所定义，特别优选地，该固体表面包含具有不同引物或不同引物对的至少两个，更优选地至少9个，特别优选地至少20个，最优选地至少60个不同的区域。
32、固体表面，优选地芯片，特别优选地玻璃芯片，在确定的区域，优选地点中包括包含如权利要求17中定义的通用公式或其互补物的5’引物和3’引物或一对引物，优选地选自包含下述序列之一的引物：AGAGAT TTT TTT TTT TTT TT GA、AGA GAT TTT TTT TTT TTT T GG、AGA GAT TTT TTT TTT TTT T GC、AGA GAT TTT TTT TTT TTT TTGT、AGA GAT TTT TTT TTT TTT TT CA、AGA GAT TTT TTT TTT TTTTT AG、AGA GAT TTT TTT TTT TTT TTT AA、AAA AAA AAA AAAAAA GGG ATA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG ACA、AAA AAAAAA AAA AAA GGG AGA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG AAA、AAA AAA AAA AAA AAA GGG GTA、AAA AAA AAA AAA AAA GGGCTA、AAAAAAAAAAAAAAA GGG TTA，特别优选地，固体表面包含具有不同引物或不同引物对的至少两个，更优选地至少9个，特别优选地至少20个，最优选地至少60个不同的区域。
33、扩增样品中一群多核苷酸分子的方法，其特征可由下述步骤表示：
a)获得RNA样品并反转录整条RNA分子从而创立全长cDNA或获得全长cDNA样品，
b)用多核苷酸尾在3’端后给转录的cDNA的3’端加尾，
c)使用一对引物扩增cDNA，其中第一(3’)引物对cDNA的5’端特异，第二(5’)引物对多核苷酸尾的上游部分以及cDNA的3’多核苷酸尾上游的最近的1到100个核苷酸，优选地，最近的1到50个核苷酸，特别优选地，最近的1到20个核苷酸，特别优选地，最近的1到10个核苷酸特异，优选地也包含非特异的摆动核苷酸，特别优选地在上游部分内在1到100个核苷酸范围内-其中至少1个核苷酸对cDNA的核苷酸特异；该方法如权利要求1到29任一项进一步优选地定义。34、根据权利要求1或33的方法，特征为，反转录使用了对RNA(可选地加载的3’尾)或mRNA(可选地内源3’聚腺甘酸尾)的3’尾和3’尾上游的最近的1到100个核苷酸，优选地，最近的1到50个核苷酸，特别优选地，最近的1到20个核苷酸，特别优选地，最近的1到10个核苷酸特异，和/或第一扩增引物对同RNA或mRNA的3’尾和5’尾下游的最近的1到100个核苷酸，优选地最近的1到50个核苷酸，特别优选地最近的1到20个核苷酸，特别优选地最近的1到10个核苷酸互补的cDNA的5’尾特异。
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