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CN108949937A - 一步法rt-pcr预混试剂 - Google Patents

一步法rt-pcr预混试剂 Download PDF

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CN108949937A
CN108949937A CN201810779299.3A CN201810779299A CN108949937A CN 108949937 A CN108949937 A CN 108949937A CN 201810779299 A CN201810779299 A CN 201810779299A CN 108949937 A CN108949937 A CN 108949937A
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tris
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宋东亮
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Yi San Biotechnology (shanghai) Co Ltd
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Yi San Biotechnology (shanghai) Co Ltd
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

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Abstract

本发明提供一种一步法RT‑PCR预混试剂，其特征在于，包括：RNA转录为cDNA的试剂，以及多聚糖。本发明将RT‑PCR反应所需酶、缓冲液等试剂预混在一个反应管中，节省了RT‑PCR操作时间，并且减少了反复开盖可能带来的污染。进一步，本发明通过添加多聚糖等试剂，增强了RT‑PCR反应效率。

Description

一步法RT-PCR预混试剂
技术领域
本发明涉及一种一步法RT-PCR预混试剂，属于分子生物学领域。
背景技术
反转录PCR(RT-PCR)以RNA为模板进行扩增，在基因表达水平的检测、RNA病毒含量检测以及直接克隆特定基因cDNA等方面有着广泛的应用。反转录PCR分为两个步骤，首先在反转录酶的作用下将RNA反转录为单链的cDNA，然后在DNA聚合酶的作用下将单链cDNA扩增为双链的DNA分子。RT-PCR过程可以分步进行，即在转录完成后去除酶、金属离子等对DNA聚合酶有抑制的组分，再加入DNA聚合酶和对应的缓冲溶液，也可以将反转录酶和DNA聚合酶混入一管中进行一步反应。同两步反应相比，一步反应降低了反复开盖带来的风险，因而更加便捷和安全。
要实现一步RT-PCR反应并不容易，一系列报道显示当反转录酶和DNA聚合酶在一管中进行反应时会相互干扰，引起RT-PCR灵敏度的降低。一方面这种抑制来自于反转录酶和DNA聚合酶最优缓冲液的不一致，另一方面多篇报道指出诸如鸟类成髓细胞白血病病毒反转录酶(AMV-RT)和小鼠白血病病毒反转录酶(M-MLV-RT)等会抑制DNA聚合酶的活力。
发明内容
本发明的目的在于提供一种新的一步法RT-PCR预混试剂，以增强一步法RT-PCR的反应效率。
本发明采用了如下技术方案：
一种一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于，包括：RNA转录为cDNA的试剂，以及多聚糖。
进一步，本发明的一步法RT-PCR预混试剂：其中，RNA转录为cDNA的试剂包括：反转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、辅因子以及表面活性剂。
优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，还具有这样的特征：其中，RNA转录为cDNA的试剂包括：反转录酶：M-MLV-RT或者AMV-RT，一种或者两种DNA聚合酶，5-100mM的Tris-HCl或者Tris-SO4，1～10mM的MgCl2，10～200mM的KCl，200～400μM的dNTP，5～40mM的DTT，10～400mM的海藻糖，0.2～3mg/mL的BSA，20～50mM的硫酸盐，甘油5～35％。
优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，还包括：SYBR染料，用以染料法RT-PCR过程。
优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，其中，硫酸盐为硫酸铵。
优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，其中，多聚糖为：水溶性葡聚糖。
优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，其中，水溶性葡聚糖的浓度范围是10-25mM。
优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，其中，水溶性葡聚糖的浓度是20mM。
优选的，本发明的一步法RT-PCR预混试剂，预混试剂的pH范围是8.3～9.2。
本发明还提供上述任意一项的一步法RT-PCR预混试剂在制备核酸检测试剂盒中的应用。
发明的有益效果
第一，将RT-PCR反应所需酶、缓冲液等试剂预混在一个反应管中，节省了RT-PCR操作时间，并且减少了反复开盖可能带来的污染。
第二，通过添加多聚糖等试剂，增强了RT-PCR反应效率。
附图说明
图1是添加水溶性葡聚糖的RT-PCR扩增曲线。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明的技术方案做详细的说明。
实施例1：Tris-HCl和Tris-SO4对RT-PCR的影响
为了考察不同pH的Tris-HCl和Tris-SO4对一步法RT-PCR的影响，以GAPDH基因为例进行试验，分别加入Tris-HCl或者Tris-SO4配制了5个梯度pH的预混试剂。本实施方式中其他组分及浓度为：硫酸铵20mM、KCl 50mM、占预混试剂总质量15％的甘油、dNTP 300μM、海藻糖300mM、DTT 20mM、BSA 0.4mg/mL。常规浓度的AMV-RT和DNA聚合酶。
RT-PCR反应条件：42℃或者50℃反转录5min，95℃变性10s；95℃预变性5s，60℃扩增20s，40个循环反应。
从表1可知，Tris-HCl和Tris-SO4的最优pH浓度为8.8，且Tris-HCl更有利于RT-PCR过程，这可能是我们配制的buffer中已经有了适宜浓度的硫酸根离子，再加入更多的硫酸根离子反而不利于RT-PCR反应。各实施方式中反转录酶M-MLV-RT和DNA聚合酶的浓度采用常规浓度即可。
表1.不同pH的Tris-HCl和Tris-SO4对RT-PCR的影响
+，表示促进RT-PCR过程且加号越多促进作用越明显；-，表示抑制RT-PCR过程
实施例2：添加水溶性葡聚糖Ficoll 400(Sigma-aldrich)对RT-PCR的影响。各实施方式中的水溶性葡聚糖均指来自Sigma-aldrich的Ficoll400葡聚糖。
本实施方式中其他组分及浓度为：硫酸铵20mM、KCl 50mM、占预混试剂总质量15％的甘油、dNTPμM、海藻糖300mM、DTT 20mM、BSA 2mg/mL。pH浓度调节至8.8。常规浓度的AMV-RT和DNA聚合酶。
RT-PCR反应条件：42℃或者50℃反转5min，95℃变性10s；95℃预变性5s，60摄氏度扩增20s，40个循环反应。
添加水溶性葡聚糖，考察了不同浓度水溶性葡聚糖对RT-PCR的影响。从表2可知，随着葡聚糖浓度的增加RT-PCR效果呈现先增加后降低的趋势，当其浓度为20mM时，RT-PCR效果最好，而当浓度过高时促进作用减弱。
在水溶性葡聚糖浓度为20mM时用不同RNA模板浓度进行试验，同不添加葡聚糖的组分比较。从附图1可知，添加适宜的水溶性葡聚糖对RT-PCR促进效果明显，显著提升了样品Ct值。图1中带星号的曲线是未加水溶性葡聚糖的曲线，不带星号的曲线是加入不同浓度水溶性葡聚糖的曲线。
表2.不同浓度水溶性葡聚糖对RT-PCR的影响
+，表示促进RT-PCR过程且加号越多促进作用越明显；-，表示抑制RT-PCR过程
实施例3：
本实施方式中的一步法RT-PCR预混试剂包括：反转录酶：M-MLV-RT，DNA聚合酶，5mM的Tris-HCl和5mM的Tris-SO4，1mM的MgCl2，10mM的KCl，200μM的dNTP，5mM的DTT，10mM的海藻糖，1mg/mL的BSA，20mM的硫酸铵，占总质量5％的甘油。10mM的水溶性葡聚糖Ficoll400。将pH值调节到8.3。
RT-PCR反应条件：42℃或者50℃反转5min，95℃变性10s；95℃预变性5s，60摄氏度扩增20s，40个循环反应。
实施例4：
反转录酶：AMV-RT，DNA聚合酶，100mM的Tris-HCl，10mM的MgCl2，200mM的KCl，400μM的dNTP，40mM的DTT，400mM的海藻糖，1.8mg/mL的BSA，50mM的硫酸铵，占预混试剂总质量15％的甘油。
25mM的水溶性葡聚糖Ficoll 400。将pH值调节到9.2。
RT-PCR反应条件：42℃或者50℃反转5min，95℃变性10s；95℃预变性5s，60摄氏度扩增20s，40个循环反应。
实施例5：添加不同BSA对实验结果的影响。
本实施方式中各组分及浓度为：硫酸铵20mM、KCl 50mM、占预混试剂总质量15％的甘油、dNTPμM、海藻糖300mM、DTT 20mM、BSA0.4mg/mL。pH浓度调节至8.8。常规浓度的AMV-RT和DNA聚合酶。
RT-PCR反应条件：42℃或者50℃反转5min，95℃变性10s；95℃预变性5s，60摄氏度扩增20s，40个循环反应。
在此基础上添加不同浓度的BSA。
RT-PCR反应条件：42℃或者50℃反转5min，95℃变性10s；95℃预变性5s，60摄氏度扩增20s，40个循环反应。
结果见表3。从表中可知，添加不同BSA对RT-PCR有较大影响，当BSA浓度为2mg/mL时，RT-PCR效果最好0.2～3mg/mL的BSA，而当BSA浓度进一步增加时，促进作用不增加。BSA的作用主要在于稳定DNA聚合酶活力，促进PCR扩增效率。
表3.不同浓度BSA对RT-PCR的影响
+，表示促进RT-PCR过程且加号越多促进作用越明显；-，表示不促进RT-PCR过程
实施例6
利用实施例2-4中的任意一种一步法RT-PCR预混试剂，应用于核酸检测试剂盒中。对各种来源的RNA进行扩增和检测。

Claims (10)

1.一种一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于，包括：
RNA转录为cDNA的试剂，以及多聚糖。
2.如权利要求1所述的一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于：
其中，所述RNA转录为cDNA的试剂包括：
反转录酶、DNA聚合酶、缓冲液、辅因子以及表面活性剂。
3.如权利要求1所述的一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于：
其中，所述RNA转录为cDNA的试剂包括：
反转录酶：M-MLV-RT或者AMV-RT，
一种或者两种DNA聚合酶，
5-100mM的Tris-HCl或者Tris-SO4，
1～10mM的MgCl2，
10～200mM的KCl，
200～400μM的dNTP，
5～40mM的DTT，
10～400mM的海藻糖，
0.2～3mg/mL的BSA，
20～50mM的硫酸盐，
甘油5～35％。
4.如权利要求1所述的一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于，还包括：
SYBR染料。
5.如权利要求1所述的一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于：
其中，所述硫酸盐为硫酸铵。
6.如权利要求1所述的一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于：
其中，所述多聚糖为：水溶性葡聚糖。
7.如权利要求6所述的一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于：
其中，所述水溶性葡聚糖的浓度范围是10-25mM。
8.如权利要求6所述的一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于：
其中，所述水溶性葡聚糖的浓度是20mM。
9.如权利要求1所述的一步法RT-PCR预混试剂，其特征在于：
预混试剂的pH范围是8.3～9.2。
10.如权利要求1-9中任意一项所述的一步法RT-PCR预混试剂在制备核酸检测试剂盒中的应用。
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