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CN101200504B - 高分子巯基化改性衍生物及其交联材料 - Google Patents

高分子巯基化改性衍生物及其交联材料 Download PDF

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CN101200504B CN200610119414A CN200610119414A CN101200504B CN 101200504 B CN101200504 B CN 101200504B CN 200610119414 A CN200610119414 A CN 200610119414A CN 200610119414 A CN200610119414 A CN 200610119414A CN 101200504 B CN101200504 B CN 101200504B
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Abstract

本发明公开了通式(I)或(II)的高分子巯基化改性衍生物及其相应的二硫键交联材料和巯基反应活性交联剂交联材料，其中R1和R2是亚烷基、取代亚烷基、芳香基、聚醚基等，R1和R2可以具有相同或不相同的化学结构；P是指侧链含有羧基的高分子化合物残基，所述高分子巯基化改性衍生物的分子量为1000到500万。本发明通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物的侧链化学结构灵活多变、性能可调，具有制备条件温和、产率高、改性程度高且可控等许多显著优点。本发明的高分子巯基化改性衍生物的交联材料可以用于抑制细胞的粘附，用作细胞粘附生长的基质。
Figure 200610119414.1_AB_0

Description

高分子巯基化改性衍生物及其交联材料
技术领域
本发明涉及化合物，尤其涉及高分子巯基化改性衍生物；此外，本发明还涉及该高分子巯基化改性衍生物相应的二硫键交联材料和巯基反应活性交联剂交联材料。
背景技术
高分子巯基化改性衍生物具有许多重要的生物医学用途，如用于各种小分子药物和多肽蛋白药物的化学活性修饰、制备各种交联高分子材料等等。这些新型材料可以作为细胞生长基质、创伤修复再生基质、药物缓释载体、伤口敷料，原位包埋细胞基质等等，在生物医学领域具有重要用途。然而到目前为止，这类巯基化改性高分子衍生物的种类很少，只有Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中公开的高分子巯基化改性衍生物具有较好的应用前景。这类高分子巯基化改性衍生物具有下述结构：
Figure G2006101194141D00011
其中P是高分子化合物残基。然而这两种结构的高分子巯基化改性衍生物侧链结构和性能单一，并不能有效地满足各种生物医学应用。同时这两种结构的高分子巯基化改性衍生物的侧链较短，制约了巯基在进一步化学修饰和交联时与其它化学官能团的碰撞几率，化学反应性能不佳。因此，制备具有可调节的侧链分子结构和化学性能的高分子巯基化类衍生物具有重要的意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题之一在于提供一类新的具有重要生物医学用途的高分子巯基化改性衍生物，该类衍生物具有可调节的侧链分子结构和化学性能。
本发明要解决的技术问题之二是提供一类二硫键交联的高分子巯基化改性衍生物交联材料。
本发明要解决的技术问题之三是提供一类巯基反应活性交联剂交联的高分子巯基化改性衍生物交联材料。
本发明以侧链含羧基的高分子化合物为原料，采用化学制备方法合成了新颖的巯基化改性高分子衍生物。该类衍生物具有可调节的侧链分子结构和化学性能，在生物医药领域具有重要的用途。
本发明的高分子巯基化改性衍生物用下述通式(I)或(II)表示：
Figure G2006101194141D00021
其中R1和R2是亚烷基、取代亚烷基、芳香基、聚醚基等；R1和R2可以具有相同或不相同的化学结构，所述高分子巯基化改性衍生物的分子量为1000到500万。
上述P是指侧链含有羧基的高分子化合物残基，其中至少一个高分子化合物侧链羧基被改性为巯基。侧链含有羧基的高分子化合物包括多糖、蛋白质以及合成高分子等。其中多糖包括硫酸软骨素、皮肤素、肝素、类肝素、海藻酸、透明质酸、硫酸皮肤素、果胶、羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖等以及它们的盐形式；合成高分子包括聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚酒石酸、聚谷氨酸、聚富马酸等以及它们的盐形式；蛋白质包括胶原蛋白、碱性明胶蛋白、酸性明胶蛋白、碱性基因重组明胶蛋白、酸性基因重组明胶蛋白、弹性蛋白、核心蛋白多糖层粘连蛋白纤维结合蛋白等。侧链含有羧基的高分子化合物优选硫酸软骨素、肝素、类肝素、海藻酸、透明质酸、聚天冬氨酸、聚谷氨酸以及它们的盐形式(如钠盐，钾盐等)，和碱性明胶蛋白、酸性明胶蛋白、碱性基因重组明胶蛋白、酸性基因重组明胶蛋白。特别优选硫酸软骨素、肝素、透明质酸以及它们的盐形式(如钠盐，钾盐等)，和碱性明胶蛋白、酸性明胶蛋白。
上述亚烷基是指-(CH2)n-(n是1～15的整数)。优选n是1～8的整数。
上述取代亚烷基是指至少一个氢原子被低级烷基、羟基、氨基、烷氧基、苯基、酯基等基团取代的亚烷基。
上述芳香基是指芳香族的苯基、萘基等。优选苯基。
上述聚醚基是指-[(CHR)nO]m-，其中R是低级烷基，n是1～10的整数，m是1～500的整数。优选R为氢原子，n分别等于2、3和4。
上述低级烷基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷基。例如：甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、仲丁基、戊基、新戊基、己基、庚基、辛基等。优选具有1～4个碳原子的直链或支链的烷基，特别优选甲基、乙基和丙基。
上述烷氧基是指具有1～6个碳原子的直链或支链的烷氧基。例如：甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基、丁氧基、异丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、戊氧基、新戊氧基、己氧基等。优选具有1～4个碳原子的支链或直链的烷氧基，特别优选甲氧基和乙氧基。
上述酯基是指-C(O)OR，其中R是上述低级烷基。优选甲酯基、乙酯基、丙酯基和丁酯基。
优选的本发明化合物是其中R1和R2代表亚烷基。最优选的是R1和R2是碳原子数为1～8的亚烷基。
以透明质酸为例，本发明的高分子巯基化改性衍生物具有下列化学结构特征：
Figure G2006101194141D00031
其中R1和R2的定义同前述；i是大于0的整数，j是大于或等于0的整数。
本发明通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物的制备一般采用酰肼/碳二亚胺偶合化学方法。其基本原理是高分子化合物的侧链羧基在碳二亚胺的活化下生成活性中间体，然后二硫代二酰肼的氨基亲核进攻活性中间体生成加成物，最后加成物的二硫键被还原成自由巯基，纯化即可得到产物。
为了制备本发明通式(I)或(II)的高分子巯基化改性衍生物，首先按照本申请人已申请的发明专利(申请号：200610118715.2，发明名称：二酰肼化合物及其制备方法和用途)合成以下两类新型的二硫代二酰肼：
Figure G2006101194141D00041
其中R1和R2的定义同前述。这两类新型二硫代二酰肼的特征是含有一个二硫键、两个酰胺键和两个酰肼官能团，可由相应的二硫代二酸和二硫代二氨制备。以下是可用于合成本发明通式(I)和(II)的高分子巯基化改性衍生物的部分二硫代二酰肼化合物的化学结构式：
Figure G2006101194141D00042
其中，(1)是二硫代二丙酸双酰甘氨酸二酰肼(简称DGDTPDH)；(2)是二硫代二丙酸双酰丙氨酸二酰肼(简称DADTPDH)；(3)是二硫代二丙酸双酰(羟基)氨基乙酸二酰肼(简称DHADTPDH)；(4)是二硫代二丙酸双酰氨基丙酸二酰肼(简称DPDTPDH)；(5)是二硫代二丙酸双酰氨基丁酸二酰肼(简称DBDTPDH)；(6)是二硫代二丁酸双酰甘氨酸二酰肼(简称DGDTBDH)；(7)是二硫代二丁酸双酰氨基丙酸二酰肼(简称DPDTBDH)；(8)是双丙二酸双酰胱胺二酰肼(简称DPCDH)；(9)是双琥珀酸双酰胱胺二酰肼(简称DSCDH)；(10)是双(甲基)丁二酸双酰胱胺二酰肼(简称DMPCDH)；(11)是双戊二酸双酰胱胺二酰肼(简称DGCDH)；(12)是双己二酸双酰胱胺二酰肼(简称DACDH)；(13)是双庚二酸双酰胱胺二酰肼(简称DHCDH)。
本发明通式(I)和(II)高分子巯基化改性衍生物的一种制备方法为：高分子化合物的侧链羧基在1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐的活化下与二硫代二酰肼的一个或两个酰肼官能团生成加成物；最后加成物的二硫键被羟基硫醇、二硫苏糖醇或硼氢化钠等还原剂还原成自由巯基，透析纯化除去杂质即可得到本发明通式(I)或(II)的高分子巯基化改性衍生物。以下是其化学合成路径及化学结构式，其中，R1和R2是亚烷基、取代亚烷基、芳香基、聚醚基等。
Figure G2006101194141D00051
本发明通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物，当R1和R2都为亚烷基，即为本发明的优选化合物，其化学结构如下所示：
其中，(1)代表R1和R2都为亚烷基的本发明通式(I)高分子巯基化衍生物结构通式；(2)代表R1和R2都为亚烷基的本发明通式(II)高分子巯基化衍生物结构通式(i、j、m、n都是大于1的整数)。
本发明最优选的通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物，其中R2是碳原子数为2和3的亚烷基，R1分别是碳原子数为1～5的亚烷基，P为硫酸软骨素、肝素、透明质酸和它们的盐形式(如钠盐，钾盐等)、碱性明胶蛋白、酸性明胶蛋白等的残基，其化学结构式如下所示：
Figure G2006101194141D00062
其中，(1)是二硫代二丙酸双酰甘氨酸二酰肼改性高分子巯基化衍生物(P-DGDTPDH)；(2)是二硫代二丙酸双酰丙氨酸二酰肼改性高分子巯基化衍生物(P-DADTPDH)；(3)是二硫代二丁酸双酰甘氨酸二酰肼改性高分子巯基化衍生物(P-DGDTBDH)；(4)是二硫代二丁酸双酰丙氨酸二酰肼改性高分子巯基化衍生物(P-DADTBDH)；(5)是双琥珀酸双酰胱胺二酰肼改性高分子巯基化衍生物(P-DSCDH)；(6)是双戊二酸双酰胱胺二酰肼改性高分子巯基化衍生物(P-DGCDH)；(7)是双己二酸双酰胱胺二酰肼改性高分子巯基化衍生物(P-DACDH)；(8)是双庚二酸双酰胱胺二酰肼改性高分子巯基化衍生物(P-DHCDH)。
巯基化改性制备过程不会显著改变分子量及其分布，通常本发明通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物的分子量及其分布与起始原料(侧链含羧基高分子化合物)的分子量及其分布基本相同。不同起始原料(侧链含羧基高分子化合物)的分子量差别较大，通常在1000到500万之间；其分子量分布也差别较大，如明胶的分子量分布通常较宽。起始原料(侧链含羧基高分子化合物)的分子量及其分布并不会影响巯基化改性过程，不会影响本发明通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物的制备。
本发明通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物具有很多有益效果。本发明采用酰肼键的化学结合方式进行巯基化改性，具有制备条件温和、产率高、改性程度高且可控等许多显著优点。与Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002和WO2004/03716所公开的高分子巯基化改性衍生物相比，虽然都采用酰肼键的化学结合方式进行巯基化改性，但本发明通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物创新性地引入了一个酰氨键，侧链化学结构灵活多变、性能可调。研究表明本发明的通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物具有以下两大有益效果：
(1)通过引入酰氨键的方式，可以灵活调节侧链的长度和结构。侧链的长度将在很大程度上影响巯基的反应性能(Shu等，Biomaterials 24，3825，2003)。侧链越长，端巯基和其他反应官能团的碰撞几率越高，因而进一步使反应改性的性能得到了很大的提高。
(2)酰氨键为强吸电子基团，本发明化合物侧链酰氨键的引入，在很大程度上影响了端巯基的电离常数(pKa)，然而这与酰氨键的连接方式有关。本发明通式(I)高分子巯基化改性衍生物的侧链酰氨键中的羰基与端巯基相近，强化了端巯基的电离(pKa降低)；与此相反，本发明通式(II)高分子巯基化改性衍生物的侧链酰氨键的氮原子与端巯基相近，弱化了端巯基的电离(pKa升高)。一般说来，与Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002和WO 2004/03716所公开的侧链连接片断为亚烷基(碳数为2和3)的高分子巯基化改性衍生物相比，本发明通式(I)高分子巯基化改性衍生物的巯基电离常数(pKa)降低约0.1～0.4，而本发明通式(II)高分子巯基化改性衍生物的巯基电离常数(pKa)则升高约0.2～0.7。因而本发明通式(I)高分子巯基化改性衍生物的端巯基更活泼，而本发明通式(II)高分子巯基化改性衍生物的端巯基则更稳定。
本发明通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物与已公开的高分子巯基化改性衍生物相比，具有许多独特的性能，可以根据实际应用的需要，选择合适的化学结构。以透明质酸(HA)的下述具体高分子巯基化衍生物为例来进一步说明本发明通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物的有益效果：
Figure G2006101194141D00081
上述化合物在端巯基侧具有相同的结构，其中(a)是Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002和WO 2004/03716所公开的高分子巯基化改性衍生物；(b)是本发明通式(I)高分子巯基化改性衍生物；(c)是本发明通式(II)高分子巯基化改性衍生物。高分子巯基化改性衍生物(b)的巯基反应活性比(a)高很多，其形成双硫键交联凝胶的能力提高了约50％；而高分子巯基化改性衍生物(c)的巯基反应活性比(a)低很多，其巯基稳定性能提高了一倍以上。
本发明通式(I)或(II)的高分子巯基化改性衍生物，具有至少一个侧链自由巯基，可以在合适的条件下重新氧化形成二硫键。氧气、低浓度过氧化氢、碘、铁三价离子等中强度氧化剂均可使自由巯基形成二硫键，从而制备出高分子交联材料。二硫键的形成通常受溶液pH值的影响：在碱性条件下，巯基电离成硫负离子，反映活性很高，即使空气中的氧气也能快速促进二硫键的形成；而在酸性条件下，巯基的电离受到抑制，反应活性降低，巯基相对稳定。本发明通式(I)的高分子巯基化改性衍生物的巯基较活泼，即使在中性的条件和弱氧化剂的作用下也可生成二硫键交联材料；而本发明通式(II)的高分子巯基化改性衍生物的巯基较稳定，需要在弱碱性或较强氧化剂的作用下才能快速生成二硫键交联材料。
本发明的二硫键交联的高分子巯基化改性衍生物交联材料的制备方法简单可靠，产物灵活多变。常用的制备方法是将一种或多种本发明通式(I)或(II)的高分子巯基化改性衍生物制成水溶液或混合水溶液，在中性或弱碱性条件下用室温空气氧化制备二硫键交联材料；或者在弱酸性或酸性条件下，用低浓度过氧化氢、铁三价离子等更强的氧化剂氧化制备二硫键交联材料。
本发明单组份和双组份的二硫键交联的高分子巯基化改性衍生物交联材料用下述通式(III)、(IV)或(V)表示：
其中P1和P2都是侧链含羧基的高分子化合物残基，其定义同前述。R1和R2的定义同前述；R3和R4的定义与R1和R2相同；R1、R2、R3、R4可以具有相同或不相同的化学结构。当P1和P2相同时，即为单组份交联材料，当P1和P2不相同时，即为双组份交联材料。
本发明的三组份或三组分以上的二硫键交联的高分子巯基化改性衍生物交联材料可由三种或三种以上通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物制备，其结构特征是包含三种或三种以上高分子化合物通过二硫键结合形成交联材料。
本发明的有益效果是可以方便地制备各种二硫键交联高分子材料：如一种多糖的二硫键交联材料、一种蛋白质的二硫键交联材料、或者两种多糖的复合二硫键交联材料、两种蛋白质的复合交联材料、一种多糖和一种蛋白质的复合二硫键交联材料等等。这些二硫键交联高分子材料可以制成薄膜、海绵、凝胶等各种形态，可以用于抑制细胞的粘附，用作细胞生长基质等等。
本发明的巯基反应活性交联剂交联的高分子巯基化改性衍生物交联材料由一种或多种通式(I)或(II)的新颖高分子巯基化改性衍生物和巯基反应活性交联剂制备。本发明采用的巯基反应活性官能团包括马来酰亚胺、乙烯砜、α，β不饱和丙烯酸酯、α，β不饱和甲基丙烯酸酯、卤代丙酸酯、卤代丙酰胺、二硫代吡啶、N-羟基丁二酰亚胺活化酯等等。其中马来酰亚胺、乙烯砜、碘代丙酸酯、碘代丙酰胺、二硫代吡啶等官能团具有很高巯基反应活性。以本发明通式(I)高分子巯基化改性衍生物为例，以下给出了巯基和这些官能团的化学反应式，其中，R1和R2是亚烷基、取代亚烷基、芳香基、聚醚基等：
Figure G2006101194141D00101
这些反应可以分为三类：(1)巯基和活化不饱和双键的加成反应，属于这类反应的官能团包括马来酰亚胺、乙烯砜、α，β不饱和丙烯酸酯、α，β不饱和甲基丙烯酸酯等；(2)巯基和活化卤代烷的取代反应，属于这类反应的官能团包括碘代丙酸酯、溴代丙酸酯、氯代丙酸酯、碘代丙酰胺、溴代丙酰胺、氯代丙酰胺、二硫代吡啶等；(3)最后一类是硫酯化反应，这类反应得官能团包括各种羧酸的活化酯，如N-羟基丁二酰亚胺活化酯等等。
本发明采用的巯基反应活性交联剂至少含有两个上述反应官能团的聚乙二醇(简称PEG)的衍生物，如双臂、三臂、四臂、八臂或更多臂的聚乙二醇衍生物，它们具有如下的典型化学结构：
Figure G2006101194141D00111
其中G1、G2、G3、G4、G5、G6、G7和G8为上述巯基反应活性官能团如马来酰亚胺、乙烯砜、α，β不饱和丙烯酸酯、α，β不饱和甲基丙烯酸酯、卤代丙酸酯、卤代丙酰胺、二硫代吡啶或N-羟基丁二酰亚胺等等，它们可以具有全部相同、部分相同或全部不相同的化学结构；PEG是指分子量为100到1000000的具有CH2CH2O重复单元的链段。
以双臂的聚乙二醇为例，以下是本发明采用的常见交联剂——双臂聚乙二醇巯基反应活性交联剂的化学结构式：
本发明的巯基反应活性交联剂交联的高分子巯基化改性衍生物交联材料的通常制备方法包括将一种或多种通式(I)或(II)的新颖高分子巯基化改性衍生物制成水溶液或混合水溶液，调节溶液的pH值为中性，然后加入上述巯基反应活性交联剂的水溶液，混合均匀后室温静置片刻即形成凝胶，得到交联材料。本发明通式(I)的高分子巯基化改性衍生物的巯基较活泼，与交联剂的反应较快；而本发明通式(II)的高分子巯基化改性衍生物的巯基较稳定，与交联剂的反应则相对较慢。
以通式(I)高分子巯基化改性衍生物和上述双臂聚乙二醇巯基反应活性交联剂为例，本发明的单组份和双组份的巯基反应活性交联剂交联的高分子巯基化改性衍生物交联材料具有如下所示的结构：
Figure G2006101194141D00121
其中P1和P2都是侧链含羧基的高分子化合物残基，其定义同前述；R1、R2、R3和R4的定义同前述；R1、R2、R3、R4可以具有相同或不相同的化学结构。当P1和P2相同时，即为单组份交联材料，当P1和P2不相同时，即为双组份交联材料。也可以采用两种或两种以上的上述双臂聚乙二醇巯基反应活性交联剂共同交联制备高分子巯基化改性衍生物交联材料。另外也可以采用一种或多种多臂聚乙二醇衍生物交联剂(如三臂聚乙二醇衍生物交联剂、四臂聚乙二醇衍生物交联剂、八臂聚乙二醇衍生物交联剂等等)来制备高分子巯基化改性衍生物交联材料。巯基反应活性交联剂交联的通式(II)高分子巯基化改性衍生物交联材料和通式(I)高分子巯基化改性衍生物交联材料具有类似的结构。
本发明的三组份或三组分以上的巯基反应活性交联剂交联的高分子巯基化改性衍生物交联材料可由三种或三种以上通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物制备.通常的制备途径是首先制备出三种或三种以上通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物的混合溶液，然后调节溶液的pH值为中性，加入一种或多种上述聚乙二醇巯基反应活性衍生物交联剂，从而制备出多组份交联材料.
通常说来，巯基反应活性交联剂和本发明通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物的交联作用非常快速，其交联凝胶化速度比二硫键的交联速度提高5倍以上，具有重要的生物医学用途，如细胞的原位包埋等等。本发明可以方便地制备出各种巯基反应活性交联剂交联高分子材料：如一种多糖的交联材料、一种蛋白质的交联材料、或者两种多糖的复合交联材料、两种蛋白质的复合交联材料、一种多糖和一种蛋白质的复合交联材料等等。这些巯基反应活性交联高分子材料可以制成薄膜、海绵、凝胶等各种形态，可以用于抑制细胞的粘附，用作细胞生长基质等等。
附图说明
图1是本发明实施例4中低取代衍生物的氢原子核磁共振谱图和重要化学位移峰的归属(D2O为溶剂)；
图2是本发明实施例4中高取代衍生物的氢原子核磁共振谱图和重要化学位移峰的归属(D2O为溶剂)；
图3是本发明实施例20中细胞在空白细胞培养板表面的形貌示意图；
图4是本发明实施例20中细胞在聚乙二醇二丙烯酸酯交联透明质酸-明胶双组分水凝胶表面的形貌示意图。
具体实施方式
下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1.合成二硫代二丙酸双酰甘氨酸二酰肼(简称DGDTPDH)
在1000毫升烧杯中加入10克二硫代二丙酸(Aldrich，美国)，50毫升无水二甲基甲酰胺。室温搅拌溶解后，加入17.0克羰二咪唑(Aldrich，美国)。此时溶液产生大量二氧化碳气泡和白色沉淀。室温减压反应3小时。然后加入14.7克甘氨酸乙酯盐酸盐(Aldrich，美国)，搅拌反应1小时。然后在加入500毫升乙醚，静止1小时。小心倒去上层有机相，然后加入100毫升乙醇和10毫升水合肼。室温搅拌过夜，过滤收集沉淀产物。沉淀用200毫升无水乙醇淋洗两次，然后真空减压干燥得到略带黄色固体产物DGDTPDH约8.5克，产率约50％。
实施例2.低取代DGDTPDH改性透明质酸巯基化衍生物(HA-DGDTPDH)的合成
透明质酸钠(分子量62～115万，NovaMatrix FMC BIOPOLYMER，美国)1克溶解于200毫升蒸馏水中，得到澄清透明溶液。在上述溶液中加入1.32克实施例1制备的DGDTPDH，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.36克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。溶液黏度不断增加，并在15分钟左右形成凝胶。凝胶形成后，室温静置反应2小时。然后加入10克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和少量0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌.凝胶逐渐溶解，同时不断加入0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液使溶液的pH值保持在8.5.待凝胶全部溶解后，室温电磁搅拌反应24小时.此后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体约0.7克。
实施例3.高取代DGDTPDH改性透明质酸巯基化衍生物(HA-DGDTPDH)的合成
透明质酸钠(分子量62～115万，NovaMatrix FMC BIOPOLYMER，美国)1克溶解于200毫升蒸馏水中，得到澄清透明溶液。在上述溶液中加入2.64克实施例1制备的DGDTPDH，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.96克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。溶液黏度不断增加，并在10分钟左右形成凝胶。凝胶形成后，室温静置反应2小时。然后加入20克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和少量0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。凝胶逐渐溶解，同时不断加入0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液使溶液的pH值保持在8.5。待凝胶全部溶解后，室温电磁搅拌反应24小时。此后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体约0.7克。
实施例4.DGDTPDH改性透明质酸巯基化衍生物(HA-DGDTPDH)的表征
HA-DGDTPDH的化学结构式如下：
Figure G2006101194141D00151
对实施例2和实施例3制备的HA-DGDTPDH进行表征：
1、凝胶液相色谱(GPC)检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明实施例2和实施例3制备的低取代和高取代HA-DGDTPDH为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
2、氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)，谱图和化学位移峰的归属如图1和图2所示，HA-DGDTPDH在δ3.96、2.70、2.56ppm出现了三个新的吸收峰，分别对应于CH2NHC(O)CH2CH2SH、CH2NHC(O)CH2CH2SH和CH2NHC(O)CH2CH2SH三个侧链亚甲基的氢原子吸收.化学位移为δ2.8ppm左右的小吸收峰为少量副反应产物的吸收峰.
以透明质酸的乙酰基的特征甲基吸收峰为内标，根据吸收峰的面积计算出实施例2制备的低取代HA-DGDTPDH的侧链取代度为27％，实施例3制备的高取代HA-DGDTPDH的侧链取代度为59％。
3、分子量及其分布测定(GPC测定，以单分散透明质酸校正标准曲线)：实施例2制备的低取代HA-DGDTPDH重均分子量(Mw)102万，数均分子量(Mn)53万，分子量分布1.92；实施例3制备的高取代HA-DGDTPDH重均分子量(Mw)123万，数均分子量(Mn)58万，分子量分布2.12。
4、采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Fllman方法检测实施例2和实施例3制备的HA-DGDTPDH的活性巯基含量。实施例2制备的低取代HA-DGDTPDH的侧链活性巯基含量25.4个巯基/100个透明质酸二糖重复单元，实施例3制备的高取代HA-DGDTPDH的侧链活性巯基含量为55.1个巯基/100个透明质酸二糖重复单元。基本与氢谱核磁共振检测结果相符。
实施例5.合成二硫代二丙酸双酰氨基丙酸二酰肼(简称DADTPDH)
在1000毫升烧杯中加入10克二硫代二丙酸(Aldrich，美国)，50毫升无水二甲基甲酰胺。室温搅拌溶解后，加入17.0克羰二咪唑(Aldrich，美国)。此时溶液产生大量二氧化碳气泡和白色沉淀。室温减压反应3小时。然后加入14.7克氨基丙酸乙酯盐酸盐(Aldrich，美国)，搅拌反应1小时。然后再加入500毫升乙醚，静止1小时。小心倒去上层有机相，然后加入100毫升乙醇和10毫升水合肼。室温搅拌过夜，过滤收集沉淀产物。沉淀用200毫升无水乙醇淋洗两次，然后真空减压干燥得到略带黄色固体产物DADTPDH约7.3克，产率约40％。
实施例6.DADTPDH改性透明质酸巯基化衍生物(HA-DADTPDH)的合成和表征
透明质酸钠(分子量62～115万，NovaMatrix FMC BIOPOLYMER，美国)1克溶解于200毫升蒸馏水中，得到澄清透明溶液。在上述溶液中加入1.43克实施例5制备的DADTPDH，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.48克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。溶液黏度不断增加，并在10分钟左右形成凝胶。凝胶形成后，室温静置反应2小时。然后加入12克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和少量0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。凝胶逐渐溶解，同时不断加入0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液使溶液的pH值保持在8.5。待凝胶全部溶解后，室温电磁搅拌反应24小时。此后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体约0.7克。
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的HA-DADTPDH为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)。HA-DADTPDH在δ3.4、2.66ppm出现了两个新吸收峰分别对应于CH2CH2NHC(O)CH2CH2SH和CH2CH2NHC(O)CH2CH2SH两个侧链亚甲基的氢原子吸收；CH2CH2NHC(O)CH2CH2SH和CH2CH2NHC(O)CH2CH2SH两个侧链亚甲基的氢原子吸收峰在δ2.5ppm左右相互重叠。化学位移为δ2.8ppm左右的小吸收峰为少量副反应产物的吸收峰。
以透明质酸的乙酰基的特征甲基吸收峰为内标，根据吸收峰的面积计算出合成的HA-DGDTPDH的侧链取代度为61％。
用GPC测定分子量及其分布测定(以单分散透明质酸校正标准曲线)：重均分子量(Mw)122万，数均分子量(Mn)67万，分子量分布1.82。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测HA-DADTPDH的活性巯基含量：53.6个巯基/100个透明质酸二糖重复单元，稍低于氢谱核磁共振检测结果。
实施例7.合成双琥珀酸双酰胱胺二酰肼(简称DSCDH)
胱胺二盐酸盐(Aldrich，美国)100克溶解于1500毫升蒸馏水，得到澄清透明溶液。在上述溶液中加入4摩尔/升的氢氧化钠直至溶液pH值为10。然后在电磁搅拌下加入133克琥珀酸酐(Aldrich，美国)，同时不断加入4摩尔/升的氢氧化钠使溶液的pH值保持在7～10。室温反应2小时后，在溶液中加入6摩尔/升的盐酸。。过滤收集白色沉淀产物，用2000毫升蒸馏水洗两次。然后真空减压干燥，得到白色产物固体产物合成双琥珀酸双酰胱胺酸(简称DSC)约150克，产率大于90％。
在250毫升三颈圆底烧瓶中加入100克DSC，1200毫升无水乙醇和100滴浓硫酸。氮气保护下回流2小时，然后减压浓缩至小于200毫升。剩余溶液转移到2500毫升分液漏斗，然后加入600毫升乙酸乙酯。有机相用500毫升水洗三次，弃去水相，有机相减压蒸馏得到白色腊状固体产物双琥珀酸双酰胱胺酸二乙酯(简称DSCDE)约93克，产率大于80％。
在150毫升烧杯中加入10克DSCDE，80毫升乙醇。室温搅拌溶解后再加入10毫升水合肼(Aldrich，美国)，反应过夜。过滤收集白色沉淀产物，然后用40毫升乙醇淋洗四次。室温通风厨中挥发有机溶剂后，真空减压干燥，得到白色产物固体产物DSCDH约8克，产率大于75％。
实施例8.DSCDH改性透明质酸巯基化衍生物(HA-DSCDH)的合成和表征
透明质酸钠(分子量62～115万，NovaMatrix FMC BIOPOLYMER，美国)1克溶解于200毫升蒸馏水中，得到澄清透明溶液。在上述溶液中加入0.95克实施例7制备的DSCDH，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.288克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75。溶液黏度不断增加，并在10分钟左右形成凝胶。凝胶形成后，室温静置反应2小时。然后加入10克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和少量0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。凝胶逐渐溶解，同时不断加入0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液使溶液的pH值保持在8.5。待凝胶全部溶解后，室温电磁搅拌反应24小时。此后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体约0.7克。
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的HA-DSCDH为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)。HA-DSCDH在δ3.26、2.5ppm出现了两个新吸收峰。其中δ3.26ppm的新吸收峰对应于CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH一个侧链亚甲基氢原子吸收；CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH、CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH和CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH的三个侧链亚甲基的氢原子吸收则重叠在δ2.5ppm。
以透明质酸的乙酰基的特征甲基吸收峰为内标，根据吸收峰的面积计算出合成的HA-DGDTPDH的侧链取代度为38％。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测HA-DSCDH的活性巯基含量：39.1个巯基/100个透明质酸二糖重复单元，基本与氢谱核磁共振检测结果相符。
实施例9.DSCDH改性硫酸软骨素巯基化衍生物(CS-DSCDH)的合成和表征
硫酸软骨素(c型，来自鲨鱼软骨，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中，得到澄清透明溶液。在上述溶液中加入0.704克实施例7制备的DSCDH，搅拌溶解。然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.192克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌。在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75，室温电磁搅拌反应2小时。然后加入10克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和少量0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。凝胶逐渐溶解，同时不断加入0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液使溶液的pH值保持在8.5。待凝胶全部溶解后，室温电磁搅拌反应24小时。此后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体约0.6克。
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的CS-DSCDH为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)。CS-DSCDH在δ3.27、2.54ppm出现了两个新吸收峰。其中δ3.27ppm的新吸收峰对应于CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH侧链亚甲基氢原子吸收；CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH、CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH和CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH的三个侧链亚甲基的氢原子吸收则重叠在δ2.54ppm。
以硫酸软骨素的乙酰基的特征甲基吸收峰为内标，根据吸收峰的面积计算出合成的CS-DGDTPDH的侧链取代度为47％。
用GPC测定分子量及其分布测定(以单分散透明质酸校正标准曲线)：重均分子量(Mw)3.8万，数均分子量(Mn)1.7万，分子量分布2.23。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测CS-DSCDH的活性巯基含量：44.2个巯基/100个硫酸软骨素二糖重复单元，稍低于氢谱核磁共振检测结果。
实施例10.DSCDH改性明胶巯基化衍生物(GEL-DSCDH)的合成和表征
明胶(B型，来自猪皮，Sigma，美国)1克溶解于100毫升蒸馏水中，得到澄清透明溶液.在上述溶液中加入0.75克实施例7制备的DSCDH，搅拌溶解.然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入1克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌.在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75.溶液黏度不断增加，并在10分钟左右形成凝胶.凝胶形成后，室温静置反应2小时.然后加入10克二硫苏糖醇(Diagnostic ChemicalLimited，美国)和少量0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。凝胶逐渐溶解，同时不断加入0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液使溶液的pH值保持在8.5。待凝胶全部溶解后，室温电磁搅拌反应24小时。此后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体约0.6克。
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的GEL-DSCDH为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)。GEL-DSCDH在δ3.27、2.54ppm出现了两个新的强吸收峰。其中δ3.28ppm的新吸收峰对应于CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH侧链亚甲基氢原子吸收；CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH、CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH和CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH的三个侧链亚甲基的氢原子吸收则重叠在δ2.53ppm。
用GPC测定分子量及其分布测定(以标准分子量聚乙二醇校正标准曲线)：重均分子量(Mw)5.6万，数均分子量(Mn)2.1万，分子量分布2.67。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测GEL-DSCDH的活性巯基含量：0.57毫摩尔巯基/克GEL-DSCDH。
实施例11.合成双戊二酸双酰胱胺酸二酰肼(简称DGCDH)
胱胺二盐酸盐(Aldrich，美国)100克溶解于1500毫升蒸馏水，得到澄清透明溶液。在上述溶液中加入4摩尔/升的氢氧化钠直至溶液pH值为10。然后在电磁搅拌下加入152克戊二酸酐(A1drich，美国)，同时不断加入4摩尔/升的氢氧化钠使溶液的pH值保持在7～10。室温反应2小时后，在溶液中加入6摩尔/升的盐酸。过滤收集白色沉淀产物，用2000毫升蒸馏水洗两次。然后真空减压干燥，得到白色产物固体产物双戊二酸双酰胱胺酸(简称DGC)约155克，产率大于90％。
在2500毫升三颈圆底烧瓶中加入100克DGC，1200毫升无水乙醇和100滴浓硫酸。氮气保护下回流2小时，然后减压浓缩至小于200毫升。剩余溶液转移到2500毫升分液漏斗，然后加入600毫升乙酸乙酯。有机相用500毫升水洗三次，然后减压蒸馏得到白色腊状固体产物双戊二酸双酰胱胺酸二乙酯(简称DGCDE)约94克，产率大于80％。
在150毫升烧杯中加入10克DGCDE，80毫升乙醇。室温搅拌溶解后再加入10毫升水合肼，反应过夜。过滤收集白色沉淀产物，然后用40毫升乙醇淋洗四次。室温通风厨中挥发有机溶剂后，真空减压干燥，得到白色产物固体产物双戊二酸双酰胱胺酸二酰肼(简称DGCDH)约7.1克，产率大于75％。
实施例12.DGCDH改性透明质酸巯基化衍生物(HA-DGCDH)的合成和表征
透明质酸钠(分子量62～115万，NovaMatrix FMC BIOPOLYMER，美国)1克溶解于200毫升蒸馏水中，得到澄清透明溶液.在上述溶液中加入1.53克实施例11制备的DGCDH，搅拌溶解.然后溶液的pH值用0.1摩尔/升盐酸调节至4.75，加入0.48克1-乙基-3-(3-二甲胺丙基)碳二亚胺盐酸盐(Aldrich，美国)，电磁搅拌.在上述溶液中不断加入适量0.1摩尔/升盐酸，使溶液的pH值保持在4.75.溶液黏度不断增加，并在10分钟左右形成凝胶.凝胶形成后，室温静置反应2小时.然后加入10克二硫苏糖醇(Diagnostic Chemical Limited，美国)和少量0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液，搅拌。凝胶逐渐溶解，同时不断加入0.1摩尔/升的氢氧化钠溶液使溶液的pH值保持在8.5。待凝胶全部溶解后，室温电磁搅拌反应24小时。此后，在上述溶液中加入6摩尔/升的盐酸直至约pH 3.0。上述溶液装入透析管(截除分子量3500，Sigma，美国)，用10升0.001摩尔/升的盐酸和0.3摩尔/升的氯化钠溶液透析5天，每8小时换一次透析液；然后再用10升0.001摩尔/升的盐酸溶液透析3天，每8小时换透析液。最后收集透析管内的溶液，冷冻干燥得到白色絮状固体约0.7克。
GPC检测(纯水为流动相，紫外210纳米吸收检测)均未发现小分子杂质流出峰，表明合成的HA-DGCDH为高度纯化，杂质低于仪器检测水平。
氢谱核磁共振检测(1H-NMR)(D2O为溶剂)。HA-DGCDH在δ3.23、2.56、2.3ppm出现了三个新吸收峰。其中δ3.23、2.56ppm的新吸收峰分别对应于CH2CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH和CH2CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH两个侧链亚甲基氢原子吸收；CH2CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH和CH2CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH两个侧链亚甲基的氢原子吸收峰则重叠在δ2.3ppm左右；CH2CH2CH2C(O)NHCH2CH2SH链亚甲基的氢原子吸收峰则和透明质酸的乙酰基的特征甲基吸收峰在δ3.23ppm附近重叠。
以透明质酸的乙酰基的特征甲基吸收峰为内标，根据吸收峰的面积计算出合成的HA-DGDTPDH的侧链取代度为52％。
采用Shu等人在Biomacromolecules，3，1304，2002中报道的改进Ellman方法检测HA-DSCDH的活性巯基含量：49.4个巯基/100个透明质酸二糖重复单元，基本与氢谱核磁共振检测结果相符。
实施例13.单组分二硫键交联水凝胶的制备
1、二硫键交联透明质酸水凝胶的制备：实施例3制备的本发明透明质酸巯基化衍生物(HA-DGDTPDH)0.1克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。然后上述溶液倒入25毫升玻璃烧杯，室温静置12小时，溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
2、二硫键交联明胶水凝胶的制备：实施例10制备的本发明明胶巯基化衍生物(GEL-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。然后上述溶液倒入25毫升玻璃烧杯，室温静置12小时，溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
实施例14.多组分二硫键交联水凝胶的制备
1、二硫键交联透明质酸-明胶双组分水凝胶的制备：实施例3制备的本发明透明质酸巯基化衍生物(HA-DGDTPDH)0.1克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。实施例10制备的本发明明胶巯基化衍生物(GEL-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。然后上述两种溶液同时倒入50毫升玻璃烧杯，电磁搅拌10分钟。此后室温静置12小时，溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
2、二硫键交联硫酸软骨素-明胶双组分水凝胶的制备：实施例9制备的本发明硫酸软骨素巯基化衍生物(CS-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。实施例10制备的本发明明胶巯基化衍生物(GEL-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。然后上述两种溶液同时倒入50毫升玻璃烧杯，电磁搅拌10分钟。此后室温静置12小时，溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
3、二硫键交联透明质酸-硫酸软骨素-明胶三组分水凝胶的制备：实施例3制备的本发明透明质酸巯基化衍生物(HA-DGDTPDH)0.1克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。实施例9制备的本发明硫酸软骨素巯基化衍生物(CS-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。实施例10制备的本发明明胶巯基化衍生物(GEL-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。然后上述三种溶液同时倒入50毫升玻璃烧杯，电磁搅拌10分钟。此后室温静置12小时，溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
实施例15.单组分聚乙二醇二乙烯砜交联水凝胶的制备
1、聚乙二醇二乙烯砜交联透明质酸水凝胶的制备：实施例3制备的本发明透明质酸巯基化衍生物(HA-DGDTPDH)0.1克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400，Nektar Therapeutics，美国)0.1克溶解于2.5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液。然后上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升HA-DGDTPDH溶液，立即电磁搅拌30秒，室温静置30分钟。溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
2、聚乙二醇二乙烯砜交联硫酸软骨素水凝胶的制备：实施例9制备的本发明硫酸软骨素巯基化衍生物(CS-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400，Nektar Therapeutics，美国)0.1克溶解于2.5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液。然后上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升CS-DSCDH溶液，立即电磁搅拌30秒，室温静置30分钟。溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
3、聚乙二醇二乙烯砜交联明胶水凝胶的制备：实施例10制备的本发明明胶巯基化衍生物(GEL-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。聚乙二醇二乙烯砜(分子量3400，Nektar Therapeutics，美国)0.1克溶解于2.5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液.然后上述2.5毫升聚乙二醇二乙烯砜溶液加入到10毫升CS-DSCDH溶液，立即电磁搅拌30秒，室温静置30分钟.溶液黏度逐渐增加并形成凝胶.
实施例16.多组分聚乙二醇二丙烯酸酯交联水凝胶的制备
1、聚乙二醇二丙烯酸酯交联透明质酸-明胶双组分水凝胶的制备：实施例3制备的本发明透明质酸巯基化衍生物(HA-DGDTPDH)0.1克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。实施例10制备的本发明明胶巯基化衍生物(GEL-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。聚乙二醇二丙烯酸酯(分子量3400，Nektar Therapeutics，美国)0.2克溶解于5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液。然后上述10毫升HA-DGDTPDH溶液、10毫升GEL-DSCDH溶液、5毫升聚乙二醇二丙烯酸酯溶液同时倒入50毫升玻璃烧杯，立即电磁搅拌30秒。室温静置30分钟。溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
2、聚乙二醇二丙烯酸酯交联硫酸软骨素-明胶双组分水凝胶的制备：实施例9制备的本发明硫酸软骨素巯基化衍生物(CS-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。实施例10制备的本发明明胶巯基化衍生物(GEL-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。聚乙二醇二丙烯酸酯(分子量3400，Nektar Therapeutics，美国)0.2克溶解于5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液。然后上述10毫升CS-DSCDH溶液、10毫升GEL-DSCDH溶液、5毫升聚乙二醇二丙烯酸酯溶液同时倒入50毫升玻璃烧杯，立即电磁搅拌30秒。室温静置30分钟。溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
3、聚乙二醇二丙烯酸酯交联透明质酸-硫酸软骨素-明胶三组分水凝胶的制备：实施例3制备的本发明透明质酸巯基化衍生物(HA-DGDTPDH)0.1克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH7.4。实施例9制备的本发明硫酸软骨素巯基化衍生物(CS-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。实施例10制备的本发明明胶巯基化衍生物(GEL-DSCDH)0.3克溶解于10毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液，在上述溶液中加入适量0.1摩尔/升的氢氧化钠直至pH 7.4。聚乙二醇二丙烯酸酯(分子量3400，Nektar Therapeutics，美国)0.3克溶解于7.5毫升0.1摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)得到澄清透明溶液。然后上述10毫升HA-DGDTPDH溶液、10毫升CS-DSCDH溶液、10毫升GEL-DSCDH溶液、7.5毫升聚乙二醇二丙烯酸酯溶液同时倒入50毫升玻璃烧杯，立即电磁搅拌30秒。室温静置30分钟，溶液黏度逐渐增加并形成凝胶。
实施例17.二硫键交联透明质酸水凝胶用于抑制细胞的粘附
按照实施例13在24孔标准细胞培养板内制备二硫键交联透明质酸水凝胶，每孔为1毫升。12小时后整块细胞培养板浸泡在75％的酒精溶液消毒2小时。此后细胞培养板用无菌生理盐水浸洗三次。每孔加入1毫升细胞培养液(DMEM，10％牛血清)和2万个NIH 3T3成纤细胞。37摄氏度、二氧化碳细胞培养箱培养24小时。显微镜观察发现绝大部分成纤细胞悬浮在二硫键交联透明质酸水凝胶表面，不能黏附铺展；而在空白细胞培养板孔内，成纤细胞黏附在底部，呈纺锤形。这个结果表明二硫键交联透明质酸水凝胶可以抑制细胞的黏附，可用于外科手术后粘连的预防和治疗。
实施例18.二硫键交联透明质酸-明胶二组份水凝胶作为细胞粘附生长的基质
按照实施例14在24孔标准细胞培养板内制备二硫键交联透明质酸-明胶二组份水凝胶，每孔为1毫升。12小时后整块细胞培养板浸泡在75％的酒精溶液消毒2小时。此后细胞培养板用无菌生理盐水浸洗三次。每孔加入1毫升细胞培养液(DMEM，10％牛血清)和2万个NIH 3T3成纤细胞。37摄氏度、二氧化碳细胞培养箱培养24小时。显微镜观察发现细胞在二硫键交联透明质酸-明胶二组份水凝胶表面的黏附铺展与空白细胞培养板相似，细胞呈纺锤形。这个结果表明二硫键交联透明质酸-明胶二组份水凝胶是细胞粘附生长的良好基质。
实施例19.聚乙二醇二乙烯砜交联透明质酸水凝胶用于抑制细胞的粘附
按照实施例15在24孔标准细胞培养板内制备聚乙二醇二乙烯砜交联透明质酸水凝胶，每孔为1毫升。12小时后整块细胞培养板浸泡在75％的酒精溶液消毒2小时。此后细胞培养板用无菌生理盐水浸洗三次。每孔加入1毫升细胞培养液(DMEM，10％牛血清)和2万个NIH 3T3成纤细胞。37摄氏度、二氧化碳细胞培养箱培养24小时。显微镜观察发现绝大部分成纤细胞悬浮在聚乙二醇二乙烯砜交联透明质酸水凝胶，不能黏附铺展；而在空白细胞培养板孔内，成纤细胞黏附在底部，呈纺锤形。这个结果表明聚乙二醇二乙烯砜交联透明质酸水凝胶可以抑制细胞的黏附。
实施例20.聚乙二醇二丙烯酸酯交联透明质酸-明胶双组分水凝胶作为细胞粘附生长的基质
按照实施例16在24孔标准细胞培养板内制备聚乙二醇二丙烯酸酯交联透明质酸-明胶双组分水凝胶，每孔为1毫升。12小时后整块细胞培养板浸泡在75％的酒精溶液消毒2小时。此后细胞培养板用无菌生理盐水浸洗三次。每孔加入1毫升细胞培养液(DMEM，10％牛血清)和2万个NIH 3T3成纤细胞。37摄氏度、二氧化碳细胞培养箱培养24小时。显微镜观察发现细胞在聚乙二醇二丙烯酸酯交联透明质酸-明胶双组分水凝胶表面的黏附铺展与空白细胞培养板相似，细胞呈纺锤形(如图3和图4所示)。这个结果表明二硫键交联透明质酸-明胶二组份水凝胶是细胞粘附生长的良好基质。

Claims (7)

1.下述通式(I)或(II)的高分子巯基化改性衍生物：
Figure F2006101194141C00011
其中R1和R2是亚烷基、取代亚烷基、芳香基或聚醚基；所述取代亚烷基是指至少一个氢原子被低级烷基、羟基、氨基、烷氧基、苯基、酯基等基团取代的亚烷基；P是侧链含有羧基的高分子化合物残基，所述低级烷基是指具有1～8个碳原子的直链或支链的烷基；所述的侧链含有羧基的高分子化合物包括多糖、蛋白质以及合成高分子，所述的多糖是硫酸软骨素、皮肤素、肝素、类肝素、海藻酸、透明质酸、硫酸皮肤素、果胶、羧甲基纤维素、羧甲基壳聚糖及其盐中的一种；所述的蛋白质是胶原蛋白、碱性明胶蛋白、酸性明胶蛋白、弹性蛋白、核心蛋白、多糖层粘连蛋白、纤维结合蛋白中的一种；所述的合成高分子是聚丙烯酸、聚天冬氨酸、聚酒石酸、聚谷氨酸、聚富马酸及其盐中的一种；所述高分子巯基化改性衍生物的分子量为1000到500万。
2.按照权利要求1所述的通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物，其中R1和R2是亚烷基。
3.按照权利要求2所述的通式(I)或(II)高分子巯基化改性衍生物，其中R1和R2都是碳原子数1到8的亚烷基。
4.一种或一种以上如权利要求1-3任一项所述的高分子巯基化改性衍生物通过二硫键交联生成的高分子交联材料。
5.一种或一种以上如权利要求1-3任一项所述的高分子巯基化改性衍生物通过与至少含有两个相同或不相同巯基反应活性官能团交联剂交联生成的高分子交联材料。
6.按照权利要求5所述的高分子交联材料，其特征在于，所述的巯基反应活性官能团交联剂是包括巯基反应活性官能团的双臂、三臂或更多臂的聚乙二醇衍生物，所述的聚乙二醇衍生物的分子量为100到1000000。
7.按照权利要求6所述的高分子交联材料，其特征在于，所述的巯基反应活性官能团是马来酰亚胺、乙烯砜、α，β不饱和丙烯酸酯、α，β不饱和甲基丙烯酸酯、碘代丙酸酯、溴代丙酸酯、碘代丙酰胺、溴代丙酰胺、二硫代吡啶、N-羟基丁二酰亚胺活化酯中的一种。
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